Tesis Doctoral Papel fundamental de cFLIP en el control de la apoptosis en células epiteliales de mama Rosario Yerbes Cadenas Enero, 2010 Centro Anadaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER). Editor: Editorial de la Universidad de Granada Autor: Rosario Yerbes Cadenas D.L.: GR 1472-2010 ISBN: 978-84-693-0699-4 Dr. Abelardo López Rivas, Profesor de Investigación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas y miembro del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), CERTIFICA: Que el trabajo titulado “Papel fundamental de cFLIP en el control de la apoptosis en células epiteliales de mama” presentado por Doña Rosario Yerbes Cadenas, para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Granada, ha sido realizado bajo su supervisión en el Centro Andaluz de Biología Molecular Y Medicina Regenerativa y reúne, a su juicio, originalidad y contenidos suficientes para que sea defendido ante el tribunal correspondiente. Y, para que conste a los efectos oportunos, expido y firmo el presente certificado en Sevilla a de 200 Fdo: Dr. Abelardo López Rivas ÍNDICE I. Abreviaturas………………………………………. 1 II. Resumen………………………………………….. 4 III. Introducción……………………………………... 7 1. Mecanismos de muerte celular……………………... 8 2. Apoptosis………………………………………… 12 3. Mediadores de la apoptosis. Caspasas………………. 15 3.1 Características y organización estructural …………. 15 3.2 Clasificación ……………………………………. 16 3.3 Activación……………………………………… 19 3.3.1 Activación de caspasas iniciadoras…………… 19 3.3.2 Activación de caspasas ejecutoras……………. 20 3.4 Inhibición de las caspasas. IAPs…………………… 21 3.5 Otros mecanismos de regulación………………….. 24 4. Rutas de apoptosis………………………………… 26 4.1 Ruta Intrínseca o mitocondrial…………………… 26 4.4.1 Papel de la mitocondria en la apoptosis……….. 26 4.1.2 Familia de proteínas de Bcl-2…………………. 28 4.2 Ruta extrínseca o de receptores de muerte…………. 33 4.2.1 Señalización mediada por TNFR1/TNF………… 36 4.2.2 Señalización mediada por Fas/FasL……………. 39 5. Señalización mediada por el ligando de muerte TRAIL…. 42 5.1 TRAIL y sus receptores……………………………. 42 5.2 Señalización apoptótica mediada por TRAIL…………. 44 5.3 Señalización no apoptótica mediada por TRAIL………. 47 5.4 TRAIL y cáncer……………………………………. 47 6. FLIP………………………………………………….. 51 6.1. Estructura molecular de FLIP………………………. 51 6.2. Regulación de la expresión de cFLIP…………………. 53 6.2.1 Regulación de la síntesis de cFLIP…………………. 53 6.2.2 Regulación de la degradación de cFLIP………….. 55 6.3 Funciones de cFLIP……………………………….. 57 6.3.1 Inhibición de la apoptosis ……………………… 57 6.3.2. Proliferación celulas. Activación de las células T…. 59 6.3.3. Adhesión y migración celular………………….. 61 6.3.4. Fenotipo del ratón deficiente para cFLIP………… 61 6.3.5 Regulación de la autofagia ……………………. 62 6.3.6. cFLIP y cáncer……………………………….. 62 7. Desarrollo morfogenético del epitelio glandurar de mama... 64 IV. Objetivos………………………………………….. 70 V. Materiales y Métodos………………………… 72 VI. Resultados………………………………………….. 96 1. Sensibilización de células de cáncer de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. Papel de cFLIP………………………… 96 1.1 Doxorrubicina y SAHA sensibilizan a células de cáncer de mama a la apoptosis inducida por TRAIL……………… 1.2 cFLIP juega un papel fundamental en la resistencia de 96 células de cáncer de mama a la acción de TRAIL……………. 108 1.3 Implicación de la mitocondria en la apoptosis inducida por la sensibilización de células de cáncer de mama a TRAIL….. 112 2. Papel de cFLIP en la supervivencia celular…………………….. 115 2.1 La disminución de cFLIP por RNA de interferencia induce apoptosis en células de cáncer de mama……………………. 115 2.2 La bajada de expresión de cFLIP por siRNA induce apoptosis en células epiteliales no transformadas de mama MCF-10A . … 118 2.3 La apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP por siRNA requiere del receptor de TRAIL, TRAILR2…… 120 2.4 La apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP es independiente de ligando…………………………….. 