Repositorio Académico - Universidad de Chile

UNIVERSIDAD DE CHILE
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
BIOCOMPATIBILIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS
METÁLICAS CON COPOLÍMEROS DE QUITOSANO
Tesis para optar al grado académico de
Magíster en Bioquímica, área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular
y
Memoria para optar al Título de Bioquímica por:
CLAUDIA MACARENA MOLINA PELAYO
Directores de Tesis
Dr. Marcelo Kogan
Dr. Andrónico Neira-Carrillo
Santiago, Chile
2010
UNIVERSIDAD DE CHILE
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
BIOCOMPATIBILIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS
METÁLICAS CON COPOLÍMEROS DE QUITOSANO
CLAUDIA MACARENA MOLINA PELAYO
Directores de Tesis
Dr. Marcelo Kogan
Dr. Andrónico Neira-Carrillo
Santiago, Chile
2010
II
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
INFORME DE APROBACIÓN
TESIS DE MAGÍSTER
Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas que la Tesis de Magíster presentada por la candidata:
CLAUDIA MACARENA MOLINA PELAYO
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para
optar al grado de Magíster en Bioquímica área de especialización Bioquímica
Toxicológica y Diagnóstico Molecular y al título de Bioquímica, en el examen de
defensa de Tesis rendido el día _____________________del 2010.
Directores de Tesis:
Dr. Marcelo Kogan
___________________________
Dr. Andrónico Neira
___________________________
Comisión Informante de Tesis:
Dr. Yedi Israel (Presidente)
___________________________
Dr. Mehrdad Yazdani
___________________________
Dr. José Luis Arias
___________________________
III
A mi familia…
IV
AGRADECIMIENTOS.
En primer lugar, quiero expresar mis más profundos agradecimientos a mi
familia, por quienes estoy aquí en este momento, muchas gracias por su constante
apoyo y comprensión. Han sido el pilar fundamental durante todo este proceso y no
encuentro las palabras para agradecer todo lo que han hecho por mí, mamá, papá,
Jorge, Marta, Rafaela, Romina, tía Pilar y abuelita Marta: estas son las personas que
más me han acompañado. Por supuesto mis padres han sido los principales
responsables, con la crianza, los valores y el apoyo que me han dado. Mis hermanos
son mis compañeros de vida, siempre hemos compartido buenos y malos momentos y
mi tía Pilar es muy especial para mí, ya que siempre ha estado presente en mi vida
estimulándome a desarrollarme como persona y como científica. Y, a pesar que mi
abuelita ya no esté con nosotros, fue muy importante para mí. Sé que siempre podré
contar con todos ustedes y, por supuesto, espero que sepan que siempre pueden
contar conmigo también. Los amo mucho.
V
También quiero destacar a una persona muy especial para mí, que me ha
acompañado bastante desde hace un tiempo, Carlos. Probablemente sea una de las
personas que más ha tenido que soportar mis crisis de estrés, los momentos difíciles,
las frustraciones, etc., pero debo agradecerle que me haya acompañado y ayudado
todo lo posible. Carlos, eres un gran apoyo y compañero para mí, te amo y espero ser
también un apoyo para ti, cuando lo necesites.
No puedo dejar de mencionar a mis amigos!! Han sido demasiado importantes
en mi vida académica y sé que no habría disfrutado tanto mis días de colegio y/o
universidad sin ustedes: Estefanía, Valentirijilla, Alonso, Blanca, Matías, Juanito,
Cataldo, Mitzy, Naty, Cristian, Nico. Muchas gracias a todos, ya que muchas veces (la
mayoría) ustedes eran el motivo por el que iba a clases, gracias por hacerlas más
agradables y, por supuesto, por todos los momentos que disfrutamos fuera de ellas, en
especial con el grupo de “Los de atrás”.
También quiero agradecer a mis profesores, en especial a los Dres. Andrónico
Neira y Marcelo Kogan, por guiarme en el largo camino de tesis. En especial quisiera
agradecer al profesor Marcelo Kogan por abrirme la puerta a un nuevo y fascinante
mundo, la nanotecnología, no conocía nada al respecto y me alegro de haber trabajado
con usted, muchas gracias. Al mismo tiempo, quiero agradecer a la Dra. Marcela
VI
Urzúa, por su gran aporte durante el desarrollo de mi tesis, y por sus amables
consejos.
Además, quisiera destacar a los Dres. Dante Miranda y Margarita Montoya, a
quienes conocí al principio de mi carrera, y con quienes siempre me he mantenido en
contacto. Muchas gracias, no sólo por todo lo que me enseñaron en el ámbito
académico, sino también por sus consejos, su apoyo personal, las conversaciones que
muchas veces tuvimos, las comidas y todas las vivencias, fueron siempre un agrado y
espero no perder el contacto con ustedes. Al mismo tiempo, quiero agradecer a
quienes son o han sido parte de este laboratorio y con quienes también compartí y
pasé muy buenos momentos también, el profesor Javier Puente, la profesora
Jacqueline Pezoa y Gladys.
No puedo dejar de mencionar a mis compañeros del laboratorio de
Nanobiotecnología, en especial a Luis Medel, Carolina Henríquez y Juan Mena a
quienes conocí más cercanamente y con quienes disfruté muy buenos momentos.
También quiero agradecer a Carolina Adura y Simón Guerrero, con quienes también
compartí bastante en el laboratorio y a Nataly Silva, a quien no conozco mucho, pero
que me ayudó y me acogió muy amablemente desde el principio.
VII
ÍNDICE.
Contenido
AGRADECIMIENTOS. ........................................................................................................... V
ÍNDICE. .................................................................................................................................. VIII
ABREVIATURAS..................................................................................................................... X
RESUMEN. ............................................................................................................................ XII
SUMMARY. ............................................................................................................................ XV
INTRODUCCIÓN. ................................................................................................................... 1
Nanotecnología y su aplicación en biomedicina. ........................................................... 1
Distribución y toxicidad de nanopartículas de oro.......................................................... 5
Biocompatibilización de nanopartículas de oro. ............................................................. 9
Efectos de materiales sobre la coagulación sanguínea: influencia de la carga y de
la energía superficial......................................................................................................... 12
Energía superficial. ........................................................................................................... 14
Una estrategia para reducir la energía superficial del quitosano. ............................. 16
Entrecruzamiento y caracterización de polímeros. ...................................................... 19
Obtención de nanopartículas de oro. ............................................................................. 22
Síntesis de nanocompósitos............................................................................................ 23
Efecto de tamaño y carga sobre la biodistribución de nanocompósitos. ................. 24
Evaluación de toxicidad. .................................................................................................. 25
Hipótesis. ............................................................................................................................ 28
Objetivos. ............................................................................................................................ 28
METODOLOGÍA .................................................................................................................... 30
1.- Síntesis de polímeros biocompatibles...................................................................... 30
VIII
2.- Síntesis de nanopartículas de oro ............................................................................ 32
3.- Conjugación con el péptido CLPFFD ....................................................................... 32
4.- Formación y caracterización de los nanocompósitos ............................................ 33
5.- Evaluación de la toxicidad .......................................................................................... 33
RESULTADOS. ..................................................................................................................... 38
1.- Síntesis de polímeros biocompatibles...................................................................... 38
2.- Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. ............................................ 46
3.- Conjugación y caracterización de las nanopartículas de oro con el péptido
CLPFFD. ............................................................................................................................. 47
4.- Obtención y caracterización de nanocompósitos. .................................................. 48
5.- Evaluación de la toxicidad de los polímeros y de los nanocompósitos. ............. 52
DISCUSIÓN. .......................................................................................................................... 60
Obtención y caracterización de polímeros entrecruzados .......................................... 60
Obtención y caracterización de nanocompósitos......................................................... 61
Evaluación de la toxicidad ............................................................................................... 64
Efecto tamaño/carga ......................................................................................................... 65
Posible mecanismo de degradación del quitosano...................................................... 68
CONCLUSIONES. ................................................................................................................ 70
PROYECCIONES. ................................................................................................................ 72
REFERENCIAS. .................................................................................................................... 73
ANEXOS. ................................................................................................................................ 79
IX
ABREVIATURAS.
Aβ
Péptido β-amiloide
Au-NPs
Nanopartículas de oro
BSA
Albúmina bovina (del inglés Bovine Serum Albumin)
CLPFFD
Cys-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp (secuencia aminoacídica cisteína-leucinaprolina-fenilalanina-fenilalanina-ácido aspártico)
CSFE
Éster succinimidil de carboxifluoresceína diacetato (del inglés
Carboxyfluorescein diacetate, Succinimidyl Ester)
CTAB
Bromuro de cetiltrimetilamonio (del inglés Cetyl Trimethyl Ammonium
Bromide)
DLS
Dispersión Dinámica de la luz (del inglés Dynamic Light Scattering)
EA
Enfermedad de Alzheimer
EDC
N- Etil- dimetil aminopropil carbodiimida
HAuCl4
Ácido cloro aúrico
IR
Espectroscopía Infrarroja
MPS
Sistema Fagocítico Mononuclear (del inglés Mononuclear Phagocyte
System)
MTS
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2Htetrazolio
NaBH4
Borohidruro de sodio
X
NC
Nanocompósito
PBS
Buffer fosfato (del inglés Phosphate Buffered Saline)
PS
Polisiloxano
PT
Tiempo de Protrombina (del inglés Prothrombin time)
PTT
Tiempo de tromboplastina parcial (del inglés Partial Thromboplastin
Time)
Qo
Quitosano
SDS
Dodecil sulfato sódico (del inglés Sodium Dodecyl Sulfate)
TEM
Microscopía Electrónica de Transmisión (del inglés Transmission
Electron Microscopy)
TGA
Análisis Termogravimétrico (del inglés Thermogravimetric Analysis)
UV
Ultravioleta
1
Polímero entrecruzado 1, corresponde a una proporción de Qo:PS de
1:1 y equivale a un 50 % de Qo
2
Polímero entrecruzado 2, corresponde a una proporción de Qo:PS de
2:1 y equivale a un 67 % de Qo
3
Polímero entrecruzado 3, corresponde a una proporción de Qo:PS de
5:1 y equivale a un 83 % de Qo
4
Polímero entrecruzado 4, corresponde a una proporción de Qo:PS de
10:1 y equivale a un 90 % de Qo
5
Polímero entrecruzado 5, corresponde a una proporción de Qo:PS de
100:1 y equivale a un 99 % de Qo
XI
RESUMEN.
A pesar de los grandes adelantos científicos y tecnológicos, hoy en día aún hay
diversas enfermedades que no poseen un método de diagnóstico y/o de tratamiento
temprano y efectivo. Es por ello que actualmente se está explorando el uso de nuevos
materiales y tecnologías para resolver tales problemas. En este sentido, cabe
mencionar el desarrollo de la nanotecnología, área de la ciencia que se dedica al
control y desarrollo de materiales en la escala nanométrica (que incluye a materiales
que posean al menos en una de sus dimensiones, tamaños de entre 1 y 100 nm). Los
nanomateriales presentan interesantes propiedades que los convierten en una
herramienta útil para la biomedicina. Un ejemplo de ello son las nanopartículas de oro
(Au-NPs) que absorben la energía que se les suministra y la disipan de manera local,
pudiendo además, por su tamaño, distribuirse por todo el organismo llegando a
diferentes sitios de acción. Es por ello que en nuestro laboratorio se investiga el posible
uso de las mismas para el tratamiento y diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer.
Un ejemplo de ello es la conjugación de Au-NPs con el péptido CLPFFD, que reconoce
agregados tóxicos de la proteína Aβ, presentes en pacientes que padecen la
enfermedad de Alzheimer, para dirigirlas selectivamente a los mencionados agregados
y así destruirlos.
XII
Sin embargo, tales nanopartículas presentan efectos adversos, debido a su
carga superficial negativa, pudiendo generar trombogenicidad y/o opsonización, siendo
fácilmente capturadas por el Sistema Fagocítico Mononuclear (MPS, del inglés
Mononuclear Phagocyte System), lo que impediría su llegada al blanco terapéutico. Es
por ello que al administrar las nanopartículas in vivo, llega al cerebro una muy pequeña
proporción de la dosis inyectada acumulándose las mismas en hígado y bazo lo cual
debe evitarse considerando futuras aplicaciones farmacéuticas. En la presente tesis,
para evitar tales efectos, nanopartículas de oro fueron recubiertas con polímeros
derivados del quitosano (Qo). No obstante, es importante destacar que el Qo presenta
una elevada energía superficial, lo que se traduce en un efecto trombogénico, por lo
que el Qo se entrecruzó con un polisiloxano (PS), polímero de baja energía superficial,
con la finalidad de disminuir la energía superficial en el Qo. Dicha reacción de
entrecruzamiento se realizó mediante el uso de un agente entrecruzante, EDC, que es
capaz de activar el grupo carboxilo del PS para que reaccione con el grupo amino del
Qo. Los polímeros derivados del Qo fueron caracterizados por termogravimetría,
espectroscopía infrarroja y por medidas de ángulo de contacto. Posteriormente, se
evaluó la trombogenicidad de los mismos mediante ensayos de coagulación, como así
también sus efectos a nivel de la viabilidad celular en células de neuroblastoma
humano, mediante ensayos con MTS.
XIII
En resumen, se obtuvieron polímeros entrecruzados derivados del Qo que
presentaron una menor energía superficial respecto a la obtenida para el Qo solo. A
partir de la disminución en la energía superficial se logró eliminar el efecto
trombogénico y, al mismo tiempo, se disminuyó el efecto tóxico presentado a nivel de
la viabilidad celular. Dichos polímeros se emplearon para recubrir las AuNPs,
formándose así los nanocompósitos (NC) correspondientes que no presentaron efectos
sobre la coagulación ni sobre la viabilidad celular, respecto del Qo. Los
nanocompósitos obtenidos presentaron carga neta positiva, lo cual contribuirá a reducir
la interacción con el MPS siendo esto muy relevante para futuras aplicaciones
farmacéuticas.
XIV
SUMMARY.
Despite of the great scientific and technological advances, there are several
diseases that still doesn´t have an early and effective method of diagnosis and
treatment. Because of that, today it is exploring about the use of new materials and
technologies to solve this issue. In this sense, it is important to mention the
development in nanotechnology which is an area of the science dedicated to control
and develop materials on nanometric scale (include materials with at least one
dimension of size between 1 to 100 nm). This nanomaterials exhibit new properties, an
example are the gold nanoparticles (Au-NPs), that are capable of absorbing energy
supplied and dissipate it locally, beside its capacity of distribute easily by all the
organism due to their small size. For this reason in our laboratory it is investigated the
potential use of AuNPs for the treatment and diagnosis of Alzheimer´s disease. One
example is the conjugation of AuNPs with the peptide CLPFFD that recognizes the toxic
aggregates of Aβ present in the brain of patients that suffer Alzheimer’s disease with
the propose to destroy the mentioned aggregates.
