fcm971m - Tesis Electrónicas UACh
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1 UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE Facultad de Ciencias Escuela de Bioquímica Moléculas mediadoras de activación génica, Fak y Erks, en pacientes con Distrofia Muscular de Duchenne y en ratones Mdx Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico. Profesor Patrocinante: Sr. Ricardo Fadic - Departamento de Neurología - Facultad de Medicina – Pontificia Universidad Católica de Chile. Paola Cecilia Muñoz Reyes Valdivia Chile 2004 Profesor Co-Patrocinante Sr. Alejandro M. Reyes - Instituto de Bioquímica - Facultad de Ciencias. Dedicatoria … A mis padres Guido y María Angélica, por su amor y enseñanzas. … A mi hermana Claudia, por su alegría y amistad. … A mi familia por estar siempre a mi lado. 2 … A Marcos por su infinito amor y apoyo constante. Agradecimientos A la Universidad Austral de Chile, por confiar en mí, permitiendo que en sus aulas me desarrollara como persona y profesional. Al Dr. Alejandro Reyes y a la Dra. Ilona Concha por ser parte de la comisión de tesis. Al Dr. Ricardo Fadic, por recibirme en su laboratorio, por su continuo apoyo, consejos y orientación. A mis compañeros de laboratorio y amigos: Carolina, Katherine, Cristian, Gigliola, y Rodrigo, gracias por hacer de mi estadía en el laboratorio una experiencia inolvidable donde tuve la oportunidad de compartir y crecer como persona. A todos mis compañeros de carrera, así como a los amigos que hice en este tiempo de universidad, por compartir tantos años conmigo. El financiamiento para el desarrollo de este trabajo de tesis fue obtenido del proyecto FONDECYT 1020699. 3 ABREVIATURAS BSA : Albúmina sérica bovina CGD : Complejo de glicoproteínas asociadas a distrofina DM : Distrofia muscular DMC : Distrofia muscular congénita DMD : Distrofia muscular de Duchenne EDTA : Acido etilendiamin-tetra-acético EGTA : Acido etilen-glicol bis-(2-aminoetileter)-N, N,, N,, tetra-acético ERK : Quinasa regulada del extracelular FAK : Quinasa de adhesión focal FGF : Factor de crecimiento fibroblástico FITC : Iso-tiocianato de fluoresceína Grb2 : Receptor de factor de crecimiento unido a proteína 2 HRP : Peroxidasa de rábano MAPK : Proteína quinasa activada por mitógenos mdx : Distrofia muscular ligada al cromosoma X MEC : Matriz extracelular PBS : Tampón fosfato salino 4 PDGF : Factor de crecimiento derivado de plaquetas pERK : Quinasa regulada del extracelular fosforilada pFAK : Quinasa de adhesión focal fosforilada PMSF : Fenil-metil-sulfonil-fluoruro Ras : Proteína G monomérica o de bajo peso molecular SH2 : Región homologa de Src tipo 2 SH3 : Región homologa de Src tipo 3 5 1. RESUMEN La distrofia muscular de Duchenne (DMD), es una enfermedad secundaria a mutaciones en el gen de distrofina, proteína subsarcolemal de músculo. Esta condición es invariablemente fatal en humanos. El modelo animal para DMD es el ratón mdx, el cual presenta una mutación puntual en el gen de distrofina. Aunque genéticamente mdx y Duchenne son homólogos, fenotípicamente difieren, porque el ratón mdx tiene una sobrevida normal en cautiverio. Postulamos entonces que debe existir un punto regulatorio en la respuesta biológica a esta mutación que se comporte distinto en mdx en comparación a Duchenne, determinando fenotipos y resultados funcionales diferentes. Para probar esta hipótesis se analizaron las proteínas regulatorias de expresión génica, FAK (quinasa de adhesión focal) y ERKs (quinasas reguladas del extracelular), tanto por técnicas inmunohistoquímicas, como por análisis de Western blot. Los resultados obtenidos indican que los niveles de ERK están aumentados en ratones mdx, pFAK sólo aumenta en el periodo de pre-necrosis, en cambio FAK y pERK no tienen cambios significativos en ambos periodos. En pacientes con DMD, los niveles de ERK y pERK están aumentados, en cambio FAK y pFAK están disminuidas con respecto a sus controles. En la fibra muscular inmunofluorescencias muestran localizaciones celulares diferentes, para estas proteínas en pacientes con DMD y mdx. La diferencia descrita podría estar detrás del resultado funcional distinto ante el mismo defecto genético entre las dos especies, aportando así a la comprensión de la respuesta de la célula muscular en patología y la posibilidad de mejorarla. ABSTRACT Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a disease secondary to mutations in the dystrophin gene, a subsarcolemmal protein of muscle. This condition is invariably fatal in human. The animal model for DMD is the mdx mouse, which also present a dystrophin gene point mutation. Although genetically mdx and Duchenne are homologous, they differ phenotypically because the mdx mouse has a normal survival in captivity. We postulate that there is a regulatory point in the 6 biological response to this mutation which responds differently in mdx than in Duchenne, determining different functional results and phenotypes. To probe this hypothesis analyze the gene expression regulatory proteins, FAK (focal adhesion kinase) and ERKs (extracellular regulated kinase), both by immunocytochemistry as by Western blot. The levels of ERK are increased in mdx mice; pFAK is only increased in the pre-necrotic period. In contrast, both pERK and FAK do not have significative changes in both periods. In DMD patients, the levels of both ERK and pERK are increased, however FAK and pFAK are decreased with respect to controls. In the muscle fiber, we found that these proteins are located in different subcellular compartments in DMD compared to mdx. The difference described could explain the distinct functional result against the same genetic defect between the two species, apporting to the knowledge of muscle cell response to injury and may be a potential target for future therapies. 7 2. INTRODUCCION Las distrofias musculares son un grupo grande y heterogéneo de enfermedades hereditarias que se caracterizan por atrofia y debilidad muscular progresiva, afectando en etapas tempranas de su desarrollo a músculos específicos. El tipo de herencia, los músculos afectados, la edad de inicio de los síntomas y la progresión de la patología son algunas de las características usadas para definir los distintos subtipos de distrofias musculares. 2.1. Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) Con la identificación del gen responsable de la Distrofia Muscular de Duchenne, (Monaco y cols., 1986) y de la proteína que codifica, distrofina (Koenig y cols., 1988) por el grupo de Kunkel, se inició toda una revolución por entender esta patología. La DMD afecta a 1 de cada 3.500 niños (Kunkel y cols., 1986; Koenig y cols., 1987; Emery, 1991). Se hereda en forma recesiva ligada al cromosoma X, y es causada por mutaciones puntuales, duplicaciones o delecciones en el gen de la distrofina (Lenk y cols., 1993; Roberts y cols., 1994). Los pacientes con DMD se caracterizan por presentar elevados niveles de creatina quinasa sérica, pérdida progresiva de la fuerza muscular y coexistencia de atrofia con pseudo hipertrofia de algunos grupos musculares. Histopatológicamente sus músculos presentan gran variación en el tamaño y forma de las fibras, continuos ciclos de necrosis, degeneración y regeneración de las fibras, con un agotamiento gradual de este último proceso y el reemplazo de las fibras musculares degeneradas por tejido adiposo y tejido conectivo. Generalmente los primeros síntomas de la patología aparecen entre los 2 a 5 años de edad (Jennekens y cols., 1991) cuando se manifiestan irregularidades al caminar, subir escaleras y correr, luego la debilidad y daño muscular se acrecientan, necesitando de una silla de ruedas, entre los 7 a 12 años de edad. Finalmente la mayoría de los pacientes mueren por insuficiencia respiratoria o cardiaca, alrededor de los 20 años. 8 El gen responsable de DMD, consiste en 79 exones distribuidos en 2,5 MB (Koenig y cols., 1987; Monaco y cols., 1988) y codifica para una proteína de gran tamaño (427 kDa) denominada distrofina (Hoffman y cols., 