biofarbo 2001 - Organización Panamericana de la Salud. Bolivia

Validación del Test de Zona como método
de diagnóstico de la capacidad fecundante
del espermatozoide humano
GONZALES A., Ana Rosa1
CORTEZ G., Jacqueline2
OLIVARES P., Jorge3
RIOS C., Eddy4
ORDOÑEZ J., Justina5
RESUMEN
Los ensayos de unión del espermatozoide a la zona pelúcida
del ovocito humano, evalúan la etapa crucial de la interacción
espermatozoide-ovocito que lleva a la fecundación. utilizan
ovocitos recuperados del tejido ovárico cadavérico y/o de ovarios
obtenidos quirúrgicamente. Uno de los ensayos más comunes
de unión, es el Test de Zona o ensayo con zonas pelúcidas
intactas.
El propósito de este trabajo fue validar el Test de Zona como
método de diagnóstico de la capacidad fecundante del
espermatozoide humano en pacientes con problemas de
infertilidad, determinar su sensibilidad y especificidad.
Identificar los valores predictivos y razones de verosimilitud y
por último correlacionar el Test de Zona con otras pruebas de
fertilidad in vitro.
El diseño de investigación utilizado fue el Test Diagnóstico.
Se estudiaron 22 pacientes infértiles y 22 fértiles de acuerdo a
cálculo de tamaño muestral.
1 Investigadora Adscrita
Instituto de Genética
2 Docente Investigadora
Instituto de Genética
3 Docente Emérito, UMSA,
Master en Genética
4 Director IINSAD - UMSA
5 Directora Lab. Gen y Vida
Instituto de Genética,
Facultad de Medicina,
Universidad Mayor de San Andrés,
Casilla 10080,
La Paz - Bolivia
PALABRAS CLAVES:
Test Diagnóstico, Test de Zona, Capacidad
fecundante, Infertilidad masculina.
Vol. IX - Diciembre de 2001
Se obtuvo resultados de sensibilidad y especificidad (100%
y 95.70% respectivamente), valores predictivos positivo y
negativo (85.70% y 100% respectivamente), razones de
verosimilitud positivo de 23% de la unión espermatozoide-zona
pelúcida, mostrando una curva ROC con puntaje de 50 como
el óptimo.
Además se realizó un análisis de asociación, observando
una correlación altamente significativa del Test de Zona con:
1) la morfología del espermatozoide normal según criterio
estricto de Kruger (r = 0.8636 y un p = 0.01); 2) la reacción
acrosómica (r= -0.7261 y un p = 0.01), 3) madurez
espermática (r = 0.5749 y p = 0.01), 4) motilidad espermática
(r = 0.857 y un p = 0.01) y 5) test hipoosmótico (r = 0.6973 y
un p = 0.01).
Se validó el Test de Zona como método confiable de
diagnóstico, se determinó que el Test de Zona es altamente
sensible y espécifico. Los valores predictivos positivo y negativo
y las razones de verosimilitud del Test de Zona indicaron que
tienen la capacidad de discriminar los pacientes
verdaderamente fértiles de los infértiles. Los resultados de
correlación entre los diversos parámetros seminólogicos
(motilidad y morfología normal) mostraron una concordancia
notable con el Test de Zona, demostrando la solidez de los
estudios, la coherencia del Test de Zona con el Gold Estándar,
y la importancia de estos para la fecundación. La reacción
acrósomica, madurez espermática y test hipoosmótico
BIOFARBO - (5)
GONZALES, CORTEZ, OLIVAREZ, RIOS, ORDOÑEZ
presentaron índices de correlación altos con el Test
de Zona, mostrando su capacidad para evaluar la
unión espermatozoide-ovocito.
Esto predice que los espermatozoides para unirse
a la zona pelúcida deben ser morfológicamente
buenos, con acrosoma indemne, con madurez
espermática y membrana plasmática intacta.
De acuerdo a los resultados obtenidos en el
presente trabajo, se concluyó que el Test de Zona
puede ser utilizado como método de diagnóstico de
la capacidad fecundante del espermatozoide humano
en pacientes con problemas de infertilidad.
ABSTRACT
The assays to sperms-zona pellucida binding to human
oocytes, tested the crucial stage of sperm-oocytes
interaction, that leads to the fecundation. It is evaluated by
using human oocytes recovered from cadaveric ovarie
tissue or ovaries obtain quirurgically. One of the most
common assays of binding, is the Zone Test or assay with
intact pellucid zones.
The porpouse of this work was to validate the Zona Test
as a diagnosis method for the fecunding capacity of the
human sperm in patients with fertility problems. Determine
it’s sensitivity and especificity. To identify it’s predictive
values and likely rates and the lats one, looking for a
correlation between Zone Test and other fertility test in vitro.
The investigation desing was: Diagnosis Test. The study
group consisted was, 22 infertile and 22 fertile patients,
according to the calculated sample size.
The sensitivity and especifity values obtained were 100%
and 95.70% respectivelly. The positive and negative
predictive values were 85.70% and 100% respectivelly. The
positive likely rates of the binding sperm-pellucid zone show
a ROC curve with a 50 mark as the optimum.