XV
However, such nanoparticles show adverse effects, because of the negative
superficial charge present in them, that could generate thrombogenicity and
opsonisation, been easily captured by Mononuclear Phagocytic System (MPS),
impeding their arrival to the therapeutic target. For this reason after an injection of
nanoparticles the percentage of the injected dose that reaches the brain is very low
being necessary to improve the drug delivery for future pharmaceutical applications. In
the present thesis, to avoid these side effects, the nanoparticles will be capped
polymers derivated from chitosan (Qo). Nevertheless, this polymer shows a high value
of superficial energy, involving a thrombogenic effect. That´s why, in this thesis work,
Qo was cross-linked with polysiloxane (PMS), a polymer with low superficial energy,
expecting a decreasing in this energy, and use it to recover the Au-NPs. This reaction
was possible by the use of a cross-linking agent, EDC, whom is capable to activate the
carboxyl group of the PMS, to react with the amine group of Qo. The obtained
copolymers were characterized by thermogravimetry, infrared spectroscopy and contact
angle measures. On the other hand, the thrombogenic effects of the polymers were
evaluated by means of a coagulation assay and their effects on cell viability on human
neuroblastome cells were evaluated using MTS assay.
XVI
In summary, in this work it was obtained crosslinked derivates polymers from
chitosan that shows a lower surface energy with respect to Qo. The copolymerization of
Qo with PMS lead to the elimination of the thrombogenic effects and to a diminution of
the effects on the cell viability. These copolymers were used for capping the AuNPs,
obtaining nanocomposites, that did not show thrombogenic effects and neither a
reduction of cell viability. These nanocomposites presented a positive charge which
could contribute to avoid interaction with MPS which is very relevant for future
pharmaceutical applications.
XVII
INTRODUCCIÓN.
Nanotecnología y su aplicación en biomedicina.
En la actualidad hay diversas enfermedades que aún no pueden diagnosticarse y/o
tratarse de una manera que sea efectiva y temprana, como algunos tipos de cáncer y
diversas enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson y la Enfermedad
de Alzheimer (EA). Es por esto que se ha comenzado a investigar el uso de nuevas
tecnologías con posibles aplicaciones en este tipo de enfermedades, y una de estas es
la nanotecnología, área de la ciencia que se dedica al control y manipulación de la
materia en una escala nanométrica. Un nanomaterial es aquel que posee, por lo menos
en una de sus dimensiones, medidas nanométricas (de 1 a 100 nm) [Silva, 2008].
Desde hace algunos años, la nanotecnología ha cobrado gran importancia debido al
desarrollo de nuevos materiales para su aplicación en diversas áreas. Un ejemplo de
sus aplicaciones es el desarrollo de nanopartículas elaboradas a partir de distintos
materiales para utilizarlas en biomedicina. El hecho de que las nanopartículas sean tan
pequeñas permite que lleguen de manera más fácil a distintos sitios del organismo
[Silva, 2008], y al mismo tiempo, son capaces de interactuar de manera única con los
sistemas biológicos a nivel molecular [Wang, 2008], presentando mecanismos
especiales de ingreso a las células pudiendo así atravesar diferentes barreras, como la
hematoencefálica.
1
Las nanopartículas desarrolladas pueden otorgar capacidades nuevas y únicas para
diversas aplicaciones biomédicas debido a que, en esta escala, los materiales
(polímeros, metales, liposomas, entre otros) presentan interesantes y únicas
propiedades. Algunos materiales, como los metales, en la escala nanométrica
presentan especiales propiedades ópticas, electrónicas y magnéticas, las que no se
presentan en el mismo material a escala mayor [Jain, 2007]. Todas estas propiedades
permiten que las nanopartículas sean muy apreciadas para utilizarlas en el diagnóstico
de enfermedades e incluso para el desarrollo de novedosas terapias.
En particular, las nanopartículas de oro (Au-NPs) presentan propiedades ópticas y
de contraste que han brindado diversas aplicaciones, como la detección por
inmunobloting y la citometría de flujo, entre otras [Tan, 2005]. Asimismo, se ha
reportado que las Au-NPs mejoran el contraste de imágenes en métodos radiográficos
[Hainfeld, 2006] y por estos motivos se han vuelto muy útiles en diversas aplicaciones
como la liberación controlada de fármacos (drug delivery), la biodetección y el
diagnóstico por imagen.
Una potencial aplicación de las Au-NPs es en el diagnóstico y tratamiento de la EA,
un desorden neurodegenerativo que lleva a alteraciones progresivas de las funciones
cognitivas incluyendo la memoria, el juicio, la toma de decisiones y el lenguaje, entre
otras características [Klafki, 2006]. En dicha enfermedad se produce la acumulación
de agregados tóxicos del péptido β-amiloide (Aβ), los que juegan un rol crucial en los
eventos neurodegenerativos subyacentes a la EA. Dichos agregados son considerados
por algunos científicos como los responsables directos del desarrollo de la EA [Walsh,
2007], por lo que se han intentado utilizar como un blanco para una intervención
inmunoterapéutica, la que lamentablemente no ha tenido resultados muy prometedores
[Taguchi, 2008], debido a las reacciones inflamatorias secundarias. En estudios
recientes, realizados en nuestro laboratorio, se demostró que es posible la
desagregación in vitro de agregados tóxicos de la proteína amiloide (Figura 1) a través
2
del empleo de Au-NPs conjugadas al péptido CLPFFD, las que son irradiadas
mediante el uso de microondas de bajas potencias (0.1 W) [Kogan, 2006].
En este caso, el uso de las Au-NPs se debe a que estas son especies capaces de
absorber
la
energía
que
se
les
suministra,
disipándola
de
manera
local
(nanométricamente), lo que afectaría sólo a aquellas moléculas o células que estén
directamente unidas a estas Au-NPs. Se ha observado que a pesar de haber
suministrado pequeñas dosis de energía, es posible desagregar in vitro agregados
tóxicos de Aβ y también evitar su re-agregación [Kogan, 2006]. Para que este
tratamiento sea efectivo y selectivo, estas Au-NPs son conjugadas con el péptido
CLPFFD (Figura 2), que reconoce una parte de la secuencia de Aβ [Olmedo, 2008] y
se une a este mediante interacciones hidrofóbicas con uno de los núcleos o centros de
agregación de Aβ, como LVFFA, secuencia a la que se une LPFF (Figura 3). Una vez
unido CLPFFD a los agregados de Aβ se impide la unión de otra molécula del mismo,
deteniendo el proceso de agregación. Esto ocurre porque se sustituye una valina (V)
por prolina (P), generando así un efecto disruptor en la secuencia. Además, este
péptido posee un ácido aspártico (D) al final de la secuencia con lo que se logra
solubilizar el péptido CLPFFD, debido a un aumento en su polaridad. La cisteína (C)
agregada al inicio de la secuencia se utiliza debido a que este aminoácido posee en su
estructura un grupo sulfhidrilo (SH), que favorece la unión con la Au-NP. El azufre
reacciona con el oro generándose un enlace de tipo covalente entre ambos.
3
Figura 1: Microfotografía de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de agregados de Aβ
en presencia de Au-NPs antes y después de la irradiación (abajo). Arriba: imágenes de AuNPCLPFFD unidas a los agregados Aβ después de una incubación de Aβ 10 µM y AuNP-CLPFFD
por 48 h. Abajo: imágenes de AuNP-CLPFFD previamente unido a Aβ después de 8 h de
irradiación. Las flechas horizontales indican la presencia de dímeros y trímeros, las flechas
verticales indican la presencia de partículas aisladas, y los círculos, la presencia de fibras
pequeñas. Las barras son 500 nm. Nano Letters, 2006; 6 (1): 110-115.
Figura 2: Au-NP conjugada con el péptido CLPFFD.
4
Figura 3: Secuencia del péptido Aβ. Se destaca en rojo la secuencia que interacciona con
CLPFFD. En azul se representan los aminoácidos hidrofóbicos (L y F), en amarillo la prolina (P)
y en celeste el ácido aspártico (D), aminoácido con una cadena lateral polar.
Distribución y toxicidad de nanopartículas de oro
Ahora bien, en un escenario biológico hay algunas consideraciones importantes
para el uso de las nanopartículas en aplicaciones biomédicas como son la estabilidad
y la potencial toxicidad. En estudios recientes llevados a cabo en nuestro laboratorio,
se demostró que las Au-NPs recubiertas con el péptido CLPFFD son más estables en
medios biológicos y menos tóxicas que las Au-NPs sin recubrir, siendo este hecho muy
relevante de cara a futuras aplicaciones biomédicas [Olmedo, 2008].
Asimismo, considerando el uso de las Au-NPs para el tratamiento y diagnóstico de
la EA, es necesario que las mismas sean capaces de llegar al cerebro para así actuar
sobre los agregados tóxicos característicos de tal enfermedad.
La biodistribución y eliminación de las nanopartículas es absolutamente
dependiente del tamaño de las mismas, observándose que cuanto mayor es el tamaño,
menor es la proporción que llega al cerebro. Al respecto, se ha observado que Au-NPs
de 10 nm se distribuyen por todo el organismo, llegando al cerebro, aunque en una
muy baja proporción respecto de la dosis inyectada. Sin embargo, se acumulan
mayoritariamente en hígado, riñón y bazo [Lasagna-Reeves, 2010; Sonavane, 2008].
5
Este hecho no es sorprendente, ya que en estudios de biodistribución de fármacos, se
ha observado que las cantidades de éstos, que efectivamente son capaces de
atravesar la barrera hematoencefálica y llegar al cerebro son muy bajas. Por ejemplo,
sólo llega al cerebro un 0,02% de una dosis de morfina, administrada periféricamente,
pero tal cantidad es suficiente para producir el efecto farmacológico deseado. De
hecho, para la mayoría de los fármacos dirigidos al Sistema Nervioso Central, la
cantidad que llega al cerebro es de menos de un 0,2% con una dosis suministrada de
manera periférica. Por lo tanto, a partir de estos datos, se puede concluir que se
requiere muy poca cantidad de un fármaco en el SNC para que se produzca un efecto
terapéutico [Banks, 2008]. En estudios recientes llevados a cabo en nuestro laboratorio
se demostró que al conjugar Au-NPs de 13 nm de diámetro con el péptido CLPFFD, un
0.05% de la dosis administrada del correspondiente conjugado llega al cerebro de ratas
luego de una inyección intraperitoneal [Guerrero, 2010] (Figura 4), mientras que sólo
un 0.01% de la dosis inyectada llega al cerebro para el caso de Au-NPs sin conjugar
con dicho péptido. En ambos casos, la mayor concentración de nanopartículas se
encontró en bazo e hígado siendo los niveles en el cerebro muy bajos (Figura 5).
Interesantemente, la conjugación de las Au-NPs con CLPFFD contribuyó a disminuir la
retención en órganos como bazo, lo cual puede atribuirse a una disminución de la
carga negativa de la partícula. Considerando futuras aplicaciones terapéuticas se
debe aumentar la llegada de las Au-NPs al cerebro, lo que se puede lograr
disminuyendo la captura de las mismas por algunos de estos órganos e
incrementándose así los niveles de nanopartículas que lleguen al cerebro.
Respecto a la eliminación de las nanopartículas, se ha observado que para aquellas
partículas que no pueden ser eliminadas por el sistema renal (límite de 5 nm de
diámetro), son eliminadas por el sistema biliar, pero aquellas que poseen un radio
hidrodinámico mayor a 200 nm muestran una tasa de eliminación más rápida que
partículas que poseen un radio hidrodinámico menor a 200 nm (pero mayor a 5 nm)
[Owens, 2006].
6
Figura 4: Concentraciones de Au-NP-CLPFFD-carboxifluoresceína en cerebro de rata después
de una inyección intraperitoneal de nanopartículas en una concentración de 20 nM. (Extraído de
Guerrero y cols, Nanomedicine, 5:897 -913, 2010).
Figura 5: Distribución de Au-NPCLPFFD,
unidas
a
carboxifluoresceína,
en
bazo,
hígado y riñón después de una
inyección
intraperitoneal
de
nanopartículas
en
una
concentración de 20 nM. (Extraído
de Guerrero y cols, Nanomedicine,
5:897 -913, 2010).
7
Una de las principales razones por las cuales las Au-NPs no alcanzan a llegar
al sitio de acción es debido a procesos como la opsonización o remoción de éstas por
el Sistema Fagocítico Mononuclear (MPS) [Owens, 2006; Li, 2008], o también a la
interacción con diversas moléculas presentes en el medio, como proteínas o elementos
figurados de la sangre [Lasagna-Reeves, 2010], lo que dificultaría en gran medida la
llegada al sitio de acción, que en el caso de la EA es el cerebro. Los macrófagos del
MPS tienen la capacidad de remover, en unos pocos segundos, de la circulación
sanguínea a las Au-NPs luego de que éstas sean administradas intravenosamente.
Tales macrófagos se encuentran principalmente en el hígado, siendo denominados
células de Kupffer, los que no reconocen directamente a las nanopartículas, pero sí a
las opsoninas adheridas a su superficie, y una vez que las reconocen ocurre la
fagocitosis. A partir de estos datos, lo que se busca es evitar que las opsoninas se
unan a la superficie de la nanopartícula para así impedir que sean fagocitadas,
aumentando su tiempo de vida media en el torrente sanguíneo para favorecer así la
llegada al sitio de acción deseado. Respecto a esto, se ha observado que la
opsonización ocurre más rápidamente en las partículas hidrofóbicas que en las
hidrofílicas, debido a un aumento en la adsorción de proteínas en tales superficies.
También se ha demostrado una correlación entre la carga superficial y la opsonización,
observándose que las partículas neutras presentan una menor opsonización que
aquellas cargadas [Guerrero, 2010; Fontana, 2001]. Respecto a esto, un grupo de
investigadores analizó la tasa de opsonización de liposomas de aproximadamente 200
nm con distintas cargas superficiales, observándose que la tasa de eliminación de los
liposomas cargados negativamente (potencial zeta de - 40 mV) fue significativamente
más alta que para los liposomas neutros (± 10 mV) y aumentándose su captura por el
MPS en el hígado, lo que estaría indicando que las células fagocíticas favorecen la
captura de partículas cargadas negativamente y de esta forma se aumentaría la tasa
de eliminación del torrente sanguíneo [Owens, 2006; Levchenko, 2002].
8
Ahora bien, como se mencionó previamente, las nanopartículas también se
pueden unir a diversas proteínas plasmáticas y respecto a esto, se ha reportado que
los complejos nanopartícula-proteína forman la denominada corona de proteínas
[Neus, 2009]. Dicha corona está formada por diferentes proteínas como fibrinógeno,
globulinas, histonas, insulina, y se mantiene estable por 24 horas. El control de las
propiedades físicas, químicas y biológicas de la adsorción de proteínas sobre las
nanopartículas define en gran medida el destino de la nanopartícula en los sistemas
vivos [Lacerda, 2010].
Entonces, se tiene claro que el uso de las Au-NPs ofrece múltiples ventajas
debido a su tamaño y propiedades únicas. Sin embargo, su principal desventaja es la
captura por el sistema inmune, lo que incluso podría generar cierta toxicidad.
Actualmente, se sabe que ciertas propiedades de las nanopartículas, tales como su
tamaño, su carga superficial, la hidrofobicidad/hidrofilicidad pueden tener influencia
directa sobre la compatibilidad de estas con el sistema inmune. En base a esto, una de
las formas de aumentar la funcionalidad de las nanopartículas es cambiar sus
propiedades fisicoquímicas como su tamaño y/o carga [Zolnik, 2010], por ejemplo a
través del recubrimiento con biomoléculas como péptidos o polímeros orgánicos.
Biocompatibilización de nanopartículas de oro.
