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ENZIMAS
Enzima
Requerimientos
Actividad
• Buffer de reacción
•
(Tris-HCl, NaCL, MgCl2,
KCl, DTT)
•
•
ATP
•
• BSA
• Incubación a
temperatura adecuada •
(37ºC- 65ºC)
B
Endonucleasas
de
Restricción
Tipo I
B
•
• Buffer de reacción
•
(Tris-HCl, NaCL, MgCl2,
KCl, DTT)
•
• BSA
• Incubación a
•
temperatura adecuada
(37ºC- 65ºC)
B
Endonucleasas
de
Restricción
Tipo II
B
•
•
• Buffer de reacción
•
(Tris-HCl, NaCL, MgCl2,
KCl, DTT)
•
•
ATP
•
• BSA
• Incubación a
temperatura adecuada •
(37ºC- 65ºC)
B
Endonucleasas
de
Restricción
Tipo III
B
•
Sistemas de
Restricción
Metilasa
dependientes
mrr
Sistemas de
Restricción
Metilasa
dependientes
mcrA
Sistemas de
Endonucleasa
de •
dsDNA.
ATP dependiente
La misma proteína
tiene
actividad
metilasa
La enzima corta el
DNA y queda unida
al mismo.
Sitios
de
reconocimiento no
palindrómicos
Endonucleasa
de •
dsDNA
No
son
ATP
dependientes
La
actividad
de
clivaje y metilasa
están separadas
Sitios
de
reconocimiento 4-6
pb palindrómicos
Dejan
extremos
romos, 5´extendidos,
3´extendidos.
Endonucleasa
de •
dsDNA.
ATP dependiente
La misma proteína
tiene
actividad
metilasa
La enzima corta el
DNA y no queda
unida al mismo
Sitios
de
reconocimiento no
palindrómicos
• Buffer de reacción
(Tris-HCl, NaCL, MgCl2, •
KCl, DTT)
• BSA
• Incubación a
temperatura adecuada
(37ºC- 65ºC)
• Buffer de reacción
(Tris-HCl, NaCL, MgCl2, •
KCl, DTT)
• BSA
• Incubación a
temperatura adecuada
(37ºC- 65ºC)
• Buffer de reacción
B
B
B
B
Reconoce y digiere
dsDNA
sitios
conteniendo
metilación en la
posición m6A .
P
P
Reconoce y digiere
dsDNA
sitios
conteniendo
metilación en la
posición m5CG .
P
1
P
Ejemplos
Restricción
Metilasa
dependientes
mcrB
(Tris-HCl, NaCL, MgCl2,
KCl, DTT)
• BSA
• Incubación a
temperatura adecuada
(37ºC- 65ºC)
• Buffer de reacción
(Tris-HCl, NaCL, MgCl2,
KCl, DTT)
• BSA
• Incubación a
temperatura adecuada
(37ºC- 65ºC)
•
• Buffer de reacción
•
B
B
B
Homing
Endonucleasas
dam Metilasa
•
•
(Tris-HCl, NaCL, MgCl2,
KCl, DTT, EDTA)
• BSA
• S-adenosilmetionina
• Incubación a
temperatura adecuada
(37ºC- 65ºC)
B
• Buffer de reacción
(Tris-HCl, NaCL, MgCl2,
KCl, DTT, EDTA)
• BSA
• S-adenosilmetionina
• Incubación a
temperatura adecuada
(37ºC- 65ºC)
• Buffer de reacción
B
•
(Glicina-KOH, MgCl2,
β-mercaptoetanol)
• Incubación a 37ºC
B
B
•
Exonucleasa III
• Buffer de reacción
(Tris-HCl, MgCl2,)
B
B
P
Endonucleasa de
•
dsDNA.
Sitios
de
reconocimiento
largos (12-40 pb),
asimétricos.
Secuencias
codificantes dentro
de intrones (llevan
prefijo I-) o inteínas
(llevan el prefijo PI-).
Digestión y
mapeo de
genomas
grandes.
Introduce
grupos •
metilo en dsDNA en
la posición N6 de la
Adenina
si
encuentra
la
secuencia GATC.
Inhibe el corte de
endonucleasas que
reconocen ese sitio.
Bloquea y
protege la acción
de algunas
enzimas. de
restricción que
reconocen
GATC, Ej: MboI
(GATC) es
sensible, sin
embargo Sau3AI
(GATC) no es
sensible a dam
metilación.
