Laboratorio de Introducción a la Microbiología

Universidad Técnica Federico Santa María.
Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Laboratorio de Introducción a la Microbiología
Practico N° 1
“PREPARACIÓN PARA LA OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS POR
MICROSCOPIA”
Los microorganismos son demasiado pequeños para ser observados a simple vista,
por lo que es necesario utilizar un microscopio. Los modernos microscopios proporcionan,
con una gran claridad, aumentos de decenas a cientos de veces superiores a los obtenidos
con las lentes sencillas de van Leeuwenhoek.
Figura 1: Microscopio óptico
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Resumen de las características de distintos microscopios.
Tipos de microscopio
Características especiales
Usos principales
Campo claro
Utiliza luz visible como fuente de
iluminación; no puede resolver
estructuras de menos de 0,2 m;
la muestra aparece sobre fondo
brillante.
Comúnmente usado para observar
especimenes teñidos (muertos)
diversos; no resuelve muestras
muy pequeñas, como los virus. El
instrumento es económico y fácil
de usar.
Campo oscuro
Utiliza un condensador especial
con un disco opaco que impide la
entrada directa de la luz en el
objetivo; entra la luz difractada
por la muestra, la cual aparece
brillante sobre fondo oscura.
Comúnmente
usado
para
examinar microorganismos vivos
que
sean
invisibles
al
microscopio de campo claro, que
sean difíciles de teñir o que se
alteren por la tinción; usado a
menudo para detectar Treponema
pallidum.
Contraste de fases
Usa un condensador especial y
una placa de difracción que
difracta los rayos de luz para que
se desfacen unos con respecto a
otros; la muestra aparece con
diferentes grados de brillo y
contraste.
Se usa frecuentemente para
permitir un examen detallado de
las estructuras internas de los
especímenes vivos; no se requiere
tinción.
Fluorescencia
Utiliza una fuente de luz
ultravioleta o cercana a la
ultravioleta que provoca la
emisión de luz por parte de
compuestos
fluorescentes
presentes en la muestra.
Su uso fundamental es en técnicas
de inmunofluorescencia para
detectar o identificar con rapidez
microorganismos en muestras
clínicas.
Electrónico
Usa haces de electrones en vez de
luz gracias a la longitud de onda
más corta de los electrones puede
resolver estructuras menores de
0,2 m.
Se usa el microscopio electrónico
de transmisión para examinar
virus o ultraestructuras celulares
en cortes delgados, la imagen no
es tridimensional . El microscopio
electrónico de barrido se usa para
estudiar la superficie de células y
virus, la imagen que se forma e
tridimensional.
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Para poder observar los microorganismos directamente, el microbiólogo debe utilizar un
instrumento de precisión, el microscopio. Si lo que interesa observar es la motilidad o
reactividad frente a sustancias químicas es conveniente examinar las bacterias sin teñir; por
otra parte si se quiere visualizar estructuras celulares específicas es necesario tratar las
células con colorantes, proceso denominado TINCIÓN.
Examen de microorganismos sin tinción:
1.-
Preparación húmeda: es la forma más simple de examinar las bacterias y otros
microorganismos vivos, y consiste en la suspensión de un inóculo de cultivo en
agua u otro líquido, colocando una gota de ésta suspensión en un portaobjeto común
y cubrirlo con un cubreobjeto. Este procedimiento requiere utilizar microscopía de
contraste de fase.
2.-
Preparación de la gota pendiente: ésta técnica requiere de un portaobjeto con una
concavidad o depresión circular en su centro (portaobjeto excavado)
Técnica:
- Colocar un anillo delgado de vaselina alrededor de la depresión central.
- Depositar una gota de solución fisiológica en el centro del cubreobjeto y
emulsionar en ella el material a examinar si proviene de un cultivo sólido o
utilizar una gota de cultivo si es líquido.
