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Revista Computadorizada de Producción Porcina
Vol: 11 No. 1 2004
ESTUDIOS DE ELIMINACION DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS DE RESIDUALES
PORCINOS EN UN BIORREACTOR CON TIEMPO DE RETENCIÓN CORTO
M.A. Oliva1, D. Velasco2, L.M.C. Ventura2, E.J. Ballinas1, M.L. Salvador1,
Dendooven3 y F.A. Gutiérrez1
1
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
Universidad Autónoma de Chiapas
Carretera Ejido Emiliano Zapata km 8 Tuxtla Gutiérrez
Chiapas, México
2
3
Departamento de Investigación y Posgrado
Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez
Chiapas, México
Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN
Chiapas, México
RESUMEN
Se estudiaron variables de operación de un biorreactor tubular en condiciones experimentales
(dimensiones, 68.58 cm de largo y 15.24 cm de diámetro), y se utilizó un diseño experimental
completamente aleatorio, con un arreglo factorial 2x2x2 con tres réplicas por tratamiento. Los
factores fueron el aislamiento térmico del reactor (aislado o no)., la velocidad de agitación (0 y 0.6
rpm) y la hermeticidad (abierto o cerrado). Para un estudio de la cinética, se realizaron mediciones
de pH y temperatura a los siguientes tiempos: 0, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 23 hr. Los residuales
porcinos se mezclaron con rastrojo de sorgo, melaza, suero de leche y agua (MS promedio inicial,
21.2%).
La desaparición de organismos patógenos (Salmonella spp, Shigella spp y Escherichia coli) tuvo
lugar entre 16 y 23 hr en todos los tratamientos (conteo mínimo en el tiempo cero, 10-6 UFC/mL), y
los mejores tratamientos fueron cuando la fermentación ocurrió en condiciones abiertas y con
agitación, sin necesidad de aislamiento térmico. El tiempo mínimo para alcanzar un pH de 4.0 fue
de 16 hr. La calidad nutricional de la mezcla con residuales porcinos también influenciaron las
condiciones del proceso. El contenido promedio proteico (Nx6.25) de la mezcla fermentada fue un
10% más que el valor inicial, al pasar de 11.7 a 15.0% en base seca (P<0.05). No hubo cambios
en la concentración final de MS (21.7%).
Se sugiere que mediante un biorreactor tubular con un tiempo de retención corto, no es necesario
el aislamiento térmico para la eliminación de microorganismos patógenos, y las mejores
condiciones de trabajo son mediante la operación del reactor abierto y con agitación.
Palabras claves: residuales porcinos, eliminación de patógenos, bioreactor tubular
Título corto: Eliminación de coliformes patógenos de excretas porcinas en un biorreactor tubular
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Revista Computadorizada de Producción Porcina
Vol: 11 No. 1 2004
STUDIES OF PATHOGENIC MICROORGANISMS ELIMINATION FROM SWINE WASTES BY
USING A SHORT RETENTION TIME BIORREACTOR
SUMMARY
Different operation variables in a tubular bioreactor (dimensions, 68.58 cm length x 14.24 cm
diameter) were studied. An experimental design with a factorial arrangement 2x2x2 and three
replications per treatment was used. The factors were thermal isolation (isolated or not), speed of
agitation (0 and 0.6 rpm) and hermetic status (open or closed). The kinetics of reaction was
studied by pH measurements at 0, 10, 12, 14, 16, 18, 20 and 23 hr. Pig wastes were mixed with
sorghum straw, sugar cane molasses, whey and water (average initial DM, 21.2%).
It was found a complete disappearance of pathogen organisms (Salmonella spp, Shigella spp and
Escherichia coli) between 16 and 23 hr (minimum count at zero time, 10-6 UFC/mL) and the best
treatments were in open conditions with agitation and not thermal isolation. The minimum time to
reach pH values was 16 hr. The nutritional quality of the mixture had influence on the process of
fermentation. The crude protein (Nx6.25) content of the fermented mixture was 10% higher
(P<0.05) than the original value (from 11.7 to 15.0% in dry basis). There was no changes in final
content of DM (21.2%).
