Evaluación de Trichoderma spp. contra Rhizoctonia solani in vitro e

Evaluación de Trichoderma spp.
contra Rhizoctonia solani in vitro e invernáculo
Cúndom, María A. - Mazza, Silvia Gutiérrez, Susana A. - Mazzanti de Castañón, María A.
Cátedra de Fitopatología - Facultad de Ciencias Agrarias - UNNE.
Sargento Cabral 2131 - (3400) Corrientes - Argentina.
E:mail: [email protected]
ANTECEDENTES
Rhizoctonia solani Kühn, es un patógeno de suelo, que causa enfermedades en un amplio rango de
hospedantes de cultivos agrícolas, hortícolas y florícolas (11).
En el nordeste de Argentina, ocasiona severos daños en cultivos hortícolas, que comúnmente ocurren en las
fases de pre-emergencia y post-emergencia de plántulas, con pudrición de cuellos y raíces, marchitamiento y
muerte, pudiendo ser un factor limitante en la producción de plantines (8, 9).
Actualmente las medidas utilizadas para el control de las enfermedades causadas por R. solani, son el uso de
productos químicos y prácticas culturales (11). Sin embargo, el control por medio de estas prácticas se ve
restringida por razones económicas y ecológicas.
Las posibilidades de sustituir o disminuir el uso de productos químicos en el control de enfermedades
producidas por hongos de suelo, por técnicas alternativas, como el control biológico, está siendo investigado
desde las últimas décadas por varios investigadores. Se han realizado numerosos estudios de laboratorio e
invernáculo, que prueban la influencia de antagonistas de diversas especies de hongos saprófitos, entre ellos,
Trichoderma spp. sobre R. solani (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10).
Las pruebas in vitro reflejan la capacidad y variabilidad genética del antagonista, y la del fitopatógeno para
resistir el antagonismo permitiendo la selección preliminar para ser evaluados en condiciones de invernáculo,
determinando de esta forma su capacidad antagónica (1).
El objetivo de este trabajo, es evaluar el potencial antagónico de Trichoderma spp. contra R. solani, a través
de la velocidad de crecimiento en cultivos duales, y la reducción de muerte de plántulas en condiciones de
invernáculo.
MATERIALES Y METODOS
Ensayo in vitro.
Para la evaluación comparativa de la actividad antagónica en cultivos duales se utilizaron como
fitopatógeno tres aislamientos de punta de hifa de R. solani, obtenidos de plántulas de melón, pimiento y
tomate con síntomas de podredumbre de raíces y cuello. Como potenciales biocontroladores, fueron evaluados
nueve aislamientos monospóricos regionales de Trichoderma spp., aislados de la rizosfera de plantas de tomate y
pimiento.
Se utilizaron 30 tratamientos. Las combinaciones de Trichoderma spp. y R. solani, figuran en la Tabla 1.
Los discos de los aislamientos utilizados para la ejecución del ensayo, fueron obtenidos de cultivos
sembrados en agar papa glucosado (APG) 1,5 % pH 6,5, mantenidos bajo estufa en oscuridad a 24-25°C,
durante 10 días. De la periferia de las colonias, se cortaron discos con sacabocados de 0,5 cm de diámetro que
fueron transferidos a cajas de Petri con el mismo medio, en posiciones opuestas y equidistantes, de tal modo que
quedaran enfrentados uno del fitopatógeno y otro del antagonista a probar en cada tratamiento. Los testigos
consistieron en el crecimiento de los distintos aislamientos de R. solani, sin la presencia de los posibles
antagonistas.
Las cajas fueron mantenidas en estufa en las condiciones ya señaladas.
Se aplicó un diseño en bloques al azar con cuatro repeticiones; cada unidad experimental constituída por una
caja de Petri. Se midió el diámetro de las colonias a las 24, 48 y 72 horas, efectuándose análisis de varianza y
prueba de Tukey de los valores obtenidos.
Tabla 1. Combinación de nueve aislamientos de Trichoderma spp. y tres aislamientos de
Rhizoctonia solani, correspondiente a cada uno de los tratamientos probados.
Tratamiento Trichoderma spp.
Aislamiento Nº
Nº
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
1
1
2
2
2
3
3
3
4
4
4
5
5
5
Rhizoctonia solani
Aislamiento Nº
98
102
103
98
102
103
98
102
103
98
102
103
98
102
103
Tratamiento Trichoderma spp.
Aislamiento Nº
Nº
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
6
6
6
7
7
7
8
8
8
9
9
9
-------------
Rhizoctonia solani
Aislamiento Nº
98
102
103
98
102
103
98
102
103
98
102
103
98
102
103
Ensayo en invernáculo.
Se midió la actividad antagónica de los aislamientos 1, 3 6 y 7 de Trichoderma spp., seleccionados in vitro,
en el control de muerte de plántulas de melón, causado por R. solani. El antagonista se aplicó de la siguiente
forma: a) en las semillas, y b) al suelo.
Los aislamientos de R. solani y Trichoderma spp., se prepararon en cajas de Petri, y en tubos pico de flauta,
conteniendo APG, 1,5 %, pH 6,5 mantenidos bajo estufa en oscuridad a 24-25°C, durante 10 días. Para todos
los tratamientos se utilizó suelo no esterilizado, en macetas, que fueron infectados artificialmente con 5 discos de
1,5 cm de diámetro de R. solani, 7 días antes de la siembra.
