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REBIOL Revista Científica de la Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú Vol 32, N° 1, Enero-Junio, 2012, pp. 24-103 Aislamiento y selección de bacterias nativas de rizobios fijadores de nitrógeno, a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris. Isolation and selection of rhizobia native bacteriae nitrogenfixing from Phaseolus vulgaris root nodules. Eva E. Villanueva Tarazona y Aníbal Quintana Díaz Departamento de Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú RESUMEN La presente investigación tuvo como objetivo aislar, seleccionar, y conservar bacterias nativas de rizobios a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris “frijol”, para lo cual se utilizó la metodología sugerida por Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y la de Somasegaran y Hoben, los cuales tienen en cuenta las características morfológicas, bioquímicas y metabólicas de los cultivos, lográndose aislar y seleccionar cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno de crecimiento rápido y lento con características similares a lo descrito en el manual de bergey's, que concuerdan con los géneros de Rhizobium y Bradyrhyzobium. Determinándose la predominancia de rizobacterias de crecimiento rápido pertenecientes al género Rhizobium en comparación con las de crecimiento lento del género Bradyrhyzobium. Posteriormente los cultivos obtenidos se conservaron por el método de subcultivos periódicos en refrigeración, ya que existe una potencial riqueza de rizobios cuya diversidad no ha sido aún estudiada con un potencial uso agronómico. Palabras clave: Rhizobium, Bradyrhyzobium, rizobios ABSTRACT The present study aimed to isolate, select, and retain native rhizobia bacteria from root nodules of Phaseolus vulgaris "bean", for which we used the methodology suggested by the International Center for Tropical Agriculture (CIAT) and the Somasegaran and Hoben, which take into account the morphological, biochemical and metabolic crop, achieving isolate and select crops native rhizobia nitrogen-fixing fast growing and slow with similar characteristics as described in Bergey's Manual's, consistent with the Rhizobium and Bradyrhyzobium genres. Determining the predominance of rapid growth rhizobacteria belonging to the genus Rhizobium compared with slow growing Bradyrhyzobium genus. Subsequently the cultures were maintained by periodic subculturing method refrigerated, since there is a wealth of potential diversity rhizobia which has not yet been studied with a potential agronomic use. Keywords: Rhizobium, Bradyrhyzobium, rhizobia INTRODUCCIÓN La necesidad de disminuir el uso de agroquímicos para aumentar las respuestas de la agricultura en la alimentación humana han orientado las investigaciones hacia el desarrollo de nuevas biotecnologías y en los últimos años ha habido un interés creciente en el estudio de los microorganismos fijadores de nitrógeno, que convierten el nitrógeno gaseoso a amonio mediante reacciones enzimáticas; esta es una característica exclusiva de procariontes y se encuentran distribuidas en muchos géneros de bacterias 1. Tales microorganismos pueden ser de vida libre o simbiótica como los del género Rhizobium que se REBIOL Revista Científica de la Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú Vol 32, N° 1, Enero-Junio, 2012, pp. 25-103 asocian a leguminosas esta asociación Rhizobium - Leguminosa contribuye entre 1/3 y un 1/2 del nitrógeno fijado de la atmósfera y se basa en el intercambio de carbono por nitrógeno entre ambos simbiontes2. Las leguminosas son ricas como fuente de proteínas tanto para la alimentación humana como para el ganado. La producción de plantas leguminosas depende en gran medida de la fijación de nitrógeno molecular que realiza en simbiosis con especies específicas de Rhizobium. Existen cerca de 