It is suggested that thermal isolation is not necessary for pathogenic microorganisms in a tubular
bioreactor with a short retention time, and the other best parameters are by operating in open
conditions and with agitation.
Key words: Swine waste, pathogen elimination, tubular bioreactor
Short Title: Elimination of pathogenic coliforms from swine waste in a tubular bioreactor
INTRODUCCION
Los desechos de las granjas porcícolas contienen nutrientes que se pueden usar para alimentar
vegetales o animales. Sin embargo, un riesgo inherente en los sistemas de reciclado es la
posibilidad de transmisión de microorganismos patógenos. Se ha demostrado que el ensilado de
las excretas es un método efectivo para eliminar bacterias coliformes fecales (McCaskey y
Anthony 1975; Knight et al 1977), así como para disminuir la sobrevivencia de coccidios
provenientes de los bovinos. Este proceso también reduce los riesgos de transmisión de
micobacterias en las raciones formuladas con estiércol de bovinos (McCaskey y Schehane 1980).
En el proceso del ensilado, las bacterias lácticas utilizan los nutrientes que se encuentran en las
excretas para crecer y para producir ácido láctico y pequeñas cantidades de ácido propiónico y
ácido butírico (Knight et al 1977). A medida que se producen los ácidos, el pH disminuye a valores
menores que 4.5 y esto es el factor principal de la antibiosis que ocurre en el proceso del ensilado
(McCaskey y Anthony 1979). Se ha informado que el tiempo en el cual las mezclas ensiladas
alcanzan valores de pH menores que 4.5 es variable y que depende del porcentaje de humedad
de las excretas, de los ingredientes que se le adicionen para fermentar las excretas y de factores
operativos del proceso del ensilado. Soria et al (2001) encontraron tiempos de 50 días para la
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eliminación de coliformes fecales en las excretas de cerdo con alto contenido de agua y en un
proceso del tipo de lagunas de oxidación.
Para propósitos prácticos, los tiempos arriba mencionados son muy largos para implementarse en
las granjas porcícolas. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar las condiciones de
operación de un biorreactor tubular para la eliminación de las bacterias patógenas presentes en
las excretas de cerdo en tiempos más cortos que los informados habitualmente.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseňo experimental
Se estudiaron variables de operación de un biorreactor tubular en condiciones experimentales de
laboratorio, se utilizó un diseño experimental completamente aleatorio, con un arreglo factorial
2x2x2 con tres réplicas por tratamiento. Los factores fueron el aislamiento térmico del reactor
(aislado o no)., la velocidad de agitación (0 y 0.6 rpm) y la hermeticidad (abierto o cerrado). Para
un estudio de la cinética del proceso fermentativo, se realizaron mediciones de pH y temperatura
a los siguientes tiempos: 0, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 23 hr. Los residuales porcinos se mezclaron
con rastrojo de sorgo, melaza y suero de leche.
Preparación de las excretas
Los sólidos de excretas de cerdo se obtuvieron en la granja “Mundet”, ubicada en el municipio de
Suchiapa, Chiapas, sur de México. Este municipio está situado en la región central del Estado de
Chiapas. La granja tiene 300 cerdos en promedio. Los cerdos se crían entre 25 y 105 kg de peso
y se mantienen con dietas basadas en sorgo y un complemento vitamínico y mineral. Se eligió
esta granja debido a que las instalaciones, la prevención de enfermedades y la alimentación
tienen un grado de tecnificación por encima del promedio de las granjas que se encuentran en
Chiapas.