1987), la que se expresa en músculo liso, estriado esquelético, corazón y cerebro (Hoffman y cols., 1988). En músculo normal, la distrofina se asocia con un grupo de proteínas del sarcolema, distroglicanes, sarcoglicanes, distrobrevinas, sintrofinas, sarcospan, entre otras (Campbell y Kahl, 1989; Campbell, 1995; Crosbie y cols., 1997; Wakayama y cols., 2000). Este complejo de glicoproteínas transmembrana asociadas a distrofina (CGD), conecta el citoesqueleto (filamentos de actina) de la fibra muscular, a la matriz extracelular (laminina-2) (FIGURA 1). Se piensa que la interacción entre todas estas proteínas estabiliza la periferia de la fibra muscular durante la contracción. El subcomplejo distroglicán, está formado por la proteína de superficie α-distroglicán, que se une a laminina-2, y la proteína estructural de membrana β-distroglicán, que se une a distrofina, siendo distroglicán, la columna central de unión entre proteínas intracelulares y extracelulares. La distroglicán y interacción entre α- β-distroglicán, se encuentra estabilizada por el complejo heterotetramérico, sarcoglicán (subunidades α, β, δ, y γ) (Araishi y cols., 1999). Anomalías primarias y secundarias de varios componentes de este complejo de proteínas, son responsables de la fisiopatología de varios tipos de distrofias musculares (TABLA I). Otras proteínas también están asociadas a CGD, proteínas citoesqueléticas, tales como vinculina, espectrina, α-actinina, talina e integrinas, y proteínas no citoesqueléticas, como por ejemplo, canales de sodio gatillados por voltaje, nNOS y Grb2 (Gossrau, 1998; Lakonishok FIGURA 1. Modelo esquemático del complejo de glicoproteínas asociadas a distrofina (CGD) en músculo esquelético. Se observa la unión de la matriz extracelular a través de laminina-2 con el citoesqueleto (actina) de la fibra muscular. La interacción entre α y β distroglicán, se encuentra estabilizada por el complejo heterotetramérico sarcoglicán (α,β, δ y γ) (Tomado de Durbeej y Campbell, 2002). 9 TABLA I. Tipos de distrofias musculares. Enfermedad DM Duchenne/Becker Emery-Dreifuss DM de cintura DMC 1A DMC 1B DMC 1C DMC 2A DMC 2B DMC 2C Modo de herencia Localización del gen Producto génico Modelo animal Recesiva, crom. X Recesiva, crom. X Xp21 Xp28 distrofina emerina Mdx - Autos. dominante Autos. dominante Autos. dominante Autos. recesiva Autos. recesiva Autos. recesiva 5q31 1q11 3p25 15q15 2p13 13q12 miotilina laminina A/C caveolina-3 calpaina-3 disferlina γ-sarcoglicano Lmna Cav3 Capn3 SJL Sgcg 10 DMC 2D Autos. recesiva DMC 2E Autos. recesiva DMC 2F Autos. recesiva DMC 2G Autos. recesiva DMC 2H Autos. recesiva DMC 2I Autos. recesiva DM Distal Miopatia de Miyoshi Autos. recesiva Tibial Autos. dominante DM Congénita Clásica Autos. recesiva α7-integrina Autos. recesiva 17q12 4q12 5q33 17q11 9q31 19q13 α-sarcoglicano β-sarcoglicano δ-sarcoglicano teletonina TRIM31 prot. relac. fukitina Sgca Sgcb Sgcd - 2p13 2q31 disferlina - SJL - 6q22 12q13 laminina α2 α7-integrina dy Igta7 21q22 21q22 2q37 colágeno VI α1 colágeno VI α2 colágeno VI α3 Col6α1 - Otras formas de DM Miopatia de Bethlem Autos. dominante Miopatia de Bethlem Autos. dominante Miopatia de Bethlem Autos. dominante Lista resumen de distrofias musculares, su modelo mendeliano de herencia, localización cromosomal, proteína mutada y modelo animal. (DM; distrofia muscular, DMC; distrofia muscular de cintura; Autos; autosomica, Crom; cromosoma). (Durbeej y Campbell, 2002). y cols., 1992; Williams y Bloch, 1999; Yang y cols., 1995). Los proteoglicanes, proteínas de la matriz extracelular, también pueden unirse al complejo CGD, entre estas moléculas están; perlecán, agrina, y biglicán (Bowe y cols., 2000; Peng y cols., 1998). Mutaciones que afectan a las proteínas de matriz extracelular, que se unen directa o indirectamente al CGD producen también el fenotipo histológico de distrofia muscular, es así como mutaciones en el gen de laminina-2 (inicialmente denominada merosina) produce una distrofia muscular esquelética severa, la distrofia muscular congénita (DMC) merosina negativa (Helbling-Leclerc y cols., 1995). Mutaciones en los genes de las subunidades del colágeno VI, que interactúa con laminina-2 se asocian a la miopatía de Bethlem (Speer y cols., 1996) otro subtipo de distrofia muscular. El número de proteínas asociadas al complejo CGD, continúa creciendo y todos pasan a ser candidatos para proteínas responsables por distrofia o su modificación. Por lo tanto, la teoría existente acerca de la patogenia de distrofia muscular es la interrupción de la unión entre la matriz extracelular y el citoesqueleto, que puede ocurrir por falla en el citoesqueleto subsarcolemal (Ej. DMD), a nivel del sarcolema (Ej. distrofias en cintura asociadas 11 a sarcoglicanes), o a nivel de la matriz extracelular (Ej. DMC). Este sarcolema debilitado mecánicamente se rompería más fácilmente, permitiendo el ingreso descontrolado de componentes del extracelular. Sin embargo, varias líneas de evidencia, muestran que la explicación anterior es incompleta. El fenotipo de distrofia muscular se ha encontrado asociado a mutaciones en una serie de proteínas musculares, que aparentemente no tienen función estructural de integridad del sarcolema; algunas de ellas se presentan a continuación: a) Mutaciones en el gen de la caveolina-3, asociada a una distrofia muscular en cintura (Minetti y cols., 1998; McNally y cols., 1998). b) Mutaciones en calpaína-3, una proteasa especifica de músculo (Richard y cols., 1995), y en las proteínas sarcoméricas teletonina, (Moreira y cols., 2000) y miotilina (Hauser y cols., 2000) también son responsables de distrofia muscular en humanos. c) Otras proteínas del sarcolema, involucradas en la transducción de señales a nivel de la membrana, y que su defecto se ha asociado a distrofia muscular, son las integrinas (Mayer y cols., 1997; Saher y Hildt, 1999; Hayashi, 1998). Esta evidencia nos sugiere que la expresión fenotípica de necrosis celular por falla de uno de los componentes del complejo distrofina y proteínas asociadas, puede ser el resultado de alteraciones en vías tróficas necesarias para la mantención celular, y no sólo una pura falla mecánica. 2.2. Modelo animal para Distrofia Muscular de Duchenne; El ratón mdx El ratón mdx (de muscular dystrophy X-linked), es un modelo animal de distrofia que ocurre naturalmente, debido a una mutación puntual en el gen de distrofina (Sicinski y cols., 1989). La transición de C a T en la posición 3185 que convierte un codon CAA (Glutamina), por un codon TAA que es una señal de término, en el exon 23 (Bulfield y cols., 1984), produce la interrupción prematura de la traducción de distrofina. La proteína resultante es inestable y falla en ubicarse en posición subsarcolemal. 12 Aunque el ratón mdx, es un modelo de DMD, su fenotipo es distinto al de humanos. El ratón mdx, después de un periodo de necrosis y regeneración, tiene una sobrevida normal. Histopatológicamente la necrosis y regeneración tiene un curso predecible temporalmente y ocurre en forma simultánea en todas las fibras. La necrosis ocurre entre la segunda y cuarta semana de vida (Tanabe y cols., 1986), la cual se compensa con una activa regeneración (aproximadamente a la semana 10 de vida), en donde todas las células musculares quedan en etapa de miotubos con núcleos centrales. No se produce fibrosis endomisial y no se encuentra posteriormente nueva necrosis. En cambio en las distrofinopatías de humanos, el proceso de necrosis y regeneración es focal y asincrónico, esto se acompaña de una fibrosis endo y perimisial precoz e irreversible (FIGURA 2). El músculo diafragma del ratón mdx, es el que se comporta más parecido patológicamente a los músculos humanos afectados con DMD (Cullen y cols., 1988; Stedman y cols., 1991), siendo este el que sufre de mayor fibrosis, necrosis y calcificación. Por lo tanto, tiene que haber un punto regulatorio en la respuesta biológica a esta mutación, que se comporte distinto en el ratón mdx en comparación a Duchenne, determinando fenotipos y resultados funcionales diferentes. 