Una de las formas de reducir la interacción de las nanopartículas con especies
endógenas es recubrirlas con polímeros que posean cargas positivas de manera tal de
evitar que las mismas sean capturadas por el MPS [Dobrovolskaia, 2008]. En este
sentido, en la literatura existen algunos ejemplos de biocomptaibilización de Au-NPs
con polímeros como alginato o quitosano [Manca 2008]. Al recubrir las nanopartículas
con los polímeros se obtiene un nanocompósito (Figura 6).
9
Figura 6: Esquema del recubrimiento de Au-NP previamente conjugadas con el péptido
CLPFFD.
Idealmente, el material polimérico debe ser biocompatible y con capacidad para
interactuar con las nanopartículas, formando complejos estables. Un material que
cumple muy bien con estas características es el quitosano (Figura 7), un polímero
natural, obtenido a partir de la desacetilación de quitina; cuando el nivel de
desacetilación de la quitina es mayor al 50%, el polímero se denomina quitosano (Qo).
Entre sus características más importantes se puede mencionar que es un polímero
lineal de D-glucosamina (por lo que posee grupos amino primarios), es biodegradable,
biocompatible, antibacteriano, no antigénico, biofuncional, de bajo costo, con una
excelente capacidad para formar films, alta fuerza mecánica, susceptible a
modificaciones químicas y catiónico, siendo ideal para aplicaciones biológicas, ya que
también es hidrofílico. Sin embargo, el uso de Qo posee un inconveniente, ya que este
polímero presenta un efecto trombogénico, debido a su elevada energía superficial, la
que promueve una alta capacidad adhesiva de las plaquetas, induciendo de esta
manera la aceleración en la formación del trombo [Kweon, 1998]. Respecto a esto,
varios estudios demuestran que el Qo tiene efectos sobre la coagulación sanguínea in
vitro y en la activación plaquetaria (Figura 8). Sin embargo, la hemostasis causada por
el Qo no posee una explicación clara sobre a qué nivel estaría actuando, aunque se ha
10
indicado que el Qo tiene la capacidad de activar los sistemas del complemento y de la
coagulación sanguínea [Benesch, 2002; Minami, 1998; Brandenberg, 1984]. También
se ha reportado que la densidad de carga que posee el quitosano incidirá en su
toxicidad, indicándose que a mayor densidad de carga aumentaría su efecto tóxico, por
lo que una modificación en este polímero que disminuya la densidad de carga,
disminuiría
o
eliminaría
su
posible
toxicidad
[Kean,
2010].
En
resumen,
desafortunadamente el Qo promueve la adsorción de proteínas plasmáticas, la
adhesión plaquetaria y la activación y desarrollo del trombo [Banks, 2008].
Figura 7: Estructura del Quitosano.
11
Efectos de materiales sobre la coagulación sanguínea: influencia de
la carga y de la energía superficial.
A fin de simplificar su entendimiento, la cascada de la coagulación ha sido dividida
en dos vías: la intrínseca y la extrínseca, las que convergen finalmente en una sola vía
que lleva a la formación completa del trombo (Figura 8). Tales vías son iniciadas por el
factor XII y el VIIa/TF, respectivamente. Varias de las etapas de la coagulación
requieren calcio (Ca) y fosfolípidos para su actividad y secuencialmente se van
activando los distintos factores o células a medida que son requeridos en cada una de
las vías mencionadas [Monroe, 2006].
Como se ha mencionado previamente, el Qo ejerce un efecto trombogénico en la
sangre, lo que puede deberse a los grupos amino que posee, ya que a pH fisiológico
presenta una carga neta positiva y alta hidrofilicidad, lo que puede traducirse en una
alta energía superficial (tema analizado más adelante) y debido a esto, el Qo estaría
actuando en la vía extrínseca de la coagulación (Figura 8), y más específicamente, a
nivel de la activación plaquetaria activándose así el proceso trombogénico, debido a
que las plaquetas poseen en su superficie una carga negativa, por lo que interactuarían
con el Qo por unión electrostática y al unirse el Qo a esta superficie promovería más
rápidamente la unión de más plaquetas y/o diversas otras moléculas presentes en el
medio, para comenzar la formación del trombo. Por otro lado, las Au-NPs, debido a su
carga negativa, podrían actuar al principio de la vía intrínseca de la cascada de la
coagulación, particularmente en la activación del factor XII, debido a que este reconoce
superficies extrañas (preferencialmente aquellas con carga superficial negativa) y se
une a ellas, adsorbiéndose sobre la superficie cargada negativamente (que en este
caso sería la Au-NP).
12
Figura 8: Cascada de la coagulación.
En resumen, los efectos sobre la coagulación pueden darse por la energía
superficial o por la presencia de cargas en el nanomaterial.
13
Energía superficial.
Se denomina así a la tensión superficial crítica (γc) de una superficie sólida y se
mide en unidades de fuerza por área de superficie (en el Sistema Internacional, N/m).
Este dato se obtiene a partir de datos de ángulo de contacto con distintos solventes y
permite caracterizar los materiales de acuerdo a las energías superficiales que
presenten, esto se debe a que la tensión superficial crítica es una característica única
de la superficie de un sólido y está relacionada con la constitución química más externa
de tales superficies. Por ejemplo, las superficies de los fluorocarbonos son
intrínsecamente de baja energía superficial, por lo que poseen valores de γc bajos y
muestran pobres cualidades adhesivas, contrario a lo que ocurre con aquellas
superficies que presentan alta energía superficial [Baierm, 1970].
La medida de energía superficial se utiliza ampliamente en el rubro de la
industria minera, esto se debe a que en este rubro se emplea un proceso denominado
flotación para separar los minerales de interés de la ganga. La flotación de una
partícula sólida (como un mineral) en un líquido, depende del ángulo de contacto entre
la partícula y el líquido y debido a que el ángulo de contacto puede modificarse a través
de factores como grasa superficial (lo que aumentaría el ángulo de contacto), entonces
la flotación de las partículas también puede ser regulada o controlada [Toral, 1973;
Adamson, 1990].
Esto se debe a que los diversos componentes de los minerales tienen distintas
tendencias a flotar en la superficie del agua y estas tendencias pueden aumentarse por
la presencia de aditivos, como aceites colectores, los que se adsorben fuertemente en
la superficie del mineral, con lo que aumenta el ángulo de contacto y se hace posible
así la flotación; en cambio, tales aceites no se adsorben sobre la ganga, que sí se moja
por el agua y por lo tanto no flota [Baierm, 1970].
14
Respecto a los estudios de ángulo de contacto mencionados, estos son datos
indicativos sobre la mojabilidad y reactividad de los distintos materiales, tanto de
interés industrial como de interés biológico [Monroe, 2006].
Ahora, en relación con el efecto de la energía superficial de los distintos
materiales sobre la coagulación sanguínea, se han realizado estudios sobre la pared
de vasos sanguíneos y se ha determinado que estos están constituidos principalmente
por lipoproteínas de baja energía cuya capa más externa se encuentra principalmente
compuesta de hidrocarburos. El daño a esta capa superficial puede exponer proteínas
de la matriz, de mayores energías, lo que podría generar una trombosis intravascular
[Monroe, 2006].
Es por esto que es necesario caracterizar los polímeros obtenidos,
determinando su energía superficial, y comparar tales resultados con el Qo para así
determinar si disminuye o no la energía superficial al entrecruzarlo con un polímero
hidrofóbico (como el polisiloxano) y, a su vez, evaluar si disminuye o se elimina el
efecto trombogénico. Este procedimiento probablemente debiera realizarse sobre
cualquier material que se quiera utilizar en posibles aplicaciones biomédicas, ya que
permite determinar si estos interferirán o no con la cascada de la coagulación, lo que
puede ser deseable en algunos casos.
15
Una estrategia para reducir la energía superficial del quitosano.
Como se ha mencionado, una de las formas de reducir la energía superficial del Qo
es entrecruzándolo con polímeros de baja energía superficial, como los polisiloxanos,
polímeros que además poseen una alta estabilidad térmica y son hidrofóbicos. Con el
entrecruzamiento entre estos polímeros se pretende eliminar su efecto trombogénico,
al disminuir su energía superficial [Depan, 2008; Huntmacher, 2001; Senthil, 2005].
Los polisiloxanos (PS), Figura 9A, son materiales atractivos que han sido utilizados
extensamente para fabricar aparatos de bajo costo y desechables. Entre sus
principales características ventajosas se pueden mencionar: transparencia óptica,
biocompatibilidad, bajo costo, durabilidad, alta flexibilidad, permeabilidad a los gases y
química superficial versátil, entre otras. El hecho de que presente tantas ventajas, lo
hace un sustrato útil para diversas aplicaciones, y por lo tanto, también lo convierte en
un polímero valioso para uso en dispositivos biomédicos, tales como catéteres y
dentaduras postizas, entre otros. Sin embargo, los PS aún tienen algunos defectos
como adsorción fuerte de moléculas hidrofóbicas pequeñas, biomoléculas y células, las
cuales limitan enormemente su aplicación posterior, lo que se podría solucionar al
entrecruzarlo con Qo [Owens, 2006; Zhao, 2008].
Para que este tipo de polímero pueda entrecruzarse con el Qo, requiere algún grupo
funcional (o reactivo) en su estructura que pueda interaccionar con el grupo amino del
Qo. Es por esto que una buena estrategia es utilizar un PS funcionalizado (Figura 9B)
con un grupo como el carboxílico (COOH), para que así pueda reaccionar con el grupo
NH2 del Qo, formando así un enlace covalente entre ambos polímeros.
16
Figura 9: A) Estructura general de un polisiloxano (PS) y B) Estructura de un derivado,
funcionalizado con un grupo carboxílico (COOH).
La unión de un polímero sintético como el PS funcionalizado con un grupo carboxilo
(Figura 9B) y uno natural, como el Qo (Figura 7), conservando las cualidades del
polímero natural, como la biodegradación y la bioactividad, entre otras, se puede lograr
mediante la copolimerización por injerto [Kim, 2002]. De esta manera, se incorporan al
Qo nuevas propiedades, como la reducción de su energía superficial, de forma simple
y efectiva. Por todos estos motivos, es que en el presente trabajo se empleará
esta estrategia para obtener un copolímero que comparta las ventajas de cada
uno de los polímeros mencionados (Qo y PS), mientras que al mismo tiempo,
disminuya o corrija sus efectos no deseados de una forma que podría
denominarse “mutualismo” (Figura 10).
17
Posteriormente, este nuevo polímero entrecruzado se utilizó para recubrir las AuNPs y formar los nanocompósitos (NCs), evitando así los efectos trombogénicos del
Qo y al mismo tiempo aumentando la llegada de las Au-NPs al cerebro, dado que
estaría disminuyendo la captación de las nanopartículas por el MPS, ya que su carga
negativa quedaría recubierta por el polímero, debido a que tales cargas negativas
contribuyen a la interacción electrostática con las cargas positivas del Qo,
disminuyendo así la probabilidad de ser capturadas por dicho sistema. De esta misma
forma, también se inhibiría la adsorción de proteínas en su superficie. Todo esto
aumentaría el tiempo de circulación de las Au-NPs, incrementando así la probabilidad
de que lleguen al cerebro.
Figura 10: Reacción de entrecruzamiento de Qo y un derivado de PS.
18
Entrecruzamiento y caracterización de polímeros.
El entrecruzamiento de polímeros se puede realizar por diversos métodos, uno de
ellos es mediante el fotoentrecruzamiento, en ausencia de catalizador, para lo cual,
ambos polímeros son sometidos a radiación ultravioleta (UV) por un tiempo y en
condiciones determinadas hasta que se forma el entrecruzado entre ambos polímeros
[Depan, 2008]. Otra forma de entrecruzar polímeros es mediante el uso de un agente
entrecruzante, y como en el presente caso se dispone de un PS funcionalizado con un
grupo carboxilo, que es el polímero que se pretende entrecruzar con Qo, se busca un
agente entrecruzante que sea capaz de activar algunas de las moléculas funcionales
de estos polímeros.
Una vez obtenido tal entrecruzado, se puede caracterizar por diversas técnicas
para así determinar si efectivamente se formó dicho entrecruzado, entre estas técnicas
se pueden mencionar el Análisis Termogravimétrico (TGA), la Espectroscopía Infrarroja
(IR) y medidas de ángulo de contacto. A continuación se detallarán las técnicas aquí
utilizadas, para la caracterización de los entrecruzados obtenidos.
-
Análisis Termogravimétrico (TGA): esta técnica se basa en medir la variación en
la masa de una muestra (en este caso, un polímero) al ser sometida a un
aumento progresivo de la temperatura, en una atmósfera controlada. Los
cambios en la masa de la muestra se van registrando e informan de la
temperatura a la que se descompone. Así, se puede determinar si una muestra
es más o menos termorresistente que otra [Depan, 2008]. Esta técnica también
se utiliza para determinar si una muestra polimérica es pura, es una mezcla
física de polímeros o son polímeros entrecruzados unidos covalentemente.
19
Para determinar si existe o no un polímero entrecruzado, el copolímero deberá
presentar una temperatura de descomposición distinta para tal polímero a la de
los polímeros originales, lo que significará que el entrecruzado es más o menos
resistente que los polímeros originales.
-
Espectroscopía Infrarroja (IR): Esta técnica aprovecha el hecho de que las
moléculas absorben a frecuencias específicas que son características de su
estructura. Esto se debe a que cada molécula posee un modo vibratorio en
particular, que es lo que se mide finalmente, y a medida que presenta una
mayor cantidad de enlaces, mayor será el número de señales o picos que se
observarán en el espectro infrarrojo obtenido.
El espectro se obtiene al hacer pasar un haz de luz infrarroja a través de la
muestra. Luego, se examina la cantidad de luz transmitida y esto indica cuánta
energía fue absorbida a cada longitud de onda. El análisis del espectro y por lo
tanto de sus características de absorción revela detalles de la estructura
molecular de la muestra. Cuando la frecuencia del IR es la misma que la
frecuencia vibratoria de un enlace, ocurre la absorción. Esta técnica funciona
por lo tanto, para muestras con enlaces covalentes.
Entonces, al utilizar esta técnica se puede analizar si efectivamente se forma el
compuesto o molécula que se esperaba, ya que aparecerían o desaparecerían
ciertos enlaces, o bien pueden ocurrir ambas situaciones de manera simultánea
[Kweon, 1998; Depan, 2008], produciéndose la aparición o desaparición de
señales en el espectro.
-
Medición de ángulo de contacto: Esta determinación permite conocer la
mojabilidad de una superficie sólida (polimérica, en este caso), la que se
20
relaciona con su energía superficial de tal superficie. El ángulo que se mide
corresponde al que se muestra en la Figura 11.
Posteriormente, a partir de la obtención del ángulo de contacto y conociendo las
tensiones superficiales de los líquidos utilizados para determinar dicho ángulo,
se puede obtener la energía superficial del polímero en cuestión. Esto se hace
utilizando la ecuación de la recta que se obtiene al graficar el coseno del ángulo
de contacto versus la tensión superficial [Fox, 1952].
Figura 11: Medición del ángulo de contacto de un líquido sobre una superficie sólida.
Así, se pueden obtener conclusiones acerca de cómo interactuarían los
polímeros con el medio en que se encuentre, si son más o menos hidrofílicos, poseen
mayor o menor energía superficial y por lo tanto mayor o menor reactividad con el
medio.
