INMUNODETECCION DE Bcl-2 Y Bax EN CÉLULAS DEL EPITELIO

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INMUNODETECCIÓN DE bcl-2 EN CÉLULAS DEL EPITELIO UTERINO DE
RATAS APAREADAS DURANTE EL CICLO ESTRAL.
Mirielle Espinosa Carmona
Tutor: Dr. Marco Antonio Cerbón Cervantes
Departamento de Biología
Se sabe que durante el ciclo estral de la rata los epitelios del endometrio sufren cambios
morfológicos en respuesta a los cambios hormonales que se presentan durante el ciclo. Los
epitelios luminal y glandular proliferan en las etapas de metaestro al proestro y posteriormente
sufren degeneración celular por apoptósis en la etapa del estro (Butcher et al., 1974; Spornitz et
al., 1994; Mendoza-Rodríguez et al., 2003). La homeostasis de este tejido es el resultado del
balance entre la proliferación celular, la diferenciación y la apoptósis la cuál involucra la
participación de más de 100 genes, incluyendo la familia del gen bcl-2. La familia de la proteína
Bcl-2 esta integrada por más de 16 homólogos que se han dividido en tres grupos funcionales
(Adams y Cory, 1998; Antonsson y Martinou, 200).
Grupo I. Se caracterizan por tener cuatro dominios conservados homólogos a Bcl-2 (Dominios
BH1-BH4), aunque algunos miembros carecen del dominio BH4. Todos los miembros de este
grupo tienen actividad antiapoptótica y son: Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1 (Bfl-1) y Boo, entre
los mas importantes.
Grupo II. Consiste en miembros con actividad pro-apoptótica e incluye a proteínas como Bax,
Bak, Bad, Mtd (Bok), Diva. Estas proteínas tienen una estructura muy similar a las proteínas del
primer grupo, ya que comparten una secuencia homóloga en BH1, BH2 y BH3 pero no tienen
homología en el dominio BH4, aunque se ha encontrado un dominio similar a BH4 entre algunos
miembros de esta familia como Bcl-rambo (Kataoka et al., 2001).
Grupo III. En éste se encuentran proteínas que sólo tienen una característica en común, la
presencia del dominio BH3 que consiste de 12-16 aminoácidos (Adams y Cory, 1998). Estas
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proteínas tienen una actividad pro-apoptótica e incluye a Bik, Bid, Bim, Hrk (DP5), Blk y Bnip3,
Bnip3L.
Estudios recientes de nuestro laboratorio han reportado la expresión de Bcl-2 y Bax en las etapas
del proestro y estro en ratas intactas, por medio de inmunohistoquímica. Se ha observado una
disminución en la expresión de Bcl-2 en la transición del proestro al estro (21:00h del proestro a
las 5:00h del estro) y un aumento de Bax en este mismo intervalo de tiempo, lo cual muestra un
incremento significativo en la relación pro-apoptótica Bax/Bcl-2 (Mendoza-Rodríguez y col,
2003). Estos resultados indican que el proceso apoptótico de los epitelios del endometrio uterino
puede estar mediado por los genes de la familia de Bcl-2. Sin embargo, se desconoce si los
patrones de muerte celular son afectados por el estímulo del apareamiento-fecundación de los
animales. Por lo tanto, en el presente estudio se evaluó el efecto que tiene el apareamiento de los
animales sobre la expresión de Bcl-2 y Bax en las células epiteliales del útero de ratas apareadas,
por medio de inmunohistoquímica durante las etapas del proestro y estro.
MATERIAL Y MÉTODO.
Animales de experimentación.
Para este estudio se utilizaron ratas hembras adultas de la cepa Wistar apareadas y no apareadas
con 200-250g de peso, las cuales se mantuvieron en un ciclo de luz:oscuridad 12:12 con agua y
comida ad libitum.
Se utilizaron las ratas que presentaron por lo menos 3 ciclos regulares con una duración de cuatro
días, los cuales se determinaron por medio del análisis microscópico de frotis vaginales diarios.
Se sacrificaron por decapitación a diferentes horas durante la transición de la fase del proestro al
estro: 13:00 y 21:00 horas del proestro, y 0:00, 3:00, 6:00, 9:00 y 13:00 horas del estro. Se usaron
3 animales por cada hora de estudio. Inmediatamente después de sacrificar al animal se disecaron
ambos cuernos uterinos para su inclusión en parafina.
Procesamiento del tejido.
Una vez que se disecaron los tejidos, se fijaron en paraformaldehido al 4% en PBS durante 2
horas. Posteriormente se sometieron a un proceso de deshidratación, con soluciones de etanol al
30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% preparadas con agua DEPC, y en etanol y xilol al 100%. Se
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impregnaron en parafina a 60°C durante 30 minutos y toda la noche; posteriormente fueron
incluidos en parafina.