2.3. Integrinas, proteínas transductoras de señales Las integrinas se describieron en células musculares en 1985 (Damsky y cols., 1985), localizándose en regiones de adhesión celular, como costámeros, uniones miotendinosas y neuromusculares (Bozycsko y cols., 1989). Corresponden a glicoproteínas heterodiméricas, compuestas por dos cadenas polipeptídicas, α y β, unidas por enlaces no covalentes. Poseen un dominio extracelular prominente que se une a proteínas de MEC, un dominio transmembrana y un dominio intracitoplasmático, donde la cadena β se fija directamente a los microfilamentos de actina, a través de diversas proteínas ligadoras de actina, tales como vinculina, tensina y talina (Burridge y Chrzanowska-Woodnicka, 1996; Dedhars y Hannigan, 1996). FIGURA 2. Comparación histológica de fibras musculares de paciente con distrofia muscular de Duchenne y de ratón distrófico mdx. Tinción Hematoxilina Eosina. (A) Corte 13 de tejido muscular de paciente control. (B, C, D) Cortes de tejido muscular de pacientes con DMD, en diferentes estados de la enfermedad. (E) Corte de tejido muscular de ratón control. (F, G) Cortes de tejido muscular de ratón mdx, en etapa de necrosis (F) y en regeneración (G). (Fecha negra: muestra los núcleos; flecha en azul: muestra infiltración de tejido conectivo; flecha blanca: muestra células necróticas; asterisco amarillo: muestra células en regeneración). Entre las funciones celulares de integrinas, se conoce que participan en un importante número de eventos celulares, tales como, modulación de la expresión génica, progresión del ciclo celular, proliferación, diferenciación, adhesión y migración celular (Saher y Hildt, 1999). La actividad de las integrinas como transductores de señales es bidireccional, conducen información tanto de afuera hacia adentro de la célula, como a la inversa (Yamada, 1997). En muchos casos los eventos de señalización en ambas direcciones se han asociado con cambios estructurales en las integrinas. Sin embargo no hay evidencia todavía, que cambios conformacionales modulan la afinidad de unión a ligandos a integrinas y con ello su activación (Tsuchida y cols., 1998). 14 2.3.1. Mediadores FAK y ERKs: FAK, quinasa de adhesión focal, una proteína de 120 kDa, se expresa a partir del desarrollo embrionario (Ilic y cols., 1995) hasta la formación de todos los tejidos adultos y en muchas líneas celulares (Kornberg y cols., 1992). FAK, es una proteína tirosina quinasa citoplasmática, elemento fundamental en los sistemas de transducción mediante integrinas (FIGURA 3). La unión del ligando a integrina, provoca la activación de FAK y su auto-fosforilación en Tyr-397 (Schaller y Parsons, 1994; Schlapfer y cols., 1997). La fosforilación de esta tirosina ocurre en el sitio de unión del dominio SH2 de la familia de la proteína quinasa Src. La subsecuente fosforilación dependiente de Src, en Tyr-576 y Tyr-577, incrementa la actividad catalítica de FAK (Calalb y cols., 1995). La fosforilación en Tyr-925 genera un sitio de unión en el dominio SH2 de la proteína adaptadora Grb2. Esta última esta formada de un dominio central SH2, conocido para unir residuos de fosfotirosina y dos dominios SH3 animo y carboxilo- terminal (Lowenstein y cols., 1992). El dominio SH3 de Grb2 interactúa con la proteína SOS (Yu cols., 1994), la cual modula la actividad de Ras, finalmente resultando en la activación de Raf-1 y las MAPKs (Juliano, 1996; Hanks y Polte, 1995). FIGURA 3. Cascada de activación, vía FAK y EKRs. Modelo esquemático de activación de las proteínas FAK y ERKs, mediado por unión a integrinas y factores de crecimiento. Al unirse el ligando al receptor de integrina se activan varias proteínas, entre ellas paxilina, talina, y forman un complejo de adhesión que termina activando a FAK, esta última produce la activación de otras proteínas hasta que ERKs es fosforilada, y se transporta al núcleo produciendo la fosforilación de sustratos nucleares, con subsiguiente activación génica. (P, sitio de fosforilación; EGF, factor de crecimiento epidérmico; MEC, matriz extracelular; FN, fibronectina). 15 Se sabe que FAK participa en eventos de morfogénesis (Sorenson y Sheibani, 1999), viabilidad celular (Sonoda y cols., 1999; Almeida y cols., 2000) y media el efecto de factores de crecimiento en migración unidos a integrinas (Sieg y cols., 2000). Específicamente en músculo, la integrina β1 junto a FAK son una importante vía de señalización intracelular que regula la expresión génica muscular (Wei y cols., 2000). También dentro de los participantes de transducción de señales esta la super familia de las proteínas serina/treonina quinasas, conocidos como proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs). De amplia expresión en distintos tipos celulares, controlan procesos celulares fundamentales, tales como, proliferación, diferenciación, sobrevida y apoptosis. La activación básica de esta vía incluye a una familia de proteínas G pequeñas (Ras), y tres quinasas; una MAPK quinasa quinasa (Raf), una MAPK quinasa (MEK), y una MAPK (ERK) (FIGURA 3). 16 Una amplia variedad de hormonas, y factores de crecimiento, promueven la activación de esta vía, la mayoría de estos estímulos inducen a la proteína Ras a su forma activa y está última a la activación de Raf. Raf, es una proteína serina/treonina quinasa específica, de 74 kDa, la que en forma secuencial activa a MEK1/2, dos quinasas responsables de la doble fosforilación en tirosina y treonina de ERK 1/2 (quinasas reguladas del extracelular 1 y 2), con su subsecuente activación. Las ERKs (ERK1/2) son serina treonina quinasas de 44 y 42 kDa. de tamaño y dentro de los sustratos que son activados por está proteína se encuentran; c-Jun, c-Fos, c-Myc, c-Myb y Elk-1. En la vía MAPK, la modulación de células de adhesión a la MEC, contribuye a la reorganización morfológica requerida para la mitosis, migración y diferenciación. La adhesión mediada por integrinas a la MEC, permite una activación eficiente por factores de crecimiento de ERKs. En músculo liso de vasos sanguíneos se ha mostrado como la respuesta a fuerzas mecánicas es mediada por la interacción de integrinas con moléculas de MEC, seguidas de activación de ERKs (Goldschimds y cols., 2001). En músculo liso vascular el efecto de laminina y fibronectina en la respuesta a factores de crecimiento es similar en ERKs, pero distinta en FAK. Cultivos de estas células en fibronectina muestran una activación marcada de FAK en respuesta a PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) o FGF (factor de crecimiento fibroblástico), lo que no ocurre si están cultivadas en laminina (Morla y Mogford, 2000). 17 3. HIPOTESIS Genotípicamente el ratón mdx y pacientes con Distrofia Muscular de Duchenne son equivalentes. Fenotípicamente tanto en sobrevida, secuencia temporal de necrosis, como histopatológicamente el resultado de mutaciones en el mismo gen, difiere entre las dos especies. Por lo tanto, se plantea como hipótesis para este trabajo de tesis, que “Existen estrategias de expresión génica diferentes para las proteínas FAK y ERKs en pacientes con Distrofia Muscular de Duchenne y en ratones mdx”. 3.1. Objetivo General Comparar las cantidades, niveles de fosforilación y ubicación subcelular de las proteínas mediadoras de expresión génica, FAK y ERKs, en pacientes con DMD con sus respectivos controles, versus las obtenidas en ratones mdx. 3.2. Objetivos Específicos Evaluar tanto la cantidad como la fosforilación de dos quinasas de respuesta temprana en el proceso de transducción de señales por unión de ligandos a integrina, FAK y ERKs. A través de técnicas de Western blot, comparar la cantidad o nivel de cada una de las proteínas en estudio y así poder compararlas entre las especies. Determinar la localización de FAK y ERKs en la fibra muscular, tanto en muestras de pacientes sanos y con DMD, como en ratones mdx y c57, a través de técnicas inmunohistoquímicas. 