122 2.5 Los componentes del DISC de TRAIL, FADD y Caspasa-8 participan en la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP……………………………………………… 124 2.6 La muerte inducida por la bajada de expresión de cFLIP siFLIP requiere la ruta mitocondrial de apoptosis…………. 126 2.7 cFLIP regula la morfogénesis de células epiteliales de mama .. 130 3. Regulación de la expresión de cFLIP…………………………… 140 3.1 Regulación de la degradación de cFLIP……………………… 140 3.2 Regulación de la síntesis de cFLIP………………………….. 144 VII. Discusión…………………………………………….. 150 VIII. Conclusiones……………………………………….. 165 IX. Bibliografía…………………………………………… 167 X. Anexo…………………………………………………… 191 I. ABREVIATURAS Abreviaturas ABREVIATURAS. 3D : Tridimensional ADN: Ácido desoxirribonucléico AIF: Factor inductor de apoptosis (Apoptotic Inducing Factor) APAF-1: Factor 1 activado por proteasas apoptóticas (Apoptotic ProteaseActivating Factor-1) APS: Persulfato de amonio (Amonium Persulfate) ARN: Ácido ribonucleico ARNm: Ácido ribonucleico mensajero ATP: Adenosina 5´-trifosfato BH: Dominio de homología de las proteínas de la familia de Bcl-2 (Bcl-2 Homology) BIR: Repetición IAP del baculovirus (Baculoviral IAP repeat) BSA Seroalbúmina bovina CARD: Dominio reclutador de caspasas (caspase reruitment domain) CHX: Cicloheximida CRD: dominio rico en cisterna, de la región extracelular de receptores de la familia de TNF (cystein rich domain) DAPI: Diaminofenilindol (4´,6-diamidino-2-phenylindole) DcR: Receptor señuelo (decoy deceptor) DD: Dominio de muerte (death domain) DED: Dominio efector de muerte (death efector domain) DISC: Complejo inductor de señales de muerte (death inducing signalling complex) DMEM: Dubelco’s modified Eagle’s medium DMSO: Dimetilsulfóxido DEPC: Dietilpirocarbonato DTT: Ditiotreitol DXR: dooxorrubicina 1 Abreviaturas ECL: Reactivo quimioluminiscente (Enhanced chemiluminiscence) EDTA Etinildiaminotetraacetato EGF: Factor de crecimiento epidérmico (epidermal growth factor) FBS: Suero fetal bovino (foetal bovine serum) HRP: Peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase) IAP: Proteínas inhibidoras de apoptosis (inhibitor of apoptosis proteins) IFN: Interferón KDa: Quilodaltons mg: miligramo ml: mililitro mM: milimolar NF-κB : Factor nuclear kappa B (Nuclear factor Κappa B) ng: nanogramo nm: nanometros nM:nanomolar OPG: Osteoprotegerina PARP: Poli-ADP-ribosa polimerasa PBS: Tampón fosfato (Phosphate-buffered saline) PCR: reacción en cadena de la polimerasa PMSF: Fenilmetil sulfonil fluoruro (Phenylmethyl sulphonyl fluoride) PS: Fosfatidilserina rpm: revoluciones por minuto RT-PCR: Transcripción reversa de ARN y amplificación de ADN por Reacción en Cadena de la Polimerasa shRNA: ARN de bucle corto (Short hairpin RNA) siRNA : Pequeño ARN de interferencia (Small interfering RNA) TA: Temperatura ambiente TE: Tris- DTA TAE: Tris-acetato-EDTA 2 Abreviaturas TNF: Factor de necrosis tumoral (Tumor necrosis factor) TRAIL: Ligando inductor de apoptosis de la familia de ligandos TNF (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) μg: microgramo μl: microlitro μM: micromolar 3 II. RESUMEN 4 Resumen RESUMEN. TRAIL es un ligando de muerte de la familia de TNF con un gran potencial terapéutico contra el cáncer, debido fundamentalmente a que es capaz de inducir apoptosis en células tumorales sin provocar toxicidad en células normales. Sin embargo, existen algunos tipos de células tumorales, como las de mama, que presentan resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL por causas no bien conocidas. En esta tesis se ha estudiado el papel que cFLIP, proteína inhibidora de la apoptosis inducida por ligandos de muerte, juega