- Invierta el portaobjeto de manera tal que la excavación central quede
encima de la gota del cubreobjeto.
- Presione el portaobjeto y luego inviértalo con un movimiento rápido. La
gota que contiene el material quedará pendiendo sobre la excavación del
portaobjeto como se muestra en la figura 2:
Con el estudio de la gota pendiente, se puede conocer la motilidad de los microorganismos,
sus agrupaciones naturales, sus reacciones en presencia de ciertas sustancias químicas.
Figura 2: Técnica de la gota pendiente.
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Examen de microorganismos teñidos:
Colorantes: son compuestos químicos orgánicos, generalmente sales, en las que uno
de sus iones es el portador del color. Según su comportamiento químico los colorantes
pueden clasificarse en : ácidos, básicos y neutros.
a).-
Colorante Ácido o aniónico: la carga del ión que imparte el color es negativa.
Ejemplo: fucsina ácida, eosina. Los colorantes ácidos no son atraídos por la
mayoría de las bacterias porque los iones negativos del colorante son repelidos por
la superficie bacteriana cargada negativamente. De modo que el colorante es
repelido por la bacteria y colorea en cambio el fondo de la preparación. Esta
preparación de bacterias incoloras sobre un fondo coloreado se llama tinción
negativa. Es útil para la observación de la morfología externa de la célula, del
tamaño y de la cápsula, porque las células resultan muy visibles al contrastar con el
fondo oscuro.
b).-
Colorante Básico o catiónico: el ión que imparte el color tiene carga positiva.
Ejemplo: cristal violeta, azul de metileno, safranina. A pH 7.0 las bacterias tienen
carga ligeramente negativa y por lo tanto el ión positivo coloreado de un colorante
básico es atraído por la célula bacteriana.
c).-
Colorante neutro: sal compuesta de un colorante ácido y otro básico. Ejemplo:
eosinato de azul de metileno.
El proceso de tinción supone una reacción de intercambio de iones, entre el
colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la célula.
Para teñir una preparación se pone una pequeña cantidad del material a examinar en
un portaobjeto limpio y sin grasa. Si el inóculo proviene de un medio sólido se emulsiona
en una gota de solución fisiológica estéril o agua destilada. La muestra se extiende con el
asa (esterilizada y enfriada) hasta que quede una fina película. Esta película se conoce
como FROTIS. Una vez realizado el frotis, se procede a la FIJACIÓN. Éste es un
procedimiento que mata las bacterias del frotis y hace que se adhieran al portaobjeto, ya
que el calor desnaturaliza las proteínas. La fijación también se puede realizar sumergiendo
el portaobjeto en alcohol metílico, éter o formalina; sin embargo es el calor el más indicado
para el trabajo de rutina. La fijación por calor se logra pasando el portaobjeto varias veces
por sobre la llama del mechero.
Una vez realizado el frotis y la fijación, se procede a aplicar el o los colorantes
según sea la tinción. En bacteriología se utilizan tres clases de tinciones:
a) Tinción simple
b) Tinción diferencial
c) Tinciones especiales.
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1.-Tinción simple: es aquella que hace uso de un sólo tipo de colorante y sirve para
observar tamaño y forma celular. Las más comunes son la de azul de metileno,
carbolfucsina, cristal violeta y safranina.
Técnica:
-frotis y fijación de la muestra
-colorante durante un minuto
-lavar con agua para retirar exceso de colorante
-dejar secar al aire
-observar al microscópio de inmersión
Tinciones diferenciales: permiten dividir a las bacterias en grupos, de acuerdo a su
reacción con los colorantes utilizados. Entre ellos la tinción de Gram y la de
alcohol-ácido resistente son las más usadas.
2.1-
Tinción Gram: es la técnica de uso más común en microbiología y permite dividir
las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram positivas y Gram negativas, de
acuerdo a las propiedades físicas de la pared celular.