18 4. MATERIALES Y METODOS 4.1. Materiales 4.1.1. Reactivos: De Bio Rad, Hercule, CA, USA, se obtuvo SDS y persulfato de amonio. De Dako Corporation, CA, USA, se obtuvo medio de montaje para las inmunofluorescencias (Fluorescent Mounting Medium). De Equilab, Santiago, Chile se obtuvo metanol y etanol para análisis. De Gibco BRL, USA, se obtuvo EDTA. De Invitrogen, Technologies, USA, se obtuvo glicerol, Tris, agarosa, y el conjunto de Marcador de peso molecular (Bench Mark Prestained Protein Ladder). De Merck, Darmstadt, Alemania, se obtuvo ácido acético glacial, Triton X-100, cloruro de sodio, β-mercaptoetanol, isopropanol, isopentano, pirofosfato de sodio, fluoruro de sodio, y ácido clorhídrico. De Perkin Elmer, Life Sciences, Boston, MA, USA se obtuvo el reactivo de revelado por quimioluminiscencia (Western Lighthing Chemiluminescence Reagent Plus). De Pierce, IL, USA, se obtuvo otro reactivo de revelado por quimioluminiscencia (Super Signal West dura Extendend Duration Substrate) y el ensayo de cuantificación de proteínas (Micro BCA Protein Assay Reagent). De Scheider & Schuell, Dassel, Alemania se obtuvieron las membranas de nitrocelulosa. De Sigma, Chemical CO, MO, USA, se obtuvo aprotinina, PMSF, pepstatina A, leupeptina, TEMED, paraformaldehido y bis-benzamida (Hoechst B-2883). De Laboratorios W & Z, Santiago, Chile, se obtuvo Tween 20, PBS, bis-acrilamida, acrilamida, NP40, y glicina. 4.1.2. Material Biológico: 4.1.2.1. Anticuerpos: De Sigma, Chemical CO, MO, USA, se obtuvieron anti-laminina de conejo y anti-α tubulina monoclonal de ratón. De Santa Cruz Biotechnological, USA, se obtuvieron anticuerpos policlonales de conejo, anti-pERK (Tyr 204), anti-ERK1 (K-23), anti-pFAK (Tyr 925), anti-FAK 19 (C-20), anti-distrofina (H-300), y el anticuerpo policlonal de cabra anti-pFAK (Tyr 925). También se obtuvieron, los anticuerpos secundarios como, anti-IgG de conejo y anti-IgG de cabra, ambos conjugados a peroxidasa de rábano (HRP) y anti-IgG de conejo conjugado a fluoresceína (FITC). De Pierce, IL, USA, se obtuvo anti-IgG de ratón, conjugado a HRP. 4.1.2.2. Sueros: De Gibco BRL, USA, se obtuvo suero de cabra preinmune. 4.1.2.3. Animales: Del vivero de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile, se obtuvieron los ratones mdx/mdx y controles C57BL/10, de 1 a 30 semanas de vida, cepas parentales provenientes de Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA. Estos se sacrificaron por medio de dislocación cervical, retirando los músculos diafragma y tibiales anteriores, los que fueron sumergidos inmediatamente en isopentano enfriado por nitrógeno líquido y conservado dentro de tubos con isopentano en congelador de –80 0C, para su posterior análisis. La TABLA II, muestra la cantidad de animales (n) utilizados en los experimentos. TABLA II. Número de ratones y biopsias musculares utilizados en los experimentos. Ratón c57 y mdx c57 y mdx c57 y mdx c57 y mdx c57 y mdx c57 y mdx c57 y mdx c57 y mdx Pacientes Duchenne Controles 4.1.2.4. Biopsias Musculares: Semana de vida 1 2 4 6 12 16 20 30 Cantidad por especie 2 6 2 3 3 3 5 2 Cantidad 4 3 20 Del Hospital Clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile, se obtuvieron biopsias de tejido muscular de pacientes entre 3 y 9 años de edad, con DMD y controles. Estas biopsias fueron tomadas bajo anestesia local y sedación en quirófano, retirando parte del músculo cuadriceps, con un tamaño comprendido entre 3 a 5 mm. de diámetro y 0,5 a 1 cm. de longitud. Las muestras son obtenidas con el debido consentimiento informado y escrito de los padres. Las biopsias controles corresponden a pacientes que fueron sometidos a intervenciones quirúrgicas ortopédicas. El estudio original fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Las muestras son congeladas en isopentano enfriado por Nitrógeno líquido, a –80 0C, para su posterior análisis. La TABLA II, muestra la cantidad de biopsias utilizadas. 4.2. Métodos 4.2.1. Homogeneización del Tejido Muscular: Tanto las biopsias de tejido muscular de pacientes controles y con DMD, como las muestras de músculo diafragma de ratones C57BL/10 y mdx/mdx, fueron homogeneizadas en tampón RIPA (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, NP-40 0,5 %, EGTA 2 mM, y EDTA 2 mM), pH 7,40 con inhibidores de fosfatasas (Pirofosfato de sodio 30 mM, fluoruro de sodio 100 mM, y ortovanadato de sodio 2 mM) e inhibidores de proteasas (Pepstatina 1 μg/ml, aprotinina 10 μg/ml, leupeptina 5 μg/ml, y PMSF 10 μg/ml), en ULTRA-TURRAX. Entre cada homogenizado la muestra se mantuvo en hielo. El material insoluble fue removido por centrifugación a 20.000 xg por 10 min. a 4 0C. (Osses y Brandan, 2002) 4.2.2. Análisis de Proteínas: La concentración de proteínas totales se determinó usando el método del ácido bicinconínico, el cual consiste en la formación de un complejo colorimétrico con Cu+1, formado por la reducción alcalina de Cu+2, en presencia de proteínas. Para ello cada muestra fue preparada diluyéndola 1:400 y 1:800 en el mismo tampón a un volumen final de 150 μl. La reacción se llevó a cabo en una placa multipocillo de 0,32 mm2, en la cual se mezclaron volúmenes iguales de reactivo de trabajo y de la muestra. La placa fue incubada por 2 h a 37 0C. Las mezclas de reacción fueron 21 leídas a 570 nm en un lector de Elisa Anthos 2010, determinando la concentración de proteínas totales de cada muestra, sobre la base de una curva estándar, construida en un rango de concentraciones de 0 a 30 μg/ml de BSA diluida en el mismo tampón que las muestras. 4.2.3. Electroforesis en geles de poliacrilamida. Alícuotas con 100 a 150 μg de proteína total son cargadas en geles de poliacrilamida-SDS, el cual está formado por un gel espaciador y un gel separador, preparados a partir de una solución de acrilamida: bisacrilamida (30:0,8) según las condiciones descritas por Laemmli (1970). El gel separador contiene poliacrilamida en concentración de 6 a 12 %, en tampón Tris-HCl 375 mM (pH 8,80), SDS 0,1%. El gel espaciador contiene poliacrilamida al 4%, en Tris-HCl 125 mM (pH 6,80), SDS 0,1%. Las muestras son desnaturadas, usando solución de carga para geles (Tris 62.5 mM, SDS 2,3%, glicerol 10%, β-mercaptoetanol 5%, y azul de bromofenol 0,006%) al hervirlas por 5 min. Para la corrida electroforetica se usó un tampón de corrida (Tris 25 mM, glicina 192 mM, y SDS 0,1%). 4.2.4. Electrotransferencia e Inmunodetección: Las proteínas fraccionadas, son transferidas a una membrana de nitrocelulosa por 2 h a temperatura ambiente, en un tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, y metanol 20%). Más tarde, como control de la transferencia, la membrana fue teñida con Rojo Ponceau S (Ponceau 0,1%, en ácido acético 5%) por algunos minutos y lavada con agua destilada para retirar el exceso. Los sitios no específicos de la membrana, fueron bloqueados en tampón Blotto-Tween (Tris-HCl 0,61%, NaCl 0,59%, Tween 1%, leche descremada 5%, a pH 7,70) durante 1 h a temperatura ambiente, en agitación continua. Luego se incubó con los anticuerpos primarios, anti-pERK (1:250), anti-ERK (1:500), anti-FAK (1:250), anti-pFAK (1:250) de conejo y cabra, antiαtubulina (1:1000), y anti-distrofina (1:500), todos diluidos en Blotto-Tween, durante toda la noche a 4 0C en agitación. Posteriormente se lavó 3 veces, cada 5 min, con el mismo tampón y se incubó por 2 h con sus respectivos segundos anticuerpos, conjugados a HRP, todos con dilución 22 (1:5000). Finalmente se lavó la membrana por 1 h con Blotto-Tween; seguido de 3 lavados de 5 min con el mismo tampón y 2 lavados con PBS 1X, también de 5 min., para luego ser visualizadas las proteínas a estudiar, mediante reacción quimioluminiscente por acción de HRPLuminol, bajo una película de rayos X (Fuji Photo Film CO, Tokio, Japón). Para la reutilización de las membranas se liberaron los anticuerpos de la membrana, mediante baño en solución de lavado (Tris 62,5 mM, SDS 2%, β-mercaptoetanol 100 mM, pH 6,80) por 30 min a 60 0C. 4.2.5. Inmunofluorescencia Indirecta: En el caso de las muestras de ratones c57 y mdx, los tibiales anteriores congelados en isopentano a –80 0C, se cortaron