19,000 especies de leguminosas2, y la mayoría aún no son aprovechadas por el hombre. Solo se conocen los simbiontes para alrededor del 1% de las leguminosas que forman nódulos fijadores de nitrógeno 3. El género Rhizobium incluye especies importantes para la agricultura, han sido empleados como biofertilizante. Fue el primer género bacteriano producido a gran escala para ser utilizado como inoculante en diversos cultivos agrícolas; esta práctica ha sido realizada durante años. Se estima además que la biodiversidad de los rizobios que aún no son conocidos, representa un importante recurso biológico debido a que las leguminosas constituyen un grupo grande y diverso que se encuentran distribuidas en distintos ecosistemas4. En el año 2000 se obtuvieron 58 nuevas cepas de Rhizobium aisladas de nódulos de raíces de fríjol común cultivado en suelos originarios de diferentes áreas agroecológicas en Senegal y Gambia (este de África)5. En el 2002 se aislaron 28 cepas rizobianas nodulantes del fríjol caupí, en una relación de 1:3 entre la presencia de cepas de crecimiento rápido frente a las de crecimiento lento6; una relación de 1: 9 y 1: 7 entre los aislamientos7,8, lo que habla de la gran diversidad existente según el lugar de muestreo. Estos datos brindan la factibilidad de aislar Rhizobium spp. a partir de suelos en los que se cultivan leguminosas. Se sabe que existen diversos factores que pueden afectar la relación simbiótica impidiendo la aparición de nódulos y como consecuencia de ello la leguminosa puede morir, salvo en suelos muy ricos en derivados nitrogenados. Entre los factores químicos destacan la concentración de cloruro de sodio, metales, pH, niveles tóxicos de aluminio o manganeso y bajos niveles de calcio, magnesio, potasio y molibdeno8. Entre los factores físicos: la temperatura, la erosión, presencia de malezas, hidromorfismo y compactación9. Entre los factores biológicos se pueden mencionar la presencia de virus, y bacterias como Bdellovibrio que inhiben la nodulación10. La búsqueda de nuevas alternativas ecológicas que ayuden a disminuir los costos de la producción agrícola, cuidar el ambiente y por ende lograr un desarrollo sostenible obliga a estudiar la posibilidad de utilizar el potencial que tienen las bacterias que nodulan en las raíces de las leguminosas y en especial de las que se consideran no especializadas o promiscuas, de suerte que puedan utilizarse para inducir nodulación y fijar nitrógeno en otras leguminosas que pueden ser de mayor efectividad. El seleccionar cepas autóctonas con alta capacidad de competencia en lugar de introducir cepas que aunque competitivas provienen de nódulos o suelos ajenos al sitio en cuestión, constituye una excelente alternativa. A pesar de la determinante influencia que tiene la población de Rhizobium autóctona en los campos de cultivo, compite con las cepas foráneas introducidas y da lugar a un menor rendimiento11,12; entonces, puede ser ventajoso utilizar los rizobios nativos aislados como biofertilizantes, en cantidades adecuadas. Esto constituye una alternativa para el enriquecimiento de los suelos agrícolas. En la actualidad, la taxonomía de los rizobios se basa en un enfoque polifásico que incluye caracterización morfológica, bioquímica, fisiología, genética y filogenia; no es factible adelantar estudios de tipo genético si no se han identificado sus propiedades fenotípicas 13. Se estima que los rizobios no conocidos en el mundo representan un recurso biológico importante porque las leguminosas constituyen un grupo grande de plantas que se encuentran distribuidas en distintos ecosistemas4. Uno de problemas fundamentales que enfrenta la humanidad es la producción de alimentos en cantidad suficiente para la población que se incrementa en forma progresiva. Para solucionar este problema se ha recurrido a la llamada revolución verde que se basa en