Replicación del DNA Archivo

Unidad 8. ESTRUCTURA Y REPLICACION DEL ADN
Documento elaborado con fines docentes por:
GUSTAVO LOZANO CASABIANCA
Biólogo M. Sc.
Profesor asociado Escuela de Nutrición y Dietética
Universidad de Antioquia
YOENIS GARCÍA HERRERA
Biólogo M. Sc.
Profesor de cátedra Escuela de Nutrición y Dietética
Universidad de Antioquia
SEBASTIAN GARCÍA RESTREPO
Estudiante Instituto de Biología
Universidad de Antioquia
CLARA I. ORTIZ RAMIREZ
Bióloga
Estudiante de maestría en Biología
Universidad de Antioquia
Estructura del ADN
Tanto las proteínas como los ácidos nucleicos se consideraban como los candidatos
para desempeñar la función de material genético, es más, hasta la década de 1940
muchos biólogos se inclinaban por las proteínas.
Fred Griffith en 1928 llevó a cabo investigaciones sobre la transferencia de
virulencia en Streptococcus pneumoniae, sentando las bases de la investigación
que demostró, por primera vez, que el ADN era el material genético (5).
Hirviendo bacterias virulentas e inyectándolas en ratones, Griffith comprobó que
éstos no se veían afectados y que tampoco era posible recuperar neumococos de
dichos animales. Posteriormente, al inyectar una combinación de bacterias
virulentas muertas y una cepa de bacterias vivas no virulentas, los ratones morían
y era posible recuperar bacterias virulentas vivas del cuerpo de los ratones. Griffith
denotó la conversión de bacterias no virulentas en patógenos virulentos, con el
término transformación (5).
Oswald T. Avery, Colin M. MacLeod y Maclyn J. McCarty (1944) se propusieron
descubrir qué componente de los neumococos virulentos muertos era responsable
de tal transformación. Primero destruyeron algunos componentes de extractos
purificados de neumococos virulentos utilizando enzimas capaces de hidrolizar
ADN, ARN o proteínas. A continuación, expusieron cepas de neumococos no
virulentos a los extractos tratados. Dado que la transformación de bacterias no
virulentas sólo se veía impedida cuando se destruía el ADN, esto permitió concluir
que el ADN transportaba la información necesaria para la transformación, siendo
ésta la primera prueba de que el ADN era el “principio transformador” de Griffith (5).
La publicación de su investigación sobre la naturaleza química de un “principio
transformante” en bacterias, sumado a posteriores descubrimientos por parte de
otros equipos de investigación, constituyeron pruebas experimentales directas de
que el ADN, y no las proteínas, era la biomolécula responsable de la herencia (5).
Años después, en 1952, Alfred D. Hershey y Martha Chase desarrollaron diversos
experimentos para demostrar que el ADN era el material genético en el bacteriófago
T2. Es interesante señalar que en el descubrimiento se corrió con la suerte de haber
seleccionado un virus ADN para su estudio, ya que en muchos virus el ARN es el
material genético (5).
El experimento consistió en marcar radioactivamente el ADN del virus con 32P, o la
cápside proteica con 35S. Luego se mezclaron los bacteriófagos radioactivos con E.
coli y se incubó la mezcla. Después de agitar y centrifugar, se determinó la
radioactividad del sobrenadante y del precipitado. Descubrieron que la mayoría de
la proteína radioactiva permanecía en el sobrenadante, mientras que el ADN
marcado se encontraba dentro de la bacteria. Dado que se había producido la
progenie de T2, el material genético se debió haber inyectado, y por lo tanto el ADN
tenía que ser el que transportaba la información genética de T2 (5).
En la época de las investigaciones de James Watson y Francis Crick se sabía que
el ADN consistía en un polímero compuesto de cuatro nucleótidos (Ilustración 45),
dos con bases púricas o purinas (Adenina [A] y Guanina [G]) y dos con bases
pirimídicas o pirimidinas (Citosina [C] y Timina [T]), que estaban unidos a azúcares
fosforilados. Debido al papel central del ADN como material genético, resultaba
crítico vislumbrar su estructura tridimensional para entender su función (5).
Ilustración 45. Nucleótido
Se ilustra la estructura del Desoxiadenosin monofosfato, un desoxirribonucleótido
conformado por un azúcar de cinco carbonos (desoxirribosa), una base
nitrogenada (adenina) y un grupo fosfato.