Also was made an association analysis, observing a highly
significative correlation between the Zone Test with: 1) the
normal sperm morphology according to the Kruger’s strict
criteria (r= 0.8636 and a p= 0.01), 2) the acrosome reaction
(r= -0.7261 and a p= 0.01), 3) sperm maturity (r= 0.5749
and a p= 0.01), 4) sperm motility (r= 0.857 and a p= 0.01)
and 5) hipoosmotic test (r= 0.6973 and a p= 0.01).
The Zone Test was validated as a thrusteable method of
diagnosis. It was determine that the Zone Test is highly
sensitive and especific. The predictive positive and negative
values and the likely rates of the Zone Test showed its
capacity to differenciate the real infertile patients of the
fertile. The correlation results between the different
semminological parameters (motility and normal
morphology) showed a high concordation with the Zone
Test, showing the strenght of the study and the test
coherence with the gold standard; and their importance
for fecundation. The acrosomic reaction, sperm maturity
and hipoosmotic test presented high correlation rates with
the Zone Test, showing its capacity for evaluate the oocytesperm binding.
(6) - BIOFARBO
These correlation predicts that the sperm for binding with
pelucid zone have to be morphologically goods, with onwurt
acrosome, spermatic maturity and plasmatic membrane
entire.
According to the results obtain in the present work, it is
conclude that the Zone Test can be used as a diagnosis
method of the fecundation capacity of the human sperm in
patients with fertility problems.
INTRODUCCION
La Reproducción Humana constituye una función
fisiológica e indispensable para el mantenimiento de la
especie (Comparato M., 1983), y dentro de este amplio
campo, la infertilidad es una de las áreas que concita más
interés, las causas son diversas por lo que se requiere de
un estudio meticuloso y profundo para identificarlas.
Muchas de las cuales aún son completamente
desconocidas, y han de requerir el desarrollo de las
tecnologías, mediante la elaboración de métodos que
faciliten el descubrimiento de éstos factores etiológicos.
La mayoría de los trabajos de investigación han concluido
que, aproximadamente el 46.5% de la infertilidad conyugal
se debe a un factor de origen masculino (OMS, 1992).
Por esto, el rápido avance que ha ocurrido en el campo de
la andrología durante los últimos años ha hecho necesario
el desarrollo de nuevas metodologías que permitan evaluar
de un modo más objetivo la calidad y capacidad de
fecundación del espermatozoide humano.
La habilidad del espermatozoide humano de fecundar a
un ovocito depende de la estructura del espermatozoide,
la calidad de la motilidad espermática, de la capacitación
y reacción acrosómica. La alta incidencia de infertilidad
causada por el tan llamado “factor masculino”, promovió
una intensa investigación para predecir seriamente el
potencial fecundante del espermatozoide humano tanto
in vivo como in vitro. En este intento, la unión estrecha del
espermatozoide a la zona pelúcida (ZP) es un evento
crucial en la interacción gamética que lleva a la
fecundación. Esta etapa de unión o “binding” puede
proveer una información única predictiva del potencial
fecundante del espermatozoide humano.
Los ensayos de unión del espermatozoide a la zona
pelúcida (ZP) evalúan principalmente, la etapa crucial de
la interacción espermatozoide-ovocito que lleva a la
fecundación, los investigadores Yanagimachi (1981);
Overstreet y Hembree (1976), fueron los primeros en
proponer un ensayo para evaluar la penetración de la ZP
por espermatozoides humanos usando ovocitos
recuperados de ovarios cadavéricos. Los dos ensayos más
comunes de unión a la zona más corrientemente utilizados
son: el Test de Hemizona (HZA) y el test de Zona (ZA)
(Burkman y col., 1992). Ambos bioensayos tienen ventaja
de proveer una prueba funcional homóloga para la unión
del espermatozoide a la zona comparando poblaciones
de espermatozoides fértiles e infértiles en el mismo ensayo.
Vol. IX - Diciembre de 2001
VALIDACION DEL TEST DE ZONA COMO METODO DE DIAGNOSTICO
Por tanto, estos bioensayos, pueden llegar a ser una
herramienta experimental muy útil y valiosa para el análisis
fisiológico y celular de los eventos que llevan a la
fecundación y desarrollo pre-embrionario, primordialmente
en aquellos pacientes en los que se sospecha de
desórdenes en su fertilidad. El HZA y el ZA han probado
ser altamente predictivos de un resultado de fecundación
in vitro (FIV) (Oehninger y col., 1989), inicialmente
desarrollados como un test para investigar infertilidad
masculina y predecir el potencial fecundante, también está
siendo usado para evaluar la función espermática después
de un tratamiento contraceptivo (Burkman, 1988;
Oehninger y col., 1991).
Se ha establecido que parámetros como la morfología, la
motilidad, reacción acrosómica, maduración espermática
de los espermatozoides, serían de gran utilidad para
esclarecer las posibles causas de infertilidad de origen
masculino, así como para el éxito de los bioensayos.
En nuestro país se hace necesario desarrollar modelos y
técnicas actualizadas que redunden en el mejoramiento
de los procedimientos convencionales del estudio y
diagnóstico, que permitan así un mejor manejo de la
infertilidad conyugal.
