EfEcto dE bloquEo dE la forskolina , un activador dE la adEnilato

Efecto de bloqueo
de la forskolina, un activador
de la adenilato ciclasa, sobre
la corriente de potasio tipo
rectificador tardío
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ
Ricardo Duarte Jáquez
Rector
David Ramírez Perea
Secretario General
Manuel Loera de la Rosa
Secretario Académico
Daniel Constandse Cortez
Director del Instituto de Ciencias Biomédicas
Luis Enrique Gutiérrez Casas
Coordinador General de Investigación y Posgrado
Ramón Chavira Chavira
Director General de Difusión Cultural y Divulgación Científica
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ
Efecto de bloqueo
de la forskolina, un activador
de la adenilato ciclasa, sobre
la corriente de potasio tipo
rectificador tardío
Eduardo Iván Acosta Gómez
Ciencias de la Salud
Coordinación General de Investigación y Posgrado
Lisbeily Domínguez Ruvalcaba
Coordinadora de la colección
Acosta Gómez, Eduardo Iván.
Efecto de bloqueo de la forskolina, un activador de la adenilato ciclasa, sobre la corriente de potasio tipo rectificador tardío / Eduardo
Iván Acosta Gómez. Ciudad Juárez, Chih. : Universidad Autónoma de
Ciudad Juárez, 2013. (Colección Textos Universitarios, Serie Investigación)
32 p.; 30 cm.
Incluye bibliografía
Colección Reportes Técnicos de Investigación Isbn: 978-607-7953-80-7
Serie ICB, Vol. 11. isBn: 978-607-520-001-9
Contenido:
1.– Introducción. 2.– Planteamiento. 3.– Metodología. 4.– Resultados.
5.– Conclusiones.
D. R. © Acosta Gómez, Eduardo Iván.
La edición, diseño y producción editorial de este documento estuvo a cargo de la Dirección General de Difusión Cultural y Divulgación Científica, a través de la Subdirección
de Publicaciones.
Resumen
Palabras clave
Abstract
Keywords
Usuarios potenciales
Reconocimientos
Índice
7
8
9
10
10
10
I. Introducción
II. Planteamiento
III. Antecedentes y justificación
IV. Metodología
Cultivo celular
Registros electrofisiológicos
Tabla 1
17
18
19
V. Resultados
La forskolina suprime a la IKV y a la corriente de potasio
generada por las subunidades Kv2.1
Efecto dosis–dependiente de la forskolina sobre corrientes
generadas por las subunidades Kv2.1
Figura 1
Figura 2 La forskolina produce potenciales de acción de tipo
adaptativo dependiente de la frecuencia
Figura 3 21
22
22
23
24
25
V. Conclusiones
Referencias
29
Resumen
L
a función de comunicación celular con el entorno, se inicia con la percepción
del mensaje externo, función llevada a cabo por proteínas receptoras. Una
vez captado el estímulo, éste se traduce en un mensaje interno a través de
distintos mecanismos de señalización celular.
En la transducción de señales se investigan muchas moléculas naturales o sintéticas, muchas de ellas para ser usadas como instrumentos farmacológicos y con esto
poder manipular las cascadas de señalización que median una variedad de procesos
celulares. Sin embargo, algunos de estos compuestos podrían actuar recíprocamente
con otras proteínas celulares entre ellas los canales iónicos. Por ejemplo, parte central de este reporte es sobre la forskolina (7 beta-acetoxy-8, 13-epoxy-1 alfa, 6 beta,
9 alfa-trihidroxy-labd-14-ene-11-uno), derivado de una planta conocida como Coleus
forskholii y se ha utilizado durante siglos en la medicina hindú, debido a su capacidad
para actuar y activar de forma no hormonal sobre uno de los reguladores celular más
importante del cuerpo humano, el compuesto adenosin monofosfato cíclico (AMPc).
Como es bien sabido, este nucleótido es vital para el organismo, ya que actúa como segundo mensajero intracelular, activando o inhibiendo otras enzimas que desempeñan
un sin número de funciones específicas en las células de un organismo.
En este proyecto se llevó a cabo el estudio de la forskolina sobre el voltaje de la
membrana celular, denominada fijación de corriente. Así como su efecto sobre los
registros de la corriente de potasio tipo rectificador tardío, en neuronas del ganglio
cervical superior de rata y que es independiente de AMPc. Encontramos que la corriente de potasio tipo rectificador tardío denominada IKV, puede ser directamente
afectada, a lo cual se observó un bloqueo reversible de dicha corriente por la forskolina. A partir de estos datos obtuvimos una IC50= 32 μM. A pegado a lo anterior como
los canales de Kv2.1 contribuyen a generar la IKV, más lejos probamos el efecto de
forskolina en células humanas embrionarias de riñón (HEK-293) transfectadas con
la subunidad Kv2.1. También conjuntamente se evaluó el impacto de esta regulación
sobre el patrón de disparo que tiene lugar en este tipo de neuronas.