Preparación del tejido para IHQ
Se realizaron cortes de 5 m de grosor en micrótomo y se colocaron en laminillas tratadas con PoliL-lisina (Sigma). Los cortes histológicos se desparafinaron durante 15 minutos a 60°C
y se
rehidrataron.
Inmunohistoquímica.
Para recuperar el antígeno de interés, los tejidos se trataron en citrato de sodio 10 mM pH 6
hirviendo durante 20 minutos con un descanso intermedio de 5 minutos entre cada 10 minutos. Se
bloqueó la peroxidasa endógena con H2O2 al 3% durante 30 minutos. Posteriormente se
permeabilizó con triton X-100 al 0.5 % durante 30 minutos. Entre cada tratamiento se realizaron 2
lavados de 5 minutos con PBS.
Se bloqueó durante media hora con albúmina bovina al 5% en solución de H2O2 al 1% en PBS.
Posteriormente se incubó con el anticuerpo primario en una dilución 1:300 en PBS-Tritón 3%,
dirigido contra la proteína investigada, (Bcl-2: sc-492, Bax: sc-526, Santa Cruz Biotechnology Inc.,
Santa Cruz, CA) por 24 h a 4oC.
Para obtener el control negativo, se omitió el anticuerpo primario de Bcl-2 y Bax .El anticuerpo
primario se detectó por un anticuerpo secundario biotinilado que se incubó por 2 h en una dilución
1:100 y después con el complejo avidina-biotina por 1 h. La reacción se reveló con
diaminobencidina y se contratiñó con hematoxilina. Las células marcadas se observaron en un
microscopio de luz. La intensidad de reacción inmunopositiva obtenida en el epitelio luminal y
glandular se determinó con ayuda del programa Zeiss, capturando las imágenes de tres úteros
diferentes por cada hora estudiada y analizando todas las células de los epitelios asignando un valor
de densidad en una escala de 0 - 255 (0 = blanco, 255 = negro) a la intensidad de la tinción.
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RESULTADOS.
Las ratas apareadas presentan una mayor expresión de Bcl-2 en las últimas horas del proestro
(21:00h) y primeras del estro (0:00, 3:00 y 6:00 h) en contraste con las ratas no apareadas que
presentan una menor expresión de la proteína en este mismo intervalo de tiempo. En las ratas
apareadas Bcl-2 mostró una localización citoplasmática y nuclear; mientras que en las no
apareadas sólo se expresa en el citoplasma. La expresión de Bax se mostró disminuida en las
ratas apareadas respecto con las no apareadas y en ambas su localización fue principalmente
citoplasmática.
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CONCLUSIONES.
Las diferencias que muestran Bcl-2 y Bax a nivel de su expresión y localización en el epitelio
uterino de las ratas apareadas y las no apareadas, indican que el apareamiento de los animales
induce un cambio en la expresión de ambas proteínas, lo cual podría influir en el patrón de
muerte celular de los epitelios uterinos durante el periodo estudiado y puede participar de manera
importante durante la fertilización del huevo fecundado. En el caso de Bcl-2 ya que se observó
una localización nuclear, también podría estar participando en otros procesos moleculares dentro
del núcleo.
BIBLIOGRAFÍA.
-Adams JM y Cory S (1998). The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 281,
1322.
-Antonsson B y Martinou JC (2000). The Bcl-2 protein family. Exp Cell Res 256, 50.
-Butcher RL, Collins WE y Fugo NW (1974). Plasma concentrations of LH, FSH, prolactin,
progesterone and estradiol-17 throughout the 4-day estrous cycle of the rat. Endocrinology 94,
1704.
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-Kataoka T, Holler N, Micheau O, Marinon F, Tinel A, Hofmann K y Tschopp J (2001). Bclrambo, a novel Bcl-2 homologue that induces apoptosis via its unique C-terminal extension. J
Biol Chem 276, 19548.
-Mendoza-Rodríguez CA, Merchant-Larios H, Segura-Valdez ML, Moreno-Mendoza N, Cruz ME,
-Arteaga-López P, Camacho-Arroyo I, Domínguez R, Cerbón M (2002). Expression of p53 in
luminal and glandular epithelium during the growth and regression of rat uterus during the estrous
cyle. Mol Reprod Develop 61, 445.
-Mendoza-Rodríguez CA, Monroy-Mendoza G, Morimoto S, Cerbón MA. Pro-apoptotic signals
of the bcl-2 gene family in the rat uterus occurs in the night before the day of estrus and precedes
ovulation. Mol Cell Endocrinol. 2003 Oct 31;208(1-2):31-9.
-Spornitz UM, Rinderknecht BP, Edelmann A, Scheidegger B, Cairoli F (1994). Ultrastructure as
a basis for dating of rat endometrium. Anat Rec 238, 163.
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