21
Obtención de nanopartículas de oro.
La síntesis de Au-NPs se realiza principalmente mediante la reducción de una
sal de oro, como HAuCl4. Esta reducción puede realizarse de diversas formas como se
menciona a continuación. Una de las formas más comunes para la reducción del oro es
con citrato de sodio, en este caso, la solución de oro es sometida a reflujo y
posteriormente se le agrega el citrato de sodio. De esta manera, según la relación de
sales de oro/citrato se logra controlar el tamaño de las nanopartículas.
Otro método para reducir el oro y obtener posteriormente las nanopartículas es
mediante el uso de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) con la sal de oro
mencionada previamente, adicionando también borohidruro de sodio (NaBH4)
[Guerrero, 2008].
Finalmente, se puede mencionar un método fotoquímico para reducir y obtener
las Au-NPs, este es mediante la irradiación con rayos X. Para esto, se utiliza el
detergente tritón, que se mezcla con la solución de la sal de oro (HAuCl4). Esta
solución se irradia con 40 kV y 40 mA, por 40 ó 60 minutos para completar la reducción
del precursor de oro en la solución [Long, 2009].
Una vez obtenidas las nanopartículas, estas pueden ser caracterizadas por
diversas
técnicas
como
Microscopía
Electrónica
de
Transmisión
(TEM),
Espectroscopía UV/Visible, Microscopía de Fuerza Atómica, medidas de potencial zeta,
entre otras [Minami, 1998].
22
En este trabajo se utilizó el primer método mencionado para la síntesis de AuNPs, que consiste en la reducción de la sal de oro con citrato de sodio.
Síntesis de nanocompósitos.
Los nanocompósitos (NCs) también pueden ser obtenidos de distintas formas y,
al mismo tiempo, también pueden estar constituidos de distintos materiales, pueden ser
sólo mezclas de polímeros o metales recubiertos por polímeros u otros materiales de
interés. En este caso, nos interesa recubrir las Au-NPs con polímeros derivados del Qo
(entrecruzados con un PS funcionalizado con el grupo carboxilo). Respecto a esto, Tan
y Zhang proponen como metodología utilizar Au-NPs de 5 nm de diámetro y Qo al 1%,
que se agrega gota a gota sobre la solución de nanopartículas bajo agitación constante
y posteriormente la solución es lavada y centrifugada repetidas veces [Tan, 2005],
obteniéndose los correspondientes nanocompósitos.
Otra metodología propuesta es más simple y para esto se utilizan
nanopartículas previamente centrifugadas, a las que se les agrega una cantidad
determinada de Qo y de agua milli-Q. Esta mezcla se deja a temperatura ambiente por
24 horas, para posteriormente caracterizar el producto obtenido. En este caso, el grado
de agregación entre las nanopartículas y los polímeros dependerá de las cantidades
que se agreguen de cada uno, lo que dependerá de las aplicaciones deseadas [Hong,
2009].
23
Efecto de tamaño y carga sobre la biodistribución de
nanocompósitos.
Como se ha mencionado previamente, es muy importante determinar las
propiedades físicoquímicas superficiales de cualquier partícula o molécula que se
quiera aplicar en medios biológicos. Entre tales propiedades, las más importantes son
el tamaño, la carga superficial, lo grupos funcionales que recubran la partícula y la
hidrofilicidad, esto se debe a que ambas características son las que más influyen en el
destino final de la partícula y/o su captura por el MPS [Zahr, 2006]. Por ejemplo, ya se
ha explicado que las partículas que poseen cargas negativas son más susceptibles de
ser capturadas por el MPS, por lo tanto es ideal el utilizar partículas neutras o cargadas
positivamente para evadir tal sistema o bien utilizar partículas cargadas negativamente
si lo que se pretende es dirigirlas al sistema inmune. Esto está demostrado, ya que se
ha reportado que al reducir la carga negativa de las Au-NPs (- 40 mV aprox.)
recubriéndolas con un polímero neutro (llega a - 8 mV aprox.) conlleva a una
disminución en su captura por el MPS [Zhang, 2009], aunque también en dicha captura
tiene gran influencia el tamaño.
Con respecto al tamaño, ya se ha mencionado que a menor tamaño, mayor es
la biodistribución de estas por todo el organismo, incluso llegando al cerebro, lo que es
claramente observable con partículas de unos 10 nm de diámetro [Lasagna-Reeves,
2010; Sonavane, 2008]. Mientras que partículas más grandes (más de 250 nm) tienden
a quedar atrapadas en órganos del MPS, como bazo o hígado. Es por esto que si se
desea llegar a un blanco específico, como el cerebro en este caso, es importante
utilizar partículas muy pequeñas (10 – 15 nm) o bien partículas más grandes que se
puedan degradar en el trayecto al cerebro. Este es el caso de los nanocompósitos
(NCs), como los preparados en el presente trabajo de tesis, donde las Au-NPs están
24
recubiertas por un polímero entrecruzado de Qo y PS, que debe ser biocompatible y
biodegradable, por lo que, a pesar que el tamaño sea mayor a los 250 nm, se espera
que estos NCs se degraden en el trayecto para liberar las Au-NPs y así permitir su
llegada al cerebro. Al respecto, hay evidencia de nanopartículas basadas en Qo de
unos 250-300 nm de diámetro, son capaces de atravesar barreras y acumularse en un
tejido específico, como un tumor, lo que se debe probablemente a su capacidad
deformable y su alta capacidad de ser incorporado en las células [Kim, 2010].
Evaluación de toxicidad.
Como se mencionó previamente, para poder considerar las aplicaciones
biomédicas, es necesario evaluar la potencial toxicidad que presentan los polímeros y
los NCs para lo cual se realizarán los ensayos toxicológicos a nivel hematológico y a
nivel de viabilidad celular. Esto se realiza previo al recubrimiento de las Au-NPs con el
polímero entrecruzado y también una vez formados los NCs. Como se ha mencionado
anteriormente, el Qo es capaz de inducir un efecto trombogénico siendo entonces
necesario realizar ensayos de coagulación sanguínea para evaluar si los nuevos
copolímeros obtenidos perdieron la capacidad trombogénica. Mientras que el ensayo
de viabilidad en neuronas también es requerido debido a que se ha descrito que el Qo
puede atravesar la barrera hematoencefálica llegando al cerebro y los NCs a obtener
en el presente trabajo serán utilizados para ser dirigidos a ese órgano [Yao, 2008;
Aktas, 2005]. Asimismo, es importante considerar que la incorporación del PS al Qo
aporta un componente que aumenta la hidrofobicidad del copolímero, incrementando
así la posibilidad de que el Qo modificado llegue al cerebro. Entonces, en los ensayos
de citotoxicidad se evaluará la viabilidad de una línea celular de neuroblastoma (SHSY5Y), ya que los nanocompósitos se utilizarán para el posible desarrollo de una
terapia contra la enfermedad de Alzheimer.
25
Otros grupos ya han realizado ensayos de citotoxicidad utilizando diversas
nanopartículas y se ha reportado, por ejemplo, que las nanopartículas de plata
presentan citotoxicidad, genotoxicidad y además, son antiproliferativas, conclusiones
obtenidas a partir de la evaluación de la morfología y la viabilidad celular, la actividad
metabólica, el estrés oxidativo y el ensayo de micronúcleos [AshaRani, 2009]. Por otro
lado, también se ha evaluado la toxicidad de Au-NPs en ratas y se ha observado que
estas no presentan toxicidad, pero si observaron un ingreso a los tejidos de manera
eficiente, llegando también al cerebro, aunque en baja cantidad, indicando que serían
capaces de atravesar la barrera hematoencefálica. Los estudios realizados incluyen
sobrevida, conducta, peso, morfología de los órganos, bioquímica de la sangre, e
histología de los órganos [Lasagna-Reeves, 2010].
Como se ha mencionado, hay diversos ensayos para determinar o evaluar la
viabilidad celular y algunas alternativas posibles son las siguientes: bromuro de 3-(4,5
dimetiltiazol-2-il)2,5
difeniltetrazolio
(MTT),
carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-
(MTS),
(4-[3-(4-Iodofenil)-2-(4-
nitrofenil) -2H-5-tetrazol-1,3-benceno disulfonato (WST-1), entre otros. En los ensayos
mencionados, se determina la actividad mitocondrial por la reducción de los colorantes
utilizados, los que varían su color al estar en presencia de células viables y por lo tanto,
pueden medirse a nivel de su absorbancia por espectrofotometría, la que será
directamente proporcional al metabolismo celular, aspecto que se relacionará
directamente con su viabilidad. La metodología utilizada en el presente trabajo se basó
en la reducción del MTS.
Además, debido a que las células de neuroblastoma (SH-SY5Y) que se
utilizaron son adherentes, es necesario evaluar si los polímeros obtenidos impiden o
alteran de alguna forma la adherencia de estas células. Para ello se utilizó
fluorescencia, empleando como sonda marcadora carboxifluoresceína éster succinidil
26
diacetato (CFSE). En este ensayo, las células son marcadas con esta sonda y
posteriormente se incuban con los distintos polímeros, dejando un grupo control.
Por otro lado, para determinar la hemocompatibilidad de los polímeros
entrecruzados, hay diversos métodos aceptados para su evaluación in vitro, como por
ejemplo: tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial activada, tiempo de
retracción de coágulo, tiempo de recalcificación de plasma y tiempo de coagulación de
sangre completa, entre otros [Lacerda, 2010].
Se ha postulado previamente, que el Qo actuaría en la vía extrínseca de la
coagulación, mientras que las Au-NPs podrían hacerlo en la vía intrínseca, ambas
acelerando el tiempo de coagulación (Figura 8). Para evaluar la vía extrínseca se utiliza
principalmente el tiempo de protrombina (PT), mientras que para evaluar la vía
intrínseca se utiliza el tiempo de trombina parcial o activada (PTT) y para evaluar la
cascada de coagulación en general se utiliza el tiempo de coagulación de sangre
completa, ensayo que se utilizó en el presente trabajo de tesis.
En resumen, esta memoria tiene como objetivo la obtención de nuevos Qo
modificados
que
no
presenten
efectos
tóxicos,
como
neurotoxicidad
y/o
trombogenicidad, los que se utilizarán para recubrir Au-NPs con el fin de incrementar
su paso a través de la barrera hematoencefálica, evitando así el Sistema Fagocítico
Mononuclear y los posibles efectos trombogénicos. En trabajos posteriores a esta
memoria se evaluarán factores como la toxicidad y distribución de los nanocompósitos
in vivo para futuras aplicaciones en terapia y diagnóstico de la enfermedad de
Alzheimer.
27
Hipótesis.
Dado que el quitosano presenta un efecto trombogénico y que el polisiloxano
presenta un efecto anticoagulante, un copolímero de ambos no tendrá efectos sobre la
coagulación. Además, debido a que ambos polímeros son biocompatibles, el
copolímero tampoco será citotóxico, por lo que se utilizará
para obtener
nanocompósitos de nanopartículas que sean no citotóxicos y hemocompatibles.
Objetivos.
Objetivo general:
Obtener copolímeros derivados de quitosano (Qo-PS) y nanocompósitos de
tales copolímeros con nanopartículas de oro (Au-NPs), con y sin conjugar al
péptido CLPFFD, que no sean citotóxicos y sean hemocompatibles.
28
Objetivos específicos
1.- Obtener y caracterizar nuevos polímeros derivados del quitosano
(quitosano entrecruzados con un polisiloxano funcionalizado, Qo-PS).
2.- Sintetizar y caracterizar las Au-NPs.
3.- Conjugar las Au-NPs con el péptido CLPFFD y caracterizar el conjugado.
4.- Obtener y caracterizar los nanocompósitos, utilizando los polímeros
derivados, Qo-PS, para recubrir las Au-NPs.
5.- Evaluar la toxicidad de los polímeros derivados del quitosano (Qo-PS) y
de los nanocompósitos formados por los conjugados Au-NPs-CLPFFD y los
polímeros derivados del quitosano.
5.1: Ensayos de coagulación: determinar los efectos en el tiempo de
coagulación de los distintos polímeros derivados de quitosano (Qo-PS) en
estudio.
5.2: Ensayos de viabilidad celular.
29
METODOLOGÍA
1.- Síntesis de polímeros biocompatibles.
Estos polímeros se formaron mediante una reacción de entrecruzamiento entre
quitosano (Qo) de alto peso molecular y un polisiloxano (PS) funcionalizado con un
grupo carboxilo, para así permitir su activación por un agente entrecruzante,
denominado N-etil-N,N (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y, una vez activado, su
posterior reacción con el grupo amino del Qo, para formar un enlace amida entre
ambos polímeros; el EDC se agregó al 1 % del volumen total de reacción. El medio de
reacción también contenía Imidazol 0,1 M a pH 6.0, con la finalidad de estabilizar el
intermediario y favorecer el entrecruzamiento (Adaptado del protocolo “Modify and label
oligonucleotide 5´ phosphate groups”, detallado por ©Pierce Biotechnology, Inc.,
12/2006). Posteriormente, el tubo de reacción se incubó a 37 °C y se mantuvo toda la
noche con agitación constante. La reacción se detuvo al día siguiente mediante la
utilización de Tris-HCl y posteriormente se purificó el producto obtenido, para esto,
primero
se
evaporaron
los
solventes
presentes
utilizando
un
rotavapor
y
posteriormente el producto sólido obtenido se secó en una estufa al vacío y con
temperatura ambiente. Una vez seco, el producto se masó para disolverlo
posteriormente en ácido acético (al 2%) a una concentración final de 0,5 %, al igual
que el Qo. Estos polímeros se formaron en distintas proporciones de Qo:PS, las que
serán 1:1 (denominada en adelante 1), 2:1 (2), 5:1 (3), 10:1 (4) y finalmente 100:1 (5),
las que corresponden a un porcentaje de Qo de 50, 67, 83, 90 y 99%, respectivamente.
30
1.2.- Caracterización de los polímeros.
1.2.1
Análisis
termogravimétrico
y
Espectroscopía
infrarroja:
Para
la
caracterización por análisis termogravimétrico (TGA) [Rodríguez-Baeza, 2003], los
polímeros deben secarse muy bien, para eliminar lo máximo posible la contaminación
con el agua, mientras que para caracterizar los polímeros por espectroscopía infrarroja
(IR), primero se secaron y una vez bien secos, se molieron finamente, mezclándose
con bromuro de potasio. Esta mezcla pulverizada posteriormente se prensó
mecánicamente para formar un pellet, a través del cual pasa el haz IR.
1.2.2 Energía superficial: otra caracterización realizada en el presente trabajo
es la medición de los ángulos de contacto de los distintos polímeros entrecruzados y
del Qo solo, para calcular posteriormente la energía superficial de cada uno de estos
polímeros y así evaluar si hay o no disminución en ésta. Para ello, primero se formaron
los films de cada polímero. Los mismos fueron neutralizados con NaOH 0,1 M, lavados
con agua milli-Q hasta que el pH de la solución fue alrededor de 6,5 a 7 y puestos a
secar en una estufa al vacío y a temperatura ambiente, para eliminar lo máximo posible
el ácido acético (solvente de estos polímeros), que podría alterar los resultados.