El bloqueo directo de canales de potasio por forskolina limita la utilidad de este
fármaco en estudios sobre la modulación de la liberación de neurotransmisor y excitabilidad neuronal.
7
8
Palabras clave:
Forskolina, Canales de Potasio, Neuronas simpáticas.
Efecto de bloqueo de la forskolina, un activador
de la adenilato ciclasa, sobre la corriente de potasio tipo rectificador tardío
Abstract
T
he function of cellular communication with the environment, begins with
the perception of the external message, function carried out by receptor proteins. Once the stimulus caught, this is translated in an internal message
across different mechanisms of cellular signaling.
In signal transduction research many natural or synthetic molecules are used as
pharmacological tools to manipulate the signaling pathways mediating a variety of
cellular processes. However, some of these compounds could be interacting with ion
channels. For example, a central part of this report is on the Forskolin effect (7 betaacetoxy-8, 13-epoxy-1 alpha, 6 beta, 9 alpha-trihidroxy-labd-14-ene-11-uno), derivative of a plant known as Coleus forskholii, that has been used for centuries in Hindu
medicine, due to its aptitude to act and activate in a not hormonal form one of the
most important cellular regulators of the human body, the compound cyclic adenosinmonophosfate (cAMP). It is well known that this nucleotide is vital for the organism,
since it acts as the second intracellular messenger, activating or disabling others
enzymes that recover many specific functions in the cells of an organism.
In this project I study the effect of the Forskolin on potassium current that is independent from cAMP, on the cell voltage, with current clamp. As well as its effect
on the record of potassium current, type late rectifier of the in neurons of the cervical
superior ganglion of rat. We found that the neuronal potassium current type late rectifier named, IKV, can be directly affected, observing a reversible blockage because
of Forskolin. From this data we obtained reduced both IKV and Kv2.1-mediated currents without a significant change in the steady-state activation curve of Kv2.1 channels. At 0 mV Forskolin reduced the current amplitude with an IC50 of 32 μM. To
plaster the previous data, the channels of Kv2.1 contribute to generate the IKV, beyond that we prove the Forskolin effect in human embryonic kidney cells (HEK-293)
transfected with the subunit Kv2.1. Also the impact of this regulation on the pattern
of shot that takes place in this type of neurons was evaluated.
The direct block of potassium channels by Forskolin limits the usefulness of this
drug in studies on modulation of neuroexcitability and neurotransmitter release.
9
10
Keywords:
Forskolin, K+ channels, sympathetic neurons.
Usuarios potenciales:
Alumnos de licenciatura y posgrado, farmacólogos, médicos.
Reconocimientos:
Primeramente a la UACJ–ICB por el apoyo de las instalaciones y equipo utilizado,
ya que sin esto no se hubiera podido llevar acabo ningún tipo de experimento. En segundo lugar al PROMEP, ya que por medio de éste se obtuvieron los reactivos y material consumible para poder llevar a cabo este proyecto. También un agradecimiento
muy especial al Dr. Humberto Cruzblanca Hernández, M. en C. Luis Ángel Chávez
y Q.F.B. Mario Morales Ávalos, de la Universidad de Colima, Centro Universitario
de Investigaciones Biomédicas, con el cual se colaboró en este proyecto y parte de los
resultados obtenidos se obtuvieron en dicha universidad. Y por último, a la médico
Edith Sandoval por su ayuda para la correcta traducción del abstract.
Efecto de bloqueo de la forskolina, un activador
de la adenilato ciclasa, sobre la corriente de potasio tipo rectificador tardío
I. Introducción
L
a función de comunicación celular con el entorno, se inicia con la percepción
del mensaje externo, función llevada a cabo por proteínas receptoras. Una
vez captado el estímulo, éste se traduce en un mensaje hacia dentro de la
célula, a través de distintos mecanismos de señalización celular. Estos mecanismos transmiten señales que resultan en la regulación de funciones celulares determinadas dependiendo los receptores membranales que reciben señales específicas
y llevan a la célula a seguir un mecanismo específico de señalización. Actualmente se
sabe que múltiples cascadas de señalización en una misma célula comparten numerosos componentes. Esta promiscuidad puede entenderse por el hecho de que todas
estas vías se encuentran interconectadas y con esto las respuestas pueden generarse
de forma más rápida y eficiente (Pujades, 2000). Comprender cómo la célula recibe y
coordina señales del entorno inmediato y de otras células del organismo, es esencial
para entender los procesos fisiológicos básicos celulares. Este conocimiento a nivel celular es indispensable para comprender como se regulan variables fisiológicas sistémicas como la presión arterial, la osmolaridad del plasma sanguíneo, la excitabilidad
del sistema nervioso entre otros.
