Protocolos de secuenciación de ADN

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Protocolos de secuenciación de ADN
Introducción
El método de secuenciación utilizado aquí es el desarrollado por Sanger en 1975. Este consiste en
la incorporación de didesixinucleótidos marcados fluorescentemente a una cadena de ADN
durante el proceso de copiado de la misma. Los didesixinucleótidos no poseen un grupo 3´-OH
necesario para la formación del enlace fosfodiester que permite la unión entre nucleótidos, por lo
tanto se interrumpe la elongación de la cadena cada vez que uno de estos es incorporado en ella.
De este modo se generan secuencias de diferentes tamaños. Estas se hacen migran a través de un
gel de poliacrilamida donde se separan por tamaños. El equipo de secuenciación cuenta con un
dispositivo que permite captar la emisión de luz de los cuatro didesixinucleótidos. La lectura se
hace entonces partiendo de las secuencias más cortas hasta la secuencia completa, y se genera un
gráfico con picos de emisión de luz en la posición de cada uno de los nucleótidos de la secuencia
de interés (cromatograma).
El proceso de secuenciación se hace en seis pasos. Primero se prepara la secuencia de interés o
templado de la reacción de secuencia. Esto consiste en la amplificación de la misma vía PCR. Una
vez culminado el PCR la secuencia debe ser limpiada para eliminar los restos de primer y posibles
inhibidores de la reacción de secuencia. Es recomendable mirar el producto de PCR antes de la
limpieza y hacerlo migrar unos tres dedos en un gel de agarosa, para estar seguros de que la
secuencia no presenta dobles bandas ni barridos. Si este es el caso, es necesario aislar la banda de
interés del gel y limpiarla.
El segundo paso es la cuantificación del producto de PCR limpio. La reacción de secuencia es muy
sensible a la concentración del ADN templado, grandes cantidades inhiben la reacción (los
reactivos se consumen rápidamente, como resultado se obtienen secuencias truncadas) y las
pequeñas cantidades generan intensidades de luz pequeñas que pueden ser confundidas con el
ruido de fondo. Adicionalmente se tiene establecida la cantidad de ADN templado para varios
tipos y tamaños de secuencias (ver tabla 1).
El tercer paso es la reacción de secuencia. Esta consiste en el copiado de la secuencia patrón, no es
una amplificación de la secuencia como en el caso de la PCR, de allí que la concentración del ADN
inicial sea tan restrictiva. La reacción de secuencia necesita de la hebra molde, uno solo de los
primers (la inclusión de los dos primers genera dos secuencias superpuestas ilegibles), una enzima
polimerasa de ADN, el cofactor de la enzima MgCl2, una solución tampón (buffer), los cuatro
desoxinucleotidos (dNTPs) y los cuatro didesoxinucleotidos marcados (ddNTPs). Generalmente los
kit de secuenciación traen una solución con la mezcla adecuada de dNTPs, ddNTPs, la enzima y el
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MgCl2. En nuestro caso, utilizamos el kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied
Biosystems) y la mezcla de reactivos de denomina Terminator Ready Reaction mix o Big Dye. La
reacción de secuencia se lleva a cabo en un termociclador donde se repite un programa de
extensión que consta de, un paso de desnatulalización de la secuencia de ADN a 96°C, uno para el
anhealing de la secuencia a una temperatura de 50°C y el de la extensión de la secuencia a 60°C.
Tabla 1: Cantidad de ADN templado para una reacción de secuencia, dependiendo del tipo y
tamaño de la secuencia de interés.
Tipo de Templado
Tamaño de templado (pb)
Cantidad de ADN inicial (ng)
Producto de PCR
100-200
200-500
500-1000
1000-2000
>2000
1-3
3-10
5-20
10-40
40-100
50-100
200-500
500-1000
2000-3000
ADN de hebra simple
ADN de doble hebra
Cósmidos/BAC
ADN genómico bacteriano
El cuarto paso es la precipitación de la reacción de secuencia. En este se eliminan los reactivos
sobrantes de la reacción y otras moléculas que puedan interferir en la lectura del secuenciador.