Es así que, ensayos de este tipo se hacen necesarios
implementar en nuestro medio para poder utilizarlos como
métodos predictivos del potencial fecundante del
espermatozoide humano, especialmente en aquellos
pacientes infértiles que serán sometidos a pruebas de
Reproducción Asistida como la inseminación artificial (IA),
fecundación in vitro (FIV), transferencia intratubaría de
gametos (GIFT), etc., cuya información será altamente
beneficiosa para asegurar el éxito de dicha intervención.
METODOLOGÍA
DISEÑO DE INVESTIGACIÓN: Test Diagnóstico
(Greenberg R., y col.,1998).
TAMAÑO MUESTRAL
El número total de pacientes estudiados fue de 44 (22
pacientes infértiles y 22 controles). El número de pacientes
fue calculado de acuerdo a niveles prefijados de
sensibilidad y de especificidad mínimos, y calculados en
el programa Epi info 2000.
DEFINICIONES
Los Casos fueron definidos como aquellos pacientes que
requieran un exámen de diagnóstico en infertilidad.
Los Controles fueron definidos como aquellos pacientes
que hayan embarazado a una mujer hasta dos años, que
sean elegibles de acuerdo a los criterios de exclusión e
inclusión.
De Exclusión: Varones fértiles, Varones con problemas
de enfermedades de transmisión sexual (ETS),Varones
con tratamiento de antibióticos
Controles:
De inclusión: Varones con mujeres embarazadas de 3
meses hasta individuos padres de niños antes de los dos
años, que tienen parámetros de semen que caen dentro
los rangos normales: Motilidad espermática grados II y III
mayor a 50%; concentración espermática mayor a 20
millones spz/ml; morfología espermática normal mayor a
14 % de acuerdo al criterio estricto de Kruger.
De Exclusión: Varones con problemas de infertilidad,
Varones con problemas de ETS, Individuos con hijos
mayores a los 2 años, Varones con tratamiento de
antibióticos
ESCALAS DE MEDICION
Variable resultado: Prueba de oro o Gold Estándar que
fue definida de acuerdo a los siguientes criterios: Pacientes
con una mujer embarazada de 3 meses hasta hijos de 2
años clasificados como varones fértiles, que tuvieron
parámetros seminológicos dentro del rango normal:
motilidad espermática, grados III y II mayor a 50%;
concentración espermática mayor a 20 millones de
espermatozoides/ml; y morfología espermática normal
mayor a 14% de acuerdo al criterio estricto de Kruger
(Kruger TF, 1986 ).
Variable predictora: Test de Zona, que considera como
positivo a la unión de 50 o más espermatozoides a la zona
pelúcida, y negativo a la unión menor a 50
espermatozoides a la zona pelúcida.
Se determinó fertilidad como el grupo de pacientes tanto
fértiles como infértiles.
MATERIAL BIOLÓGICO
Obtención de los ovocitos humanos cadavéricos
Los ovocitos empleados fueron proporcionados por el
Laboratorio de Reproducción y Desarrollo de la
Universidad Católica de Chile.
Los ovocitos se descongelaron y lavaron en medio Ham
F‘10 que contenía BSA 0.4 % (p/v) junto a un suave
pipeteo para quitarles las células del cúmulo. Una vez
lavados se emplearon para montar el Test de Zona.
Obtención del Líquido Seminal
El semen fue obtenido por masturbación después de un
periodo de abstinencia sexual de 3 a 5 días, para luego
ser utilizado en el Test de Zona y las otras pruebas in vitro.
MÉTODOS
CRITERIOS DE ELEGIBILIDAD
Casos:
De Inclusión: Varones que acudieron a la consulta por
problemas de infertilidad
Vol. IX - Diciembre de 2001
A los 44 pacientes (fértiles e infértiles) se les realizó las
pruebas de: Seminograma Completo, Test de Zona,
Reacción Acrosómica, Test Hipoosmótico, y Madurez
Espermática.
BIOFARBO - (7)
GONZALES, CORTEZ, OLIVAREZ, RIOS, ORDOÑEZ
Seminograma Completo
RESULTADOS
Se realizó el seminograma completo de acuerdo a
parámetros establecidos por la OMS (1992), el estudio de
la morfología se realizó de acuerdo al criterio estricto de
Kruger, este método se basa en criterios muy estrictos, es
decir cualquier pequeña anomalía convierte al
espermatozoide en morfológicamente anormal, con lo que
el valor mínimo de espermatozoides normales para
considerar una muestra morfológicamente adecuada es
tan solo del 14 %, en comparación con el 30% o más que
definen los otros métodos convencionales de análisis
morfológicos (OMS, 1992).
TEST DIAGNOSTICO
Luego de realizar el Seminograma, se procedió al lavado
de la muestra de semen por los métodos de percoll y swim
up para separar la fracción de espermatozoides mótiles
de los no mótiles y demás componentes celulares del
líquido seminal. Después se utilizó la fracción mótil de
espermatozoides para aplicar en el Test de Zona, y las
demás pruebas de fertilidad in vitro: reacción acrosómica,
test hipoosmótico, madurez espermática, además de la
morfología y motilidad.
Pruebas de Fertilidad In Vitro
Test de Zona (Overstreet 1976 actualizado por
Burkman LJ. y col.,1988)
Una vez lavados los ovocitos utilizados para este Test
fueron primeramente evaluados al microscopio y
confirmando que se encuentran en Metafase II, se dejaron
en medio Ham F‘10 más 0.4% de albúmina sérica humana
(HSA) toda la noche en una microgota debajo aceite mineral, a 370C en 5% CO2.