La modulación de canales iónicos por la súper familia de receptores 7 dominios
transmembranales o acoplados a proteínas G es el principal mecanismo por el cual
se regula la excitabilidad neuronal. Éstos, una vez estimulados, disparan cascadas
de señalización, permitiendo a la célula responder estímulos externos. Sin embargo
no solo la modulación de proteínas o canales iónicos se lleva a cabo por receptores y
más aun por la gran familia de receptores acoplados a proteínas G. Si no también
por fármacos. Ejemplo de ello y parte central de este reporte es sobre la forskolina,
derivado de una planta conocida como y se ha utilizado durante siglos en la medicina
hindú, debido a su capacidad para actuar y activar de forma no hormonal sobre uno
de los reguladores celular más importante del cuerpo humano, el compuesto AMPc.
Como es bien sabido, este nucleótido es vital para el organismo, ya que actúa como segundo mensajero intracelular, activando o inhibiendo otras enzimas que desempeñan
funciones específicas en las células de un organismo. Sin embargo como en este caso
y de manera independiente de receptores puede llevar a tener efectos sobre algunos
elementos involucrados en las cascadas de señalización celular, produciendo otros
efectos no descritos aun.
11
II. Planteamiento
E
n la investigación de señales de transducción, muchas moléculas sintetizadas en nuestro organismo como moléculas o fármacos creados en laboratorios o sintetizados en la naturaleza, son usadas como herramientas
farmacológicas, lo anterior para la manipulación de vías de señalización
celular que se encuentran involucradas en un sinfín de procesos celulares. Por mencionar un ejemplo la forskolina (FSK), un activador de la adenilato ciclasa, inhibe, en
sistemas de expresión heterológo, canales de potasio (K+) clonados y que es independientemente de la síntesis de adenosin monofosfato (AMPc). Este último se sabe que
se ve incrementado por la acción de la adenilato ciclasa, siendo un segundo mensajero
por excelencia en la señalización intracelular y en la modulación de procesos fisiológicos. Sabiendo lo anterior y siendo que los canales de K+ son parte fundamental
en la repolarización de potenciales de acción en sistemas excitables y más aun, que
el bloqueo de estos canales iónicos pudieran ocasionar aumento o decremento de la
excitabilidad neuronal, esto se traduciría en un aumento o disminución en el número de potenciales de acción generados por un estímulo dado. Por tal motivo se hace
necesario investigar si la FSK tiene algún efecto sobre canales de K+ expresados en
sistemas de expresión homólogos y heterólogos, y que se encuentran involucrados en
el aumento de la excitabilidad celular de manera directa e independiente de AMPc.
Además de llevar a cabo el estudio de que por sí sola la FSK, tiene efecto directo sobre
los canales de potasio, pudiera estar influyendo en el comportamiento de las neuronas, y lo anterior se vería traducido con una disminución de potenciales de acción en
las neuronas del GCS un ganglio meramente simpático.
13
III. Antecedentes y justificacion
L
a modulación de canales de K+ es uno de los más importantes mecanismos
usados por receptores acoplados a proteínas G (GPCR), para regular la excitabilidad neuronal. Por mencionar alguno, en neuronas simpáticas de rata
del ganglio cervical superior (GSC) los receptores muscarínicos M1, Angiotensina II AT1 y Bradicinina B2, incrementan la probabilidad de disparo de potenciales de acción, a través de la inhibición de la corriente de potasio tipo M (IKM) (Delmas
y Brown, 2005). Los mecanismos usados por los GPCR para cerrar a los canales M
(Kv7.2/Kv7.3) son ya identificados. Se sabe que la depleción de los niveles de fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2) de la membrana celular es la señal usada por los receptores M1 y AT1 (Suh y cols., 2006; Winks y cols., 2005; Zaika y cols., 2006), y donde el
receptor B2 utiliza el complejo Ca-Calmodulina, como el mensajero inhibitorio de esta
corriente, del cual el Ca2+ es liberado desde cisternas de calcio sensitivas o sensibles a
Inositol trifosfato (IP3) (Cruzblanca y cols., 1998; Gamper y Shapiro, 2003).
Otras corrientes de K+ activadas por voltaje que contribuyen a regular la excitabilidad de las neuronas GSC incluyen: 1) la rápida activación e inactivación de la
corriente de K+ tipoAA (I); 2) otro tipo de IA pero con una inactivación lenta (IAS); 3) La
corriente de potasio tipo rectificador tardía (IKV), (Malin y Nerbonne, 2000). El relativo nivel de densidad de corriente de cada una de estas corrientes de K+ y su cinética,
da el tipo de patrón de disparo en las células del SCG. (Malin y Nerbonne, 2000, 2002;
Wang y McKinnon, 1995). Además hay diferencias sutiles a nivel molecular, que las
neuronas GSC expresan IA e IKV, este último es generado por canales homomericos
formados por Kv2.1 y Kv2.2, donde solo el Kv2.1 contribuye a la IKV, de tal motivo que
en estas células se expresan IA, IAS, IKV Malin y Nerbonne, 2002).