Existen varios métodos de precipitación de la secuencia, aquí se muestran dos de ello uno basado
en etanol e isopropanol y otro donde se utilizan perlitas magnéticas para capturar el ADN.
El quinto paso es la resuspensión de la secuencia marcada en formamida de alta pureza
(Formamida Hi-Di).
Finalmente el último paso consiste en el montaje de la muestra en el equipo de secuenciación.
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1. Protocolo para PCR
1. 1Materiales
- Termociclador
-Tubos de 1,5ml
-Tubos de y 0,2ml
-Pipetas de 0.2-2uL, 2-20uL y de 20-200uL
-Guantes de látex sin polvo.
1.2 Reactivos
- Taq polimerasa de alta fidelidad de copia
- Buffer 10X de la reacción de secuencia
-MgCl2
-Primer Forward y Reverse
-dNTPs
-Agua MilliQ
1.3 Preparación de la reacción de PCR
Reactivo
Concentración en el stock
Buffer
MgCl2
dNTPs
Primer F y R (para cada uno)
Taq polimerasa
ADN total
Agua
10X
25mM
20mM (cada uno a 5mM)
10uM
5ng/uL
Concentración o cantidad en
una reacción
1X
3mM
0.4mM
0.5uM
1U
5ng
Nota: La reacción se prepara en un volumen final de 10uL. Se recomienda tener alícuotas de los
reactivos y servir de ultima la enzima.
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1.4 Protocolo
1) Preparar la mezcla de reactivos de la PCR sin incluir el ADN total en un tubo de 0,2ml. Si va
preparar varias reacciones a la vez, utilice un tubo de 1,5ml para hacer la mezcla. Prepare una
reacción adicional por cada 10 muestras a amplificar. Esto es para no quedarse corto cuando
reparta la mezcla.
2) Alicuotar el ADN en un tubo de PCR de 0.2ml. Si solo está amplificando una muestra agregue el
ADN al tubo donde está la mezcla.
3) Amplificar la muestra en el termociclador utilizando uno de los siguientes programas:
a) PCR común
b) PCR touch down
Nota: El programa de PCR Touch down es un programa de amplificación doble, que sirve para
eliminar amplificaciones inespecíficas. Este consta de ciclos de amplificación selectiva al principio
y de amplificaciones laxa después, lo que se consigue variando la temperatura de anhealing.
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4) almacenar a -20°C hasta su uso
1.5 Resultados
El resultado ideal de una PCR es un producto relativamente limpio de primers, altamente
concentrado (100ng/uL en adelante) y sin amplificaciones inespecíficas. Este resultado se puede
logar estandarizando la reacción de PCR y el programa de amplificación. La optimización de la
reacción se hace variando la concentración de MgCl2, la cantidad inicial de ADN templado y la de
la enzima. Mientras que la optimización del programa de amplificación consiste en la modificación
de la temperatura de anhealing (aumentando la temperatura mejora la especificidad de la enzima
por la secuencia de ADN) y el tiempo de extensión de la cadena (debe ser más larga para las
secuencias grandes). En ocasiones la optimización de la PCR no se logra con facilidad a pesar de
jugar con las condiciones mencionadas. Cuando esto ocurre generalmente se debe al diseño
inadecuado de primers, en ese caso lo mejor es diseñar unos nuevos y estandarizar la PCR con
estos.
Figura 3: Productos de PCR de una secuencia del gen COI en mariposas, vistos en un gel de
agarosa al 1,2% teñido con Syber Safe. A. Producto de PCR con una cantidad de primer excesiva
(mancha en la parte inferior de la columna) B. y C. Producto de PCR con una amplificación
inespecífica (banda doble) D. Producto de PCR con una amplificación baja.
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2. Reacción de secuencia
2.1 Materiales
- Termociclador
-Tubos de 1,5ml
-Tubos de y 0,2ml
-Pipetas de 0.2-2uL, 2-20uL y de 20-200uL
-Guantes de látex sin polvo.