el uso de fertilizantes químicos, los cuales se aplican cada vez en cantidades mayores generando severos daños ecológicos, contaminando los suelos y cuerpos de agua. Ello ha motivado a estudiar diversos sistemas biológicos para poder modificar las prácticas agrícolas y para que la fijación biológica del nitrógeno sea la que reemplace al nitrógeno extraído del suelo por los cultivos. Por tanto, debido a que existe una potencial riqueza de rizobios cuya diversidad no ha sido estudiada, se realizó este estudio con el fin de aislar rizobios a partir de nódulos radiculares de Ph. vulgaris “frijol”, cultivados en el distrito de Laredo y seleccionar aquellos con el mejor potencial agronómico para ser utilizados como bioinóculos en la REBIOL Revista Científica de la Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú Vol 32, N° 1, Enero-Junio, 2012, pp. 26-103 agricultura, para lo se planteó el problema ¿Qué bacterias nativas de rizobios fijadores de nitrógeno se aislarán y seleccionarán a partir de nódulos radiculares de Ph. vulgaris “frijol” cultivados en el distrito de Laredo, La Libertad, Perú, de enero a julio del 2012? , con los siguientes objetivos generales y específicos. MATERIAL Y MÉTODOS Material Biológico Raíces, con nódulos, de plantas de frijol Phaseolus vulgaris Recolección de nódulos radiculares Las raíces, con nódulos, se colectaron a partir de plantas de frijol en bolsas de primer uso. Cada muestra se acondicionó y rotuló según el código asignado y fue trasladada al laboratorio para su posterior procesamiento. Procesamiento de las muestras Las raíces se procesaron en primer lugar, contando el número de nódulos de cada una de ellas. Luego se seleccionaron los nódulos viables en base a sus características morfológicas14. Los nódulos viables fueron acondicionados en frascos de vidrio con algodón y silicagel, y conservados en refrigeración hasta su posterior tratamiento. Aislamiento de bacterias nativas de rizobios Los nódulos fueron procesados utilizando la metodología sugerida por Somasegaran y Hoben 14. La desinfección de los nódulos se realizó por inmersión sucesiva en alcohol al 95% por un minuto e hipoclorito de sodio al 3% durante tres minutos, posteriormente, se enjuagaron con agua destilada estéril (ADE) hasta que no se perciba el olor a lejía Los nódulos desinfectados fueron colocados en placas Petri y machacados adicionando una gota de ADE por nódulo. Muestras del machacado fueron sembradas por estría en placas conteniendo Agar Manitol Extracto de Levadura-Rojo de Congo (LMA-RC) y se incubaron a 28°C por 2 – 10 días. Se observó diariamente el crecimiento de las colonias características de rizobios de acuerdo al manual del CIAT (CIAT, 1988). Las colonias típicas de rizobios fueron resembradas en placas Petri conteniendo LMA-RC y se incubaron a 28°C por 2 – 10 días. Se verifico la pureza de los cultivos. Los cultivos fueron aislados en tubos conteniendo LMA-RC e incubados a 28°C. Selección primaria e identificación de cepas nativas de rizobios. Los cultivos seleccionados fueron analizados tanto en sus características macroscópicas y microscópicas. Se evaluaron el color, el diámetro, la apariencia y la forma de las colonias, la cantidad de goma producida y la textura. se realizaron coloraciones simple y de Gram15. Además, se evaluó el crecimiento de los cultivos aislados en agar peptona glucosa (PGA), agar Luria Bertani (LLA) y agar manitol (LMA). Después de la incubación a 28°C, se realizaron las lecturas y se identificaron los rizobios15. Conservación de cepas nativas de rizobios. Las cepas nativas aisladas fueron, selladas, rotuladas y conservadas en agar manitol (LMA) en condiciones asépticas de refrigeración. Análisis de Datos El número de bacterias nativas de rizobios fijadores de nitrógeno aislados, seleccionados e identificados, a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris “frijol” serán procesados y organizados en tablas y figuras. RESULTADOS Se encontraron 10 cultivos nativos de rizobios, aislados a partir de nódulos radiculares de Ph. vulgaris, en agar manitol extracto de levadura - rojo de congo (ELMA-RC) a 28°C (Tabla 1). Cuando se determinaron las características micromorfológicas de las bacterias, se encontró que eran Gram y Maneval negativas (Tabla 2). Cuando se determinaron las características macromorfológicas se encontró que tenían tamaño variable entre 1 y 7mm, borde entero, consistencia gelatinosa, de color blanquecino a rosado y tiempo de generación entre 3 y 10 días (Tabla 3). Por su lado, las características culturales determinaron REBIOL Revista Científica de la Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú Vol 32, N° 1, Enero-Junio, 2012, pp. 27-103 crecimiento en Medio Lactosa Extracto de Levadura y ausencia de crecimiento en Medio Luria Bertani (Tabla 4) habiéndose hallado que el género más frecuente (60%) fue Rhizobium (Tabla 5) Tabla 1. Cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno, aislados a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris, en agar manitol extracto de levadura - rojo de congo (ELMA-RC) a 28°C. N° DE CULTIVOS AISLADOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MUESTRAS Nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris. CÓDIGO MITPhv1 MITPhv2 MITPhv3 MITPhv4 MITPhv5 MITPhv6 MITPhv7 MITPhv8 MITPhv9 MITPhv10 MITPhv = Microbiología Industrial Trujillo, Phaseolus vulgaris Tabla 2. Características micromorfológicas de los cultivo nativos de rizobios fijadores de nitrógeno, aislados a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris. CARACTERÍSTICAS MICROMORFOLÓGICAS Gram Maneval Forma TODOS LOS CULTIVOS (del MITPhv1 al MITPhv10) Negativos Cápsula presente Bacilar y Bacilos Pleomórficos MITPhv = Microbiología Industrial Trujillo, Phaseolus vulgaris Tabla 3. Características macromorfológicas y tiempo de crecimiento de los cultivos bacterianos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno, aislados a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris, en agar manitol extracto de levadura - rojo de congo (ELMA-RC) a 28°C. CULTIVO N° Características Macroscópicas Diámetro(mm) Forma Borde Elevación Superficie Consistencia Color Detalles ópticos Cant. de goma Tiempo de crecimiento (días) MITPhv1 MITPhv2 MITPhv3 MITPhv4 MITPhv5 MITPhv6 MITPhv7 7mm Circular Entero Convexa Lisa Gelatinosa Blanquecina Opaca abundante 3 2mm Puntiforme Entero Elevada Lisa Ligosa Rosadas Translúcida escaso 10 1mm Puntiforme Entero Plana Lisa Gelatinosa Rosadas Translúcida escaso 10 1mm Puntiforme Entero Plana Lisa Gelatinosa Rosadas Translúcida escaso 10 6mm Circular Entero Convexa Lisa Gelatinosa Blanquecina Opaca abundante 3 4mm Circular Entero Convexa Lisa Gelatinosa Rosadas Translúcida abundante 3 1mm Puntiforme Entero Convexa Lisa Ligosa Rosadas Translúcida escaso 10 REBIOL Revista Científica de la Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú Vol 32, N° 1, Enero-Junio, 2012, pp. 28-103 Tabla 4. Selección de cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno, a partir de pruebas bioquímicas y de crecimiento para la determinación de pureza de los cultivos aislados de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris. MUESTRA Nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris. CULTIVO PRUEBA BIOQUÍMICA LLA PG-PBC LB + (SC) Escaso +(SC) +(SC) +(SC) + (SC) Escaso +(SC) +(SC) +(SC) +(SC) +(SC) Escaso - MITPhv1 MITPhv2 MITPhv3 MITPhv4 MITPhv5 MITPhv6 MITPhv7 MITPhv8 MITPhv9 MITPhv10 GENERO Rhizobium Bradyrhizobium Bradyrhizobium Bradyrhizobium Rhizobium Rhizobium Bradyrhizobium Rhizobium Rhizobium Rhizobium LLA = Medio lactosa extracto de levadura PG-PBC = Medio peptona glucosa-púrpura de bromocresol LB = Medio Luria Bertani + = Crecimiento - = Ausencia de crecimiento SC = Sin