Los canales formados por Kv2.1 constituyen el mayor componente de la corriente
de K+ tipo rectificador tardío en globo pálido, hipocampo y neuronas corticales piramidales (Baranauskas y cols., 1999; Murakoshi y Trimmer, 1999). En estas neuronas
centrales los canales conformados por Kv2.1 preferentemente se localizan el cuerpo
celular y dendritas proximales (Hwang y cols., 1993; Misonou y cols., 2004), aquí regulan la excitabilidad somato-dendrítica dependiente de frecuencia (Du y cols., 2000).
En neuronas del GCS, agonistas muscarínicos y Angiotensina II incrementan la IKV e
inhiben a la corriente de potasio tipo M (IKM), siendo estas al parecer fundamentales
15
16
para la estabilización de potenciales de acción de manera tónica (Malin y Nerbonne,
2002; Acosta y cols., 2007; Cruzblanca, 2006), sin embargo, el impacto de esta regulación por receptores acoplados a proteínas G o fármacos sobre estos canales involucrados en la generación de disparos o potenciales de acción repetitivos, no han sido bien
entendidos y estudiados.
En la investigación de señales de transducción involucradas en procesos fisiológicos
comúnmente son usadas herramientas farmacológicas para encontrar la naturaleza de
las vías de señalización que subyacen diferentes procesos celulares (Nahorski, 2006).
Por ejemplo, la FSK es comúnmente usada como un activador de la adenilato ciclasa,
en el estudio de señales de señalización AMPc dependiente. Sin embargo evidencia reciente indica que la FSK puede tener acciones independientes de AMPc, sobre receptores nicotínicos a acetilcolina y corrientes de K+ rectificador tardío (Garber y cols., 1990;
Hoshi y cols., 1988; Wagoner y Pallota, 1988). Recientemente se ha encontrado en células HEK-293 que la FSK bloquea canales formados por las subunidades de K+, Kv1.1
(Un tipo de rectificador tardío) y Kv1.4 (un tipo IA) (Matthias y cols., 2002), así como recientemente se ha encontrado que bloquea a un canal de K+ activado por sodio (Nuwer
y cols., 2009). A pesar de la creciente evidencia que revela, que diferentes subunidades
de Kv son directamente blanco por la FSK, no hay ningún estudio complementario,
donde se explore el impacto de la FSK sobre el bloqueo de canales de K+ que participan
en la excitabilidad neuronal. Esto nos hace preguntarnos si la corriente de K+ tipo rectificador tardío, siendo esta muy importante para el establecimiento de potenciales de
acción de manera tónica (Malin y Nerbonne 2002), puede ser directamente afectada por
la FSK, además si esto a su vez tiene un impacto en la regulación de disparos de espiga
repetitivos en neuronas GSC de rata en cultivo primario.
Efecto de bloqueo de la forskolina, un activador
de la adenilato ciclasa, sobre la corriente de potasio tipo rectificador tardío
IV. Metodología
Cultivo celular
Los experimentos se realizaron en neuronas del ganglio cervical superior, mantenidas en cultivo primario (rata Wistar, de 2-4 semanas de edad). Las ratas se anestesiaron con cloroformo y posteriormente se sacrificaron por decapitación, se disecaron
rápidamente ambos ganglios, los cuales se encuentran a nivel de la bifurcación de las
arterias carótidas. Una vez extraídos, los ganglios se limpian y se decapsulan cuidadosamente para evitar dañar a las neuronas contenidas en ellos. Con el fin de facilitar la
difusión de las enzimas durante la etapa de dispersión enzimática, se realizaron varios
cortes transversales del GCS. Las enzimas que se emplearan en la dispersión serán:
papaína (Roche; 20 U/ml), colagenasa (Sigma; 1.8 mg/ml) y dispasa II (Roche; 5 mg/ml),
disueltas en solución de Hanks modificada (Tabla 1); las soluciones se mantuvieron
frías y continuamente se oxigenaron hasta antes de su uso, ya que esto permite una
mayor sobrevivencia de las neuronas. Después de haber incubado con las enzimas, los
trozos de ganglio se pasaron repetidamente a través de pipetas Pasteur con puntas
pulidas al calor, con el fin de facilitar la disociación mecánica de las células. Una vez
lograda la disociación del tejido, las enzimas se diluyeron, añadiendo medio DMEM
(Dulbecco’s Modified Eagle Médium; GIBCO); la suspensión se centrifugó a 1500 rpm
durante 3 min. Posteriormente se resuspendieron las neuronas con sumo cuidado en
medio fresco conteniendo además 10% de suero bovino fetal (SFB), para la inactivación
total de las enzimas utilizadas en la dispersión celular. Más aun se centrifugó por segunda ocasión a 1500 rpm durante 3 min. Después, las neuronas fueron nuevamente
resuspendidas en una pequeña cantidad de volumen, para posteriormente ser sembradas en pedazos de vidrio (≈ 4 x 4 mm) tratados previamente con poli-lisina (500 ng/ml)
(SIGMA); se dejaron reposar durante 2 horas para que las células se adhieran al vidrio.
