clonamiento, expresion y purificacion del gen de la nucleoproteina

CLONAMIENTO, EXPRESION Y PURIFICACION DEL GEN DE LA
NUCLEOPROTEINA DEL VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL. (Cloning,
expression and purification of nucleoprotein gene from respiratory syncytial virus)
Vásquez A(1),Manzur M(2), Rivero B (1), González P (1), Maldonado E (3), Avendaño LF (2),
Fernández JA(2). (1)Centro de Investigación y Desarrollo, Departamento de Producción,
Instituto de Salud Pública. Programas de (3)Biología Celular y Molecular y (2)Virología,
ICBM, Facultad de Medicina Universidad de Chile. <[email protected]>
Introducción: El VRS es el principal agente causal de bronconeumonia en lactantes
menores de 2 años. El análisis de la respuesta inmune contra antígenos definidos del virus
es fundamental para estudios epidemiológicos y de inmunoprofilaxis contra esta infección
viral. El VRS posee 2 antígenos inmunodominantes en su envoltura (glicoproteínas GyF).
Sin embargo, la variabilidad antigénica de estas proteínas puede ser un obstáculo en el
análisis de la respuesta inmune contra el VRS. El gen N es el más conservado entre todos
los aislados virales de VRS descritos y estudios recientes indican que la proteína que
codifica este gen es reconocida por anticuerpos y linfocitos T de sujetos inmunes contra el
VRS Objetivo: Clonar, expresar y purificar la proteína del gen codificante de la
nucleoproteína (N) del VRS, grupo A Mon3/88, cepa prototipo de aislados VRS del Cono
Sur. Métodos: Se diseñaron partidores complementarios a los extremos 5' y 3' del gen N
del VRS A2 (GenBank). Se obtuvo el cDNA por RT-PCR utilizando como templado RNA
de células Hep-2 infectadas con VRS A Mon3/88. El cDNA fue clonado en el vector
PUC19 y analizado en secuenciador automático. El gen N fue posteriormente subclonado
en el vector de expresión pET15b y transformado en E.coli BL21. La proteína expresada
fue purificada en columna Ni-NTA y analizada por SDS-PAGE y Western Blot
Resultados. El secuenciamiento parcial del gen ( 60% extremo 5') revela un 97% de
homología con el gen N de cepas VRS obtenidas en otras zonas geográficas. La proteína
fue expresada después de 2 horas de inducción a 30°C en presencia de ITPG. El análisis
mediante SDS-PAGE mostró una banda de 45 Kda aprox. La proteína fue soluble bajo las
condiciones utilizadas en la expresión y purificada utilizando los residuos de histidina
ubicados en el extremo N-terminal de la proteína. Sueros de sujetos hiperinmunes para el
VRS reaccionan con la proteína recombinante en Western-Blot. Conclusiones: El análisis
de secuenciación indica que el gen clonado corresponde al gen N del VRS. La purificada
posee propiedades bioquímicas e inmunológicas concordantes con la proteína previamente
descrita. Esta proteína será utilizada en estudios de respuesta inmune (celular) contra el
VRS. El uso de la nucleoproteína N en estos estudios podría respresentar una ventaja sobre
las glicoproteínas G y F, en las cuales la extensa varianción antigénica representa una
limitante para la detección de respuesta inmune contra el VRS.
IDENTIFICACION DEL EXPOSITOR
Abel Eduardo Vásquez Veloso
Centro de Investigación y Desarrollo, Departamento de Producción, Instituto de
Salud Pública de Chile.
Av. Marathon 1000, Ñuñoa. Santiago.
tel: 3507516
[email protected]
Modalidad: Panel