cambio de color Tabla 5. Frecuencia de cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno, Rhizobium sp. y Bradyrhizobium sp., encontrada a partir de aislados de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris. MUESTRAS Nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris. CULTIVOS GÉNERO N° DE CULTIVOS % MITPhv 1, 5 , 6, 8, 9, 10. Rhizobium 6 60 MITPhv 2, 3, 4, 7. Bradyrhizobium 4 40 MITPhv = Microbiología Industrial Trujillo, Phaseolus vulgaris DISCUSIÓN El uso de fertilizantes nitrogenados a nivel mundial ha sido indispensable para mantener o incrementar las reservas de nitrógeno del suelo; no obstante, su abuso ha conducido a problemas de contaminación ambiental, por tal motivo, la FBN ha atraído a los científicos interesados en la nutrición vegetal, la cual es de bajo costo y no causa daño ambiental16. La búsqueda, el aislamiento y selección de bacterias fijadores de nitrógeno es muy importante desde el punto de vista agronómico, ya que se requiere como base para la producción de inoculantes bacterianos que estimule la producción vegetal. Existe una gran diversidad de microorganismos presentes en el suelo que se encuentran interactuando entre sí y con otros organismos del medio, de ellos tenemos un grupo de gran importancia por su relación sinérgica con las plantas en la fijación biológica del nitrógeno (FBN), y por su gran potencial uso biotecnológico en la agricultura. En los últimos años se ha observado un gran interés a nivel mundial en el estudio de estas interacciones planta-microorganismo, fundamentalmente enfocado a generar nuevos conocimientos básicos aplicables a los sistemas de producción17. Del estudio realizado, se puede observar en la Tabla 1, que se aislaron y seleccionaron 10 cultivos de rizobios nativos fijadores de nitrógeno a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris, 6 de los cuales según las pruebas realizadas pertenecerían al género Rhizobium y 4 del género Bradyrhyzobium tal como se observa en las Tabla 3 y 4, los cuales se caracterizaron por ser heterótrofos, con metabolismo aeróbico, al microscopio se observaron en forma de bacilos no esporulados, Gram negativos, y sus células presentaron formas irregulares o pleomórficas en forma de X o de Y, llamados bacteroides, creciendo a una temperatura óptima de 28 °C. y un pH de 7,0. REBIOL Revista Científica de la Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú Vol 32, N° 1, Enero-Junio, 2012, pp. 29-103 Las especies del género Rhizobium encontradas, se caracterizaron por tener un crecimiento rápido (3 a 5 días), de reacción ácida en un medio con sales minerales conteniendo manitol, fueron productores de abundante lipopolisacáridos extracelulares, por consiguiente formaron colonias de aspecto mucilaginoso; semitranslúcidas y opacas, circulares, convexas, de color blanco o ligeramente rosadas, midiendo de 2 a 7 mm de diámetro a los 3- 5 días de incubación en medio ELMA (Agar Manitol Extracto de levadura). Asimismo, es importante mencionar que dentro del género Rhizobium existen nueve especies definidas: R. etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R. huatlense, R. mongolense, R. tropici y R. leguminosarum18. Para el género Bradyrhyzobium las especies seleccionadas se caracterizaron por el crecimiento lento que presentaron (3 a 10 días) con colonias pequeñas circulares puntiformes y midiendo de 1 a 2 mm de diámetro y produciendo una reacción alcalina en el medio. Estas características encontradas durante el aislamiento y selección de bacterias nativas de rizobios. son similares y concuerdan con lo descrito en el Manual de Bergey para los géneros de Rhizobium y Bradyrhyzobium18. Al mismo tiempo, realizando un análisis porcentual de los rizobios que se muestran en la Tabla 5, se puede observar que existe una predominancia de rizobacterias de crecimiento rápido pertenecientes al género