Bloquea
y
protege la acción
de
algunas
enzimas.
de
restricción
que
reconocen
CCAGG
o
CCTGG.
P
P
Introduce
grupos •
metilo en dsDNA en
la posición C5 de la
Citocina interna si
encuentra
la
secuencia CCAGG o
CCTGG.
P
•
B
Exonucleasa I
•
B
B
Metilasa
mEcoRI
•
(Tris-HCl, NaCL, MgCl2,
KCl, DTT, EDTA)
• BSA
• S-adenosilmetionina
• Incubación a
temperatura adecuada •
(37ºC- 65ºC)
• Buffer de reacción
dcm Metilasa
P
B
B
Reconoce y digiere
dsDNA
sitios
conteniendo
metilación en la
posición Pum5C
•
P
Cataliza
la •
transferencia de un
grupo Metilo de una
s-adenosilmetionina
(sam) a una de las
adeninas
de
la
secuencia
de
reconocimiento de
EcoRI (GAA´TTC)
Cataliza la remoción •
de nucleótidos de
ssDNA
en
la
dirección 3´a 5´.
Cataliza la remoción •
de nucleótidos de un
hidroxilo 3´ terminal
de un dsDNA.
Dirección 3´a 5´.
2
Bloquea el sitio
de
reconocimiento
de EcoRI
Estudio
de
regiones de DNA
por
deleciones
controladas.
• Incubación a 37ºC
•
•
•
Exonucleasa
Lambda
• Buffer de reacción
•
•
(Glicina-KOH, MgCl2,)
•
BSA
• Incubación a 37ºC
B
B
•
•
Exonucleasa T7
•
•
• Buffer de reacción
(KAc,Tris-Ac,
MgAc,
DTT)
• Incubación a 37ºC
•
Exonucleasa VII
• Buffer de reacción
•
(Kfosfato, EDTA, βmercaptoetanol)
•
• Incubación a 37ºC
• Buffer de reacción
Nucleasa Mung (NaAc, NaCl, ZnSO4)
• Incubación a 30ºC
Bean
B
•
B
•
•
• Buffer de reacción
(CaCl2, NaCl, MgCl2,
•
Tris-HCl, EDTA)
• Incubación a 30ºC
B
Nucleasa
31
BAL-
B
B
B
Los
sustratos
adecuados
son
dsDNA
con
extremos romos o
5´extendidos.
La enzima no es
activa en dsDNA con
extremos
3´extendidos.
Cataliza la remoción •
de mononucleótidos
5´de un dsDNA
Dirección 5´a 3´.
Los
sustratos
adecuados
son
dsDNA
5´
fosforilados, aunque
degrada a menor
tasa
ssDNA
y
sustratos
no
fodforilados.
No inicia digestión
en nicks o gaps.
Cataliza la remoción •
de mononucleótidos
5´ de un dsDNA.
Dirección 5´a 3´.
Degrada
tanto
extremos
5´
fosforilados como no
fosforilados.
También
degrada
RNA y DNA de un
híbrido
RNA/DNA,
pero no actúa sobre
dsRNA y ssRNA.
Inicia digestión en
nicks o gaps.
Degrada
sdDNA
tanto de un extremo
3´ como 5´.
Es
activa
en
presencia de EDTA.
Degrada extremos
simple hebra de
moléculas
de
dsDNA, dsRNA o
DNA/RNA,
dejándolos romos
Dirección 3´a 5´.
Degrada extremos
3´y 5´ de un dsDNA
Es activa en nicks,
gaps y regiones
simple hebra de un
duplex DNA o RNA.
3
•
•
Reparación
de
extremos
de
DNA extendidos
•
Mapeo
de
estructuras
secundarias de
DNA
Mapeo de sitio
de restricción en
DNA
•
•
Nucleasa SI
• Buffer de reacción
(NaCl, ZnCl2, Tris-HCl)
• Incubación a 37ºC
B
B
•
• Buffer de reacción
B
Dnasa I
•
(NaAc, MgCl2, Tris-HCl,
KCl)
• Incubación a 25ºC
B
•
• Buffer de reacción
Dnasa RQ1
•
(HEPES, KCl, CaCl2,
MgCl2)
• Incubación a 37ºC
•
B
B
B
B
•
Ribonucleasa H
• Buffer de reacción
(HEPES-KOH,
KCl,
DTT)
• Incubación a 37ºC
•
Ribonucleasa
T1
Ribonucleasa
T2
• Buffer de reacción
•
(Tris-HCl, EDTA)
• Incubación a 37ºC
•
• Buffer de reacción
•
(NaAc, EDTA)
• Incubación a 37ºC
•
• Buffer de reacción
Ribonucleasa A
(sin mayores
requerimientos)
• Incubación a 37ºC
•
Degrada ssDNA y
ssRNA en forma de
endonucleasa
generando
productos
con
extremos
5´
fosforilados.
dsDNA, dsRNA y
DNA/RNA
son
resistentes
a
la
enzima, salvo a
concentraciones
extremadamente
altas de ésta.