Posteriormente, se agregaron 8 µL del solvente correspondiente (agua destilada,
anilina o cloroformo) en cada film de polímero y se proyectó la imagen de la gota en
una pared blanca, a la que se le sacaron varias fotografías para medir el ángulo de
contacto que se forma con cada polímero, a través del programa Image J. Por otro
lado, también se midió la tensión superficial de los solventes utilizados, para
emplearlos junto con los otros datos recolectados de ángulo de contacto y realizar el
gráfico de Zisman, donde se grafica el coseno del ángulo de contacto versus la tensión
superficial de los solventes, para cada polímero, luego se obtuvo la ecuación de la
recta y a partir de esto la energía superficial de cada polímero (cuando el coseno del
ángulo es igual a 1).
31
2.- Síntesis de nanopartículas de oro
Las nanopartículas de oro (Au-NPs) se prepararon por reducción de una sal de
oro (HAuCl4) con citrato de sodio. Para esto, 100 mL de HAuCl4 1 mM se colocaron en
un balón y se sometieron a reflujo constante por unos 5 a 10 minutos, luego se agrega
rápidamente la solución de citrato de sodio 38,8 mM, calentada previamente a 50 – 60
°C, dejándose a reflujo por 30 minutos, hasta obtener una solución roja y
posteriormente se dejó enfriar a temperatura ambiente. Después, la solución obtenida
se filtró y almacenó a 4 °C. El tamaño de las nanopartículas pudo ser controlado
modificando la razón citrato/ HAuCl4 [Zharov, 2005]. Las Au-NPs fueron caracterizadas
por Espectrofotometría UV/Vis y Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) [Klafki,
2006].
Para la caracterización por TEM, se prepararon las rejillas de la siguiente forma:
se colocaron 10 µL de la solución de Au-NPs, dejándose secar durante toda la noche y
observándose al día siguiente por TEM.
3.- Conjugación con el péptido CLPFFD
Esta se realizó mezclando Au-NPs 5 nM con una solución de péptido stock
(1mg/mL), en una proporción de volumen de 10:1. Esta conjugación se realizó en
presencia de un exceso de moléculas de péptido para lograr el máximo recubrimiento
posible. Después de la incubación, se obtuvo una monocapa del péptido y con el fin de
eliminar el péptido libre, la muestra se dializó por 3 noches frente a citrato [Olmedo,
2008], almacenándose posteriormente a 4 °C. El péptido fue sintetizado por el
estudiante Simón Guerrero durante el desarrollo de su tesis de pregrado.
Los
conjugados obtenidos se caracterizaron por UV-Vis y TEM.
32
4.- Formación y caracterización de los nanocompósitos
Para formar los nanocompósitos (NCs), se centrifugó 1 mL de Au-NPs (con y
sin conjugar) a 16000 x g por 7 minutos para luego extraer el volumen correspondiente
del solvente, que va a depender de la proporción Au-NP: polímero que se pretenda
formar. Posteriormente, se agregó el volumen de la solución de polímero elegida (Qo o
entrecruzado), luego se completó a 1,5 mL con agua milli-Q y se dejó a temperatura
ambiente
por
24
horas
[Hong,
2009].
Estos
NCs
se
caracterizaron
por
espectrofotometría UV-Vis, TEM, medidas de potencial zeta y de Dynamic Light
Scattering (DLS) [Kim, 2008; Murthy, 2008].
5.- Evaluación de la toxicidad
5.1 Ensayo de coagulación: para esto se utilizó sangre completa humana
(donante sano) en 0,109 M de citrato de sodio 3,2%, la que se incubó por 5 minutos a
37 °C con la muestra que corresponda en una proporción 1:1 (500 µL de sangre y 500
µL de muestra). En todos los casos se añadió cloruro de sodio (NaCl), para mantener
la osmolaridad adecuada (150 mM en que debe estar la sangre para impedir la lisis de
los glóbulos rojos), pero en el caso del control, se agregó sólo NaCl 300 mM (500 µL),
en lugar de la muestra. Es por esto que, en el caso de los tubos que llevan muestras,
se les agregó también un volumen de NaCl de mayor concentración para así evitar la
hemólisis (si el medio posee mayor concentración de sales, entonces el agua presente
dentro del eritrocito tiende a salir (fenómeno conocido crenación), produciéndose la
destrucción celular, por el contrario, si la concentración del medio es menor, entonces
tiende a entrar agua a la célula (fenómeno conocido hemólisis), provocando la ruptura
celular. Posteriormente, para activar la coagulación, se utilizó 250 µL de cloruro de
calcio 50 mM; en el instante en que agregó el cloruro de calcio, se comenzó a medir el
tiempo que tarda en formarse el trombo, el que se detuvo cuando estuvo
completamente formado (cuando no escurra líquido por las paredes del tubo) [Koziara,
33
2005; Okamoto, 2003]. A continuación se presenta un esquema simplificado (Esquema
I) del procedimiento para realizar el ensayo de coagulación sanguínea.
Polímero
Esquema I: Procedimiento para determinar el tiempo de coagulación.
En el caso de la evaluación de los polímeros, estos se depositaron en el fondo
del tubo donde se realizó el ensayo, se dejaron secar allí, en una estufa al vacío y a
temperatura ambiente y posteriormente fueron neutralizados con hidróxido de sodio
(NaOH) 0,1 M y lavados con agua milli-Q para descartar los posibles efectos del ácido
acético que podría haber quedado presente sobre el polímero (recordar que los
polímeros utilizados están disueltos en ácido acético al 2%, para quedar a una
concentración final de 0,5 %). En cada tubo se agregaron 400 µL de la solución del
polímero correspondiente, el cual una vez seco, corresponde a 2 mg del polímero.
34
Por otro lado, al utilizar los NCs obtenidos, estos se encontraron en solución,
pero como en este caso el principal solvente es agua milli-Q, no se ve alterado el
proceso de coagulación. Sin embargo, de todas maneras se utilizó NaCl, en cada tubo,
para mantener constante la presión osmótica (150 mM).
5.2
Ensayo de viabilidad: Se empleó la técnica de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-
yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium
(MTS).
En
este
ensayo, se evaluó la viabilidad celular mediante la determinación de su actividad
mitocondrial. Para ello se utilizó el MTS, reactivo que en presencia de células viables
llega a la mitocondria donde es reducido, originando un compuesto coloreado
(formazán) [Hiebl, 2010]. Para determinar las diferencias en la coloración, se utilizó un
espectrofotómetro y se midió a 490 nm de longitud de onda, mientras mayor fue la
absorbancia (intensidad del color azul), mayor es la viabilidad celular en ese pocillo.
35
5.3
Por otro lado, se realizó un ensayo de fluorescencia para determinar si
la presencia de los polímeros, induce o no algún efecto sobre la adherencia de las
células a tales polímeros (o copolímeros). Para realizar este experimento, se utilizó
CSFE (éster succinimidil de carboxifluoresceína diacetato) como marcador celular
fluorescente, y se realizó de la siguiente manera: primero se contaron las células a
utilizar (en este caso, células de neuroblastoma humano, SH-SY5Y), una vez obtenida
la cantidad de células que se necesitan, estas se centrifugaron a 2100 x g por 4
minutos y se resuspendieron en PBS, suplementado con BSA al 1 %, en este medio se
marcaron con la sonda fluorescente, CSFE, dejándolas a 37 °C por 15 minutos. Una
vez marcadas, se volvieron a centrifugar, se lavaron con PBS, se resuspendieron en
medio y posteriormente se sembraron 10000 células por pocillo en una placa de 96
pocillos. Luego del tiempo determinado (en este caso 0.5, 1, 2 y 72 horas) se removió
todo el medio del pocillo y se agregó medio nuevo. Entonces, al quitar el medio
antiguo, se retiraron también las células que no lograron adherirse a la superficie.
Finalmente, la fluorescencia detectada es proporcional al número de células. De esta
manera se comparó las muestras con el control.
En el caso de la evaluación de los polímeros, esta se realizó de manera
similar a lo hecho en el ensayo de coagulación, ya que antes de sembrar las células,
los polímeros se agregaron a placas de 96 pocillos (100 µL de cada polímero).
Posteriormente se dejaron secando en una estufa al vacío, a temperatura ambiente,
para que se evaporara el solvente (ácido acético). Una vez secos, cada pocillo fue
lavado y neutralizado con NaOH 0,1 M y agua Milli-Q y secado nuevamente. Debido a
que estas placas ya han sido manipuladas, como se mencionó, perdieron su
esterilidad, por lo que es necesario esterilizarlas nuevamente y para esto se utilizó
óxido de etileno, gas muy tóxico, ampliamente utilizado para este fin, ya que destruye
cualquier tipo de organismo vivo. Las placas a esterilizar se introdujeron en una bolsa
que también contiene una ampolla de óxido de etileno, luego de sellarla, se rompió la
ampolla y se dejaron por 12 horas aproximadamente (el óxido de etileno ya se ha
evaporado completamente), luego de esto, la bolsa fue abierta, pero dejada bajo la
36
campana de extracción por 24 horas, para permitir su ventilación completa y asegurar
que no queden rastros de óxido de etileno [Terragno, 2004].
Este procedimiento también se realizó para evaluar la viabilidad celular
frente a los polímeros utilizando como técnica el MTS y una vez teniendo las placas
estériles nuevamente, se sembraron las células y se procedió con los ensayos de
viabilidad y de fluorescencia, como se han mencionado previamente.
37
RESULTADOS.
1.- Síntesis de polímeros biocompatibles.
Los polímeros entrecruzados derivados de quitosano, formados por quitosano
(Qo) y polisiloxano (PS), fueron obtenidos como se detalló en la metodología,
empleando un agente entrecruzante que produce la activación del grupo carboxilo (que
se encuentra en el PS funcionalizado), facilitando la formación del enlace amida con el
grupo amino del Qo como se observa en la Figura 12, y estos entrecruzados fueron
caracterizados, con el fin de determinar si realmente se formaron tales entrecruzados y
cuáles serían sus características superficiales principales. La caracterización se realizó
mediante análisis termogravimétrico (TGA), espectroscopía infrarroja (IR) y por
medición de ángulos de contacto para la obtención de la energía superficial.
Posteriormente se compararon todos los resultados obtenidos entre las distintas
proporciones de los polímeros entrecruzados con los polímeros originales, Qo y PS.
Estos resultados se detallan en las Figuras 13 a 16.
En los termogramas (Figuras 13 y 14), se observó que los entrecruzados
obtenidos presentaron diferente estabilidad térmica respecto a los polímeros originales.
En base a estos resultados, se puede apreciar que los copolímeros obtenidos
presentan una menor resistencia a la temperatura, respecto al Qo y al PS, lo que se
evidencia en la disminución en la temperatura a la que se degradan. El Qo lo hace a
313°C y el PS a 475°C aproximadamente (Figura 13), mientras que los entrecruzados
presentan una estabilidad térmica que alcanza entre los 215 y 255°C (Figura 14). Estos
38
resultados indican que efectivamente, en las muestras analizadas se obtienen los
nuevos derivados Qo-PS.
Figura 12. Reacción mediante la cual EDC activa el grupo carboxilo de PS para que reaccione
con el grupo amino del Qo, para formar finalmente el entrecruzado.
Por otra parte, en los espectros FT-IR de los 5 entrecruzados, se observó una
banda característica que corresponde a la presencia del enlace amida (Figura 15), y es
justamente mediante este enlace que se forma el entrecruzado de los polímeros (grupo
amino, NH2, del Qo al reaccionar con el grupo carboxilo, COOH, del PS), y que no se
observa en los espectros de los polímeros Qo y PS (Figura 15). También se puede
observar que en los copolímeros aparecen las bandas características, tanto del Qo
como del PS, que pertenecen a los grupos amino libre y a los grupos siloxanos (Si-OSi), respectivamente (Figura 16). Todo esto confirma la formación de los
entrecruzados, que presentan espectros muy similares entre ellos. Es importante
destacar que Kweon [Kweon, 1998] obtuvo resultados IR similares a los obtenidos en
el presente trabajo.
39
Figura 13. Termogramas de A) quitosano (Qo) y B) polisiloxano (PS) funcionalizado con grupo
carboxilo.
Figura 14:. Termogramas de los polímeros entrecruzados obtenidos a partir de las cinco proporciones formadas.
Las proporciones corresponden a las siguientes: A) entrecruzado 1 (proporción de Qo:PS = 1:1, 50% de Qo), B)
entrecruzado 2 (proporción Qo:PS = 10:1, 90% de Qo) y E) entrecruzado 5 (proporción de Qo:PS = 100:1, 99% de Qo). En cada
gráfico se indica la temperatura de descomposición.
40
Figura 15: Espectros IR de PS funcionalizado con el grupo carboxilo (A) y Qo de alto peso molecular (B), con sus
señales características indicadas en cada espectro.
Figura 16: Espectros IR de los distintos polímeros entrecruzados y de los polímeros originales, con sus bandas
características destacadas. Las distintas proporciones de Qo:PS son las siguientes: A) 1:1, B) 2:1, C) 5:1, D) 10:1 y E)
100:1, correspondientes al 50, 67, 83, 90 y 99% de Qo respectivamente.
41
Además, con el objetivo de determinar la energía superficial de los polímeros se
realizaron medidas de ángulo de contacto (Figura 17) del Qo sin entrecruzar y de cada
una de las proporciones obtenidas de los polímeros entrecruzados y con solventes de
polaridades distintas.
Determinar la energía superficial es importante ya que cuanto menor es esta,
existe un menor efecto trombogénico [Kweon, 1998]. Para esto se prepararon films de
Qo y de los polímeros entrecruzados obtenidos, a los cuales se les agregó 8µL del
solvente correspondiente sobre las distintas superficies poliméricas, esta gota se posó
sobre la superficie, más o menos expandida, dependiendo de la polaridad del solvente
y de la energía superficial del polímero, observándose una imagen como la que se
muestra en la Figura 17. La finalidad de esto fue evaluar si los entrecruzados
efectivamente presentan una disminución en la energía superficial, respecto del Qo, al
entrecruzarlo con el PS funcionalizado. En este estudio, se graficó el coseno del ángulo
de contacto versus la tensión superficial de los solventes utilizados (Figura 19),
obteniéndose así la ecuación de la recta, a partir de la cual se calcula la energía
superficial. Este procedimiento se realizó tanto a 25, como a 37 °C, siendo esta última
la temperatura que más se asemeja a las condiciones fisiológicas. Los resultados
obtenidos se detallan en las Figuras 18 a 20, apreciándose que sí hay una disminución
en la energía superficial del Qo, al entrecruzarlo con el PS, observando resultados muy
similares en ambas temperaturas estudiadas (25 y 37 °C) y en las distintas
proporciones obtenidas de los polímeros entrecruzados, por lo que sólo se muestran
los resultados obtenidos a 37 °C, ya que los experimentos de toxicidad también fueron
realizados a esta temperatura.
No se realizó este procedimiento con el PS debido a que es soluble en agua,
por lo que no fue posible determinar los ángulos de contacto.
42
Figura 17: Fotografía utilizada para medir el ángulo de contacto de los distintos polímeros entrecruzados,
agregando el solvente respectivo. Este ejemplo corresponde a una gota de anilina sobre un film de
entrecruzado con un porcentaje de Qo de 99%.