Técnica:
-frotis y fijación de la muestra
-cristal violeta durante un minuto
-lavar con agua
-mordiente: solución de yodo (lugol) durante un minuto
-lavar con agua
-agente decolorante: alcohol durante 30 seg.
-lavar con agua
-safranina por 30 seg.
-lavar con agua y secar al aire
-examinar al microscópio con objetivo de inmersión
El mordiente tiene la función de aumentar la afinidad del colorante con las
estructuras celulares.
El agente decolorante tiene la función de retirar el colorante de la célula.
Las bacterias sometidas a la tinción de Gram que retienen el colorante "cristal
violeta" y aparecen de color violeta profundo se clasifican como bacterias Grampositivas. Aquellas que pierden el cristal violeta y se tiñen rojas por el colorante de
contraste, se clasifican como bacterias Gram-negativas. Este resultado se fundamenta en el
hecho de que las bacterias Gram(+), después del tratamiento con alcohol, se produce una
deshidratación con la consiguiente disminución en el diámetro de los poros de
péptidoglicano de la pared celular. Esto permite que el colorante cristal violeta quede
retenido en el interior de la célula. Las paredes de las bacterias G(-) tienen una cantidad
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mucho menor de péptidoglicano con ligaduras cruzadas menos extensas, lo que le da una
consistencia mucho más laxa que permite la salida del complejo cristal violeta-yodo y la
posterior tinción con safranina. (Cuadro I).
Figura 3: Tinción de Gram
CUADRO I: Reacción de las células Gram (+) y Gram (-), frente a la tinción de Gram.
COLORANTE
Cristal violeta
Lugol
Alcohol
Safranina
GRAM (+)
azul
azul
azul
azul
GRAM (-)
azul
azul
decolorada
rojo
El método de Gram es una de las técnicas de tinción más importantes en microbiología
médica. No obstante, los resultados de la tinción de Gram no son absolutos porque algunas
células bacterianas se tiñen mal o no lo hacen. La reacción de Gram es más reproducible
cuando se aplica a bacterias jóvenes en crecimiento (cultivos de 18 - 24 horas).
En muchos casos la tinción de Gram de una bacteria proporciona una información útil para
el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, las bacterias Gram positivas tienden a ser
más sensibles a la penicilina y a las sulfamidas. Las bacterias Gram negativas suelen ser
resistentes a estos fármacos pero son mucho más susceptibles a antibióticos como la
estreptomicina, el cloramfenicol y las tetraciclinas. Por lo tanto, la identificación de una
bacteria según la tinción de Gram puede ayudar a determinar que fármaco será más eficaz
contra la enfermedad.
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2.2
Tinción de ácido-alcohol resistencia
Otra importante tinción diferencial (que divide a las bacterias en grupos diferenciados) es la
tinción de ácido alcohol resistencia. Los microbiólogos utilizan esta tinción para identificar
bacterias pertenecientes a los géneros Micobacterium y Nocardia. Aunque muchas
bacterias de este grupo no son patógenas, hay dos miembros que son importantes
productores de enfermedad, Micobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae. La
diferencia principal del Micobacterium y Nocardia con otros microorganismos es que estos
dos géneros poseen ceras e sus paredes celulares.
En la técnica de tinción de ácido alcohol resistencia se aplica sobre la tinción fijada
el colorante rojo carbolfuchsina y el portaobjetos se calienta suavemente sobre la llama
durante varios minutos. El calor facilita la penetración y retención del colorante. Se deja
enfriar la preparación y se lava con agua. A continuación se trata con ácido y alcohol, un
decolorante, que elimina el colorante rojo de las bacterias que no son ácido alcohol
resistentes. Las bacterias ácido alcohol resistentes retienen el color rojo porque la
corbolfuchsina es más soluble en las ceras que forman parte de su pared celular que en el
ácido alcohol. En las bacterias no ácido alcohol resistentes, cuyas paredes carecen de ceras,
la carbolfuchsina es rápidamente eliminada durante la decoloración, quedando sus células
sin teñir. La extensión se tiñe entonces con azul de metileno como colorante de contraste.