2.2 Reactivos
- Big Dye Terminator v3.1 (del kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems))
- Buffer 5X de la reacción de secuencia (del kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied
Biosystems))
-Producto de PCR
-Primer Forward o Reverse
-Agua MilliQ
2.3 Preparación de la reacción de secuencia
Reactivo
Terminator ready
reaction mix (Big Dye)
Buffer del kit
Primer F ó R
Producto de PCR
Agua
Concentración
inicial
Concentración en
la reacción
-
Cantidad para una
reacción (uL)
0,5
5X
10uM
-
1X
2,0
0,2
Completar el
volumen
Nota: La reacción se prepara en un volumen final de 10uL. Se recomienda tener alícuotas de los
reactivos de secuencia. El Big Dye es sensible a la luz y el calor, almacenarlo en recipiente oscuro y
descongelar al cuando se vaya a terminar la reacción de secuencia.
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2.4 Protocolo
1) Hacer la mezcla de la reacción de secuencia en un tubo de 0,2uL.
2) Correr la reacción de secuencia en un termociclador siguiendo este programa de elongación.
Nota: El tiempo de cambio entre temperaturas (rampa del termociclador) debe ser de 1°C por
segundo. Si se utiliza el Big Dye diluido y/o la secuencia es grande (800pb en adelante) debe
utilizarse un número de ciclos elevado, 40 ciclos. Si la secuencia de interés es pequeña (300pb) con
20 ciclos es suficiente.
3. Limpieza de la reacción de secuencia
3.1 Protocolo con etanol e isopropanol
3.1.1 Materiales
-Pipetas de 2-20uL, de 20-200uL
-Plancha de calentamiento
- Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que alcance 14000 rpm
- Vortex
-Tubos de 1,5ml
-Guantes de látex sin polvo.
3.1.2 Reactivos
-Isopropanol al 65%
-Etanol al 60%
-Formamida Hi-Di
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3.1.3 Protocolo
Para una reacción de secuencia en un volumen de 10ul.
1) Agregar al tubo con la reacción de secuencia 40uL de isopropanlo al 65% y transferir a un tubo
nuevo de 1,5mL.
2) Mezclar vigorosamente (vortex).
3) Dar un spin.
4) Guardar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min.
5) Centrifugar a 14000 rpm durante 25 minutos, a temperatura ambiente.
6) Remover el isopropanol por inversión del tubo.
7) Agregar 100uL de etanol al 60%
8) Mezclar vogorosamente (vortex)
9) Centrifugar a 14000 rpm durante 5 min.
10) Secar la muestra en una plancha de calentamiento a 60ªC durante 10 min.
11) Resuspender en 10uL de Formamida Hi-Di. La formamida debe estar fuera de la nevera 10 min
antes de ser utilizada para evitar la incorporación de cristales en la muestra.
3.1.4 Resultados obtenidos con este método de limpieza
El resultado de la limpieza de las secuencias con este método es variable. Generalmente se
observan picos de emisión luz a través del electroferograma correspondientes a rastros de etanol
en la muestra. Este problema puede ser corregido secando muy bien la muestra antes de
resuspenderla en la formamida. Adicionalmente se pierden un buen número de bases al inicio de
la secuencia contrariamente a lo que se obtiene utilizando el método de Magnesil Green
(Promega).
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Figura 3: Electroferograma de una secuencia del gen COI de mariposas que presenta rastros de etanol.
3.2 Protocolo con Magnesil Green de Promega
3.2.1 Materiales
-Pipetas de 2-20uL, de 20-200uL
-Plancha de calentamiento
- Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que alcance 14000 rpm
- Vortex
-Tubos de 1,5ml
-Magneto
3.2.2 Reactivos
-Magnesil Green (Promega)
-Formamida Hi-Di
3.2.3 Protocolo
Para una reacción de secuencia en un volumen de 10ul.
1) En un tubo de 1,5mL mezclar el producto de secuenciación con 90uL de Magnesil Green.
2) Mezclar con pipeta.
3) Almacenar en la oscuridad a temperatura ambiente por 10min.
4) Poner tubo en el magneto.
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5) Retirar el sobrenadante con pipeta sin llevarse las perlitas de metal.
