Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas

Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas
Posgrado en Microbiología
IDENTIFICACIÓN DE LA FLAGELINA DE Haemophilus influenzae NO TIPIFICABLE MEDIANTE
MÉTODOS MOLECULARES E INMUNOLÓGICOS
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS (MICROBILOGÍA)
CON OPCIÓN EN: MICROBIOLOGÍA MÉDICA
PRESENTA
L.BM. JULIETA MARTÍNEZ GARCÍA
DIRECTOR DE TESIS
D.C. ROSA DEL CARMEN ROCHA GRACIA
PUEBLA, PUE.
FEBRERO, 2011
ÍNDICE GENERAL
RECONOCIMIENTOS…i
AGRADECIMIENTOS…ii
Abreviaturas…iv
RESUMEN…v
Introducción…1
Generalidades…1
Haemophilus influenzae No Tipificable…2
Determinantes de la patogenicidad…4
Patogénesis…7
Flagelo Bacteriano…9
Estructura Flagelar…10
Ensamble flagelar…11
Genética flagelar y su control…13
GEN fliC…14
Flagelina…14
Papel del flagelo en la patogénesis de la enfermedad…15
ANTECEDENTES…16
JUSTIFICACIÓN…18
OBJETIVOS…19
ESQUEMA DE TRABAJO…20
MATERIAL Y METÓDOS…21
Cepas bacterianas…21
Cultivo de cepas…21
Obtención de ADN molde…21
Diseño de oligonucleótidos…22
Reacción en Cadena de la polimerasas (PCR)…25
Secuenciación de productos de PCR…26
Técnica de purificación de banda…26
Hidridación del gen fliC Southern Blot…26
Obtención de la flegelina…28
Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (SDS-PAGE)…28
Western Blot….29
Electroelución…29
Electroforesis de Doble Dimensión…30
Preparación de la muestra proteica para Secuenciar …30
RESULTADOS…31
Caracterización del gen fliC…31
Identificación de la presencia de otros genes involucrados en la estructura flagelar…42
Identificación de la presunta flagelina de H. influenzae…47
DISCUSIÓN…58
CONCLUSIÓN…64
PERSPECTIVAS…65
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…66
APÉNDICES…77
INTRODUCCIÓN
Generalidades
El género Haemophilus se ubica dentro de la familia Pasteurellaceae formada por los
géneros Pasteurella, HAEMOPHILUS Y Actinobacillus (Krieg et al., 2002).
H. influenzae es un cocobacilo Gram negativo, no forma esporas, pleomórfico, no móvil,
aerobio y anaerobio facultativo con requerimientos exigentes para su crecimiento; este
microorganismo necesita de 2 factores presentes en la sangre: X (hemo) y V (nicotinamidaadenina-dinucleótido). Su máxima proliferación ocurre a 37°C y con un Ph 7.4 A 7.8 (Caballero ,
2000).
El término Haemophilus deriva del griego Haemo-sanggre y philos-que ama y significa que
ama la sangre.
Los miembros del género son parásitos obligados para el ser humano y son miembros de la
flora normal del tracto respiratorio superior.
H. influenzae fue aislado por primera vez por el médico alemán Emil Pfeiffer, a partir de
esputo de un enfermo de gripa durante la epidemia de influenza ocurrida de 1889-1892 (Morris,
1992).
En 1930 Margaret Pittman identificó seis tipos distintos de cepas capsuladas que designó
como serotipos y los nombró de la a-f; a las cepas no capsuladas las denominó cepas No
Tipificables (Shapiro et al., 1991).
Las cepas de H. influenzae capsuladas producen enfermedades sistémicas como
Menningitis, Epiglotitis, Neumonía, Artritis Séptica, Pericarditis, Celulitis, Bacteremia, y las cepas
no capsuladas o No Tipificables producen enfermedades localizadas como Otitis media con o su
secreción, Sinusitis, Conjuntivitis, Neumonía adquirida en la comunidad y se encuentra asociada a
la enfermedad pulmonar obstruida crónica en adultos (EPOC).