Rhizobium en comparación con las de crecimiento lento del género Bradyrhyzobium. Además, los miembros del género Rhizobium se distingue de Mesorhizobium por diferencias en su tasa de crecimiento, en tanto que con Allorhizobium o Sinorhizobium sólo se distingue por sus caracteres fenotípicos individuales de cada especie. El género Agrobacterium se diferencia de los demás géneros señalados anteriormente por la producción de la enzima ketolactasa19,20,21. La taxonomía de los rizobios ha cambiado considerablemente durante los últimos 30 años, la familia Rhizobiaceae en la 8va Edición del Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática incluye a Bradyrhizobium como un nuevo género, basado en la rapidez de crecer en un medio de cultivo 22. Los rizobios actualmente abarcan un rango de géneros, que incluyen Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Allorhizobium yAzorhizobium, que pertenecen a diferentes familias dentro de la clase Alpharizobiales y los cuales establecen simbiosis con plantas leguminosas21. La FBN puede ser llevado a cabo por microorganismos que viven libremente o formando asociaciones. Los microorganismos asociados o simbióticos usan los productos de la fotosíntesis de la planta para fijar el N2 atmosférico por lo que es un proceso muy eficiente para la bacteria, siendo los más eficaces en la FBN. Este tipo de simbiosis es muy común entre bacterias fijadoras de nitrógeno y plantas leguminosas23. Son muchas ventajas de las asociaciones simbióticas ya que, la planta puede autoabastecerse del nitrógeno fijado por los bacteroides encontrados dentro de los nódulos, elevando de manera considerable su contenido de proteínas; así mismo, los bacteroides reciben de la planta toda la energía necesaria para su multiplicación. A pesar de estas indiscutibles ventajas, los rizobios no siempre se encuentran en el suelo, están en poblaciones relativamente bajas o si se encuentran presentes, muchas veces son de baja efectividad, por lo que una de las estrategias para incrementar la fijación de nitrógeno ha sido el aislamiento y la selección de cepas y la posibilidad de introducir estos microorganismos en el suelo a través de la inoculación y favorecer así la simbiosis. Adicionalmente, cabe destacar que inocular las semillas de leguminosas tiene un bajo costo para el productor, con un valor promedio estimado en sólo un 5% sobre el costo de la semilla24,25. Finalmente, los cultivos nativos de Rhizobium y Bradyrhyzobium aislados y seleccionados según las pruebas realizadas, fueron conservados en refrigeración, utilizando el método de subcultivos periódicos en el medio agar manitol extracto de levadura proceso que se realizó en condiciones asépticas, posteriormente fueron selladas, rotuladas y agrupados según su género, este proceso de preservación de cultivos es muy importante ya que nos permitirá en el futuro disponer de bacterias nativas de rizobios fijadores de nitrógeno seleccionados para posteriores estudios y ser proporcionados a los agricultores para promover el uso de inoculantes microbianos. CONCLUSIONES Se aislaron 10 cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno, a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris. Se seleccionaron 6 cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno del género Rhizobium . Se seleccionaron 4 cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno del género Bradyrhyzobium. REBIOL Revista Científica de la Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú Vol 32, N° 1, Enero-Junio, 2012, pp. 30-103 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. Young JP. Phylogenetic classification of nitrogen organisms. In: Stacey, Burns y Evans (Eds.) Biological Nitrogen Fixation. Chapman y Hall, New York, USA 1992; pp. 43-86. Allen ON, Allen EK. The leguminosae; a source book of characteristics, uses, and nodulation. Madinson WI, USA: Univ Wisconsin Press. 