Al día siguiente se procesó primero la muestra seminal
realizando un lavado de percoll y swim up ajustando a
250.000 espermatozoides mótiles/ml (50.000 a 250.000
espermatozoides motiles/ml x ovocito), 50 ul de este fue
colocada bajo aceite mineral. Luego a esta gota de
espermatozoides se colocó un ovocito y se procedió a
coincubar los gametos a 370C. en 5% de CO2 durante 4
horas (Franken y col. 1986), luego de ese tiempo se lavaron
en medio Ham’F10 + HSA pipeteando vigorosamente para
remover los espermatozoides unidos inespecíficamente,
durante 4 a 5 veces, para luego ser llevados a un
portaobjetos cubriéndolo con un cubreobjeto. El número
de espermatozoides unidos a la zona pelúcida se
determinó usando microscopía de contraste de fases. Los
espermatozoides deben ser capaces de unirse a la zona
pelúcida, atravesarla y llegar al espacio perivitelino antes
de unirse a la membrana plasmática del ovocito. Se
considera Test de Zona positivo a la unión de 50 o más
espermatozoides a la zona pelúcida (Vigil y cols., 1993).
Para las Pruebas de 1) la Reacción Acrosómica (RA), se
realizó según Talbot y Chacon, modificada por M. Riffo,
Universidad de Chile, 1992; 2) la Hinchazón de los
Espermatozoides en Medio Hipoosmótico (HOS), según
Jeyendran, R.S. y col., 1984, 3) Madurez Espermática
según Terquen y Dadoune, 1983.
(8) - BIOFARBO
Fertilidad vs. Gold Estándar
TABLA No. 1
VALORES
PORCENTAJE
IC 95%
Sensibilidad
90.48
(68.2-98.5)
Especificidad
87.00
(65.3-96.6)
Valor predictivo (+)
86.40
(64.0-96.4)
Valor predictivo (-)
91.00
(69.4-98.4)
Razón de probabilidad (+)*
6.90
(2.4-20.1)
Razón de probabilidad (-)*
0.10
(0.03-0.4)
* o índice de verosimilitud
En la comparación de la Fertilidad vs. el Gold Estándar
(Tabla Nº 1) el valor de sensibilidad obtenido muestra que
el 90.48% de los pacientes infértiles tienen infertilidad
verdadera confirmado con el valor predictivo positivo VP(+)
que nos indica que del total de pacientes infértiles 86.4%
en realidad son infértiles y el índice de verosimilitud positivo
que existe una probabilidad de 6.9 veces que la prueba
detecte pacientes verdaderamente infértiles.
Mientras que la especificidad (Tabla Nº 1) nos indica que
el 87% de pacientes fértiles dieron resultados negativos
para infertilidad, confirmado con el valor predictivo negativo
VP (-) que nos indica que el 91% de los pacientes con
resultados negativos para la infertilidad verdaderamente
son fértiles, respaldado con el índice de verosimilitud
negativo(-) que nos indica que 0.1 veces es más probable
que la prueba resulte negativa en pacientes fértiles.
Fertilidad vs. Test de Zona
En la comparación del Estado de Fertilidad vs. Test de
Zona (Tabla Nº 2) el valor de sensibilidad obtenido indicó
que el 100% de los pacientes con la enfermedad (infértiles)
tuvieron una prueba positiva para la infertilidad por lo tanto,
test de zona negativo (-) confirmado con el valor predictivo
positivo(+) que nos muestra que del total de pacientes
infértiles el 95.5% verdaderamente son infértiles y el índice
de verosimilitud o razón de probabilidad positiva (+) nos
muestra que existe una probabilidad de 23 veces más que
TABLA No. 2
VALORES
PORCENTAJE
IC 95%
Sensibilidad
100.00
(80.80-99.6)
Especificidad
95.70
(76.0-99.7)
Valor predictivo (+)
95.50
(75.1-99.8)
Valor predictivo (-)
100.00
(81.5-99.6)
Razón de probabilidad (+)*
23.00
(3.4-156.50)
Razón de probabilidad (-)*
-
-
* o índice de verosimilitud
Vol. IX - Diciembre de 2001
VALIDACION DEL TEST DE ZONA COMO METODO DE DIAGNOSTICO
la prueba detecte pacientes infértiles en aquellos
verdaderamente infértiles. Mientras que la especificidad
(Tabla Nº 2) nos indica que el 95.7% de pacientes fértiles
tuvieron resultados negativos en la prueba de infertilidad,
es decir un Test de Zona positivo(+), confirmado con el
valor predictivo negativo (-), que nos indica que el 100%
de los pacientes con resultados negativos para la
infertilidad o sea Test de Zona positivo (+), verdaderamente
son pacientes fértiles y no infértiles.
TEST DE ZONA
nos indica que efectivamente el 85.7% de los pacientes
infértiles realmente son infértiles y el índice de verosimilitud
o razón de probabilidad positiva (+), que 8.3 veces es más
probable que la prueba detecte pacientes infértiles en
aquellos verdaderamente infértiles.