Existen 8 biotipos denominados con números romanos del I-VIII, los cuales de identifican
con base a tres pruebas bioquímicas básicas que son producción de indol, actividad de la ureasa y
actividad de la ortinina descarboxilasa. La mayoría de cepas aisladas de tracto respiratorio son
biotipo I, II o III, así, el 90% de las cepas serotipo b pertenecen al biotipo I las cuales están
asociadas más frecuentemente con la producción de meningitis y las cepas No Tipificables, en su
mayoría corresponden al biotipo II y III. Cerca del 20% de cepas de H. influenzae No Tipificable de
origen urogenital son biotipo IV (Gilsdorf et al., 1997; Sosa, 1992).
Haemophilus influenzae No Tipificable
H. influenzae es una bacteria no capsulada, Gram negativa, pleomórfica, posee forma de
bacilo y coloniza el tracto respiratorio superior, incluyendo la nasofaringe y orofaringe posterior.
La transmisión entre los hospederos generalmente ocurre a través de gotitas de saliva o por
contacto directo con secreciones respiratorias.
Las cepas de HiNT están asociadas a infecciones aguas y crónicas de tracto respiratorio,
tales como otitis media aguda (OM), Otitis media crónica con efusión, otorrea, sinusitis,bronquitis
y enfermedad pulmonar obstruida crónica.
También pueden ocasionar enfermedad invasiva como meningitis y sepsis en hospederos
inmunocomprometidos. La enfermedad de Hi NT ocurre cuando la bacteria se adhiere y
coloniza/invade células epiteliales en el tracto respiratorio o invade tejidos circundantes (Terán et
al., 2009).
El daño a la mucosa del tracto respiratorio por otro agente como un virus o el humo del
tabaco, es predisponente para que H. influenzae No Tipificable se asocie a la nasofaringe y
posteriormente pueda producir Otitis Media, Sinusitis, Bronquitis y Conjuntivitis (Murphy et al.,
1987). De igual manera, la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC), la Bronquiactasia y
la Fibrosis Cistica, se asocian con anormalidades en el especio mucociliar y predisposición a
adquirir H. influenzae No Tipificable (Rao et al., 1999). Es el segundo agente etiológico aislado de
la Otitis Media Aguda y la causa más común bacterial de Otitis Media con derrame (Giebink,
1989;Roberts et al., 1986). Se estima que este organismo causa aproximadamente un tercio de
episodios de Sinusitis Aguda y Crónica y está fuertemente asociado con exacerbaciones de
Bronquitis Crónica y de EPOC (Evans et al., 1975; Murphy et al., 1992). H. influenzae No Tipificable
representa la segunda causa bacteriana de neumonía adquirida en la comunidad, especialmente
en niños en países desarrollados, adultos mayores y pacientes con EPOC (Murphy et al., 1987;
Musher et al., 1983; Weinberg et al., 1989).Las pacientes inmunocomprometidos (Gilsdorf, 1987).
Se ha reportado que puede ser la causa de septicemia en neonatos y en mujeres parturientas
(Wallace et al., 1983). Ocasinalmente H. influenzae No Tipificable es aislado de tracto urogenital y
asociado con endometriosis, cérvicovaginitis, otras infecciones urogenitales y sepsis neonatal
(Quentin et al., 1989).
Se ha identificado que cepas de H. influenzae Nt forman biopelícula (Bakaletz et al., 2005)
la cual se define como un grupo de bacterias creciendo como una comunidad y encerradas en una
matriz polimérica, en donde el oxígeno es limitado y la tasa metabólica de estos microbios sésiles
es alterada, presenta varias funciones, incluyendo protección contra amenazas ambientales como
defensas inmunes del huésped, antibióticos y surfactantes (Jurcisek y Bakaletz, 2007).
La capacidad para producir biopelícula puede contribuir a la patogénesis de H. influenzae
NT en el caso de otitis media esta característica contribuye a la persistencia de la bacteria y la
enfermedad . Esto también en vías respiratorias del huésped es considerado como un factor que
contribuye a la enfermedad de naturaleza crónica y/o recurrente (Swords et al., 2003).