6) Retirar el tubo del magneto.
7) Agregar al tubo 90uL de etanol al 90%.
8) Mezclar vigorosamente (vortex).
9) Esperar 5 min.
10) Poner el tubo en el magneto y retirar el sobrenadante con pipeta.
11) Repetir el lavado con etanol, pasos 7 a 10.
12) Retirar tubo del magneto e incubarlo a 65ªC por 10min.
13) Resuspender en 15uL de formamida Hi-Di. La formamida debe estar fuera de la nevera 10 min
antes de ser utilizada para evitar la incorporación de cristales en la muestra.
14) Dejara a temperatura ambiente por 10 min.
15) Poner tubo en magneto y recuperar 13uL del liquido. Esto evita llevarse las perlas magnéticas.
Figura 4: A. Magneto B. Magnesil Green cuando se ha agitado y después de ponerlo en el magneto. Observe
como las perlitas magnéticas de la solución (marrón oscuro) se congregan al ser colocadas en el magneto.
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3.2.4 Resultados obtenidos con este método de limpieza
En general las secuencias que se limpian con este método son muy buenas. Generalmente no se
observan picos de emisiones de luz a través del electroferograma. Adicionalmente la secuencia
puede empezar a ser leída mas cercanamente del extremo del primer, es decir que se pierden
menos bases al inicio de la secuencia.
4. Corrida en el secuenciador
4.1 Materiales
-Secuenciador automático. En este caso se emplea el 3130 Genetic Analyser de Applied
Biosystems.
-Placa de 96 pozos adaptada al secuenciador.
-Cubre placa de 96 pozos.
-Termociclador.
-Pipetas de 2-20uL, de 20-200uL.
-Guantes de látex sin polvo.
4.2 Reactivos
-Buffer de corrida
-Agua MilliQ
-Polímero POP7
-Formamida Hi-Di
4.3 Protocolo
La corrida de las muestras en el secuenciador se hace en tres pasos. El primero consiste en la
preparación de las muestras (desnaturalización del ADN y montaje en la placa de corrida), el
segundo en la preparación del archivo con las condiciones de corrida y el último en el montaje de
las muestras en el equipo y la corrida en sí. Siempre debe verificar el nivel de polímero, buffer y
agua de los compartimientos del equipo destinados para ello antes de empezar a secuenciar.
1) Una vez resuspendida la muestra en formamida Hi-Di, pasarla a la placa de corrida del
secuenciador. Es importante que no queden burbujas en el pozo ni tampoco gotas en las paredes,
las primeras introducen aire a los capilares y las segundas generar puentes eléctricos ocasionando
cortos en el equipo.
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2) Desnaturalice la muestra en el termociclador a 94°C por 2 min y llévela a 4°C hasta su uso. No
utilice hielo para el enfriamiento, las gotas de agua en las afueras de la placa generan puentes
eléctricos.
3) Prepare el archivo con los parámetros de corrida de la muestra. Esto consiste en nombrar la
muestra, ubicarla dentro de la placa de secuenciación, indicarle al equipo con que velocidad se va
a hacer la corrida de la muestra, cuánto tiempo se va a tardar en inyectarla, que tipo de marcaje
fluorescente lleva la muestra y si esta contiene un marcador de tamaño molecular (esto para el
caso de microsatélites). Esto se hace en la ventana Plate Manager.
4) Saque la bandeja del secuenciador presionando el botón Tray.
5) Abra la puerta del secuenciador y monte la placa en él. Verifique que esta tenga la tapa bien
puesta y que esté al mismo nivel de los tanques de agua y buffer. Cierre la puerta del
secuenciador.
5) Asocie la placa con el archivo de parámetro de corrida en la ventana Run Scheduler. Esto se hace
seleccionando la planilla y después la placa.
6) Dele inicio a la corrida presionando el icono de la flecha verde en la ventana Run View.
7) Puede monitorear la corrida a través de la ventana Status.
Para una explicación más detallada de los pasos a seguir consulte la guía de Preparación del ABI
3130 para electroforesis adjunta.
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