en forma seriada, con un grosor de 8 μm, en críostato Leica 1911, al igual que las muestras de músculo cuadriceps de pacientes controles y con DMD; y en orden fueron ubicados en portaobjetos gelatinizados. Posteriormente los cortes se fijaron a temperatura ambiente en paraformaldehído 4% en tampón PBS (NaH2PO4 0,1 M y NaCl 0,9%, pH 7,40) durante 30 min. Luego los cortes son lavados 3 veces, cada 5 min en PBS-Triton 0,2%, y bloqueados con suero de cabra al 10% en el mismo tampón, en cámara húmeda por 1 h. Se elimina la solución bloqueadora, y se incuba el primer anticuerpo, anti-FAK (1:50), antipERK (1:25), anti-ERK (1:25), y anti-distrofina (1:50) en cámara húmeda por toda la noche. Como control negativo, se utilizó solo suero de cabra al 10% en PBS, y como control positivo anti-laminina (1:100). Luego se lavan los cortes con PBS-Triton 0,2 %, dos veces cada 10 min. y se incuba con el segundo anticuerpo anti-IgG de la especie que originó el primer anticuerpo, conjugado a FITC, con dilución (1:200) por 1 h en cámara húmeda. Después de lavar nuevamente con PBS-TRITON, se incuba con bis-benzamida (1:10000) en PBS, para visualizar los núcleos, por 15 min. Se lava finalmente 2 veces con el mismo tampón y 1 vez con agua destilada, para ser montados los cubreobjetos en medio de montaje fluorescente DAKO. Se observan las inmunofluorescencias en Microscopio Invertido Nikon Eclipse E600. 4.2.6. Cuantificación de imagen: Las membranas reveladas por quimioluminiscencia y expuestas en papel de rayos X son escaneadas en un scaner Genius Colorpage-Vivid3X, la imagen es digitalizada en escala de grises. Se cuantifica cada banda con el programa Image J 1.32j (Laboratorio Neurociencias, 23 Centro de Investigaciones Médicas, Pontificia Universidad Católica), por densidad óptica, y corregido por α-tubulina, usado este último como control de carga. Los resultados son presentados en gráficas de barras, como el promedio de pixeles ± EEM (error estándar medio), en donde se agrupan los resultados por transferencia en Western de ratones c57 y mdx, como periodo de pre-necrosis (que incluye las semanas 1 a 6 de vida) y periodo de postregeneración (que incluye las semanas 12 a 30 de vida). Para el análisis estadístico se utilizó, tstudent, no apareado de experimentos independientes, con el programa PRISMA. 24 5. RESULTADOS Tanto en los pacientes con DMD como en ratones distróficos se observa la ausencia parcial o total de la proteína distrofina bajo el sarcolema, como resultado de diferentes mutaciones en su gen. Con el fin de corroborar nuestro modelo en estudio se analizaron previamente las muestras de tejido muscular de ratones y humanos tanto por técnicas inmunohistoquímicas, como por Western blot. 5.1. Ausencia de distrofina, en pacientes con DMD y en ratones distróficos: Muestras de músculo diafragma de ratones controles y mdx fueron homogeneizadas, separadas electroforéticamente, transferidos a membrana y reveladas por quimioluminiscencia (como se describe en métodos) utilizando el anticuerpo policlonal anti-distrofina. En la FIGURA 4 (A), se observa la ausencia de distrofina (por análisis de Western blot) en ratones mdx, comparado con ratones controles, en los cuales si está presente la proteína. A la misma membrana se le incuba con el anticuerpo α-tubulina, para comprobar que están en igualdad de carga proteica, al eliminar la primera detección de la membrana, con solución de lavado a 60o C. En la FIGURA 4 (B), se muestran criosecciones de 8 μm de grosor correspondientes a músculo tibiales anterior de ratones c57 y mdx de 12 y 20 semanas de vida, los cuales son analizados por inmunofluorescencia indirecta con FITC. Se observa que en ratones mdx hay ausencia de distrofina en el sarcolema de la fibra muscular con respecto a la musculatura control, la cual presenta una gran marca que rodea cada fibra muscular. Como control negativo, solo se incubó con segundo anticuerpo, para así eliminar fondo inespecífico. Como control positivo se utilizo anti-laminina (en verde), proteína de la membrana basal que permite visualizar la morfología de cada fibra en este caso; los núcleos son visualizados con Hoechst B-2883 (en azul). Por lo tanto se observa que las fibras musculares de ratón mdx presentan diferente tamaño y forma, con activa regeneración al presentar sus núcleos en posición central, comparada con fibras normales 25 de ratón, en las cuales hay regularidad en tamaño y forma de las fibras, además sus núcleos están en posición periférica. Entonces las muestras utilizadas en esta tesis concuerdan con el modelo descrito para músculo distrófico de ratón mdx. FIGURA 4. Ausencia de distrofina en la fibra muscular de ratones distróficos. (A) Inmunodetección para distrofina. Carriles 1, 3, 5 y 7 corresponden a ratones c57, carriles 2, 4 y 6 a ratones mdx. Se observa ausencia de distrofina en ratones mdx, comparado con ratones c57. (B) Inmunofluorescencia en cortes de tejido muscular de ratones c57 y mdx de 12 y 20 semanas. Se aprecia la ausencia de distrofina en el sarcolema de fibras musculares, en ratones mdx. Como control positivo se utilizó un anticuerpo dirigido contra laminina (en verde), con visualización de núcleos (en azul). (Fotos tomadas a magnificación de 40 X, barra corresponde a 100 μm). 26 La FIGURA 5 (A) corresponde a un gel al 6% de poliacrilamida-SDS, de homogeneizados de tejido muscular de pacientes controles y con DMD. En pacientes con DMD se presenta ausencia de distrofina en el sarcolema de cada fibra, comparada con los controles. Para verificar que todas las muestras están en igualdad de carga detectamos anti α-tubulina en la misma membrana, después de un baño en solución de lavado a 60o C. Cortes de músculo cuadriceps de pacientes sanos y con DMD, fueron analizados por inmunofluorescencia indirecta (FIGURA 5 (B)), la cual revela la ausencia de distrofina en el sarcolema de fibras musculares de pacientes con DMD. También se utilizó laminina (en verde) para observar en más detalle la morfología de fibras distróficas y así compararlas con fibras normales. Los núcleos se observan en posición periférica (en azul). Se puede observar entonces, el daño que presenta la musculatura con DMD, con infiltración de tejido conectivo, fibras de irregular tamaño y forma, comparada con fibras normales. Por lo tanto las muestras de biopsia muscular de pacientes con DMD estudiadas en esta tesis, presentan todas las características propias de la musculatura enferma con distrofia muscular. FIGURA 5. Ausencia de distrofina en la fibra muscular de pacientes con DMD. (A) Inmunodetección para distrofina. Carriles 1, 3 y 5 corresponden a pacientes con DMD, carriles 2, 4 y 6 a pacientes sanos. Se observa ausencia de distrofina en pacientes con DMD. (B) Criosecciones de músculo esquelético de pacientes controles (C1, C2) y con distrofia muscular (D1, D2) son analizados por inmunofluorescencia con FITC. Se muestra la ausencia de distrofina en el sarcolema de las fibras musculares de pacientes con DMD. Se utilizó laminina como control positivo (en verde) con visualización de núcleos (en azul). Fotos tomadas a 40X, barra corresponde a 100 μm. 27 5.2. Expresión y distribución celular de FAK en músculo esquelético distrófico 5.2.1. Niveles de FAK, en pacientes con DMD y en ratones mdx, analizados por Western blot. Para evaluar el nivel de expresión que tiene FAK en tejido muscular, se homogeneizaron muestras de músculo de ratón c57, mdx y de pacientes humanos, que son cargados en igualdad proteica (100 μg) en un gel de poliacrilamida-SDS al 7,5 %. La FIGURA 6 (A) muestra la inmunorreacción de FAK en ratones c57 y mdx de 1 a 30 semanas de vida, los resultados se 28 muestran agrupados en dos periodos de estudio, periodo de pre-necrosis (que incluye a los ratones de 1 a 6 semanas) y de post-regeneración (que incluye a los ratones de 12 a 30 semanas de edad). Se observa que los niveles de FAK en ratones distróficos no sufren cambios, comparado con los ratones controles, en ambos periodos estudiados. En la FIGURA 6 (B) se observa el