Por esto, la comprensión de la estructura, deducida en 1953, ha sido la base para
la biología molecular actual.
El enfoque de Watson y Crick estuvo influenciado por la descripción de Linus
Pauling de las uniones por puentes de hidrógeno y la -hélice (un tipo común de
estructura secundaria de las proteínas). También obtuvieron información
experimental sobre la estructura del ADN por medio de los estudios de cristalografía
por refracción de rayos X realizados por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin.
El análisis de los datos permitió a Watson y Crick describir la molécula de ADN como
una hélice compuesta por dos cadenas de ADN que da un giro cada 3.4 nm, y que
la distancia entre pares de base nitrogenadas es de 0.34 nm, por lo que en cada
vuelta de la hélice hay 10 pares de bases. Además, que el diámetro de la hélice es
de 2 nm (6). (Ilustración 46)
En cada una de las hebras de ADN, el grupo fosfato de un nucleótido se une con el
azúcar del siguiente nucleótido, llevando a una sucesión de enlaces que da forma
a una “columna vertebral” donde se alternan azúcares y fosfatos unidos por enlaces
covalentes, y desde la cual se proyectan bases de nucleótidos (6).
Es decir, cada nucleótido de ADN consta de tres partes: un grupo fosfato, un azúcar
llamado desoxirribosa y una base nitrogenada: Adenina (A), Guanina (G), Citosina
(C) o Timina (T) (2). Las bases están en el interior y orientadas de tal forma que se
forman enlaces de hidrógeno entre Purinas y Pirimidinas. La adenina únicamente
forma enlaces de hidrógeno con la citosina (A-T), y a su vez, la guanina solo forma
enlaces con la citosina (G-C); formando los llamados “Pares de bases
complementarias” (Ilustración 47).
Ilustración 46. Estructura del ADN
Modelo propuesto por Watson y Crick (1953) de la estructura de la doble hélice
Ilustración 47. Bases Nitrogenadas
.
Esta especificidad explica los resultados previos de Erwin Chargaff, quien estudió
la composición de diversos ADN encontrando que la cantidad de adenina siempre
era equivalente a la de timina, y la cantidad de citosina era equivalente a la de
guanina. A causa de dicha especificidad, las dos hebras de ADN son
complementarias: cada hebra contiene toda la información necesaria para
especificar la secuencia de bases de la otra (1).
Una característica propia de la estructura del ADN es formar una doble hélice
enrollada, con el esqueleto azúcar-fosfato en el exterior y las bases nitrogenadas
en el interior de la molécula. Además, las dos hebras de la doble hélice de ADN
están orientadas en direcciones opuestas o antiparalelas, es decir, una hebra tiene
un grupo fosfato unido al carbono 5 del azúcar, pero que no se une a otro nucleótido
en la parte superior y un azúcar que tiene el carbono 3 libre en la parte inferior (es
decir que no se une a otro nucleótido), mientras que en la otra hebra ocurre lo
contrario (en otras palabras una corre en dirección 3’→5’ y la otra en dirección
5’→3’) (6) (Ilustración 48).
Ilustración 48. Cadenas complementarias de ADN
Cromosomas y Cromatina
Los genomas de los eucariotas están compuestos por múltiples cromosomas, cada
uno de los cuales contiene una molécula de ADN lineal. Aunque el número y el
tamaño de los cromosomas varían considerablemente entre especies, su estructura
básica es la misma en todos los eucariotas (7).
El ADN de las células eucariotas está fuertemente unido a unas pequeñas proteínas
básicas llamadas histonas que empaquetan el ADN de manera ordenada en el
núcleo de la célula (7). Estos complejos de ADN e histonas forman la cromatina,
esta contiene el doble de proteínas que de ADN (7).
El empaquetamiento del ADN con las histonas produce una fibra de cromatina
aproximadamente de 10 nm, esta fibra presenta la apariencia de un collar que
sugiere el modelo del nucleosoma (7). Empaquetar el ADN en una fibra de
cromatina de 10 nm reduce su longitud aproximadamente seis veces. La cromatina
se puede condensar aún más para formar fibras de 30 nm, resultando en una
condensación total de una 50 veces (7). Las interacciones de las histonas son
importantes en la condensación de la cromatina, esto es crítico para determinar la
accesibilidad del ADN cromosómico en procesos como la replicación y transcripción
del ADN (7).