La especificidad, muestra que el 88% de los pacientes
fértiles nos dieron resultados negativos (-) en la prueba
para la infertilidad, es decir, Test de Zona positivo (+)
(Fig. Nº 1), confirmado con el valor predictivo negativo
(-) que nos indica que el 100% de los pacientes fértiles
con Test de Zona positivo (+) en verdad son fértiles.
TEST DE ZONA POSITIVO
TABLA No. 3
VALORES
PORCENTAJE
IC 95%
Sensibilidad
100.00
(78.1-99.5)
Especificidad
88.00
(67.7-96.8)
Valor predictivo (+)
85.70
(62.6-96.2)
Valor predictivo (-)
100.00
(81.5-99.6)
Razón de probabilidad (+)*
8.30
(2.9-24.1)
Razón de probabilidad (-)*
-
-
* o índice de verosimilitud
Determinación de los Puntos de Corte
Curva ROC
GRAFICO Nº 1
Figura Nº 1. Unión de espermatozoides humanos a la
zona pelúcida mayor a 5 (Fuente propia)
TEST DE ZONA NEGATIVO14
Se muestra los mejores puntos de corte de 40 y 50 con
respecto a la sensibilidad y especificidad del Test de Zona.
Valores Predictivos de los Puntos de Corte
TABLA No. 4
VALORES
Figura Nº 2. Unión de espermatozoides humanos a la
zona pelúcida menor a 50 (Fuente propia)
Gold Estándar vs. Test de Zona
Comparando Gold Estándar vs. Test de Zona (Tabla Nº
2), el valor obtenido para la sensibilidad muestra que el
100% de los pacientes infértiles tuvieron prueba positiva
(+) para infertilidad, es decir Test de Zona negativo (-) (Fig.
Nº 2) confirmado con el valor predictivo positivo VP(+) que
Vol. IX - Diciembre de 2001
40
50
Sensibilidad
87.17%
90.48%
Especificidad
88.00%
88.00%
Valor predictivo positivo VP(+)
77.27
86.36
Valor predictivo negativo VP(-)
90.90
91.66
Razón de probabilidad positivo
4.47
7.50
Razón de probabilidad negativo
0.13
0.10
De los 2 puntos de corte (40 y 50) que muestra la curva ROC , se
escogió como el mejor, el punto 50, ya que se aumenta tanto la
sensibilidad de 89.47% a 90.48% y la especificidad de 86.96%.
BIOFARBO - (9)
GONZALES, CORTEZ, OLIVAREZ, RIOS, ORDOÑEZ
ANÁLISIS DE CORRELACIÓN DEL TEST DE ZONA
CON OTRAS PRUEBAS IN VITRO
GRÁFICO Nº 3
Correlación entre el Test de Zona y la Reacción
Acrosómica
GRÁFICO Nº 2
En la figura Nº 4 se observa la prueba de madurez
espermática.
Figura Nº 4: Prueba de la Madurez espermática
Se observa que existe una correlación negativa r = -0.7261
entre el Test de Zona y la Reacción Acrosómica (RA) dando
un p = 0.01 estadísticamente significactivo en la prueba
de Spearman.(Steel R., y col. 1992). Resultados que
muestran que a mayor número de espermatozoides
reaccionados menor unión a la Zona Pelúcida del ovocito
y existe mayor cantidad de espermatozoides unidos a la
zona pelúcida cuando se detecta menor grado de reación
acrosómica. La prueba de la reacción acrosómica se
observa en las figuras Nº 3.
Figura Nº 3: Prueba de la Reacción Acrosómica
Ÿ
*
Ÿ Espermatozoides inmaduros
*
Espermatozoides maduros
Tinción Anilina Blue. 100X (Fuente propia)
Correlación entre el Test de Zona y la Morfología
espermática
GRÁFICO Nº 4
a) espermatozoide vivo con acrosoma intacto.
b) espermatozoide vivo con acrosoma reaccionado
Triple tinción de Talbot y Chacón Modif. 100X
(Fuente propia)
Correlación entre el Test de Zona y la Madurez
espermática
Se observa que existe una correlación positiva r = 0.5749
entre el Test de Zona y la Madurez Espermática dando un
p = 0.01 estadísticamente significativo para la prueba de
Spearman.(Steel R, y col., 1992). Resultados que muestran
que a mayor número de espermatozoides maduros mayor
unión a la Zona Pelúcida del ovocito. No observándose
unión de espermatozoides inmaduros a la zona pelúcida.
(10) - BIOFARBO
Se puede observar que existe correlación positiva r =
0.8636 entre el Test de Zona y Morfología Espermática
Normal dando un valor p = 0.01 estadísticamente
significativo en la prueba de Spearman.(Steel R, y
col.,1992). Resultados que muestran que a mayor número
de espermatozoides morfológicamente normales mayor
unión de los mismos a la Zona Pelúcida del ovocito.
Vol. IX - Diciembre de 2001
VALIDACION DEL TEST DE ZONA COMO METODO DE DIAGNOSTICO
La figura Nº 5 nos muestra el resultado de la prueba de
morfología espermática.
Figura Nº 5: Morfología espermática
de Spearman.(Steel R, y col.,1992). Resultados que
muestran que a mayor número de espermatozoides con
una membrana plasmática íntegra, mayor unión a la Zona
Pelúcida del ovocito.