Las bacterias que no son ácido alcohol resistente aparecen azules tras la tinción de
contraste.
3.- Tinciones Especiales: Sirven para observar estructuras dentro o en el exterior de la
célula bacteriana, inclusiones citoplasmáticas como también algunos microorganismos que
dadas sus características especiales no se tiñen adecuadamente con técnicas rutinarias.
a. Esporas:
Son muy impermeables a los colorantes, por lo que se hace necesario usar
técnicas especiales.
Técnica:
- Frotis y fijación de la muestra
- Cubrir frotis con papel filtro
- Teñir con Verde Malaquita a emisión de vapores por 10 a 15 min.
- Enfriar y lavar con agua
- Aplicar Safranina por 30 segs a 1 min.
- Lavar con agua y secar al aire
- observar al microscopio con objetivo de inmersión
Las esporas aparecen de color verde y la célula vegetativa roja. La vaporización del
colorante sobre la muestra incrementa la penetración de éste en los recubrimientos
impermeables de la espora (Cuadro II).
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CUADRO II: Reacción de las células frente a la tinción de Esporas.
COLORANTE
Verde malaquita
Agua
Safranina
ESPORA
verde
verde
verde
CÉLULA VEGETATIVA
verde
decolorada
roja
b. Cápsula: Muchos microorganismos poseen una cubierta gelatinosa llamada
cápsula. En microbiología clínica de demostración de la presencia de cápsula es un medio
para determinar la virulencia de un microorganismo, es decir, la capacidad de un patógeno
para producir enfermedad. La cápsula es una envoltura mucosa, se compone de polisacáridos, polipéptidos y polímeros extracelulares complejos. Como estas estructuras se alteran
por el calor, nunca se podrá utilizar calor en ninguno de los pasos de la tinción.
La cápsula no tiene afinidad con los colorantes ordinarios pero puede apreciarse como un
halo transparente alrededor de la célula. La técnica de la tinción negativa incorpora
materiales tales como tinta china, que se compone de partículas demasiado grandes para
penetrar la célula y un colorante de contraste, la safranina, que penetra la célula bacteriana.
Al examinar la preparación, la cápsula aparecerá como una zona transparente que rodea la
pared celular. No se puede afirmar con certeza absoluta que todas las regiones claras
observadas sean cápsulas, debido a que el encogimiento de las células o la separación de la
tinta china pueden producir resultados anormales. Sin embargo, en general cuando un
frotis tratado contiene muchas zonas transparentes con siluetas uniformes, es probable que
sean reales y no artificiales.
Técnica:
- Sobre un portaobjeto limpio colocar una gota de tinta china (con
asa de loop) y emulsionar con ella los microorganismos a examinar.
- Extender la muestra y dejar secar al aire.
- Cubrir con Safranina por 30 a 45 segs.
- Dejar secar
- Observar al microscopio con inmersión.
La cápsula se verá como un halo transparente rodeando la célula de color rojo y el
resto de la preparación aparecerá de color negro.
c) Tinción de flagelos
Los flagelos bacterianos son estructuras de locomoción demasiado pequeñas para
verse al microscopio óptico. Para poderlas visualizar se utiliza un procedimiento de tinción
tedioso y delicado que emplea un mordiente y carbolfuchsina para engrosar el diámetro de
los flagelos hasta hacerlos aparentes al microscopio óptico. Los microbiólogos utilizan el
número y disposición de los flagelos como una ayuda para la identificación de las bacterias.
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Figura 4: Bacillus subtillis,
bacilo esporulado Gram+
Figura 5: Staphylococcus aureus,
azul-violeta Gram +
Figura 6: Bacillus subtillis, bacilo esporulado
Tinción espora , bacilo(rojo), espora (verde)