Degrada dsDNA y
ssDNA
a
oligodeoxiribonucleó
tidos.
A
bajas
concentraciones de
enzima y tiempos de
reacción
cortos,
introduce nicks en
dsDNA.
Degrada sdDNA y
dsDNA generando
oligos con OH-3´.
Se suministra libre
de Rnasas
Endorribonucleasa
que hidroliza los
enlaces fosfodiester
de un RNA hibridado
a
un
DNA,
generando
productos con OH 3´
y P-5´.
No degrada SSRNA,
dsDNA o dsRNA
Endorribonucleasa
que hidroliza ssRNA
en la posición 3´ de
residuos G.
Endorribonucleasa
no específica que
hidroliza ssRNA, en
preferencia
en la
posición
3´
de
residuos A.
De
origen
pancreática, cataliza
la despolimerización
de
ssRNA,
hidrolizando
específicamente en
la posición 3´de una
pirimidina (U o C).
No hidroliza DNA
4
•
•
•
Reparación
de
extremos DNA
Analizar
estructura
de
hibridos
DNA:RNA
Remoción
del
loop
generado
durante
la
síntesis
de
segunda acdena
de cDNA
•
•
Nick translation
DNAsa
Footprinting
•
Generación de
cDNA, utilizada
luego
de
la
extracción
del
RNA
Generación de
cDNA
•
•
•
•
•
•
Generación
cDNA
Rnasa
Protección
Generación
cDNA
Rnasa
Protección
de
de
Degradación de
RNA
en
extracción
y
purificación
de
ADN
•
Rnasin
• Buffer de reacción
(HEPES-KOH,
KCl, •
DTT)
• Incubación a 37ºC
•
Fosfatasa
Alcalina
Bacteriana
• Buffer de reacción
Fosfatasa
Alcalina
Intestinal
• Buffer de reacción
(Tris-HCl)
γ-32•
ATP
• Incubación a 65ºC
P
T4
Polinucleótido
Quinasa
•
Bajar el
background
previniendo la
religación (mayor
actividad y mas
estable)
Remueve fosfatos 3´
y 5´ de DNA y RNA.
•
Remueve fosfatos 3´ •
y 5´ de DNA y RNA
Bajar el
background
previniendo la
religación
•
Cataliza
la •
transferencia del γfosfato del extremo
5´de un DNA o RNA
a
un
ADP,
incorporando
un •
nuevo
fosfato
sacado de un ATP.
Utilizada
para
marcar fragmentos
de ácidos nucleicos
con γ-32-ATP
DNA polimerasa 5´- z
3´
z
Exo 5´-3´ (dsDNA)
Exo 3´- 5´(ssDNA,
dsDNA)
RNAsa H
Marcado
de
extremos
DNA
para sonda o
para
secuenciación.
Fosforilar linkers
sintéticos
que
carecen
del
fosfato 5´
DNA polimerasa 5´3´
Exo 3´- 5´(ssDNA,
dsDNA)
Primers
extension
Generación de
extremos romos
Marcado de
extremos
recesivos
Generación de
sondas
Generación de
sondas por nicktranslation
(dietanolamina,
4nitrofenil
fosfato,
MgCl2)
•
Incubación a 65ºC
B
• Buffer de reacción
(Tris-HCl, KCl, MgCl2,
β-mercaptoetanol)
γ-32•
ATP
• Incubación a 37ºC
B
P
Utilizado
enla
generación
de
cDNA
•
P
B
Inhibe
RNAsas •
eucariotas (A, B, C)
y RNAsa placentaria
No inhibe RNAsa H,
Nucleasa SI, RNA
polimerasas
(T7,
Sp6,
T3),
transcriptasas
reversas (AMV, MMLV)
Se suministra libre
de
DNAsas
y
RNAsas.