Solvente
Tensión superficial a 25 °C
Tensión superficial a 37 °C
(dyn/cm)
(dyn/cm)
Agua
71,5
67,5
Anilina
39
37
Cloroformo
27,5
25
Figura 18: Datos de tensión superficial para cada solvente, a 25 y 37 °C.
43
Figura 19: Gráficos de Zisman, utilizados para obtener la energía superficial de los polímeros entrecruzados en
sus distintas proporciones (A a E) y para el Qo (F). Las proporciones de Qo:PS son las siguientes: A) 1:1, B) 2:1,
C) 5:1, D) 10:1 y E) 100:1, correspondientes al 50, 67, 83, 90 y 99% de Qo, respectivamente.
44
La energía superficial es la que se obtiene a partir de las ecuaciones de la línea
de tendencia de los gráficos en la Figura 19. La energía superficial corresponde a la
que se obtiene cuando cos θ = 1. Así, se obtuvieron los siguientes resultados:
Polímero
Ángulo de contacto
Energía superficial
-1
% Qo
Θ agua
Θ anilina
Θ cloroformo
(mNm )
100 % (Qo)
54,6
35,2
9,1
20,9
99 % (5)
53,8
34,5
9,7
20,5
90 % (4)
51,9
34,4
10,5
19,8
83 % (3)
49,6
31,4
12,8
19,8
67 % (2)
49,1
31,6
13,0
19,4
50 % (1)
44,4
30,0
14,1
17,2
Figura 20: Tabla con resultados de energía superficial obtenidos para cada polímero a 37 °C.
A partir de la tabla de resultados mostrada en la Figura 20, podemos ver que
existe una clara correlación entre los polímeros con distinto porcentaje de Qo en su
composición con la energía superficial obtenida, la que se ve disminuida con un mayor
contenido de PS, ya que este le confiere mayor carácter hidrofóbico al film polimérico,
por lo que tiene menor capacidad de interaccionar con el medio.
Resultados similares ya han sido reportados previamente por Dong Kweon
[Kweon, 1998] y si bien la disminución en la energía superficial no es muy grande, es
suficiente para eliminar el efecto trombogénico que presenta el quitosano por sí solo
(resultados que se describen más adelante), por lo que en base a estos resultados se
podría concluir que se obtuvo un polímero entrecruzado que a priori será más
hemocompatible que el Qo.
45
2.- Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro.
Las nanopartículas de oro (Au-NPs) se prepararon por reducción de una sal de
oro (HAuCl4) con citrato de sodio. Estas nanopartículas poseen un tamaño promedio de
12 nm de diámetro y fueron caracterizadas mediante espectrofotometría UV/Visible,
Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM), potencial zeta y Dynamic Light
Scattering (DLS), con el fin de confirmar su presencia, tamaño, carga y concentración.
Los resultados de TEM y UV/Vis se presentan en la Figura 21, A y B, y concuerdan con
los obtenidos por Guerrero y colaboradores [Guerrero, 2010]. Mientras que las
determinaciones de DLS y potencial zeta indicaron que las Au-NPs tienen un diámetro
hidrodinámico de 12 ± 2 nm y un potencial zeta de – 54,3 ± 2,9 mV.
Figura 21: A) Micrografía de TEM, donde se observan Au-NPs de 12 nm de diámetro (se incluye un
histograma para indicar la dispersión de tamaño, que se correlaciona con el ancho en la señal de
absorbancia). B) Espectro de absorbancia de Au-NPs de 10 nm, la absorbancia máxima es a los 519 nm
de longitud de onda.
46
3.- Conjugación y caracterización de las nanopartículas de oro con el péptido CLPFFD.
La conjugación se realizó mezclando Au-NPs con una solución de péptido.
Luego de la síntesis descrita en la metodología, los conjugados se caracterizaron
mediante las mismas técnicas utilizadas para la caracterización de las Au-NPs solas
(TEM, UV/Vis, Potencial zeta y DLS). Los resultados de TEM y UV/Vis se muestran en
las Figuras 22, A y B, respectivamente.
Al observar estas imágenes, se puede apreciar que en el espectro UV/visible hay un
desplazamiento en la absorbancia máxima, respecto al de las Au-NPs sin recubrir, lo
que se debe al recubrimiento de las Au-NPs con el péptido CLPFFD, lo que genera un
desplazamiento en la banda del plasmón de resonancia. Estos resultados son similares
a lo observado por Olmedo y colaboradores [Olmedo, 2008]. Asimismo, dichos autores
determinaron que cada Au-NP se encuentra funcionalizada con alrededor de 400
moléculas de péptido. Respecto al tamaño y carga, se determinó que estas Au-NPs
conjugadas al péptido CLPFFD presentan un diámetro hidrodinámico de 17 ± 2 nm y
una carga de – 43,7 ± 1,5 mV.
47
Figura 22: A) Micrografía de TEM, donde se observan Au-NPs conjugadas al péptido CLPFFD. B)
Espectro de absorbancia de Au-NPs conjugadas, la absorbancia máxima es a los 526 nm de longitud de
onda, debido al desplazamiento del plasmón de resonancia.
4.- Obtención y caracterización de nanocompósitos.
Esto se realizó con las nanopartículas con y sin conjugar al péptido CLPFFD,
como se explica en la metodología. La caracterización de estos nanocompósitos (NCs)
se realizó por TEM, espectrofotometría UV/Vis, DLS y potencial zeta. Estos NCs se
formaron utilizando todos los copolímeros obtenidos, pero se seleccionó aquel que
presenta mayor estabilidad siendo el que posee un porcentaje de quitosano de 83% (y
17% de PS) correspondiendo a la proporción de Qo:PS = 5:1. Los NCs se
caracterizaron por espectrofotometría UV/Vis analizados. Los resultados obtenidos se
detallan en las Figuras 23 y 24, respectivamente. En ellas es posible observar un
desplazamiento en la banda del plasmón de resonancia, debido al recubrimiento de las
nanopartículas con los polímeros ya mencionados. También se obtuvieron NCs con
distintas proporciones de Au-NP:polímero, para así seleccionar los que presentaran
mayor estabilidad, en la Figura 25 se observa un caso de inestabilidad, observado en
48
todos los polímeros utilizados, que se evidencia en la desaparición de la banda del
plasmón de resonancia, debido a la excesiva agregación de las nanopartículas en tales
casos (en el anexo se presentan otros espectros UV/visibles, a partir de los cuales se
seleccionó la proporción de Au-NPs : polímero y el derivado de Qo más estables).
En las imágenes de TEM podemos observar que los polímeros tienen un efecto
agregante en las nanopartículas. Respecto a esto, Tan y colaboradores, al igual que
Hong y colaboradores han demostrado que esta agregación dependerá de la cantidad
de polímero que se mezcle con las nanopartículas proporción nanopartícula-polímero
[Hong, 2009; Tan, 2005].
Figura 23: A) Micrografía de TEM, donde se observan los nanocompósitos (NCs) formados con el
polímero entrecruzado 3, que corresponde a la proporción 5:1 de Qo:PS (83% de Qo) y en una
proporción de Au-NP:polímero de 1:9. B) Espectro de absorbancia de los mismos NCs, en este caso la
absorbancia máxima es a los 546 nm de longitud de onda, debido a un desplazamiento mayor en el
plasmón de resonancia, debido al recubrimiento de las Au-NPs y al aumento de tamaño.
49
Figura 24: A) Micrografía de TEM, donde se observan los NCs formados sólo con Qo en una proporción
de Au-NP:Qo de 1:9. B) Espectro de absorbancia de los mismos NCs, en este caso la absorbancia
máxima es a los 627 nm de longitud de onda, debido también al desplazamiento en el plasmón de
resonancia, aunque en este caso es mayor.
Figura 25: Espectro UV/Vis de NCs con una proporción de NP:Polímero de 1:4,5. Se utilizaron los
polímeros entrecruzados 1 (50% de Qo), 2 (67% de Qo), 3 (83% de Qo), 4 (90% de Qo) y 5 (99% de Qo) y
también se utilizó el quitosano solo (Q).
50
Polímero que recubre Au-NPs
Tamaño (nm)
Potencial Zeta (mV)
100 % (Qo)
456,2 ± 10,8
64,79 ± 0,59
99 % (5)
309,6 ± 11,2
39,92 ± 2,44
90 % (4)
274,4 ± 4,3
43,2 ± 1,07
83 % (3)
347,2 ± 17,2
49,93 ± 1,17
67 % (2)
274,6 ± 9,3
46,0 ± 1,05
50 % (1)
319,8 ± 40,6
43,11 ± 0,76
(% Qo)
Au-NP
12,0 ± 2
-54,3 ± 2,910
Figura 26: Tabla que muestra los resultados de tamaño de los NCs formados con los distintos polímeros
entrecruzados obtenidos y con el Qo sin funcionalizar. En este caso las Au-NPs utilizadas no se
encuentran conjugadas al péptido CLPFFD.
Polímero que recubre
Tamaño (nm)
Au-NP-CLPFFD (% Qo)
Potencial Zeta
(mV)
100 % (Qo)
1777,9 ± 645,5
53,44 ± 0,98
99 % (5)
363,3 ± 32,7
36,36 ± 0,87
90 % (4)
314,1 ± 18,4
34,43 ± 0,77
83 % (3)
295,0 ± 5,5
34,23 ± 0,57
67 % (2)
303,9 ± 8
41,72 ± 1,31
50 % (1)
460,3 ± 23,3
46,52 ± 1,42
Au-NP-CLPFFD
12,0 ± 2
-43,7 ± 1,510
Figura 27: Tabla que muestra los resultados de la medición del potencial zeta de los NCs formados con
los distintos polímeros entrecruzados obtenidos y con el Qo solo. En este caso, las Au-NPs utilizadas se
encuentran recubiertas por el péptido CLPFFD.
51
A partir de los resultados presentados, se concluye que al recubrir las
nanopartículas, con y sin conjugar al péptido CLPFFD, con los distintos polímeros el
potencial zeta es positivo, con lo que se esperaría una disminución considerable en la
captura por el MPS, y al mismo tiempo aumenta el tamaño de tales partículas.
5.- Evaluación de la toxicidad de los polímeros y de los nanocompósitos.
Para evaluar la toxicidad de los polímeros así como de los nanocompósitos
(NCs), se realizaron ensayos de toxicidad a nivel hematológico, donde se evaluó el
posible efecto trombogénico de los distintos polímeros o NCs y también efectos sobre
la viabilidad celular.
5.1: Ensayos de coagulación: En primer lugar, se evaluó el efecto que podrían
presentar los polímeros sobre el tiempo de coagulación sanguínea, los resultados se
pueden observar en la Figura 28. Al observar estos resultados se puede concluir que
los polímeros entrecruzados (derivados del Qo) no presentaron un efecto significativo
en el tiempo de coagulación, respecto al control, mientras que al hacer el mismo
experimento con el Qo sin entrecruzar con el PS, se observó un efecto trombogénico,
que se evidencia por la disminución en el tiempo de coagulación respecto al control,
diferencia que es significativa estadísticamente, con un P<0,5, obtenido utilizando el
test de Student.
Para realizar este experimento, se formaron films de los polímeros en los tubos de
borosilicato que se utilizan para hacer el ensayo, debido a que estos polímeros sólo
son solubles en ácido acético y este interfiere en la coagulación, produciendo la lisis
52
del glóbulo rojo. Además, cada ensayo se realizó en un medio con NaCl, para
mantener la osmolaridad adecuada.
Figura 28: Efectos de los distintos polímeros en el tiempo de coagulación sanguínea. La muestra 1
corresponde al polímero entrecruzado en una proporción de Qo:PS = 1:1 (50 % de Qo); de la misma forma
siguen las muestras que continúan, la muestra 2 corresponde a la proporción 2:1 (67% de Qo), la 3
corresponde a la proporción 5:1 (83 % de Qo), la 4 corresponde a la proporción 10:1 (90 % de Qo) y la
muestra 5 corresponde a la proporción 100:1 (99 % de Qo), mientras que la última muestra, Qo,
corresponde a Qo sin recubrir con PS. * La diferencia entre el Qo y el control (CT), es significativa, con un
P < 0,5.
Posteriormente, se evaluó el posible efecto que tendrían las Au-NPs sobre la
coagulación sanguínea, debido a que, como se ha mencionado previamente, estas
poseen carga superficial negativa, lo que podría inducir la activación de la coagulación
por la vía intrínseca. Para esto, se determinaron los efectos de las Au-NPs con y sin
conjugar al péptido CLPFFD. En este caso, se utilizó como control, el citrato de sodio a
una concentración de 1,2 mM, debido a que las nanopartículas se encuentran disueltas
en este medio. Una vez analizado esto, se puede observar, en la Figura 29, que ni las
nanopartículas sin conjugar, ni las conjugadas al péptido, alteran el tiempo que tarda
en formarse el trombo, respecto al control, lo que nos indica que no presentan un
53
efecto trombogénico (ni anticoagulante). Siendo este resultado muy interesante de cara
a futuras aplicaciones de las Au-NPs.
Figura 29: Coagulación de Au-NPs solas y con el péptido CLPFFD, comparadas con el control citrato. La
concentración de las nanopartículas usadas es de 5 mM.
Por otro lado, se realizó este ensayo de coagulación para evaluar los posibles
efectos de los NCs formados (Figura 30). Para formar los NCs se utilizaron
nanopartículas sin conjugar al péptido CLPFFD y nanopartículas conjugadas al
péptido. En ambos casos se observó que no hubo efecto significativo en el tiempo de
coagulación, ni siquiera con los NCs formados con el Qo sin entrecruzar con el PS.
54
Figura 30: Resultados del ensayo de hemocompatibilidad con los nanocompósitos (NC) obtenidos, en la
primera barra se ve el control, sólo con NaCl, la segunda corresponde a los NCs formados a partir de
nanopartículas sin conjugar al péptido CLPFFD y recubiertas con el polímero entrecruzado 3 (proporción
de Qo:PS = 5:1, que corresponde a un 83 % de Qo), en la tercera barra se ve el NC formado con
nanopartículas conjugadas a CLPFFD y recubiertas con el polímero 3 (5:1, 83% de Qo), en la cuarta barra
se ve el efecto de nanopartículas sin conjugar recubiertas con Qo y en la última barra se ve el efecto de
las nanopartículas conjugadas y recubiertas con Qo.
5.2: Ensayos de viabilidad celular: En los gráficos detallados en la figura a
continuación (Figura 31), se representa la viabilidad celular frente a los distintos
polímeros aquí analizados. A las 24 horas, ni el Qo ni los Qo modificados producen
efectos apreciables sobre la viabilidad, mientras que a las 48 y 72 horas se producen
efectos marcados, reduciéndose la misma. Notablemente, en el caso de los Qo
modificados, dicho efecto es considerablemente menor que el presentado por el Qo.
Este fenómeno podría deberse a la disminución en la energía superficial que estos
presentan respecto al Qo. La disminución en la viabilidad celular podría estar dada por
un aumento en la muerte celular al estar en presencia de los polímeros o por una
disminución en la proliferación celular, lo que a su vez podría deberse a una detención
en el ciclo celular o a un problema de las células para adherirse a la superficie
polimérica.