El grado de condensación de la cromatina varía durante el ciclo celular y juega un
papel importante en la expresión génica (2). En células en interfase (sin dividirse),
la mayoría de la cromatina, llamada eucromatina, se encuentra relativamente sin
condensar y distribuida por todo el núcleo (7), esto permite que los genes sean
trascritos para la preparación a la división celular. De forma contraria la
heterocromatina, se encuentra en un estado muy condensado, estas hebras de ADN
son transcripcionalmente inactivas y altamente repetidas como aquellas que se
presentan en los centrómero y en los telómeros (7).
El centrómero es la región central del cromosoma, cuya función es asegurar la
correcta distribución de los cromosomas duplicados a las células hijas durante la
mitosis (7). Por lo tanto, los centrómeros actúan como sitios de asociación de las
cromátidas hermanas y como sitios de unión para los microtúbulos del huso mitótico
(7). Los centrómeros son secuencias específicas de ADN a las que se unen
numerosas proteínas de unión que forman el cinetocoro (7), así la unión de los
microtúbulos al cinetocoro dirige la unión de los cromosomas al huso mitótico en la
división celular (7). Mientras que los telómeros, son secuencias de ADN situadas
al final de los cromosomas eucariotas y desempeñan un papel crítico en la
replicación y el mantenimiento de la estabilidad cromosómica (7).
Replicación del ADN
La replicación del ADN es un proceso semiconservativo en el que cada hebra
“parental” sirve como molde para síntesis de una nueva hebra “hija” complementaria
(1).
La replicación de una molécula de ADN comienza en sitios especiales llamados
orígenes de replicación (3). El cromosoma bacteriano, que es circular, tiene un
único origen de replicación, un tramo de ADN con una secuencia de nucleótidos
especifica. Las proteínas que inician la replicación del ADN reconocen esta
secuencia y se fijan al ADN separando las dos cadenas y abriendo una “burbuja” de
replicación (3). La replicación del ADN progresa entonces en ambas direcciones
hasta que se copia la molécula entera (3). En contraste un cromosoma eucariótico
puede tener cientos o miles de orígenes de replicación. Se forman burbujas de
replicación múltiples que después se fusionan, acelerando de este modo la copia
de las moléculas de ADN (3).
En cada extremo de una burbuja de replicación hay una horquilla de replicación,
una región en forma de “Y” donde están creciendo nuevas cadenas de ADN (3). La
elongación de la cadena nueva de ADN en la horquilla de replicación se cataliza por
enzimas denominadas ADN polimerasas (3). A medida que los nucleótidos
individuales se alinean con nucleótidos complementarios a lo largo de la cadena
molde de ADN, la ADN polimerasa los añade, uno a uno, al extremo en crecimiento
de la nueva cadena de ADN (3).
Cada nucleótido que se añade a una cadena de ADN en crecimiento es un
nucleótido trifosfato, esto es, un nucleósido (una azúcar y una base) con tres grupos
fosfatos (3), al momento de la unión se separan dos grupos fosfato de manera que
cada nucleótido del ADN posee un solo grupo fosfato.
Como se mencionó anteriormente las dos cadenas de ADN son antiparalelas, lo que
significa que se orientan en direcciones opuestas una de otra (3). La ADN
polimerasa agrega nucleótidos solo al extremo 3’ libre de una cadena de ADN en
crecimiento, nunca al extremo 5’ (3). De este modo una cadena de ADN nueva se
puede alargar solo en la dirección 5’→3’ (3).
En bacterias la ADN polimerasa III (ADN Pol III), se acomoda simplemente en la
horquilla de replicación sobre la cadena molde y agrega nucleótidos de forma
continua a la cadena complementaria a medida que la horquilla progresa. La cadena
de ADN sintetizada por medio de ese mecanismo se llama hebra líder (3).
Para elongar la otra cadena nueva de ADN en la dirección obligatoria 5’→3’, la ADN
Pol III debe actuar a lo largo de otra cadena molde en dirección contraria a la
horquilla de replicación (3). La cadena de ADN sintetizada en esta dirección se
denomina hebra retrasada, esta hebra se sintetiza con una serie de segmentos (3).