——
>
——
>
——>
==>
==>
GRÁFICO Nº 6
En la figura Nº 6 se observa los resultados del Test
hipoosmótico.
Figura Nº 6: Test Hipoosmótico (TH)
: Espermatozoides con morfología anormal
: Espermatozoides con morfología normal
Tinción Giemsa.100X (Fuente propia)
TH Positivo
TH Negativo
Correlación entre el Test de Zona y la Motilidad
espermática
GRÁFICO Nº 5
A: Spz con membrana
plasmática íntegra
(Fuente propia)
B: Spz con membrana
plasmática no íntegra
(Fuente propia)
DISCUSION
Se observa que existe una correlación positiva r = 0.857
entre el Test de Zona y la Motilidad Espermática dando un
valor p = 0.01 estadísticamente significativo en la prueba
de Spearman.(Steel R, y col., 1992). Resultados que
muestran que a mayor número de espermatozoides mótiles
(grado III y II) mayor unión a la Zona Pelúcida del ovocito.
Correlación entre el Test de Zona y el Test
Hipoosmótico
Se observa que existe una correlación positiva r = 0.6973
entre el Test de Zona y el Test Hipoosmótico dando un
valor p = 0.01 estadísticamente significativo en la prueba
Vol. IX - Diciembre de 2001
Ante la disyuntiva de aumentar el número de pruebas o
escoger una sola prueba para diagnosticar pacientes con
problemas de infertilidad, abaratando los costos, es que
se planteó el Test Diagnóstico para establecer si la prueba
del Test de Zona verdaderamente sirve para diagnosticar
la capacidad fecundante del espermatozoide humano en
pacientes infértiles. Las pruebas estadísticas del Test
Diagnóstico nos da la probabilidad estimada de discriminar
a los pacientes infértiles de los fértiles, y poder predecir la
capacidad fecundante del espermatozoide humano con el
Test de Zona.
La zona pelúcida constituye un sitio crítico en la interacción
gamética durante las etapas tempranas de la fecundación
y, por lo tanto, la unión del espermatozoide a la zona es un
requisito esencial del proceso de fecundación. Para que el
espermatozoide sea capaz de atravezar la zona pelúcida
in vitro deberá previamente haber experimentado el
proceso de capacitación, exibir movilidad hiperactivada,
poseer receptores que le permitan unirse a la zona y
experimentar la reacción acrosómica. Dado que la zona
BIOFARBO - (11)
GONZALES, CORTEZ, OLIVAREZ, RIOS, ORDOÑEZ
pelúcida cumple un rol esencial en la interacción gamética,
la falta de unión de los espermatozoides a la zona y/o su
incapacidad para penetrarla se asocia a ciertas causas
de infertilidad masculina (Smith R., 1992)
La cuantificación de la habilidad que presenta el
espermatozoide humano para unirse a la zona pelúcida
debe dar una indicación de su capacidad fecundante, al
menos in vitro (Thomas P y Meizel S.,1986).
Aún cuando en los programas de FIV-TE es posible
recuperar un número apreciable de ovocitos maduros in
vivo, estos ovocitos son escasos para ser usados de rutina
en la evaluación de la capacidad fecundante, lo cuál obliga
a buscar otras fuentes de ovocitos que cumplan este
propósito. Por otra parte, el utilizar ovocitos frescos es
objetable desde el punto de vista ético. Las zonas pelúcidas
utilizadas en los Test de Zona en humano pueden ser
colectadas de ovocitos, obtenidos por aspiración folicular
en programas de FIV-TE, estos ovocitos son almacenados
en soluciones salinas hipertónicas o criopreservadas. Este
tipo de tratamiento mata al ovocito y, por lo tanto, el ovocito
es incapaz de llevar a cabo los mecanismos de bloqueo a
la polizoospermia, con lo cuál serán varios los
espermatozoides que podrán unirse y atravesar la zona
alcanzando el espacio perivitelino. En contraste, el Test
de Zona en ovocitos humanos no viables no permite
evaluar otros aspectos esenciales de la capacidad
fecundante del espermatozoide, tales como la fusión con
la membrana plasmática del ovocito y la decondensación
de la cromatina en el citoplasma ovular.
El uso de este sistema de diagnóstico ha sido posible
gracias al descubrimiento de que la capacidad de unir
espermatozoides a la zona pelúcida humana se puede
preservar indefinidamente, si los ovocitos se conservan
en una solución altamente salina que contenga cloruro de
magnesio 1.5 M y 0.1% de dextrano (Osman RA., y col.,
1989, citado por Gomez E., y col., 1997). Como
consecuencia de este descubrimiento es posible
almacenar los ovocitos no fecundados del programa de
fecundación in vitro (FIV), y reutilizarlos con fines
diagnósticos para estudiar la competencia fucional de los
espermatozoides de los pacientes.
Estas características pueden ser estudiadas utilizando el
test de penetración de ovocitos de hamster. El Test de
Hamster y el Test de Zona evalúan aspectos diferentes
aunque complementarios de la función espermática (Smith
R., 1992).