Después de este periodo a las neuronas se les adicionó DMEM + 10% SFB + una mezcla
de antibiótico y antimicótico (ver soluciones) y se incubaron por lo menos durante 8 h.
La incubación se llevara a cabo a 37oC y en una atmósfera de 5% CO2, hasta antes de
su empleo para los experimentos electrofisiológicos.
17
18
Para el mantenimiento de las células HEK-293 se mantuvieron en medio DMEM
conteniendo 5% de SFB inactivado al calor, con 0.2% de antibiótico/antimicótico, y en
una incubadora a 37 oC y en una atmósfera de 5% de CO2. Se recambió el mencionado
medio cada 3 días. Después de alcanzar aproximadamente un 70% de confluencia, las
células fueron transfectadas con el cDNA que codifica para la subunidad Kv2.1 de rata
(amablemente cedido por James S. Trimmer, Universidad de California, Davis, CA.
al Dr. Humberto Cruzblanca Hernández del Centro Universitario de Investigaciones
Biomédicas de la Universidad de Colima y con el cual se está colaborando en este proyecto) y utilizando lipofectamina (Invitrogen) acorde al procedimiento recomendado
por los fabricantes. Los plásmidos a transfectar contiene al Kv2.1 y la proteína verde
fluorescente (GFP) donde la co-transfección se hizo en un radio 5:1 respectivamente.
Al día siguiente de haber transfectado las células se sembraron en pedacitos de vidrio
y se llevó a cabo el posterior registro de 5–24 horas después. Cabe mencionar que esta
parte se hará en colaboración con el Dr. Humberto Cruzblanca Profesor Investigador
del Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Colima.
Registros electrofisiológicos
Para el registro de la IKV y la corriente generada por las subunidades Kv2.1, se
transfirió uno de los fragmentos de vidrio conteniendo neuronas o las células HEK-293
a una cámara de registro de capacidad de 200 μl y se bañaron con solución Ringer Normal (Tabla 1) a una tasa de 2.5 ml/min. La IKV se registró mediante la técnica de “patchclamp” en la configuración de “célula entera”, se utilizaron pipetas de vidrio con una
resistencia de 1 – 2 MΩ. Los registros se realizaron con el amplificador EPC10 (HEKA
elektronics). Para el registro de la IKV se bloquearon previamente las corrientes de Na+
y Ca2+ con 500 nM de Tetrodotoxina (TTX) y 200 μM de CdCl2, respectivamente, siendo
ésta la solución control (Tabla 1). La IKV se generó con pulsos comando despolarizantes
de 100 ms de duración, en el rango de - 50 a 0 mV (el voltaje de sujeción fue de -50 mV).
Antes de su adquisición a 5 KHz, la IKV se filtró a 1 kHz.
Para la medición de las corrientes de cola generadas por las corrientes mencionadas en el párrafo anterior, se midieron las diferencias entre el promedio de un segmento de 2 ms al principio de la corriente de cola y un promedio durante los últimos
5 ms del registro de la corriente.
Para el estudio de los potenciales de acción generados en las neuronas del GCS
en la configuración de célula completa con fijación de corriente se llevó a cabo con el
amplificador EPC-10 (HEKA electronics) y el software patch-master. La generación
de potenciales de acción se llevó a cabo con inyección de corriente (100 a 250 pA)
por 1.5 s y esta se filtro a 10 KHz. La estadística se llevó a cabo por promedios y
estos serán comparados buscando significancia con la prueba de “t Student” entre
dos grupos (p < 0.05).
Solución Antibiótico-Antimicótico (100X): Penicilina G sódica: 10.000 unida-
Efecto de bloqueo de la forskolina, un activador
de la adenilato ciclasa, sobre la corriente de potasio tipo rectificador tardío
des/ml, Sulfato de Estreptomicina 10.000 μg/ml y Anfotericina B 25 μg/ml en 0.85%
de solución salina.
Solución Interna estándar de la pipeta para el registro de la IKV y la corriente generada por las subunidades Kv2.1 (mM): KCl, 175; MgCl2, 5; HEPES,
5; Na2-ATP, 3; Na-GTP, 0.1; BAPTA, 0.1; Leupeptina, 0.08; pH 7.4 con KOH.