55
Viabilidad de polímeros en células de neuroblastoma humano
Figura 31: Resultados de los ensayos de viabilidad celular, para determinar la posible citotoxicidad de los
distintos polímeros, a 24, 48 y 72 horas. Se indica entre paréntesis el porcentaje de Qo que presenta cada
muestra polimérica.
El hecho de que todos los polímeros presentaron una disminución en la
viabilidad celular respecto del control, podría deberse a que, como las células son
adherentes y requieren de la adhesión a una superficie para replicarse, es posible que
estos polímeros no formen una superficie adecuada para ello y por lo tanto, que esta
sea la causa de la disminución en la viabilidad celular presentada. Es por esto que se
realizó el experimento de fluorescencia, ya que para esto las células se marcan con
una sonda fluorescente (CSFE), previo a sembrarlas. Así, se mide la fluorescencia a
distintos tiempos y se compara con el control, para determinar si esta es o no la causa
de la disminución en la viabilidad celular, ya que antes de medir, se cambia el medio de
cada pocillo. Si disminuye la fluorescencia se deberá a que hay una disminución de
células adheridas a la superficie polimérica. Sin embargo, en los resultados obtenidos a
0.5, 1, 2 y 72 horas no se observó diferencias en la fluorescencia (Figura 32), lo que
indica que la disminución en la viabilidad celular no se debe a un problema de
adhesión celular, y podría deberse entonces a una disminución en la proliferación
celular (que podría ser por una detención en el ciclo celular) o a un aumento en la
muerte celular.
56
Por otro lado, los nanocompósitos (NCs) formados con nanopartículas sin
conjugar al péptido CLPFFD, así como aquellas que sí lo estaban, no presentan
alteración en la viabilidad celular a ningún tiempo, incluyendo en el caso de los NCs
preparados con Qo sin entrecruzar al PS (Figuras 33 y 34). Es interesante notar que
los NCs no disminuyen la viabilidad celular, en comparación a los polímeros solos, esto
podría deberse a que los grupos expuestos del polímero se encuentran interactuando
con las Au-NPs, evitando así que haya efectos tóxicos sobre las células, además que
en el caso de los polímeros, estos estaban formando un film sobre la placa, mientras
que los NCs están en solución, siendo este último caso lo más cercano a lo que
ocurriría fisiológicamente.
Figur
a 32:
Resul
tados
de los
ensay
os de
fluore
scenc
ia,
para
determinar algún efecto sobre la adherencia de las células a los polímeros, a 1/2, 1, 2 y 72 horas. Las
muestras corresponden a las distintas proporciones de Qo:PS, siendo estas las siguientes: 1 = 1:1, 2 =
2:1, 3 = 5:1, 4 = 10:1 y 5 = 100:1 (50, 67, 83, 90 y 99% de Qo, respectivamente) y CT corresponde al
control sólo con medio.
57
Viabilidad de nanocompósitos, utilizando las nanopartículas sin conjugar
Figura 33: Resultados de viabilidad celular frente a nanopartículas sin conjugar (Au-NPs), nanocompósitos
(NC) utilizando el polímero entrecruzado 3 (83 % de Qo) para recubrir las nanopartículas (NC 3) y NCs
utilizando sólo Qo para recubrir las nanopartículas (NC Q). Se muestran los resultados a 24, 48 y 72 horas. El
control (CT +) lleva medio de cultivo en lugar de muestra y el control de muerte lleva SDS al 10%.
58
Viabilidad de nanocompósitos, utilizando las nanopartículas conjugadas al péptido
CLPFFD
Figura 34: Resultados de los ensayos de viabilidad celular frente a Au-NPs recubiertas con el pépttido
CLPFFD (NP-CLPFFD), NCs con el entrecruzado 3 (83% de Qo) recubriendo las nanopartículas (NC-NPCLPFFD 3) y NCs de Qo recubriendo las nanopartículas (NC-NP-CLPFFD Q). Se muestran los resultados a
24, 48 y 72 horas. El control (CT+) lleva medio de cultivo en lugar de muestra y el control de muerte lleva
SDS al 10%.
59
DISCUSIÓN.
Obtención y caracterización de polímeros entrecruzados
Respecto a la obtención y caracterización de los polímeros entrecruzados de
polisiloxano (PS) y quitosano (Qo), estos fueron efectivamente formados en 5
proporciones distintas de Qo:PS, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1 y 100:1, denominadas 1, 2, 3, 4 y 5,
las que corresponden a los porcentajes de Qo de 50, 67, 83, 90 y 99%
respectivamente, la cual se verificó a través de la caracterización por TGA y por IR de
los copolímeros obtenidos. También se analizaron el Qo y PS por separado, para
determinar las semejanzas y diferencias que podrían presentar con los entrecruzados
obtenidos. En el caso de los resultados de TGA, estos indican que los polímeros
entrecruzados presentan efectivamente una nueva temperatura de descomposición,
que es distinta tanto a la del Qo, como a la del PS, lo que nos indica que efectivamente
hubo una mezcla de polímeros en todas las muestras analizadas, vale decir, la
aparición de un compuesto nuevo. Para confirmar que los polímeros entrecruzados de
Qo y PS están unidos mediante una unión covalente se pueden emplear diferentes
estrategias: 1) se podría disolver tal mezcla en un solvente que sea capaz sólo de
disolver al PS, y posteriormente hacer un nuevo análisis termogravimétrico al residuo,
teniendo que observarse la misma temperatura de descomposición, si se trata de un
copolímero formado por unión covalente entre PS y Qo y no de una mezcla física, y 2)
otra forma de corroborar la formación de un enlace covalente es mediante el análisis
IR, donde se puede observar claramente si aparece o desaparece alguna señal,
correspondiente a determinado enlace. En el presente caso, se observó que
efectivamente aparecieron nuevas señales en los polímeros entrecruzados, al
compararlos con el Qo y con el PS por separado, por ejemplo, los 5 entrecruzados
presentaron la señal característica del grupo amino del Qo y la señal característica del
grupo siloxano, perteneciente al PS, lo que nuevamente nos indica que ambos
60
polímeros están presentes en la muestra analizada, pero la característica que indica
que efectivamente existe una unión covalente entre ambos polímeros es la aparición
de una nueva señal en los 5 polímeros entrecruzados, la que corresponde al enlace
amida, formado entre el grupo amino del Qo y el carboxilo del PS, señal que no se
observa en los espectros IR del Qo ni del PS.
Posteriormente, al analizar el efecto que tendría la introducción de un polímero
hidrofóbico, como el PS, sobre la energía superficial del Qo, se observaron diferencias
tanto a nivel de ángulo de contacto, como de energía superficial, para los 5
entrecruzados obtenidos. Lo más destacable de estos resultados es que las diferencias
observadas en tales valores eran dependientes del grado de entrecruzamiento, o
porcentaje de Qo que poseía cada muestra. Efectivamente, al entrecruzar ambos
polímeros se obtuvo una disminución en la energía superficial, respecto a la del Qo, la
cual es máxima con aquel entrecruzado que posee la mayor cantidad de PS en su
estructura (50% de Qo), sin embargo, cabe destacar que incluso aquella muestra que
posee un 99% de Qo presenta una leve disminución en la energía superficial, al
comprarla con la energía superficial del Qo.
Obtención y caracterización de nanocompósitos
Estos se obtuvieron utilizando nanopartículas de oro (Au-NPs) con y sin
conjugar al péptido CLPFFD y sólo con dos polímeros, el Qo y uno de los
entrecruzados. El entrecruzado seleccionado corresponde al número 3, que tiene una
proporción de Qo:PS de 5:1, o bien un 83% de Qo. La selección del polímero a utilizar
se basó en el análisis de la caracterización por espectrofotometría UV/Vis, donde se
observó un desplazamiento y ensanchamiento de la banda del plasmón de resonancia,
y se realizó sobre los nanocompósitos (NCs) formados con todas las proporciones de
entrecruzados obtenidas, este análisis reveló que los NCs obtenidos no eran muy
61
estables en solución, lo que se demuestra claramente en tales espectros (ver anexo) al
observar un corrimiento a longitudes de onda mayores, que indica excesiva agregación
de las partículas en solución. De hecho, en un espectro que ejemplifica tal inestabilidad
de los NCs (Figura 25), se observan dos máximos de absorción, lo que indica
probablemente que sólo unas pocas nanopartículas se recubrieron con los polímeros
correspondientes, y que se agregan bastante, lo que se evidencia en la absorbancia a
longitudes de onda considerablemente mayores, mientras que otras nanopartículas
continúan absorbiendo a la longitud de onda adecuada a su tamaño (520 nm). En uno
de los casos no se observó un máximo de absorbancia en el espectro obtenido
(entrecruzado que posee un 90% de Qo), lo que se debe a que la agregación fue tan
extrema, que indujo la precipitación de los agregados (como se observa en la Figura
35). Tal agregación no es conveniente para aplicaciones farmacéuticas, ya que se
necesita que los NCs obtenidos, aparte de ser estables, tengan un tamaño
relativamente pequeño, para poder utilizarlos en una posible terapia para la
Enfermedad de Alzheimer, que no presenten demasiada agregación, para que no
alteren el medio en que se encuentran, ya que al agregarse, podrían estar induciendo
trombogenicidad. Esta agregación no se observó en el caso del entrecruzado
seleccionado.
Figura 35: Espectro UV/Vis de nanocompósito 4 (NC 4), que corresponde a una proporción de
NP:Polímero de 1:4,5. Se utilizó el polímero entrecruzado 4 (90% de Qo). En este espectro no se observa
ningún máximo de absorbancia, debido a la excesiva agregación de las nanopartículas con el polímero,
generando la precipitación de ambos.
62
Al analizar las micrografías obtenidas por TEM, se observa que el recubrimiento
de las Au-NPs con polímeros generó un efecto agrupante en éstas, lo que se observó
tanto en las nanopartículas conjugadas al péptido CLPFFD, como en aquellas que no
lo estaban y también con ambos polímeros utilizados (Qo y el entrecruzado con un
83% de Qo), pero tal efecto es controlado por la cantidad de polímero que las esté
rodeando, tal como lo indica un estudio de Hong y colaboradores [Hong, 2009]. Esto
permitiría, eventualmente, controlar el tamaño de tales NCs al modificar las cantidades
de polímero con las que se biocompatibilizarán.
Respecto al tamaño de los NCs obtenidos, se observó que al comparar tales
NCs formados con los distintos polímeros entrecruzados, estos presentaron valores
muy similares, cercanos a 300 nm. Sin embargo, los NCs de nanopartículas con Qo
presentan tamaños muy grandes, que incluso se salen del rango de medición, lo que
puede deberse a su gran capacidad adhesiva, que estaría induciendo mayor
agregación. A pesar de que los tamaños de los NCs obtenidos con los polímeros
entrecruzados son bastante altos, al entrar en circulación dentro del organismo, el Qo
comenzaría a ser degradado principalmente por una enzima ubicua en el organismo
como la lisozima, por lo que el tamaño comenzaría a disminuir a medida que avanza.
Sin embargo, esto debe ser demostrado mediante ensayos de degradación de tales
NCs.
También se determinó el potencial zeta de los mismos, observándose que los
valores obtenidos son muy cercanos entre los polímeros entrecruzados, siendo
cercanos a +35 mV, mientras que en el caso de Qo sin entrecruzar, este alcanza
mayor valor siendo aproximadamente + 65 mV. Este hecho es muy favorable al
considerar la distribución de tales partículas, debido a que se vería disminuida su
captura por el MPS in vivo. En el caso de los NCs formados con los polímeros
entrecruzados comparados con los formados por Qo, los primeros presentan una carga
bastante menor a este último, debido probablemente a la reacción del grupo amino con
el carboxilo del PS, hecho que disminuye la exposición de este grupo, con la
consecuente disminución de la carga positiva, lo que indica otra ventaja de utilizar los
63
polímeros entrecruzados ya que, como se ha mencionado en la introducción, también
es deseable utilizar partículas lo más neutras posibles para evitar o disminuir su
interacción con sistemas biológicos, mientras que también estaría reduciendo la
capacidad trombogénica del Qo.
Evaluación de la toxicidad
Para evaluar la posible toxicidad de cada uno de los materiales obtenidos en el
presente trabajo, se realizaron ensayos de coagulación sanguínea y de viabilidad
celular. El primero se realizó con el fin de determinar si efectivamente la disminución en
la energía superficial, al entrecruzar el Qo con PS, se traduce en una disminución o
eliminación del efecto trombogénico que presenta el Qo, o si surge alguna otra
alteración a nivel sanguíneo que se pueda detectar. La evaluación de la toxicidad a
nivel celular, se debe a que es muy probable que tales NCs, polímeros y
nanopartículas, entren en contacto con neuronas, por lo que es conveniente determinar
cuáles serían los posibles efectos sobre ellas.
En los resultados obtenidos a partir de los ensayos de coagulación sanguínea
se observó que ni los polímeros entrecruzados, ni las Au-NPs conjugadas y sin
conjugar, ni los NCs obtenidos presentaron efectos significativos sobre el tiempo de
coagulación sanguínea, este sólo se vio alterado cuando se utilizó Qo sin entrecruzar
con PS, lo que era de esperarse ya que está ampliamente reportada su capacidad de
inducir trombogenicidad. Lo que sí llama la atención es el hecho de que cuando el Qo
está recubriendo las nanopartículas no presenta efectos trombogénicos, lo que podría
deberse a que algunos grupos cargados positivos (amino) de esta molécula están
interaccionado con la nanopartícula (de carga negativa). De esta forma, el Qo estaría
exponiendo menos grupos reactivos, lo que estaría solapando su efecto trombogénico,
lo que también altera la energía superficial, como se ha mencionado previamente. En
base a esto, se puede concluir entonces, que la distinta exposición de grupos, de una
64
molécula en particular, será un componente esencial para determinar el efecto que
tendrá con el medio que la rodea.
Respecto a la viabilidad celular, se observó que disminuyó con todos los
polímeros utilizados, pero esta disminución se ve atenuada al utilizar los polímeros
entrecruzados, que cuando se utiliza sólo Qo. Para determinar si esta disminución en
la viabilidad celular es debida a un problema de adhesión celular, ya que estas se
encuentran sobre un film del polímero correspondiente, se realizó un ensayo de
fluorescencia, el que determinó que ninguno de los polímeros utilizados genera un
problema de adhesión para las células, por lo que las posibles causas para esta
disminución en la viabilidad serían un aumento en la muerte celular, ya sea por
apoptosis o necrosis, o bien a una disminución en su replicación, por una detención en
el ciclo celular. Al parecer, lo más probable es que se deba a una disminución en la
replicación celular, ya que se ha reportado que superficies poliméricas promueven la
detención en el ciclo celular y mientras más hidrofílico sea el polímero, mayor será la
detención en G1 [Miller, 2010], y justamente en este caso el Qo solo, que es el
polímero más hidrofílico de todos los analizados, es el que presenta un menor
porcentaje de viabilidad celular en todos los tiempos.
Efecto tamaño/carga
Con respecto a la influencia de la carga y el tamaño de una partícula sobre su
destino final en el organismo, está demostrado que estas son las principales
características que se deben tener en cuenta al diseñar una formulación que se quiera
utilizar para dirigir a un lugar específico del organismo. Esto se debe a que ambos
factores, carga y tamaño, son fundamentales para determinar si la especie será
capturada o no por el MPS, o si tendrá un tiempo de vida medio más largo y estará
más tiempo en circulación.