Estudios realizados con el objeto de determinar la utilidad
de este bioensayo (Test de Zona) como predictor de la
fertilización in vitro humana señalan que la penetración
de los espermatozoides al espacio perivitelino puede
predecir los resultados de la FIV en el 90% de los casos
estudiados, el 10% de falsos negativos observados
(bioensayo (-) y fertilización (+)) puede ser atribuible a la
variabilidad en la calidad de los ovocitos utilizados. Por
otra parte, no se encontró una correlación significativa entre
el número de espermatozoides unidos a la zona y la
presencia de espermatozoides en el espacio perivitelino.
En este ensayo, la ausencia de espermatozoides en el
espacio perivitelino es indicativo de alteraciones a nivel
de la capacitación, reacción del acrosoma o efectividad
de las enzimas intraacrosomales.
El reconocimiento entre el espermatozoide y la zona
pelúcida es un acontecimiento específico de gran
importancia que inicia una cascada de interacciones que
culminan con la fecundación del ovocito. La especificidad
de esta interacción es extremadamente importante y para
que exista ésta, el espermatozoide ha producido
receptores de superficie que solamente se unirán a una
proteína de la zona pelúcida, la ZP3. A pesar de lo
conservada que está la secuencia de péptidos de la
molécula de ZP3, la unión de la zona pelúcida con el
espermatozoide es un proceso muy específico.
(12) - BIOFARBO
La habilidad de los espermatozoides humanos para
fertilizar el ovocito es dependiente de la estructura del
esperma, de la calidad del esperma, motilidad y
capacitación. La elevada incidencia de la infertilidad
humana causada por el así llamado factor masculino ha
promovido una intensa búsqueda para una exacta causa
para predecir el potencial fértil del espermatozoide humano
in vivo e in vitro. El ensayo humano óptimo podía utilizar
idealmente ovocitos humanos fertilizados vivos. Razones
éticas, como fuese, previenen a los científicos y médicos
para realizar una contribución al diagnóstico funcional
directo (Overstreet, 1976). Como fuere ensayos de
pronóstico exactos y de discriminación son necesarios para
determinar que hombres infértiles son los probables para
ejecutarles fertilización in vitro o in vivo.
De acuerdo al resultado obtenido en la Tabla Nº 1 de
comparación entre la prueba de la Fertilidad vs. Gold
Estándar podemos observar que los parámetros
considerados (Gold Estándar) son capaces de discriminar
el 90% de los pacientes infértiles y el 87.5% de los fértiles
habiendo un 10 y 13% de falsos positivos y falsos negativos
respectivamente, esto podría deberse a que la
espermatogénesis tiene una duración de 72 días, lo que
significa que cada 72 días los parámetros seminológicos
podrían variar en cada ciclo de división celular; por otro
lado, si bien el estado de embarazo de la pareja es el
parámetro más fidedigno de un paciente fértil, el tiempo
transcurrido de un embarazo a otro también podría cambiar
los parámetros de fertilidad.
De ahí que es importante validar el Test de Zona como
una de las pruebas más específicas para evaluar la
capacidad fecundante del espermatozoide humano y
diagnosticar a los pacientes verdaderamente infértiles.
A diferencia de las pruebas rutinarias de los parámetros
seminológicos, el Test de Zona, tiene la característica particular de permitir la visualización de los espermatozoides
que efectivamente se unen a la zona pelúcida de los
ovocitos, (Figs. Nº 1 y 2), donde se puede observar un
Test de Zona positivo y Test de Zona negativo, de ahí su
Vol. IX - Diciembre de 2001
VALIDACION DEL TEST DE ZONA COMO METODO DE DIAGNOSTICO
significación clínica es determinante a la hora de decidir si
un paciente es fértil o infértil, además, por estas
connotaciones es ampliamente utilizada en programas de
Reproducción Asistida de alta complejidad como la
Fertilización in vitro (FIV), Inyección intracitoplasmática
(ICSI), etc.
Como se muestra en la Tabla Nº 2 y las Figs. 1 y 2;
utilizando el Test de Zona se pudo constatar que esta
prueba es capaz de detectar el 100% de los pacientes
infértiles y aproximadamente el 96% de pacientes fértiles,
por lo tanto, esta prueba resultó ser de mayor sensibilidad
y especificidad en relación al Gold Estandar debido a
explicaciones anteriormente citadas, sin embargo, el Test
de Zona aún no es capaz de discriminar aproximadamente
un 4% de pacientes fértiles, porcentaje mínimo poco
significativo.
Estos resultados fueron similares a los encontrados por
Morales P. (1999), con un 94.1% de sensibilidad y 100%
de especificidad, donde en el estudio que realizaron, los
espermatozoides de los 42 pacientes fueron capaces de
penetrar al espacio perivitelino del ovocito cadavérico así
como del ovocito humano fertilizado in vitro. En 3 individuos
no existió penetración en el espacio perivitelino del ovocito
cadavérico y no se detectó fertilización in vitro. Solo 2
pacientes fueron capaces de fertilizar a los ovocitos
normales sin haber podido penetrar en el ovocito
cadavérico, determinando de esta manera el valor
predictivo de la penetración del espermatozoide en el
espacio perivitelino del ovocito cadavérico humano en el
resultado de la fertilización in vitro. De acuerdo a estos
resultados sugiere que la penetración espermatozoidezona pelúcida es un bioensayo útil para predecir el
potencial de fertilidad masculina en una fertilización in vitro.