Los reactivos que se utilizaron son los siguientes: Colagenasa, poly-L-lisina, HEPES, Na-GTP, TTX y forskolina (SIGMA, St. Louis, MO); BAPTA (Molecular Probes,
Eugene, OR); papaína, dispasa II, leupeptina y K-ATP (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Alemania); DMEM, antibiótico/antimicótico, SFB y lipofectamina (GIBCO/Invitrogen Co, Carlsbad, CA).
Tabla 1
Reactivo
Hanks (mM)
Ringer (mM)
Control (mM)
NaCl
137
160
160
KCl
5.4
2.5
2.5
KH2PO4
0.44
-
-
NaH2PO4
0.34
-
-
HEPES
5
10
10
CaCl2
-
5
5
MgCl2
-
1
1
Glucosa
5
8
8
Tetrodo toxina
-
-
0.0005
Cd2+
-
-
0.1
7.4
7.4
7.4
EGTA
PH
V. Resultados
IV. Metodología
19
La forskolina suprime a la IKV y a la corriente
de potasio generada por las subunidades Kv2.1
E
n neuronas simpáticas de ganglio cervical superior la muscarina o angiotensina II incrementan a la IKV a través de una vía de señalización que es
insensible a la toxina pertussis (Cruazblanca 2006; Acosta y cols., 2007).
Para evaluar si la vía del AMPc se encuentra presenta en la modulación de
la IKV, las neuronas fueron expuestas a 20 μM de forskolina una concentración suficientemente alta para activar a la adenilato ciclasa (Sokolova y cols., 2006). Inesperadamente la FSK rápida y reversiblemente bloqueó a la IKV (Figura 1a), sugiriendo de
entrada un modo directo de acción del fármaco sobre los canales de potasio nativos,
que son responsables de generar la IKV. Por tal motivo decidimos seguir el estudio
de la FSK en células HEK-293, transfectadas con la subunidad Kv 2.1, debido a las
siguientes razones: a) los canales homoméricos formados por Kv2.1 en gran parte
contribuyen a generar la IKV neuronal (Malin y Nerbonne, 2002) y; b) Por otro lado
generar corrientes homoméricas, en sistemas de expresión homologo evita la contaminación de la corriente, por otros canales de potasio endógenos voltaje dependientes
y que se encuentran presentes dichos canales en neuronas GCS. Como se esperaba,
la FSK de manera reversible redujo la amplitud de la corriente de potasio tipo rectificador tardío, nativa en neuronas GCS y por las subunidades Kv2.1 en las células
HEK-293 (la Figura 1b).
a
b
1
1
2 nA
500 pA
2
2
1: Control
2: FSK
50 ms
21
tail current (nA)
20 μM
600
500
400
KV2.
tail current (pA)
700
lKV
300
0
50
100
150
25 μM
2.00
1.75
1.50
1.25
0
Time (s)
50
100
150
Time (s)
Figura 1. En a se muestra el efecto de la FSK 20 μM sobre la corriente IKV
nativa de las neuronas GCS, y en b el efecto de la FSK 25 μM sobre la corriente generada por las subunidades Kv2.1 en células HEK-293. Los trazos
representativos de las corrientes control (1) y el efecto de la FSK (2) sobre
estas (arriba), las líneas discontinuas muestran el nivel de corriente cero.
Cursos temporales del efecto de bloqueo de la FSK sobre las corrientes generadas IKV en neuronas e IKV en células HEK-293, cada 4 segundos (abajo).
Efecto dosis–dependiente de la forskolina sobre
corrientes generadas por las subunidades Kv2.1
Para evaluar el potencial bloqueo que tiene la FSK sobre los canales formados por
las subunidades Kv2.1, las células HEK-293 fueron bañadas por concentraciones crecientes en el rango de 1 – 100μM. La corriente de las subunidades Kv2.1, se genero con
un pulso comando de -50mV a 0mV durante 100 ms, el efecto de la FSK (1μM) (inserción de la Figura 2b) fue relativamente bajo. Así pues la FSK redujo la amplitud de la
corriente de cola de una manera dosis–dependiente (Figura 2a) en base a lo anterior
se obtuvo una concentración inhibitoria al 50%, IC50, de 32μM (Figure 2b) y donde el
máximo efecto de bloqueo de la corriente fue de 91 ± 2% (n = 9) con 100μM de FSK. Además de prácticamente suprimir la corriente de cola, esta concentración de FSK produjo
una visible corriente de inactivación observada durante los 100 ms de despolarización
(inserción en la Figura 2b).