resultado para FAK en muestras de tejido muscular de pacientes sanos y con DMD. Los pacientes con distrofia muscular presentan niveles disminuidos para esta proteína, en comparación a pacientes controles. La FIGURA 6 (C), muestra la gráfica de cuantificación de bandas, corregido por α-tubulina donde los resultados se presentan como el promedio de píxeles ± error estándar medio, para un n > 3 de experimentos. El análisis estadístico por test de student muestra que los niveles disminuidos de FAK en pacientes con DMD son significativos (*P < 0,05). Al contrario FAK en ratones distróficos no presenta cambios con respecto a sus controles. FIGURA 6. FAK está disminuida en DMD, y en ratón mdx no presenta cambios. (A) Inmunodetección para FAK. Se observa que no hay cambio en la inmunorreacción de esta proteína, en ratones mdx. (B) Se observa que FAK está disminuida en pacientes con DMD (D1, D2, D3, y D4), comparado con pacientes sanos (C1, C2, y C3). (C) Cuantificación de FAK, corregido por α-tubulina. La disminución de FAK en pacientes con DMD, es significativa con respecto a sus controles. (*p < 0,05), al ser analizados por test de student. Se presentan los resultados como el promedio de píxeles ± EEM, de experimentos independientes. 29 5.2.2. Localización celular de FAK en músculo esquelético de ratones mdx y de pacientes con distrofia muscular de Duchenne: Para determinar la ubicación celular de la proteína FAK en la fibra muscular, se realizaron cortes de 8 μm de grosor en músculo tibiales anterior para el caso de ratones c57 y mdx, y de músculo cuadriceps en pacientes humanos. Se analizaron por inmunofluorescencia indirecta, utilizando el segundo anticuerpo conjugado a fluoresceína. En la FIGURA 7 (A) se muestra la localización de FAK en cortes de músculo esquelético de ratones distróficos y normales de 12 y 20 semanas de vida. Esta proteína se encuentra a nivel del sarcolema de la fibra muscular, en ratones mdx, 30 al igual que en ratones con fibras musculares normales. Caso contrario ocurre para FAK, en músculo esquelético de pacientes con DMD, en donde cambia de posición sarcolémica a citoplasmática (FIGURA 7 (B)), comparado la musculatura control. 5.3. pFAK, en músculo esquelético de pacientes con DMD y en ratones distróficos Con el fin de conocer los niveles de expresión de pFAK en tejido muscular de ratón y humano, se determinó por western blot la inmunorreacción para esta proteína. En el músculo de ratón distrófico (mdx), esta proteína mostró un aumento en su expresión a edades de 1 a 16 semanas, siendo más notoria la diferencia a edades menores (1 y 2 semanas). Posteriormente se produce una disminución en su fosforilación a edades mayores (20 y 30 semanas), al compararlas con su expresión en músculo normal de ratón (FIGURA 8 (A)). Se agruparon los resultados de 1 a 6 semanas de vida del ratón, llamándolo periodo de pre-necrosis y de 12 a 30 semanas de vida como periodo de post-regeneración. Se concluyó que en el primer periodo mencionado existe un marcado aumento de pFAK en ratón mdx, en cambio en el periodo de post-regeneración no se muestra una clara diferencia. FIGURA 7. Distribución celular de FAK en músculo esquelético de ratones distróficos y de pacientes con DMD. (A) Criosecciones del músculo tibial anterior de ratones c57 y mdx de 12 y 20 semanas de vida. Ambos ratones mdx, muestran una ubicación de FAK a nivel de sarcolema. (B) Cortes de músculo cuadriceps de pacientes sanos y con DMD. FAK cambia su localización en pacientes con DMD, hacia el sarcoplasma, comparado con el paciente control. Inmunofluorescencias indirecta con FITC, en aumento de 40X, barra corresponde a 100 μm. 31 FIGURA 8. Los niveles de pFAK, están disminuidos en pacientes con DMD, y aumentados en ratón mdx en periodo de pre-necrosis. (A) Se observa que en el periodo de pre-necrosis hay un marcado aumento de esta proteína en ratones mdx, pero en el periodo de post-regeneración esta proteína no tiene una marcada diferencia en mdx. (B) Se observa que los niveles de pFAK están claramente disminuidos en pacientes con DMD, comparado con pacientes controles. (C) Cuantificación de pFAK, corregido por α-tubulina. Los resultados se presentan como el promedio de píxeles ± EEM, de experimentos independientes, (*p < 0,05) análisis t-student. 32 Al analizar la expresión de pFAK en muestras de homogeneizados musculares de pacientes sanos y con DMD, observamos que pFAK tiende a la disminución en pacientes con distrofia muscular de Duchenne, comparado con pacientes controles, ver FIGURA 8 (B). En la FIGURA 8 (C) se presenta la gráfica de cuantificación de pFAK, corregido por αtubulina, en la cual se muestra el aumento significativo de pFAK en el periodo de pre-necrosis en ratones mdx, y la disminución de pFAK en pacientes con DMD. Los resultados se muestran como el promedio de píxeles ± error estándar medio, para un n >3 de experimentos. 33 5.4. Expresión y distribución celular de ERK en músculo distrófico 5.4.1. ERK, se encuentra aumentado en músculo esquelético de pacientes con DMD y en ratones distróficos. Para evaluar la expresión de ERK en músculo esquelético, se analizaron por Western blot muestras de tejido muscular de ratones c57 y mdx a diferentes edades. Para ello se cargaron cantidades equivalentes de extractos proteicos de homogenizados musculares, en un gel de poliacrilamida-SDS al 12%. Los resultados muestran que ERK tiende al aumento en ratones mdx, comparado con sus controles tanto en el periodo de pre-necrosis, como en el de post- regeneración (FIGURA 9 (A)). Lo mismo ocurre en músculo de pacientes con DMD, donde ERK se encuentra aumentado, con respecto a pacientes sanos (FIGURA 9 (B)). En la FIGURA 9 (C), se presenta la gráfica de cuantificación de ERK, corregido por α-tubulina. Los resultados se muestran como el promedio de píxeles ± error estándar medio, para un n>3 de experimentos. Al ser analizados estadísticamente los resultados, se comprueba el aumento de ERK, tanto en músculo de ratones distróficos como en músculo de pacientes con DMD. FIGURA 9. ERK esta aumentada en pacientes con DMD, y en ratones distróficos. (A) Inmunodetección para ERK. Se muestra que los niveles de ERK en músculo esquelético de ratones mdx, están aumentados tanto en el periodo de pre-necrosis, como de post-regeneración. (B) Se observa que ERK esta aumentada en pacientes con distrofia muscular de Duchenne, comparada con los pacientes controles. (C) Cuantificación de ERK, corregido por α-tubulina. En ratones mdx, como en pacientes con DMD hay un aumento significativo de ERK con respecto a sus controles (*p < 0,05), al ser analizados por test de student. 34 5.4.2. Distribución celular de ERK en músculo esquelético distrófico: Criosecciones de músculo esquelético de ratón distrófico y normal, fueron analizadas por inmunofluorescencia, utilizando el anticuerpo anti-ERK de conejo y el fluoroforo FITC. Como se observa en las secciones de músculo esquelético de ratones mdx de 12 y 20 semanas, ERK está ubicado a nivel del citoplasma, comparado con su ubicación en el sarcolema de fibras musculares del ratón c57. En el caso de criosecciones de músculo de pacientes controles y con DMD, ERK toma una distribución celular semejante a la del músculo de ratón mdx, en pacientes con distrofia muscular, localizándose en el sarcoplasma de cada fibra muscular (FIGURA 10 (A) y (B)). 