B
P
•
P
z
DNA pol I holoenzima
(E.coli)
z
z
z
z
z
Klenow DNA Pol
z
z
z
z
T4 DNA Pol
z
Mg+2 o Mn+2
pH óptimo 7.4
Agente reductor
Como sustrato
necesita primers de
ssDNA o ssRNA
(OH-3´libre) sobre
hebra de DNA
Mg+2 o Mn+2
pH óptimo 7.4 (buffer
fosfato)
Agente reductor
Como sustrato
necesita primers de
ssDNA o ssRNA
(OH-3´libre) sobre
hebra de DNA
Mg+2
pH óptimo 8 - 9
Agente reductor
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
z
z
z
z
z
z
P
z
z
z
z
z
z
DNA polimerasa 5´3´
Exo 3´- 5´(ssDNA,
5
z
Nick Translation
Marcado de
moleculas de
DNA con
extremos 3´
extendidos
z
dsDNA)
z
Generación de
cDNA con
primers al azar
z
DNA polimerasa 5´3´
z
Secuenciación
z
DNA polimerasa 5´3´
z
Amplificación de
un fragmento de
DNA
Para generar
plasmidos
adecuados para
productos de
PCR
Como sustrato
necesita primers de
ssDNA (OH-3´libre)
sobre hebra de DNA
z
z
T7 DNA pol
(sequenace)
z
z
z
z
z
Taq DNA pol
z
z
Mg+2 o Mn+2
pH óptimo 7.6 - 7.8
Agente reductor
Como sustrato
necesita primers de
ssDNA (OH-3´libre)
sobre hebra de DNA
Mg+2 o Mn+2
pH óptimo 8.3 a
temp ambiente.
Actividad óptima a
70-74°C
Como sustrato
necesita primers de
ssDNA (OH-3´libre)
sobre hebra de DNA
Mg +2
pH óptimo 7.6
(MoMLV)
pH óptimo 8.3 (AMV)
Agente reductor
Como sustrato
necesita primers de
ssDNA o ssRNA
(OH-3´libre) sobre
hebra de RNA
Mg+2
rNTP
Secuncia promtora
Sutrato: dsDNA
P
P
P
P
P
P
P
z
z
P
z
RNA
dependiente
DNA pol (
transcriptasa
reversa)
MoMLV
AMV
DNA
dependiente
RNA pol
(SP6, T3, T7)
z
z
z
z
z
z
z
z
z
P
P
DNA polimerasa 5´3´
RNAsa H
z
Generar cDNA
RNA polimerasa 5´3´
z
Transcripción in
vitro
Run off
Sondas de Rna
Utilizadas en
sistemas de
expresión
z
z
z
z
Mg+2 o Mn+2
dNTP
Sustrato: ssDNA con
extremo OH-3´ libre.
dsDNA con extremos
blunt o 3´recesivos
sirven como sustrato
en presencia de Co+2
como cofactor
z
Polimerización de
ssDNA a partir de un
extremo OH-3´libre
Mg+2
ATP (cofactor)
Substarto: dsDNA
con extremos
compatibles o Blunt.
Uno de los extremos
debe ser OH- 3´ y el
otro 5´-P
z
Cataliza la
formación de un
enlace fosfodiester
entre 3´-OH y un 5´P en los extremos o
nicks de DNA
P
P
z
Transferasa
Terminal
z
P
P
z
z
DNA Ligasa T4
z
P
P
P
6
Determinación
de extremos de
Rna.
z
Para generar
plasmidos
adecuados para
productos de
PCR
z
Generar
extremos
compatibles
z
Unir fragmentos
de DNA doble
cadena.
z
Ejemplo:
Plasmido /gen
z
Reparar nicks
z
z
z
DNA Ligasa E.
coli
z
z
z
RNA Ligasa T4
Mg+2
ATP (cofactor)
Substarto: dsDNA
con extremos
compatibles. Uno de
los extremos debe
ser OH- 3´ y el otro
5´-P
ATP ( cofactor)
Sustrato: ssDNA o
ssRNA
P
P
z
z
Cataliza la
formación de un
enlace fosfodiester
entre 3´-OH y un 5´P en los extremos o
nicks de DNA
Unir fragmentos
de DNA doble
cadena (menor
eficiencia en
extremos blunt)
z
Ejemplo:
Plasmido /gen
Reparar nicks
Cataliza la unión
z
Circularizar
covalente de un 5´-P
Molecula RNa.
de ssDNA o ssRNA z Ligación de
con un 3´-OH de
Adapters
ssDNA o ssRNA
z
Determinar
extremos de
RNa.
7
z