a
3
KV2.1 tail current (nA)
22
1
FSK (μM)
25
100
2
1
Efecto de0 bloqueo de la forskolina,
un activador
100
150
200
0
50
de la adenilato ciclasa, sobre la corriente
de
potasio
tipo rectificador tardío
Time (s)
23
% Suppression of tail current
b
100
c
80
1
25
60
100
5 nA
50 ms
40
20
0
1
10
100
[Forskolin] (μM)
Figura 2: En a se aprecia el bloqueo en el tiempo de manera dosis–dependiente de la FSK 1μM (círculos vacíos), 25μM (triángulos vacíos) y 100μM
(cuadrados vacíos) sobre la amplitud de las corrientes de cola generadas en
células HEK-293. Se observa una curva dosis–respuesta para la obtención
de la IC50, la cual fue de 32μM, la línea es un ajuste de la ecuación de Hill
para así obtener el dato anterior (b). Dentro de b, también se puede apreciar
la corriente característica y generada por los Kv2.1 donde a una concentración de 100μM hay inactivación de esta. Las líneas discontinuas es el nivel
de corriente cero.
La forskolina produce potenciales de acción
de tipo adaptativo dependiente de la frecuencia
Las corrientes de potasio voltaje dependientes, tienen un papel determinante sobre
el patrón de disparo de las neuronas. Por ejemplo en las neuronas GCS la IKV contribuye en la fase tardía de la repolarización del potencial de acción y tiene un papel
significativo en la fase temprana de lo que se conoce como hiperpollarización, se ha
encontrado que la sobre expresión de la subunidad Kv2.1 promueve el disparo tónico
en las neuronas del GCS (Malin y Nerbonne, 2002; Marsh y Brown, 1991). Por lo tanto, nos interesó buscar si el efecto de la supresión de los canales Kv2.1 expresados en
células HEK-293, podrían reflejar algún efecto sobre las propiedades de disparo en las
neuronas del GCS. Sobre la base de respuesta a un estímulo por corriente depolari-
V. Resultados
24
zante, se ha visto que las neuronas GCS pueden ser clasificadas como fásicas (generan
solo uno o dos potenciales de acción), de adaptación (genera de tres a ocho potenciales
de acción) y tónico (por arriba de ocho potenciales de acción) (Jia y cols., 2008; Malin
y Nerbonne, 2000; Wang y McKinnon, 1995). Usamos solo células de tipo adaptativo
ya que son las más abundantes (54%) que las células tónicas (10%) (Jia y cols., 2008).
La figura 3 muestra la respuesta que tiene lugar en las neuronas al aplicar 150 pico
amperios (pA) de corriente depolarizante. Como era de esperase las células mostraron
la generación de potenciales de acción de tipo adaptativo, ya que generaron 8 potenciales de acción al principio de un estímulo de corriente de 1500 mili segundos (ms) de
duración. Sin embargo, en presencia de 100μM de FSK la generación de potenciales
de acción adaptativos fue incrementado, ya que las neuronas solo obtuvieron 2 potenciales de acción (Figura 3a). A concentraciones menores de FSK (35μM), las células del
GCS tienen también la tendencia a disparar menos, sin embargo, con las concentraciones más altas el efecto observado fue estadísticamente significativo, sobre una amplia
gama de corriente inyectada como estímulo (Figura 3b).
Efecto de bloqueo de la forskolina, un activador
de la adenilato ciclasa, sobre la corriente de potasio tipo rectificador tardío
a
Vm (mV)
Control
40
40
0
0
-40
-40
-80
-80
500 ms
b
FSK (35 μM)
20
15
# of spikes
# of spikes
FSK (100 μM)
20
15
10
5
0
25
FSK
10
5
100
150
200
250
0
Current (pA)
100
150
200
250
Current (pA)
Figura 3. Se aprecia en a, la generación de potenciales de acción gracias
a un estímulo de inyección de corriente de 150 pA antes y después de la
aplicación de FSK, con la técnica de Patch-Clamp en configuración de célula entera, fijación de corriente. Claramente se puede apreciar que en presencia de la FSK es considerablemente menor el número de potenciales de
acción. En b se muestra el promedio de los potenciales de acción generados
al estimular con una amplia gama de inyección de corriente depolarizante,
de manera control (barras negras) y al aplicar FSK (barras vacías) a 35μM (izquierda) y 100μM (derecha) en la misma célula. Los datos obtenidos fueron de
entre una n= 16 – 18 neuronas.