La recolección de las excretas se hizo directamente de los encierros o corrales, antes de aplicar
agua, con la finalidad de no incrementar la humedad. Las excretas se mezclaron con rastrojo de
sorgo para obtener el contenido de humedad deseado. A partir de investigaciones realizadas por
Hrubant et al (1978) y Sutton et al (1987), se eligió rastrojo de sorgo (y/o rastrojo de maíz) como
sustrato sólido para facilitar la fermentación y fue proporcionado por el mismo propietario de la
granja “Mundet”. Este rastrojo fue molido usando un molino de martillos y se hidrató con agua (1.4
L de agua por cada kg de rastrojo molido). La melaza fue la fuente principal del carbono, con una
densidad de 1.4 g/mL, y se obtuvo de la Unión Ganadera Local (Suchiapa). Esta melaza provenía
del ingenio azucarero “La Fé”, ubicado en el municipio de Venustiano Carranza, Chiapas. El suero
de leche fue adquirido de la misma granja cuidando que fuera obtenido el mismo día.
El medio de cultivo se preparó de acuerdo con las indicaciones para preparar un medio no selectivo
para el cultivo de bacterias del rumen (Church 1974), al adicionar 5.00 g de azúcar; 0.50 g de
almidón de yuca; 7.00 g de sal mineral; 200.00 mL de suero de leche y agua destilada para ajustar
a un volumen total de 1 L. La mezcla a fermentar se preparó con melaza, cerdaza y rastrojo de
sorgo (15: 59: 26).La preparación del inóculo se realizó en tres etapas. En la primera etapa, se
pesaron 10 g de cerdaza, a la que se le adicionaron 90 mL del medio de cultivo descrito con
anterioridad y se dejó incubando a temperatura ambiente durante 27 horas. En la siguiente etapa,
se utilizaron 80 mL del inóculo obtenido en la etapa 1, y se aňadieron 504 mL del medio de cultivo,
más 216 g de la mezcla a fermentar, para incubarla a continuación a temperatura ambiente durante
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27 horas. En la tercera etapa, se usaron 2160 mL del medio de cultivo, 5040 g de la mezcla a
fermentar y se le adicionaron 800 mL del inóculo obtenido en la segunda etapa.
Construcción y operación del fermentador
El fermentador piloto se construyó de PVC, y sus dimensiones fueron de 68.58 cm de largo y
15.24 cm de diámetro. Este biodigestor constaba de dos puertas localizadas en los extremos
que permitían el paso de la mezcla excretas-rastrojo a través del fermentador. La mezcla a
fermentar, ocupó 2/3 del volumen del fermentador. El fermentador funcionó sobre ruedas
ancladas a flechas impulsoras en paralelo, y se emplearon 3 juegos de poleas con su respectiva
banda para ajustar a la velocidad deseada. La potencia de la flecha la proporcionó un motor de
velocidad variable con una potencia de 1/8 hp.
Análisis químicos y microbiológicos
Se tomaron muestras de las materias primas y al producto de la fermentación para determinar el
contenido de humedad, proteína cruda (Nx6.25), extracto etéreo, fibra cruda, cenizas y extracto
libre de nitrógeno según procedimientos reconocidos (AOAC 1980). El valor de pH se determinó
por potenciometría mediante el uso de un electrodo de vidrio.
A 20 gramos del producto fermentado se le adicionaron 180 mL de agua para alcanzar una
proporción de 1:10. La mezcla se logró mediante un agitador Waring, durante 5 min. El filtrado se
usó para los análisis microbiológicos. El conteo en placa de las bacterias totales, de los hongos y
de los coliformes totales se estimaron en el filtrado obtenido en las determinaciones anteriores
mediante los siguientes medios de cultivo: agar-azul de metileno-eosina, agar-Shigella y
Salmonella y agar-McConkey.
Análisis biométrico
El análisis estadístico consistió en aplicar la técnica del análisis de varianza, utilizando el método
de Yates (Box et al 1979). La comparación de medias entre los tratamientos se realizó por el
método de Tukey con 0.05% de probabilidad. Se empleó el paquete estadístico del SAS (1985).