65
En el caso de la influencia por la carga de la partícula, se ha observado en
repetidas ocasiones [Dash, 2010] que aquellas con carga superficial negativa son más
susceptibles de ser capturadas por el MPS, debido a una mayor interacción que
presentan tales
partículas
con
proteínas
plasmáticas,
como
las
opsoninas,
recubriéndose así por una capa de proteínas que inducen finalmente, la fagocitosis de
la partícula unida a las proteínas. Mientras que aquellas partículas que poseen una
carga neutra o cercana a la neutralidad, pasan más bien desapercibidas frente al MPS,
teniendo así un tiempo de vida medio mayor que las de carga negativa. Algo similar
sucede con aquellas partículas que poseen una superficie cargada positivamente, pero
en este caso tal efecto se debe más bien a la repulsión que se genera entre la partícula
extraña y las proteínas plasmáticas, evitándose así su recubrimiento y por lo tanto se
impide también la fagocitosis. Sin embargo, una superficie con una carga positiva
también puede generar toxicidad, la que dependerá de la medida del potencial zeta, ya
que cuanto mayor sea este, mayor será la toxicidad, debido a una posible interacción
con membranas celulares (de carga negativa) que finalmente podría generar un daño
en tal membrana, aumentando su permeabilidad, debido a la generación de poros.
Por otro lado, el tamaño de las partículas también es de gran importancia para
la distribución de las partículas en el organismo, ya que se ha observado que hay una
relación inversa entre tamaño y biodistribución de partículas en el organismo [LasagnaReeves, 2010; Sonavane, 2008]. Esto se debe a que las partículas más pequeñas
tienen un tiempo de vida medio en circulación más grande que aquellas partículas de
mayor tamaño, lo que es debido a que las partículas más pequeñas pueden evadir más
fácilmente el MPS (menores a 100 nm y mayores a 50 nm) y no son fagocitadas,
contrario a lo que ocurre con las más grandes que son rápidamente capturadas por tal
sistema.
66
Con respecto a los resultados obtenidos en el presente trabajo, se observó que
las Au-NPs, al tener un tamaño tan pequeño como 12 nm de diámetro, fácilmente
podrían distribuirse por todo el organismo, llegando incluso al cerebro. Sin embargo, el
hecho de que estas nanopartículas presenten una carga superficial negativa, genera
que sean fácilmente por recubiertas por diversas proteínas plasmáticas, entre las que
se encuentran las opsoninas, con lo que facilitan la fagocitosis de tales nanopartículas,
por lo que quedan retenidas principalmente en órganos del MPS, como el hígado y el
bazo. Es por este motivo que en el presente trabajo se realizó un recubrimiento de
tales nanopartículas con polímeros de carga positiva, para evitar la opsonización y
posterior fagocitosis de tales nanocompósitos. Al evaluar el potencial zeta de tales NCs
se observó que efectivamente los polímeros entrecruzados presentan carga positiva, lo
que evitaría entonces la captura de tales NCs por el MPS, y así aumentaría su tiempo
de vida media en circulación.
Por otro lado, hay que considerar el tamaño de tales NCs, ya que también es un
factor muy importante para determinar el destino de éstos en el organismo. Al respecto,
se ha reportado que nanopartículas de menos de 100 nm se distribuyen fácilmente por
todo el organismo y presentan un bajo porcentaje de captura por el MPS, comparadas
con partículas de mayor tamaño. Sin embargo, se ha observado que nanopartículas de
300 y 500 nm también se distribuyen ampliamente, pero aumentan el porcentaje de las
que quedan retenidas en órganos del MPS, como el hígado. Esto podría contrarrestar
los beneficios que se obtienen al obtener NCs con carga superficial positiva, haciendo
que el tiempo de vida media no sea tan largo como podría ser.
Sin embargo, al ser el Qo un polímero biodegradable, y debido a que se ha
mostrado que es degradado por enzimas como la lisozima, se espera que este sea
degradado en el trayecto hacia el cerebro, con lo que el tamaño de tales NCs
disminuya conforme avanza por el organismo. Ahora bien, si los NCs de
aproximadamente 300 nm, como los obtenidos en el presente trabajo, son capturados
por el MPS al ingresar al organismo, el Qo podría comenzar a degradarse dentro de la
célula (como la célula de Kupffer, por ejemplo), y posteriormente eliminarse, con una
67
menor cantidad de polímero recubriendo las nanopartículas y por lo tanto, un menor
tamaño aumentando así las posibilidades de que lleguen al cerebro.
Posible mecanismo de degradación del quitosano
Se ha reportado que el Qo es degradado por una enzima presente ampliamente
en todo el organismo, la lisozima. Sin embargo, también se ha observado que la
cinética de degradación de este polímero es relativamente lenta, lo que es conveniente
en el presente caso, en que se desea que el polímero recubra por suficiente tiempo a
las nanopartículas y así evitar su captura por el MPS. Estudios previos han reportado
que la degradación de un quitosano con 90% de desacetilación se tarda
aproximadamente 25 días [Dai, 2009]. Se ha observado que tal cinética va a depender
de su peso molecular y de su grado de desacetilación. Al respecto, se ha reportado
que a mayor porcentaje de desacetilación, más lentas son las tasas de degradación del
Qo [Aggarwal, 2009].
Por otro lado, también se ha observado que si se introducen cambios en su
arquitectura molecular, tales modificaciones pueden actuar imitando una alteración en
el peso molecular o en el grado de desacetilación, lo que también puede alterar
propiedades como la adsorción de proteínas en su superficie. Se ha reportado que Qo
ramificados presentan niveles significativamente menores de adsorción de proteínas en
su superficie, al compararlos con Qo lineal, pero al mismo tiempo, mostraron una
menor tasa de crecimiento celular al analizar la viabilidad celular en el tiempo,
mediante análisis por MTT, comparado con el Qo lineal, diferencia que también es
significativa. Estos resultados pueden relacionarse con los obtenidos en el presente
trabajo, ya que se observó que el Qo presentó una mayor disminución en la viabilidad
celular, al compararlo con los entrecruzados Qo-PS. Asimismo, el hecho de que
aquellos Qo ramificados presenten una menor adsorción de proteínas, se esperaría
68
entonces que los entrecruzados Qo-PS presenten una conducta similar, con lo que se
disminuiría su captura por el MPS in vivo.
Por otro lado, como la lisozima está ubicua en nuestro organismo, lo más
probable es que, al llegar al cerebro ya no existan los nanocompósitos como tales,
quedando con una pequeña capa de polímero recubriendo las Au-NPs o bien, que sólo
queden las nanopartículas para ingresar a este órgano.
69
CONCLUSIONES.
En base a lo descrito en la presente tesis, se puede concluir que se obtuvieron
nuevos polímeros entrecruzados derivados de quitosano (Qo), que presentaron una
disminución en los efectos que éste presentó sobre la viabilidad celular y no
presentaron alteración en el tiempo de coagulación. Es por esto que se puede
especular que los entrecruzados nuevos son “más biocompatibles” que el Qo solo, o
bien, que presentan una menor toxicidad, tanto a nivel celular como sanguíneo. Sin
embargo, hacen falta más ensayos, tanto in vitro como in vivo, para asegurar que
estos copolímeros son efectivamente biocompatibles. La mayor biocompatibilidad
que presentan los entrecruzados, respecto del Qo, se puede deber principalmente, a la
disminución en la energía superficial de estos polímeros, comparados con la alta
energía superficial del Qo y a pesar de que esta diferencia no es tan grande, es
suficiente como para que desaparezca el efecto trombogénico de Qo.
También se sintetizaron las nanopartículas de oro (Au-NPs) y se conjugaron
con el péptido CLPFFD, evaluando en ambos casos (con y sin conjugar) su viabilidad
celular y sus efectos en la coagulación sanguínea, donde se observó que en ninguno
de los dos casos se presentó toxicidad, dato muy relevante para tener en cuenta en
posibles aplicaciones que se les quiera dar a estas nanopartículas en el área de la
biomedicina.
70
Posteriormente, se obtuvieron los nanocompósitos (NCs) de las nanopartículas
con los polímeros, los que se presentaron un tamaño cercano a los 300 nm de
diámetro, tamaño bastante grande, sin embargo se espera que el polímero derivado
del Qo que recubra la nanopartícula sea degradado en el trayecto, con lo que se
reduciría su tamaño. Además, estos NCs presentaron una carga positiva, alrededor de
30 mV, con lo que debieran ser capaces de evadir el sistema fagocítico mononuclear
(MPS), aumentando así su tiempo de vida media en circulación. Una vez obtenidos
tales NCs, se evaluó su efecto sobre la viabilidad celular y la coagulación sanguínea, a
partir de lo cual se determinó que los NCs formados con Qo sin entrecruzar con
polisiloxano (PS) no presentaron toxicidad en ningún caso, contrario a lo que ocurría
cuando el Qo interactuaba directamente con las células o la sangre. Lo mismo se
observó al evaluar los NCs obtenidos al recubrir las Au-NPs con el polímero
entrecruzado de proporción de Qo:PMS = 5:1, que corresponde a un 83% de Qo (y un
17% de PS).
Todo esto nos indica que estos nuevos polímeros tienen una mejor proyección
en sus posibles aplicaciones como moléculas a utilizar para mejorar la entrega
selectiva de fármacos, no sólo a utilizar para recubrir Au-NPs, ni como una posible
forma de optimizar el diagnóstico y la terapia de la Enfermedad de Alzheimer, sino que
podrían utilizarse para la entrega de fármacos en el caso de otras enfermedades como
cáncer.
71
PROYECCIONES.
A partir del trabajo aquí presentado se sugieren experimentos o estrategias que
podrían establecer de mejor manera la compatibilidad biológica que podrían presentar
los polímeros entrecruzados, respecto al quitosano, para utilizarlos en el área de la
biomedicina.
En cuanto a la caracterización de los polímeros sería interesante analizar la
exposición de los distintos grupos funcionales que poseen los polímeros analizados.
Para esto un estudio interesante sería el análisis de tales polímeros mediante
Microscopía de Fuerza Atómica (AFM), también podría analizarse si los films utilizados
están constituyendo o no una monocapa del polímero, lo que podría analizarse por
elipsometría y también determinar si el film está distribuido homogéneamente, lo que
se determinaría mediante el análisis del ángulo de histéresis.
Con respecto a la distribución de los nanocompósitos obtenidos, sería muy
interesante analizar la distribución que podrán presentar in vivo, a distintos tiempos
para así determinar si efectivamente son capaces de evitar el MPS y, al mismo tiempo,
aumentar la llegada de las Au-NPs al cerebro.
72
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study
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78
ANEXOS.
Volumen NP
Volumen polímero
Proporción NP:polímero
10 µL
0 µL
-
10 µL
45 µL
1 : 4,5
10 µL
90 µL
1:9
20 µL
225 µL
1 : 12,5
20 µL
90 µL
2:9
50 µL
90 µL
5:9
Tabla 1: Proporciones de NP:polímero. Estas proporciones se probaron con los distintos
polímeros entrecruzados Qo-PS.
En la tabla 1 se presentan las distintas proporciones de NP:polímero utilizadas
para formar los nanocompósitos. Mientras que en la figura 1 se observa que en
algunas de las proporciones de NP:polímero (presentadas en la tabla 1) también se
produce un efecto de agregación de las Au-NPS, que es más notorio en el caso de las
proporciones de NP:polímero como la B y D, que corresponden a 1:4.5 y 1:12.5,
respectivamente. Este hecho indica que tales nanocompósitos no son estables en
solución, por lo que se descarta su utilización en los ensayos biológicos. Por otro lado,
aquellas proporciones de NP:polímero E y F, que corresponden a 2:9 y 5:9,
respectivamente, fueron descartadas en base a bibliografía [Hong, 2009], debido a que
está reportado que aquellas proporciones presentan mayor índice de agregación,
resultando en un tamaño mayor de los agregados, lo que no es conveniente en este
caso.
79
NCB3
NCD3
NCC3
NCE3
NCF3
AuNP
0,65
0,60
0,55
0,50
Absorbancia
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
-0,05
300
400
500
600
700
800
900
Longitud de onda (nm)
Figura 1: Espectro UV/Vis de nanocompósito formado con el polímero 3 (corresponde a un 83%
de Qo) y distintas proporciones de NP:polímero, siendo A aquella que no posee polímero, B la
proporción de 1:4.5, C la proporción de 1:9, D la proporción de 1:12.5, E la proporción de 2:9 y
F la proporción de 5:9.
En base a estas observaciones, se decide entonces utilizar la proporción de
NP:polímero de 1:9 para formar los nanocompósitos. Posteriormente, se realiza un
experimento similar, pero esta vez utilizando ya la proporción 1:9 de NP:polímero y
cambiando los polímeros entrecruzados utilizados.
80
C1
C2
C3
C4
C5
CQ
0,6
0,5
Absorbancia
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
300
400
500
600
700
800
900
Longitud de onda (nm)
Figura 3: Espectro UV/Vis de nanocompósito formado con los distintos polímeros y una
proporción de NP:polímero de 1:9. Los números 1, 2, 3, 4 y 5 corresponden a las distintas
proporciones de Qo:PS, las que corresponden a 50, 67, 83, 90 y 99% de Qo, respectivamente.
En la figura 3, se puede apreciar que varios de los polímeros utilizados para
formar los nanocompósitos presentan inestabilidad, la que se ve evidenciada por la
aparición de “hombros” en el espectro, alrededor de los 700 nm de longitud de onda.
De hecho, en el caso del nanocompósito formado con el entrecruzado polimérico 4
(90% de Qo) no aparece ningún máximo de absorbancia, lo que indica que en este
caso la agregación de las nanopartículas fue tanta, que estas precipitaron. También se
observa agregación en aquellos nanocompósitos formados con los polímeros Qo y
entrecruzado polimérico 5 (este último corresponde a un 99% de Qo). Mientras que
cuando disminuye aún más el porcentaje de Qo y aumenta el de PS, se evita tal
agregación, lo que se observa a partir de los nanocompósitos formados con el polímero
81
3, que corresponde a un 83% de Qo. Hecho que se mantiene en el caso de los
polímeros 1 y 2 (50 y 67% de Qo, respectivamente).
Sin embargo, en base a los resultados obtenidos de energía superficial y
compararlos con resultados encontrados en bibliografía [kweon, 1998], se determinó
elegir el entrecruzado polimérico 3 (83% de Qo), debido a que está reportado que el
valor de energía superficial obtenido en tal caso era suficiente para eliminar su efecto
trombogénico.
Solvente
Constante dieléctrica (e)
Agua
78,5
Anilina
7,2
Cloroformo
5,0
Tabla 2: Constantes dieléctricas para los distintos utilizados en las mediciones de ángulo de
contacto. Tales constantes están directamente relacionadas con la polaridad de estos
solventes.
82
En la tabla 2 se presentan los valores de las constantes dieléctricas de los
distintos solventes utilizados para las mediciones de ángulo de contacto. Estos valores
indican la distinta polaridad de los solventes, hecho necesario para calcular
posteriormente una energía superficial constante, siendo la constante dieléctrica del
agua (78,5) la que presenta el mayor valor, lo que indica que este es el solvente más
polar utilizado, mientras que el menos polar corresponde al cloroformo (5,0), seguido
por la anilina (7,2).
83