Aplicación a las semillas. Semillas de melón var. Rocío de Miel, se inocularon por inmersión durante 30
min en una suspensión individual de los aislamientos de Trichoderma spp.; la concentración se ajustó a 10 6
conidios por ml utilizando una cámara de Neubauer. Seguidamente se sembraron 15 semillas por maceta. El
testigo consistió en semillas sin inocular con Trichoderma spp., sumergidas durante 30 min en agua destilada
estéril.
Aplicación al suelo. Cinco discos de Trichoderma spp., de 1,5 cm de diámetro, correspondiente a cada
aislamiento, se depositaron en el suelo 7 días antes de la siembra. Se sembraron 15 semillas por maceta. El
testigo consistió en macetas con suelo infectado con R. solani, sin inocular con Trichoderma spp.
Para ambas formas de aplicación se utilizó un diseño en bloques completo al azar y tres repeticiones.
Las macetas se mantuvieron en invernáculo. Las temperaturas variaron entre 13 y 35°C.
Se registró en número de plantas vivas a los 6, 16 y 25 días. La incidencia de la enfermedad se determinó a
través del % de plántulas vivas.
RESULTADOS Y DISCUSION
Ensayo in vitro.
Los nueve aislamientos de Trichoderma spp., manifestaron diferencias en el crecimiento micelial en cultivos
duales con los tres aislamientos R. solani,.
Los aislamientos 1, 3, 6 y 7 fueron los de mayor crecimiento, diferenciándose significativamente con el
aislamiento 5; los otros aislamientos tuvieron comportamiento intermedio (Fig. 1).
Cook and Baker (2) afirman que la velocidad de crecimiento presentadas por las especies de Trichoderma
son motivos de utilización de este microorganismo como antagonista, para el control de fitopatógenos.
Las diferencias detectadas, se asemejan a las obtenidas por otros autores, demostrando la variabilidad de la
actividad antagónica de los diferentes aislamientos de Trichoderma (2, 10).
Con respecto al crecimiento micelial de R. solani, frente a los diferentes aislamientos de Trichoderma spp,
no manifestaron diferencias significativas entre sí, excepto con el aislamiento 5, que es el que al presentar
crecimiento más lento, parecería no tener mucho efecto sobre el fitopatógeno. Manifestaron diferencias
significativase con el testigo (Fig. 2).
En observaciones realizadas a los 7 días, de los cultivos duales bajo el microscopio estereoscópico (40 X),
R. solani frente a los aislamientos 1, 3, 6 y 7, cesa su crecimiento al entrar en contacto con el antagonista, que
crece de modo de cubrir todo el cultivo. Asimismo se observa notable zona de demarcación correspondiente al
encuentro de los organismos apareados.
Con los aislamientos 2, 4, 8 y 9, también se forma dicha zona en la que ambas colonias se frenan y ninguna
invade a la otra hasta los 14 días, en que el antagonista cubre todo el cultivo.
Sin embargo, frente al aislamiento 5, sucede lo contrario, pues el antagonista cesa su crecimiento y es
invadido por R. solani que cubre totalmente el cultivo. Esto probablemente es debido al crecimiento lento de
dicho aislamiento, y no pueda competir por espacio y nutrientes con el fitopatógeno que tiene mayor velocidad
de crecimiento (2, 10).
8
6
Diámetros colonias deRhizoctonia (cm)
7
Diámetros colonia deTrichoderma (cm)
5
4
3
2
1
6
5
4
3
2
1
0
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
2
3
9
4
5
6
7
8
9
Testigo
Aislamientos de Trichoderma
Aislamientos de Trichoderma
Rhizoctonia 98
Rhizoctonia 102
Rhizoctonia 98
Rhizoctonia 103
Fig.1 Diámetro de las colonias de los diferentes
aislamientos de Trichoderma spp. en cultivos duales
frente a R. solani. Lectura a las 72 h.
Rhizoctonia 102
Rhizoctonia 103
Fig.2 1 Diámetro de las colonias de los diferentes
aislamientos de Rhizoctonia solani en cultivos duales frente
a Trichoderma spp.; y en cultivo puro (testigo). Lectura a
las 72 h.
Ensayo en invernáculo.
Los 4 aislamientos de Trichoderma spp., redujeron hasta en un 30 % la muerte de plántulas de melón
causado por R. solani (Fig. 3). Esto se asemeja a los resultados obtenidos por otros investigadores que utilizaron
Trichoderma spp., a fin de reducir los daños causados por R. solani (4, 6, 7). No se detectan diferencias entre los
distintos aislamientos.
Con respecto a las dos formas de aplicación de los antagonistas, se observó un comportamiento similar.
Estos resultados preliminares in vitro, y en invernáculo, demuestran la posibilidad de utilizar aislamientos
regionales de Trichoderma spp., en la reducción de muerte de plántulas de melón causado por R. solani.
Por consiguiente, se considera conveniente continuar los estudios in vitro y en invernáculo para determinar
la capacidad antagónica de Trichoderma spp. contra R. solani,
90
90
80
80
70
60
6 dias
50
16 dias
40
25 dias
30
20
10
0
Testigo
1
2
3
4
% de plantas vivas
% de plantas vivas
100
70
60
50
6 dias
40
16 dias
30
25 dias
20
10
0
Testigo
Tratamiento
Fig. 3. Porcentaje de plantas vivas aplicando
Trichoderma spp. a las semillas (Tratamiento 1- 4);
Testigo: sin aplicación del antagonista
1
2
3
4
Tratamiento
Fig. 4 Porcentaje de plantas vivas aplicando
Trichoderma spp. y R. solani al suelo (Tratamiento
1-4); Testigo: sin aplicación del antagonista.
BIBLIOGRAFIA
1.
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