En el caso de la comparación de los índices químicos antes y después de la fermentación, se
efectuó por medio de pruebas de hipótesis de comparaciones apareadas, y se utilizó la prueba t
de Student en la que el nivel de significación aceptado fue el correspondiente a P<0.05. (Wayne
1992).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Status de los microorganismos patógenos
Los tratamientos 2 y 6 fueron los que promovieron la eliminación de los microorganismos
patógenos en un menor tiempo, es decir, 16 hr (tabla1). Estos tratamientos también fueron los
mejores porque promovieron un menor valor de pH en un tiempo más corto en comparación con
los demás tratamientos El análisis de varianza de los resultados demostró que ni la agitación ni la
interacción agitaciónxhermeticidad fueron significativas. Sin embargo, la hermeticidad en sí
produjo un efecto altamente significativo (P<0.01) en la eliminación de los organismos coliformes
patógenos. De acuerdo con la prueba de efectos fijos, el factor aislamiento no evidenció influencia
en el comportamiento de los tratamientos.
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Tabla 1. Efecto de distintos factores en el tiempo de desaparición de
microorganismos patógenos de excretas porcinas tratadas en un
un biodigestor tubular con tiempo de retención corto1
Aislamiento
Desaparicion de
Tratamiento
Agitación
Hermeticidad
térmico
coliformes, hr1
1
No
Abierto
No
20
2
Sí
Abierto
No
16
3
No
Cerrado
No
23
4
Sí
Cerrado
No
23
5
No
Abierto
Sí
20
6
Sí
Abierto
Sí
16
7
No
Cerrado
Sí
23
8
Sí
Cerrado
Sí
23
Sig
ns
P<0.01
ns
-
Los resultados obtenidos son lógicos, si se considera que estos factores influyen en la
concentración de oxígeno disuelto disponible para los microorganismos y que las bacterias
lácticas producen ácido láctico preferentemente en condiciones microaerofílicas. La característica
más importante utilizada para evaluar el éxito de un proceso de tratamiento de excretas es el pH
(Naugle et al 1980). Si se compara con otros estudios, el tiempo de 16 horas es el menor
informado hasta el momento. Por ejemplo, McCaskey y Shehane (1980) hallaron que el pH
disminuyó hasta por debajo de 4.5 después de 3 días de ensilado a 25º C. Estos autores
afirmaron que el pH fue el factor que influyó para lograr la antibiosis contra las micobacterias, las
cuales representan un reto, ya que estos organismos toleran un gran rango de valores de pH.
Weiner (1992) logró valores de pH de 5.01, 4.59 y 4.38 a las 48, 72 y 96 hr, respectivamente.
Cabe mencionar que a las 72 hr ya no se encontraron coliformes totales en mezclas de cerdaza y
maíz (Weiner 1980). Berger et al (1980), al usar harina de soya y de maíz, encontraron que a
medida que se aumentó la proporción de harina de maíz, disminuyó la concentración de
carbohidratos solubles, se incrementó la concentración de ácido láctico y disminuyó el pH en un
tiempo de ensilado de 40 días.
Se observó que la fermentación llevada a cabo en el biorreactor con operación a tanque abierto fue
la que promovió menores valores de pH en contraste con la llevada a cabo con el biorreactor
cerrado. La diferencia se observó desde las 10 hr del proceso fermentativo. Estos resultados indican
que la fermentación requiere condiciones microaerofílicas más que condiciones anaeróbicas. Este
resultado es interesante, debido a que la mayor parte de los estudios relativos al diseño de
reactores para el tratamiento de la cerdaza se han enfocado hacia el establecimiento de condiciones
anaeróbicas (Sweeten 1980). Por razones económicas, el nivel de oxígeno disuelto en el reactor
debe ser el mínimo necesario de tal manera que satisfaga los requerimientos para que se genere
suficiente actividad microbiana que permita lograr los objetivos del tratamiento. Al parecer, la
operación del reactor de forma abierta permitió que se lograran condiciones microaerofílicas. Estas
condiciones permitieron que se produjera mayor concentración de ácidos orgánicos, los cuales a su
vez provocaron la disminución del pH con mayor rapidez que con las condiciones anaeróbicas, con
el reactor cerrado.