Una vez que la burbuja de replicación se abre lo suficiente, una molécula de ADN
Pol III se adhiere al molde de la cadena retrasada y se aleja de la horquilla de
replicación, para sintetizar un segmento corto de ADN (3). A medida que crece la
burbuja se puede elaborar otro segmento de la hebra retrasada de una manera
similar, estos segmentos de la hebra retrasada se llaman fragmentos de Okazaki,
en honor al japonés que lo descubrió (3). Los fragmentos tienen de 1000 a 2000
nucleótidos de longitud en E. coli y de 100 a 200 en eucariotas (3). Otra enzima, la
ADN ligasa, finalmente une o liga los fragmentos de Okazaki y forma una cadena
de ADN nueva (3).
Ilustración 49. Replicación del ADN
Las ADN polimerasas no pueden iniciar la síntesis de un polinucleótido; solo puede
añadir nucleótidos al extremo 3’ de una cadena ya existente que esta apareada con
las bases de la cadena molde (3). La cadena de nucleótidos inicial es un segmento
corto llamado cebador o primer, que es un segmento corto de ARN con un extremo
3’ disponible (3). Una enzima denominada primasa puede comenzar una cadena
de ARN desde el principio. La primasa une los nucleótidos de ARN de uno por vez
y sintetiza un cebador complementario de la cadena molde en el lugar donde se
producirá la iniciación de la nueva cadena de ADN (3). Luego al ADN pol III añade
un nucleótido de ADN al extremo 3’ del cebador de ARN y continúa agregando
nucleótidos a la cadena de ADN en crecimiento de acuerdo con las reglas del
apareamiento de bases (3).
Solo se requiere un cebador para que la ADN Pol III comience a sintetizar la cadena
líder, pero para sintetizar la cadena retrasada, cada fragmento de Okasaki debe
cebarse por separado (3). Otra enzima llamada la ADNPol I, sustituye los
nucleótidos de ARN de los cebadores con versiones de ADN añadiendo uno a uno
sobre el extremo 3’ del fragmento de Okasaki adyacente; posteriormente la ADN
ligasa une los esqueletos de azúcar-fosfato de todos los fragmentos de Okazaki en
una cadena continua de ADN (3).
La helicasa es una enzima que desenrolla la doble hélice en la horquilla de
replicación y separa las dos cadenas parentales para que estén disponibles como
cadena molde (3). Este desenrollamiento genera un enrollamiento más tenso y
tensión por delante de la horquilla de replicación y la topoisomerasa ayuda a aliviar
esta tensión. Después de que la helicasa separa las dos hebras parentales, las
moléculas de la proteína de unión a cadena simple se unen a las cadenas
desapareadas del ADN para estabilizarlas hasta que sirva como molde para la
síntesis de las nuevas cadenas complementarias (3).
Tabla 8. Proteínas involucradas en la Replicación.
Proteína
Función en las hebras líder y retrasada
Helicasa
Desenrolla la doble hélice parental en la
horquilla de replicación
Proteínas de unión a cadena simple
Se unen y estabilizan el ADN de cadena
simple hasta que pueda emplearse como
molde
Topoisomerasa
Corrige el sobreenrollamiento delante de la
horquilla de replicación, rompiendo, girando y
uniendo de nuevo las cadenas de ADN
Tabla 9. Proteínas de la replicación del ADN y sus funciones.
Proteínas
Función en la hebra líder
Función en hebra
retrasada
Primasa
Sintetiza un cebador de
ARN en el extremo 5’ de la
hebra líder
Sintetiza un cebador de
ARN en el extremo 5’ de
cada fragmento de Okazaki
ADN polimerasa III
En baterías, sintetiza la
hebra líder en forma
continua, añadiéndola al
cebador
Alarga el fragmento de
Okazaki y lo añade a su
cebador
ADN polimerasa I
En bacterias, elimina el
cebador del extremo 5’ de
la hebra líder y lo
reemplaza con ADN,
Elimina el cebador del
extremo 5’ de cada
fragmento y lo reemplaza
con ADN para añadirlo al
ADN ligasa
añadiéndolo al extremo 3’
adyacente
extremo 3’ del fragmento
adyacente
Une el extremo 3’ del ADN
que reemplaza el cebador
al resto de la hebra líder
Une los fragmentos de
Okazaki
La enzima principal implicada es la ADN polimerasa, que cataliza la unión de los
desoxirribonucleótidos (5’-trifosfato, dNTP) para formar la cadena de ADN en
crecimiento (1).