35 5.5. Expresión y distribución celular de pERK en músculo esquelético distrófico 5.5.1. La expresión de pERK no sufre cambios en músculo de ratón mdx, pero en músculo esquelético de pacientes con DMD se encuentra aumentada. Muestras de músculo diafragma son utilizados para determinar la inmunoreacción de pERK en ratones distróficos, en la FIGURA 11 (A) observamos que la expresión pERK no tiene mayores diferencias en ratones mdx, comparada sus controles, en ambos periodos estudiados (pre-necrosis y post-regeneración). Muestras de músculo cuadriceps son utilizados para determinar la inmunorreacción de pERK en pacientes con distrofia muscular de Duchenne, la FIGURA 11 (B) muestra el aumento de esta proteína en pacientes enfermos con DMD, comparado con pacientes controles. En la FIGURA 11 (C) se presenta la gráfica de cuantificación de pERK, corregido por α-tubulina. Los resultados se muestran como el promedio de píxeles ± error estándar medio, para un n >3 de experimentos. Se puede observar que pERK en ratones mdx, no tiene cambios significativos con respecto a sus controles (c57) en ambos periodos estudiados. En cambio pERK, se encuentra aumentada significativamente en pacientes con DMD (*p<0,05), con respecto a los pacientes sanos. FIGURA 10. Ubicación celular de ERK en la fibra muscular de ratones distróficos y de pacientes con DMD. (A) Cortes de 8 μm del músculo tibiales anterior de ratones c57 y mdx de 12 y 20 semanas de vida. Se muestra que en ambos ratones distróficos, ERK se ubica en posición citoplasmática, comparado con c57. (B) Criosecciones de tejido muscular proveniente de biopsias de pacientes sanos y con DMD. Se observa que ERK está distribuida a nivel citoplasmático en pacientes con DMD, comparado el paciente control. Fotos tomadas a 40X, barra corresponde a 100 μm y representativas de un n > 3 de experimentos. 36 FIGURA 11. pERK no sufre cambios en músculo de ratón mdx, pero en músculo de pacientes con DMD se encuentra aumentada. (A) Inmunodetección para pERK. Se observa que pERK en ratones distróficos no tiene mayores diferencias, comparado con los ratones c57 en ambos periodos de estudio. (B) Homogeneizados de biopsias musculares de pacientes sanos y con DMD. Se observa que pERK está aumentado en pacientes con DMD (D1, D2, D3, y D4), comparado sus controles (C1, y C2). (C) Cuantificación de pERK, corregido por α-tubulina. En pacientes con DMD hay un aumento significativo de pERK con respecto a sus controles (*p < 0,05), al ser analizados por test de student. 37 5.5.2. Localización celular de ERK fosforilado en músculo esquelético distrófico de ratón y humano: Criosecciones de músculo tibial anterior de ratones c57 y mdx de 12 y 20 semanas de vida son analizadas por inmunofluorescencia indirecta con fluoresceína. La FIGURA 12 (A), muestra una ubicación sarcolémica y nuclear para la proteína pERK en músculo esquelético de ratones mdx, a ambas edades estudiadas. En el caso de criosecciones de tejido muscular proveniente de pacientes con distrofia muscular de Duchenne, la proteína pERK muestra un patrón de localización diferente al del ratón mdx, la cual está distribuida más notoriamente a nivel nuclear que membranal (FIGURA 12 (B)). 38 5.6. Análisis comparativo de los resultados obtenidos Con el fin de comprender mejor los resultados anteriormente analizados por Western blot, y así compararlos entre especies, se resumen en la TABLA III los niveles de las proteínas estudiadas en músculo esquelético de ratón y humano. Del mismo modo, en la TABLA IV, se resume las localizaciones celulares que muestran estas proteínas en la musculatura distrófica. FIGURA 12. Localización celular de pERK en la fibra muscular de pacientes con DMD y en ratones distróficos. (A) Criosecciones del músculo tibiales anterior de ratones c57 y mdx de 12 y 20 semanas de vida. Se observa una localización de pERK a nivel de sarcolema y nuclear en ratones mdx. (B) Criosecciones de tejido muscular de biopsias de pacientes sanos y con DMD. Se muestra que la expresión de pERK esta distribuida a nivel nuclear, más que sarcolemica en pacientes con DMD. Fotos tomadas a resolución 40X, barra = 100 μm. 39 TABLA III. Cambios en los niveles de las proteínas estudiadas en músculo esquelético distrófico. Proteína Ratón mdx Pre-necrosis Post-regeneración Paciente con DMD FAK S/C S/C ↓ pFAK ↑ S/C ↓ ERK ↑ ↑ ↑ 40 pERK S/C ↑ S/C (↑ = Aumento, ↓ = Disminución, S/C = Sin cambio significativo, p > 0,05) TABLA IV. Localización celular por inmunofluorescencia de las proteínas estudiadas en la fibra muscular normal y distrófica. Proteína Ratón c57 Ratón mdx Paciente control Paciente con DMD FAK Sarcolema Sarcolema Sarcolema Sarcoplasma ERK Sarcolema Sarcoplasma Sarcolema Sarcoplasma pERK Sarcolema Sarcolema + Núcleos Núcleos Núcleos 41 6. DISCUSION La respuesta fenotípica diferente entre el ratón mdx y pacientes con distrofia muscular de Duchenne, es una oportunidad para estudiar en qué punto y cómo cambian las estrategias de expresión génica que explican la divergencia. Por ello en esta tesis se evaluó por primera vez el comportamiento de proteínas mediadoras en activación génica; FAK y ERKs en pacientes con DMD y en su modelo animal. Entre las funciones en que participan las quinasas reguladas del extracelular (ERKs), están la proliferación, diferenciación y motilidad de una amplia variedad de tipos celulares (Cobb y Goldsmith, 1995; Klemke y cols., 1997; Fincham y cols., 2000; Howe y cols., 2002). En tanto para la quinasa de adhesión focal (FAK), ella está relacionada con la migración celular (Ilic y cols., 1995; Cary y cols., 1996), proliferación (Gilmore y Romer, 1996; Zhao y cols., 1997), sobrevida celular (Frisch y cols., 1996) y la transducción de señales mediado por integrinas (Guan, 1997; Schlaepfer y cols., 1999). Por consiguiente, resulta muy interesante estudiar los niveles y localización celular de estas proteínas en esta patología muscular, ya que la diferencia fenotípica entre Duchenne y mdx podría reflejarse a este nivel regulatorio. Los resultados obtenidos en el desarrollo de esta tesis, demostraron que en músculo esquelético de ratones distróficos y de pacientes con DMD, se presentan diferencias en los niveles y localización celular de estas proteínas. Por análisis de transferencia en Western, se determinó que los niveles de FAK en músculo esquelético de pacientes con distrofia muscular de Duchenne, están disminuidos con respecto a sus niveles en la musculatura de pacientes sanos. En cambio, la musculatura distrófica de ratón no presenta cambios significativos en los niveles de esta proteína, con respecto a sus controles, en todas las edades estudiadas. Informes previos, han sugerido que FAK es una molécula clave en la activación de proteínas río abajo que regulan procesos celulares de vital importancia (Hauck y cols., 2000, 2002; Schwartz, 42 2001). Al analizar y comparar los resultados de pacientes con DMD versus mdx, se puede decir que la respuesta de activación a este nivel entre las especies difiere y el resultado funcional es mejor en el mdx. No conocemos porqué se presenta la diferencia de respuesta celular, pero ofrece un punto de partida de estudio. Por otro lado las inmunofluorescencias muestran que la quinasa de adhesión focal (FAK) se ubica a nivel de sarcolema en fibras musculares de ratones mdx, al igual que en ratones c57, en ambas edades estudiadas (12 y 20 semanas de vida). Contrariamente, en pacientes con distrofia muscular de Duchenne, FAK toma una ubicación citoplasmática en la fibra muscular comparada con los pacientes sanos, en los cuales permanece en posición sarcolemal al igual que en ratones distróficos. Al respecto, se sabe que FAK se ubica en el sarcolema de fibras del músculo soleus de ratas (Fluck y cols., 1999). Al parecer FAK está ubicada en el sarcolema, porque su activación es mediada por unión a receptores de transmembrana como integrinas, o factores de crecimiento, activando a Ras y ERK (Chen y cols., 1996). Una explicación posible entonces de la falta de activación de FAK en humanos es que en el sarcolema de estos últimos, y secundario a la ausencia de distrofina, se perdería la ubicación de FAK en este compartimento; por ende se oblitera la posibilidad de su activación por integrinas, u otros receptores de membrana. Los niveles de fosforilación de la proteína FAK (pFAK) aumentan en ratones distróficos a edades pequeñas (de 1 a 6 semanas de vida), llamado periodo de pre-necrosis, pero a edades mayores (de 12 a 30 semanas de vida) el ratón mdx no presenta cambios en los niveles de esta proteína, con respecto al ratón silvestre. Al comparar estos resultados con experimentos de otros autores, pFAK está aumentada en músculo esquelético hipertrófico