Se encontró que la agitación no tuvo una influencia significativa en el comportamiento del pH en la
fermentación. Sin embargo, la interacción con la hermeticidad si presentó diferencias
estadísticamente significativas (P<0.05). Esto pudiera explicarse con respecto con el intercambio
gaseoso dentro de la mezcla. Las condiciones de operación a tanque abierto permitieron que
existiera una aireación superficial a través de la superficie libre. Se ha estudiado con detalle la
transferencia de masa hacia adentro y hacia fuera de la película de líquido (Bailey y Ollis 1997).
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No obstante, hace falta todavía más información cuando se trata de explicar lo que sucede
cuando están presentes las células de los microorganismos, y además. se deben de incluir los
aspectos bioquímicos en el análisis. Evidentemente, los factores que determinan una diferencia
entre una actividad aeróbica y una anaeróbica dependen de la concentración de oxígeno dentro
de la mezcla a fermentar, del coeficiente de difusión de oxígeno, que depende en gran parte de la
viscosidad y densidad de la mezcla, y de la velocidad de respiración o de consumo del oxígeno
por los microorganismos.
De acuerdo con las condiciones experimentales que se probaron en el presente trabajo, la
apertura o no del bioreactor es el factor que permitió que hubieran diferencias en la concentración
de oxígeno disuelto en la mezcla a fermentar. La fermentación fue más adecuada cuando los
microorganismos tuvieron disponible oxígeno, aunque en cantidades limitadas, debido a que la
transferencia gaseosa sólo se realizó a través de la superficie de la mezcla a fermentar. Esta idea
se refuerza aún más por el hecho de que se encontró que la interacción tanque no-hermético y
agitación a 0.6 rpm fue significativa (P<0.05) al favorecer la disminución del pH, debido a que la
agitación permitió que el coeficiente de difusión de oxígeno fuera mayor, con lo que los
microorganismos tuvieron disponible más oxígeno disuelto, para que su metabolismo no lo
realizaran bajo condiciones de anaerobiosis.
En las condiciones en que se operó el biorreactor y las características de viscosidad y contenido
de sólidos de la mezcla a fermentar, lo más probable es que se hayan generado condiciones
microaerofílicas (Bailey y Ollis 1997). La disminución del pH se debe a la producción de ácidos
orgánicos, particularmente ácido láctico originado por bacterias lácticas. Como ilustración, pudiera
decirse que Burgos-Rubio (2000) encontró que el Lactobacillus bulgaricus, que anaeróbico
facultativo manifestó la mayor velocidad de crecimiento en condiciones microaerofílicas.
Análisis microbiológico de las excretas de cerdo
Antes de la fermentación, la mezcla contenía Escherichia coli (10.5x106 UFC/mL), Shigella y
Salmonella (2.5x106 UFC/mL) y de enterobacterias (8.4x106 UFC/mL). Después de la
fermentación no se encontró ninguna UFC de los tres tipos de microorganismos (tabla 2). Estos
resultados son importantes porque demuestran que se puede obtener cerdaza libre de
microorganismos patógenos en un tiempo corto de fermentación. El contenido microbiano de la
cerdaza permite obtener productos con mejor calidad; por ejemplo, si el uso es para fertilizar
plantas, se ha demostrado que la calidad del biofertilizante es baja cuando la cerdaza en forma de
composta, que contiene mayor carga microbiana. Esto se debe a que los microorganismos
inmobilizan y ayudan a retener el N en el suelo y como consecuencia disminuye la eficiencia de
asimilación de este elemento por las plantas. Particularmente en maíz, Choi et al (2001)
encontraron que la aplicación de composta de cerdaza aumentaba al doble la immobilización del
nitrógeno.