V. Resultados
L
V. Conclusiones
os resultados reportados aquí son que la FSK suprime las corrientes de potasio generadas por las subunidades Kv2.1 en células HEK-293, y donde en
neuronas simpáticas incrementan el número de las neuronas que disparan
de manera adaptativa. Se sugiere que la FSK bloquea canales formados por
las subunidades Kv2.1 por medio de un mecanismo de canal abierto lo anterior por
las siguientes razones: a) la FSK induce una moderada inactivación de la corriente
de potasio, observada a distintas concentraciones y de manera voltaje dependiente
(Figura 2). En resumen compuestos que producen bloqueo como es el caso de la FSK a
los canales Kv2.1, puede hacerlo a través de un bloqueo por canal abierto (Hille, 2001;
Kuo, 1998; Snyders y cols., 1992; Tytgat y cols., 1997). Pero cabe aclarar que esta
inferencia considerablemente se vería fortalecida con un estudio más a detalle de
las corrientes de cola generadas en las IKV en neuronas del GCS y sobre la corriente
generada por las subunidades Kv2.1 en las células HEK-293; esto en parte se llevará
a cabo en la segunda parte de este proyecto. En base a lo anterior evidencia cercana,
donde células PC12, demostraron que la FSK suprime una corriente de potasio tipo
rectificador tardío por un mecanismo de canal abierto, donde este fármaco se une a
los canales llamados Kz (Hoshi y cols., 1988; Wagoner and Pallota, 1988). La IC50
del bloqueo para los canales Kz fue de 19 μM, un valor el cual se encuentra cercano
del rango para la supresión de la corriente Kv2.1 (32 μM) en neuronas GCS. Otros
miembros de la familia de Kv se han identificado como blanco de la FSK, dentro de
estos incluye a los canales formados por Kv1.1 y los Kv1.4 (Matthias y cols., 2002).
Sin embargo comparando estos hallazgos con los canales Kv2.1, la FSK tiene un menor efecto para suprimir estas corrientes de potasio, porque los valores reportados de
la IC50 son <100μM y 245μM, respectivamente (Matthias y cols., 2002).
Por otro lado tenemos que el efecto más visible de la FSK sobre las neuronas
adaptativas del GCS es debido a: un incremento en la adaptación dependiente de la
frecuencia de los potenciales de acción y por ende un decremento en el número de
potenciales de acción en las neuronas GCS (Figura 3). El decremento en la excitabilidad por la FSK, probablemente no sea por bloqueo de canales de sodio, ya que se
ha reportado que este fármaco no tiene efecto sobre dichas corrientes (Hoshi y cols.,
1988), sin embargo cabe corroborar esta información en neuronas del GSC.
La FSK más bien podría estar actuando en la regulación de corrientes de potasio
27
28
que regulan el disparo repetitivo de las neuronas GCS, como serian además de la
IKV, la corriente de potasio tipo A (IA), la corriente M principalmente (IKM). Sin embargo a manera de comprobarlo, se sugiere que ni la IA ni la IKM son responsables
del cambio en el patrón de disparo de estas neuronas a adaptativas, lo anterior debido a: a) la supresión genética del Kv4.2, subunidad la cual en neuronas GCS genera
a la IA disminuye el porcentaje de células fásicas e incrementa la cantidad de células
adaptativas por lo tanto un efecto contrario a lo observado aquí (Malin y Nerbone,
2000), sin embargo aunque reduce IA, produce fenotipos de potenciales de acción
similares a los fásicos. b) El bloqueo de la IKM, ya sea por receptores acoplados a proteínas G o bloqueadores selectivos del canal M, promueven el disparo tónico en neuronas (Delmas y Brown, 2005; Zaika y cols., 2006), sin embargo ya que la FSK tiene al
parecer también efecto sobre los canales M, se hace necesario llevar a cabo un estudio
más a detalle sobre este efecto. Por tal motivo hasta aquí, pareciera que la evidencia
mostrará que la disminución de potenciales de acción es principalmente debida por
el bloqueo de canales Kv2.1 por qué: a) los canales Kv2.1 se activan sustancialmente
durante el potencial de acción (Malin y Nerbonne, 2002); b) en la adaptación de las
neuronas solo los canales Kv2.1 contribuyen a generar IKV (Malin y nerbonne, 2002);
c) el fenotipo de potenciales de acción fásicos, e inducidos por la FSK es de acuerdo
o va en el mismo sentido que el fenotipo tónico producido por una sobreexpresión
de canales Kv2.1 en neuronas GCS (Malin y Nerbonne, 2002). La disminución de la
probabilidad de disparo, merece sin lugar a duda una prueba experimental y análisis
más a detalle, sin embargo, se siguiere que el bloqueo de los canales Kv2.1 y tal vez
Kv2.2; ya que este último podría estar contribuyendo en la generación de la IKV. El
potencial de acción se hace más largo (Marsh y Brown, 1991) y el número de potenciales de acción gradualmente disminuyen probablemente favoreciendo la subsecuente
inactivación de canales de sodio.
El hecho es que la FSK fuertemente bloquea las corrientes Kv2.1 por un mecanismo totalmente independiente de las proteínas conocidas de transducción de señales,
limitando por ende la utilidad de estas moléculas en los estudios de corto y largo
plazo de la excitabilidad, especialmente en las neuronas que expresan este canal de
potasio formado por las subunidades Kv2.1 y posiblemente Kv2.2.
Efecto de bloqueo de la forskolina, un activador
de la adenilato ciclasa, sobre la corriente de potasio tipo rectificador tardío
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