material y métodos obtención de la muestra problema

Estudio comparativo entre la microscopía convencional y el
método de cultivo con microfiltros para la identificación del
Campylobacter sp. en muestras fecales de pacientes del HNGAI
durante el 2° semestre del 2002. Patiño Gabriel, Lilian.
MATERIAL Y MÉTODOS
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA PROBLEMA:
Se examinaron las muestras de heces frescas remitidas al Laboratorio del
Servicio de Microbiología durante el segundo semestre del 2002 para el
respectivo análisis microbiológico y el cultivo con filtro; las muestras
eran
procedentes tanto de pacientes ambulatorios como hospitalizados, de todas
las edades y de ambos sexos.
Criterios de Inclusión:
Se incluyeron en el estudio aquellas muestras que eran recientemente
emitidas
( menor de 2 horas, si no contaban con medio de transporte de
Cary-Blair ) y trasladadas inmediatamente al Laboratorio en un envase limpio
de boca ancha con tapa, debidamente rotulado con nombres y apellidos.
Criterios de Exclusión :
Se excluyeron muestras que llegaron tardíamente y las que no cumplían los
requisitos previamente mencionados.
Nota: También se excluyeron las muestras formadas y las que se enviaron con
conservantes (formalina). Se había previsto que algunos de los pacientes
pudieran haber recibido antibiótico-terapia
previa al cultivo; si este dato
aparecía en la orden de laboratorio ( Paciente con CONTROL ), la muestra se
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excluía. Sin embargo; algunos de los solicitantes pudieron haber omitido este
dato.
LLENADO DE FICHAS DE DATOS:
Se procedió al llenado de fichas previamente elaboradas (ver anexo N° 1) para
cada paciente, cuyos datos se tomaron de las órdenes enviadas por el médico
tratante lo cual permitió completar todos los datos necesarios; y para un mejor
orden también se rotularon los frascos, láminas y placas para el cultivo con los
mismos números de acuerdo a las fichas respectivas.
METODOS DE DIAGNÓSTICO:
EXAMEN MACROSCÓPICO :
Para el examen macroscópico se tuvo en consideración los siguientes aspectos:
consistencia (pastosa, semilíquida, líquidas), color y presencia o ausencia de
moco y / o sangre.
EXAMEN MICROSCÓPICO :
Para el examen microscópico se utilizó el método de coloración de Vago.
1.Fijar con el mechero ( frotis delgado).
2.Colorear con :
a.Safranina por 2 min.
Lavar con agua corriente.
b.Violeta genciana por 3 min.
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Lavar con agua corriente.
Alternativa: Fuccina al 1 % por 10 seg.
Observar al microscopio con lente de inmersión, la morfología característica del
Campylobacter.
Se informó la lectura de una (1) preparación de frotis teñido con coloración de
Vagó, por cada muestra de heces, como:
POSITIVA: Evidencia de por lo menos un microorganismo por campo, en más de
10 campos observados.
NEGATIVA :Ningún organismo por campo, en el mismo número de campos
observados.
EXAMEN DEL CULTIVO:
Método de cultivo con filtro: Se realizó el cultivo de la muestra de heces,
basado en el principio que el Campylobacter pueden pasar a través
de la
membrana del filtro de acetato de celulosa (poro:0,45 øm-0,65 øm ),con relativa
facilidad, debido a su grosor, mientras otros organismos de la flora intestinal son
retenidos durante el corto tiempo de procesamiento.
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Campylobacter sp. en muestras fecales de pacientes del HNGAI
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Se procesó la muestra fecal , colocándola directamente con un asa de siembra de
platino, sobre la membrana del filtro colocada en el agar sangre de carnero al 6 %
sin antibióticos. Para efectos de reducir costos, cada filtro se dividió en dos
semicírculos, trabajando
dos muestras de
diferentes pacientes,
utilizando
aproximadamente las 2/3 partes de la placa. Se dejó la placa a temperatura
ambiente por 30 minutos, y luego se retiró con una pinza estéril la membrana del
filtro. Con otra asa de platino se sembró el 1/3 de la placa restante con una cepa
de Klebsiella sp. que brindó las condiciones de microaerofilia
y humedad
necesarias. Finalmente, se selló herméticamente con ayuda de una banda de
goma, los bordes de la placa petri, y se incubó a 42 ° C durante 48-72 hrs.
Se informó en la ficha , el resultado:
POSITIVO: Presencia de colonias pequeñas, convexas, claras, no hemolíticas,
que al realizar
el estudio directo
o
característica del Campylobacter, Las
por tinción ,mostraron
la
morfología
colonias fueron: oxidasa y catalasa
positivas. Adicionalmente se
realizaron
pruebas de
sensibilidad antibiótica por
discodifusión, para la
identificación, utilizando los discos de 30 ug de cefalotina (resistente) y ácido
nalidíxico (sensible). (29)
NEGATIVO: Ausencia de crecimiento bacteriano.
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Identificación del Campylobacter sp : Se
identificó al Campylobacter sp. por
las siguientes características: bacilo curvado en forma de “U”,“C”, “S” ó
espiralado, a la microscopía de luz (100 X), mediante la tinción de Vagó, ya sea de
la muestra de heces o de la colonia obtenida por cultivo. Las colonias eran oxidasa
y catalasa positivas. Se reportaron en la ficha como:
POSITIVA: Evidencia de microorganismos con las características mencionadas
en todos los campos observados.
NEGATIVA :Ningún organismo por campo, por lo menos en diez campos
observados.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para crear la base de datos, cuadros y gráficos se utilizó el programa de Excel
para Windows, y para poder discutir los resultados obtenidos se realizaron
pruebas estadísticas como la de Chi 2 que sirvieron
para determinar las
asociaciones entre las variables, utilizando las siguientes fórmulas:
r
X2 =
K
Ó Ó
i=1 j=1
(Oij - Eij)
Eij
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Campylobacter sp. en muestras fecales de pacientes del HNGAI
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r = n° filas de la tabla de frecuencias.
K = n° columnas de la tabla.
Oij = frecuencia observada en la i- ésima fila con la j-ésima columna
de la tabla de frecuencias
Eij = frecuencia esperada (teórica) en la i- ésima fila con la j-ésima
columna de la tabla de frecuencias.
Siendo :
Eij = f i . f j
N
Donde: N = número total de observaciones en la tabla.
F i = número de observaciones en la fila i.
F j= número de observaciones en la columna j.
Y para comparar el método directo y el cultivo se realizó la prueba estadística
de Mc Nemar.
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PRUEBA DE MAC NEMAR:
MICROSCOPIA (VAGO)
MICROCULTIVO +
-
TOTAL
+
A(VP)
B(FN)
A+B(VP+FN)
-
C(FP)
D(VN)
C+D(FP+VN)
TOTAL
A+C(VP+FP)
B+D(FN+VN)
A+B+C+D(VP+FP+VN+FN)
X2 = ( /A-D/-1)2
con g l = 1
A+D
Referencias: 30,31.
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