ADN polimerasa:
Se identificó por primera vez en E. coli por Arthur Kornberg en 1956. La capacidad
de esta enzima para copiar exactamente una hebra molde de ADN proporciona una
base bioquímica para la replicación del ADN.
Horquilla de replicación:
Las moléculas de ADN en proceso de replicación se analizaron por primera vez por
John Cairns en experimentos con E. coli (1). La horquilla de replicación representa
las regiones de la síntesis activa del ADN, en cada horquilla las hebras se separan
y son sintetizadas dos nuevas hebras hijas (1).
Diferencias en la Replicación del ADN en eucariotas
A pesar de que la replicación del ADN sigue los mismos pasos (es semiconservativa
y bidireccional, se separan las cadenas, se necesitan cebadores, se sintetizan las
nuevas cadenas mediante polimerasas, etc), las diferencias estructurales entre los
cromosomas de procariotas y eucariotas, y su bioquímica diferente, el proceso y las
enzimas también son un poco diferentes (8).
En las bacterias existe un solo origen de replicación. Ya que el ADN procariota es
una molécula circular, a partir de este único punto, la replicación avanza en ambas
direcciones hasta que se replica toda la molécula. Cuando la duplicación se está
llevando a cabo, es cuando se pueden observar las burbujas de replicación (8).
En eucariotas el ADN no es una sola molécula circular, sino que está formado por
un número variable de hebras independientes. Cada una de ellas forma un
cromosoma durante la división celular. Por esto, y debido a la mayor cantidad de
ADN que poseen y a que está repartido en varias moléculas de ADN distintas, los
eucariotas tienen muchos orígenes de la replicación (a diferencia de los procariotas)
(8).
En E. coli existen tres ADN polimerasas, (I, II y III). La ADN polimerasa III sintetiza
las nuevas cadenas de ADN. En eucariotas existen otros tipos de ADN polimerasas
(8).
En eucariotas, los fragmentos de Okazaki son más cortos, y la velocidad de
elongación más lenta que en procariotas. Además el control sobre la regulación es
más complejo y estricto ya que solo debe haber una replicación del material
hereditario en cada ciclo celular (8).
En procariotas, al ser el ADN una sola molécula y circular, la replicación dura hasta
que ambos extremos de la burbuja se encuentran. En eucariotas ocurre lo mismo,
pero en los extremos de la molécula hay un inconveniente. Al final las nuevas
moléculas de ADN quedan con un extremo 3’ que no puede ser replicado por las
ADN polimerasas celulares. Esto resultaría en un acortamiento progresivo de los
cromosomas tras cada ciclo de replicación. Para evitarlo, los eucariotas han
desarrollado una estrategia que consiste en elongar los extremos de los ADN 3’
protuberantes de manera que no queden secuencias importantes del cromosoma
sin replicar (8).
REFERENCIAS
1. Cooper G, Hausman R. La célula. 5a ed. Madrid: Marbá Libros, S.L; 2011.
2. Audesirk T. Biología la vida en la tierra. 6a ed. México: Pearson Educación;
2003.
3. Cambell, NA. Biología. 7a ed. Madrid: Editorial Médica Panamericana; 2007.
4. Prescott LM, Harley JP, Klein DA. Microbiología. 7a ed. España: McGraw Hill;
2009.
5. Klug WS, Cummings MR, Spencer CA. Conceptos de Genética. 8a ed. Madrid:
Pearson Educación; 2006.
6. Audesirk T, Audesirk G, Byers BE. Biología, la vida en la tierra, con fisiología. 9a
ed. México: Pearson Educación de México, S.S de C.V; 2012.
7. Jiménez, LF. Conocimientos Fundamentales de Biología. Volumen 1. México:
Pearson Educación; 2006.
8. Diferencias en la replicación de procariotas y eucariotas. [Citado Julio 26 de
2015]. Disponible en:
http://www.mas-que-ciencia.com/diferencias-replicacion-procariotas-eucariotas/