De acuerdo a la Tabla Nº 3 de comparación del Gold
Estandar con relación al Test de Zona, se pudo verificar
que utilizando ambas pruebas, discriminan al 100% de
pacientes infértiles, por lo tanto, aumenta la sensibilidad
en desmedro de la especificidad, lo que no tiene mayor
importancia debido a que muestra un valor clínicamente
aceptable para todas las pruebas.
Los resultados obtenidos en las Tablas Nº 2 y 3, con la
prueba del Test Diagnóstico, muestran que el Test de Zona
es capaz de mostrar la capacidad fecundante del
espermatozoide humano en forma estadística significativa,
indicándonos que a una disminución en la capacidad de
unión de los espermatozoides a la zona pelúcida, implica
la causa principal de falta de fertilización en ciertos
pacientes que tienen problemas de infertilidad masculina,
por lo tanto, nos dan una información fisiopatológica muy
útil de la interacción espermatozoide-zona pelúcida.
Los datos de las Tablas Nº 1, 2 y 3 nos muestran que los
valores resultantes de sensibilidad elevada (90.48, 100 y
100% respectivamente) son clínicamente útiles para
diagnosticar infertilidad, que como dijimos anteriormente
son confirmados con el cálculo de los valores predictivos
Vol. IX - Diciembre de 2001
positivos (86.4, 95.5 y 85.7% respectivamente) y las
razones de probabilidad positiva ( 6.9, 23 y 8.3
respectivamente), los cuales nos orientan de manera
directa a la estimación de la probabilidad de la infertilidad.
Por el contrario, los valores de especificidad resultantes
en el presente trabajo (87, 95.7 y 88% respectivamente),
también dieron porcentajes de probabilidad elevados, que
significa que las personas fértiles (sin la enfermedad) se
diagnostiquen; confirmado con los valores predictivos
negativos (91, 100 y 100% respectivamente), y con las
razones de probabilidad negativa (0.1, 0 y 0
respectivamente); por lo tanto, estos parámetros
estadísticos permiten diagnosticar a las personas que son
efectivamente fértiles.
La curva ROC para el Test de Zona (Gráfico Nº 1) mostró
el puntaje de 50 como óptimo, de acuerdo a los porcentajes
de sensibilidad y especificidad, de esta manera podemos
clasificar como paciente fértil o Test de Zona positivo a la
unión de 50 o más espermatozoides a la zona pelúcida y,
como paciente infértil o Test de Zona negativo a la unión
menor a 50 espermatozoides a la zona pelúcida; valores
similares de punto de corte fueron descritos por Vigil y
col., 1993, para definir pacientes fértiles e infértiles.
La Tabla Nº 4 muestra los dos mayores puntos de corte
(40 y 50), sin embargo, el punto de corte de 50 aumenta la
sensibilidad y especificidad en relación al punto de corte
de 40, de ahí que los valores predictivos del punto de corte
de 50 es el resultado deseado de discriminación entre
fértiles e infértiles.
Los resultados del análisis de correlación entre los diversos
exámenes, reacción acrosómica, madurez espermática,
test hipoosmótico,, motilidad y morfología espermática con
el Test de Zona muestran una concordancia notable
(Gráficos Nº 2 - 6 ).
Por tanto, para evaluar la capacidad fecundante del
espermatozoide humano, es importante tomar en cuenta
los principales eventos que nos llevan a la fecundación,
como la capacitación espermática, reacción acrosómica y
la unión espermatozoide-zona pelúcida. Es por esto que
la fecundación se entiende mejor cuando se analiza
después de conocer la maduración final de los gametos y
los procesos que intervienen en su acercamiento, motivo
por el que se tomaron en cuenta estos parámetros para
su evaluación in vitro en el presente trabajo.
CONCLUSIONES
1.
El presente trabajo ha logrado demostrar que el
Test de Zona tiene mayor sensibilidad y
especificidad que las otras pruebas.
2.
Se validó el Test de Zona como método confiable
de diagnóstico de la capacidad fecundante del
espermatozoide humano en pacientes con
problemas de infertilidad.
BIOFARBO - (13)
GONZALES, CORTEZ, OLIVAREZ, RIOS, ORDOÑEZ
3.
Se determinó que el Test de Zona es altamente
sensible (90.48%) y específico (86.96%), para
detectar los pacientes verdaderamente infértiles
y fértiles.
4.
Los valores predictivos positivo y negativo y las
razones de verosimilitud del Test de Zona indican, así mismo, que tienen la capacidad de
discriminar los pacientes verdaderamente fértiles
e infértiles.
5.
6.
7.
Los resultados de correlación entre los diversos
parámetros seminológicos (motilidad y morfología
normal) muestran una concordancia notable con
el Test de Zona, demostrando la solidez de los
estudios, la coherencia del Test de Zona con el
Gold Estándar, y la importancia de estos para la
fecundación.
Los índices de correlación altos entre la reacción
acrosómica, madurez espermática y Test
Hipoosmótico con el Test de Zona, muestran la
importancia de los mismos para favorecer la unión
espermatozoide-ovocito, evento trascendental en
la fecundación.
El Test de Zona junto con las pruebas de fertilidad
in vitro coadyuvan con el diagnóstico de la
capacidad fecundante del espermatozoide
humano.
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