1980. Martínes-Romero E, Caballero-Mellado J. Rhizobium phylogenies and bacterial genetic diversity. Crit Rev Plant Sci 1996; 15:113-140. Bécquer CJ. Descripción y clasificación de rizobios: Enfoque histórico, métodos y tendencias actuales. Rev Biología 2004; 18: 9. Bécquer CJ. Diversidad genética y posición taxonómica de rizobios aislados de leguminosas forrajeras nativas en Sancti-Spíritus, Cuba. Tesis de Maestría, Universidad de La Habana. 1998. Martínez K, García J. Estudio de la diversidad de la cepas rizobianas nodulantes del fríjol caupí en los municipios de Villanueva y Santa Rosa en el departamento de Bolívar. Tesis Br. Química Farmacéutica, Universidad de Cartagena. 2002. Daguer N, González T. Diversidad de las cepas de Rhizobium y Bradyrhizobium que nodulan al frijol caupí (Vigna unguiculata) y autenticación utilizando bolsas de crecimiento y jarras de Leonard. Tesis Br. Química Farmacéutica, Universidad de Cartagena, Colombia. 2003. Rubio GA, Santos WR. Selección de cepas rizobianas aisladas de frijol caupi (Vigna unguiculata) con potencial uso como biofertilizantes. Tesis Br. Química Farmacéutica, Universidad de Cartagena, Colombia. 2006. Wright SF, Wright RJ, Sworobuk JE, Boyer DG. Effect of acid soil chemical properties on nodulation and competition of Rhizobium trifolii. Comm. Soil Sci Plant Anal 1988; 19: 311. Jiménez MS. Fijación biológica de nitrógeno por leguminosas arbóreas para sombra de café en Puerto Rico. Tesis de Maestría, Universidad de Puerto Rico. 2007. Abdullah M, Al-Falih K. Factors affecting the efficiency of symbiotic nitrogen fixation by Rhizobium. Pakistan J Biol Sci 2002; 5: 1277. Thies JE, Singleton PW, Bohlool BB. Influence of the size of indigenous rhizobial populations on establishment and symbiotic performance of introduced rhizobia on field-grow legumes. Appl Environ Microbiol 1991; 57: 19. Caballero-Mellado J, Martinez-Romero E. Soil fertilization limits the genetic diversity or Rhizobium in bean nodules. Symbiosis 1999; 26:111-121. Somasegaran P, Hoben H. Methods in Legume-Rhizobium Technology NIFTAL. Projet anad MIRCEN.University of Hawaii.USA. 1985. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). Simbiosis leguminosa-Rizobio. Manual de evaluación, selección y manejo agronómico. Cali, Colombia. 1987. Eugenia B, Soto L, Pardo P. Fijación Biológica de Nitrógeno. Redalyc 2000; 7(38): 43-49. Castillo C. Aislamiento de Micromonospora de nódulos de leguminosas tropicales y análisis de su interés como promotor del crecimiento vegetal. Tesis Doctoral. Universidad de Alicante, España. 2008. Don JB, Noel RK, James TS. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 2nd. Ed., Vol Two. Michigan State University. USA. 2005. Lloret L, Martínez-Romero E. Evolución y filogenia de Rhizobium. Rev Latinoam Microbiol 2005; 47(1-2): 43-60. Willems A. The taxonomy of rhizobia: an overview. Plant and Soil 2006; 287: 3-14 Sessitsch A, Howieson GJ, Perret X, Antoun H, et al. Advances in Rhizobium Research. Crit Rev Plant Sci 2002; 21(4): 323-378. Jordan DC. Transfer of Rhizobium japonicum Buchanan 1980 to Bradyrhizobium gen.nov, a Genus of SlowGrowing, Root Nodule Bacteria from Leguminous Plants. Int J SystBacteriol 1982.; 32(1): 136-139. Fuentes LE, Tapia A, Jiménez T, Mascarúa M, et al. Bacterias Acéticas: Diversidad e Interacción con las plantas. Elementos 2003; 10(49): 47-51. Abad J. Generación de una mutateca en Rhizobium leguminosarum para el análisis de proteínas de exportación TAT – dependientes. Madrid: Edit. Uthea. 2008. Martinez E, Hernandez G. Highlights of Nitrogen Fixation Research. Kluwer Academic/Plenum Publisher, New York, USA. 1999. Sosa A, Elías A, García O, Sarmiento M. Aislamiento y caracterización fenotípica parcial de cepas de rizobios que nodulan leguminosas rastreras. Rev Cubana Ciencia Agrícola 2004; 38 (2): 197-201.