de pollo y es independiente de la concentración de FAK (Fluck y cols., 1999), en este sistema al activarse pFAK se puede regular la proliferación y diferenciación mioblástica esquelética y el aumento de pFAK en cultivo de células musculares de pollo promueve la reorganización citoesquelética e influye en la actividad transcripcional y traduccional de proteínas (Giancotti, 1997; Malik y Parsons, 1996). Se puede proponer por lo tanto, que el aumento en la fosforilación de FAK en ratones distróficos de corta edad, podría ser una respuesta compensatoria, sólo necesaria en el periodo temprano. Sin 43 embargo, ¿porqué no permanece el aumento de pFAK en el periodo de post-regeneración en ratones distróficos?, es una interrogante que no ha sido resuelta todavía. En el caso de pacientes con DMD, los niveles de pFAK se encuentran disminuidos. ¿Por qué no aumenta la actividad de FAK en humanos? Sólo son posibles especulaciones: ¿Sería secundario a una falla en células satélites? Estas células musculares no pueden aumentar los niveles de fosforilación de FAK. Esta estrategia diferente podría explicar nuestra menor capacidad de adaptación a la mutación. En la quinasa regulada desde el extracelular, el ratón mdx muestra niveles aumentados de la proteína ERK a todas las edades estudiadas, además ERK está aumentado en los períodos de prenecrosis y de post-regeneración en el ratón mdx, comparado con los ratones c57. Homogeneizados de músculo esquelético de pacientes con distrofia muscular de Duchenne también muestran un aumento de la proteína ERK. Entonces, ¿hay una correlación directa entre FAK y ERK?. Tanto en ratones distróficos, como en pacientes con DMD los niveles de FAK no están aumentados, pero sí los niveles de pFAK en ratones mdx. Esto se ha descrito en otros modelos donde por ejemplo el aumento de la activación de ERK, no es dependiente de FAKmediado por integrinas, activando así vías alternativas (Juliano, 1996). Se informado que ERK2 puede disminuir la actividad de FAK-mediada por unión de ligandos a integrinas (Hughes, 1997), actuando como un regulador de control- negativo. En ambas especies ERK2 está aumentada, esto podría ser participe de la disminución de FAK. En respuesta a stress mecánico, se describió en mdx altos niveles de ERK1/2 comparado con sus controles (Taylor y cols., 2001). Entonces se podría también especular que el aumento de ERK en músculo esquelético distrófico se debe a la susceptibilidad de la musculatura al stress de la contracción muscular. En pacientes con DMD, se obtuvo un aumento en los niveles de pERK, al compararlos con músculo esquelético de pacientes controles. Caso contrario ocurrió en ratones distróficos, donde esta proteína no mostró cambios significativos con respecto a sus controles en ambos períodos de estudio (pre-necrosis y post-regeneración). Al parecer en los ratones mdx, se privilegia la fosforilación de FAK, en respuesta a mutaciones en distrofina y la consecuente cascada de 44 activación de Ras y ERK. En cambio, en pacientes con distrofia muscular de Duchenne, la respuesta principal es la fosforilación de ERK y la disminución de la actividad de FAK. Para el caso de la localización celular de ERK, ésta se encuentra en el citoplasma de las fibras musculares, tanto en pacientes con DMD como en ratones distróficos, en cambio su forma fosforilada cambia de posición en pacientes con DMD, y no en mdx. pERK se la ubica mayoritariamente en los núcleos de las fibras musculares de pacientes con DMD, en contraste con los ratones distróficos, en los cuales se observa inmunorreacción para esta proteína a nivel de sarcolema, más que en los núcleos. Esto sugiere que en pacientes con DMD, la activación de ERK, produce su translocación al núcleo, más activamente que en mdx. Se ha descrito que ERKs es translocada al núcleo y que es necesaria para la progresión de la fase G1 del ciclo celular (Aplin y cols, 2001). Se han sugerido explicaciones a la diferencia fenotípica del ratón mdx, distintas a las ya propuestas. Algunas de ellas son que las células satélites de este último tendrían una mayor capacidad replicativa, la estimulación de células satélites por factores de crecimiento fibroblásticos sería más eficiente (DiMario y Strohman, 1988), también se sugiere que el fenotipo del ratón mdx es prevenido por una compensación de distrofina, por otra proteína que estaría sobreexpresada, denominada utrofina (Sugita y cols., 1993). Es importante mencionar, que se podría argumentar que los pacientes con DMD, presentan gran heterogeneidad tanto en la presentación clínica, como en el grado de respuesta frente al fenotipo distrófico. Se intentó en lo posible incorporar pacientes de edades similares, dado que histopatológicamente las biopsias no son idénticas en su grado de compromiso distrófico. Sin embargo, pese a esta variabilidad, todas las biopsias de músculo distrófico analizadas demostraron cambios coherentes en los niveles de las proteínas estudiadas con respecto a sus controles, probablemente entonces son representativas del fenómeno biológico subyacente. En todo caso cualquier diferencia que pudiera estar detrás del resultado funcional distinto entre el ratón mdx y pacientes con Duchenne, ante el mismo defecto genético, aporta información y comprensión a la respuesta celular en esta patología muscular y la posibilidad de mejorarla. 45 6.1. Conclusiones 1. En relación con pacientes sanos, existen diferencias en los niveles de la quinasa de adhesión focal (FAK) en las quinasas reguladas desde el extracelular (ERKs) y en sus formas activas o fosforiladas, en músculo de pacientes con distrofia muscular de Duchenne. 2. Existen diferencias en la expresión de la quinasa de adhesión focal (FAK), y en las quinasas reguladas desde el extracelular (ERKs) en músculo distrófico de ratones mdx, con respecto a c57. 3. Los cambios encontrados en las cantidades de FAK y ERK y sus formas activas son diferentes en DMD y en mdx, enfermedades genotípicamente idénticas. 4. Se determinó que la localización celular de FAK y ERKs en la fibra muscular distrófica de ratones no es igual, a la de pacientes con distrofia muscular de Duchenne. 5. La respuesta entonces en niveles y localización subcelular de proteínas regulatorias de expresión son características de cada especie y éste se correlaciona tanto con la respuesta fenotípica como con el resultado funcional que es distinto en estas dos especies. 6.2. Proyecciones 1. Quedan pendientes estudiar otras proteínas, como Ras, SOS, Shc, JNK con función en la cascada de señalización río abajo de la activación de FAK y ERKs, en biopsias musculares de pacientes con DMD y en músculo distrófico de ratón. Y así comparar y analizar que vías son las que regulan los procesos celulares en la mantención muscular. 2. Lo mismo se puede realizar en estudios in vitro, experimentando con cultivos de células musculares provenientes de músculos distróficos de ratón y humanos. 3. Es evidente que hay que medir los niveles de expresión para estas proteínas cuantificando a través de RT PCR los niveles de mRNA para cada una de ellas. 4. Resulta interesante evaluar estas proteínas con función en la transducción temprana en genes, en otras patologías musculares humanas, para observar si las alteraciones específicas 46 determinadas en la distrofia muscular de Duchenne son de orden general para el resto de patologías musculares o responden solo de acuerdo al defecto primario que las origine. BIBLIOGRAFIA Almeida E.A., Ilic D., Han Q., Huack C.R., Jin F., Kawakatsu M., Schlaepfer D.D, and Damsky C.H. (2000) Matriz survival signaling from fibronectin via focal adhesión kinase to c-Jun NH(2)terminal kinase. J. Cell Biol. 149, 741-754. Aplin A.E., Stewart S.A. Assoian R.K. and Juliano R.L. (2001) Integrin-mediated adhesion regulates ERK nuclear translocation and phosphorylation of Elk-1. J. Cell Biol. 153, 273-282. Araishi K., Sasaoka T., Imamura M., Noguchi S., Hama H., Wakabayashi E., Yoshida M., Hori T., and Ozawa E. 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