Tabla 2. Conteo de microorganismos patógenos al
comienzo y al final del proceso fermentativo en el
biorreactor tubular (en 10-6 UFC/mL)1
Microorganismo
Comienzo
Final
Enterobacterias
8.4
Ausencia
Escherichia coli spp
10.5
Ausencia
Shigella y Salmonella spp
2.5
Ausencia
1 Media de todos los tratamientos
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Análisis químico de las excretas de cerdo
Los cambios en el contenido de fibra cruda, extracto etéreo y proteína bruta fueron signicativos
(P<0.05) cuando se compararon los valores antes y después de la fermentación para todos los
tratamientos (tabla 3).. Si se comparan estos resultados con los de Iñiguez et al (1990a,b), es
evidente que existió coincidencia en el contenido de proteína bruta en condiciones iniciales pero
no en las finales. Iñiguez et al (1990a,b) obtuvieron en este caso valores de 12.1% mientras que
en el presente trabajo se obtuvo un valor superior (15.0%). Desde este punto de vista el proceso
fermentativo informado aquí fue más eficiente porque promovió la obtención de un producto con
mayor contenido de proteína. Con respecto al extracto etéreo, los valores hallados por Iñiguez et
al (1990a,b) fueron más bajos (3.13 %) que los obtenidos en este trabajo (13.91%). Un factor que
posiblemente influyó para esta diferencia fue que aquí se usó suero de leche y en el experimento
de Iñiguez et al (1990a,b), no. En cuanto al contenido de fibra cruda, no se observaron diferencias
significativas originadas durante la fermentación (7.3 % aquí, y 7.06 % de acuerdo con Iñiguez et
al 1989).
Tabla 3. Cambios en la composición química del sustrato
al comienzo y final del proceso fermentativo
(porciento en base seca)1
Indice
Comienzo
Final
Sig
Humedad
78.79 ± 1.45
78.27 ± 2.08
ns
MS
21.21 ± 0.65
21.73 ± 0.59
ns
Cenizas
16.56 ± 0.04
15.32 ± 0.72
ns
Fibra cruda
8.32 ± 0.57
7.06 ± 0.04
*
Extracto etéreo
12.05 ± 0.06
13.91 ± 0.03
*
ELN
51.37 ± 1.40
48.71 ± 1.40
ns
Nx6.25
11.70 ± 0.22
15.00 ± 0.59
*
1 Media y DE de todos los tratamientos
ns, no significativo; * P<0.05
El contenido de N que se encontró para la cerdaza fermentada con el proceso descrito en el
presente trabajo permite suponer su uso potencial para elaborar biofertilizantes específicos para
diversas plantas. En otros estudios anteriores, el poder fertilizante del producto final ha sido
evaluado bajo distintas condiciones experimentales (Choi et al 2002; Cooperband et al 2002). En
este caso, habrá que evaluar en invernaderos cuáles son las respuestas de las plantas a
diferentes niveles de aplicación de un producto, con características similares al obtenido en la
presente investigación. También es importante evaluar cómo son afectados los procesos químicos
del suelo, especificamente la dinámica de carbono y nitrógeno, fósforo, potasio, así como el pH, la
temperatura, los microorganismos benéficos del suelo y otros, para determinar los posibles
efectos adversos que pudiera tener la aplicación de la cerdaza fermentada en la cual se logró
disminuir el pH y el contenido microbiano en un periodo de tiempo corto.
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación fue financiada por el Sistema de Investigación Benito Juárez del Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología (SIBEJ-CONACYT), y correspondió al proyecto “Producción de
cerdaza para alimentación de rumiantes” (código 19990505006).
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