en la resistencia de células tumorales de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. Así, hemos determinado que cFLIP es un componente clave en la resistencia de estas células a TRAIL, puesto que la inhibición de su expresión mediante tratamientos como Doxorrubicina (antraciclina muy utlizada en quimioterapia del cáncer) o SAHA (inhibidor de deacetilasas de histonas), así como el silenciamiento de su expresión mediante oligonucleótidos de ARN de interferencia (siRNA) de cFLIP, sensibilizan a todas las células tumorales de mama testadas a la apoptosis inducida por TRAIL. Además, hemos demostrado que cFLIP es también una proteína clave en la viabilidad de las células epiteliales de mama, tumorales o no, puesto que la inhibición de su expresión induce apoptosis. Esta apoptosis requiere de los componentes de la señalización apoptótica de TRAIL, como son el receptor TRAIL-R2, la molécula adaptadora FADD y la caspasa-8, pero es independiente del propio TRAIL. Por otra parte, y en vista de la importancia de cFLIP en el control de la apoptosis, se ha estudiado la participación de cFLIP durante la morfogénesis de células epiteliales de mama MCF-10A, proceso en el que la apoptosis tiene un papel fundamental. Así una expresión elevada de cFLIPL o de cFLIPS inhibe la formación del lumen de los acinos derivados de dichas 5 Resumen células cuando son cultivadas en presencia de matriz extracelular (cultivos 3D). Por otra parte, la inhibición de la expresión de cFLIP impide el desarrollo de acinos, debido probablemente a que las células que no expresan suficientes niveles de cFLIP no son viables. Por ello, el estudio de la regulación de la expresión de cFLIP ha sido de gran interés en este trabajo. Así hemos determinado, que la ruta de señalización PI3K/AKT no es la principal responsable del mantenimiento de la expresión de cFLIP en células tumorales de mama, y apuntamos a que, posiblemente, la ruta de NF-kB sea una de las implicadas en ello. Además, hemos demostrado que el sistema ubiquitina-proteasoma, juega un papel fundamental en la degradación celular de cFLIP y, actualmente, trabajamos en la descripción de la proteína E3-ubiquitin ligasa responsable de la degradación de cFLIP por dicho sistema. 6 III. INTRODUCCIÓN 7 Introducción INTRODUCCIÓN. 1. MECANISMOS DE MUERTE CELULAR. La muerte celular puede ser clasificada de acuerdo a sus características morfológicas (apoptosis, necrosis, muerte celular autofágica o muerte celular asociada con mitosis), de acuerdo a criterios enzimológicos (con o sin participación de nucleasas o de diferentes tipos de proteasas como caspasas, calpainas, catepsinas y transglutaminasas), de acuerdo a aspectos funcionales (muerte celular programada o accidental, fisiológica o patológica) o de acuerdo a características inmunológicas ( inmunogénica o no inmunogénica). Es por ello que el Comité de Nomenclatura de Muerte Celular (Nomenclature Commitee on Cell Death, NCCD) ha propuesto una clasificación y definición actualizada de las diferentes modalidades de muerte celular que se han descrito hasta el momento y que, brevemente, se describen a continuación [2] [1]: Apoptosis: muerte celular programada con características morfológicas, como son el redondeamiento de las células, la retracción de pseudópodos, reducción del volumen celular y nuclear (pyknosis), fragmentación nuclear (karyorrhexis), división de la membrana plasmática en vesículas, aunque sin pérdida de su integridad física (blebbing) y la fagocitosis de la célula, in vivo. Algunas de sus características bioquímicas son la activación de caspasas, de proteínas proapoptóticas de la familia de Bcl-2, pérdida de potencial mitocondrial, fragmentación del ADN y exposición del lípido fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plásmatica, entre otras. La apoptosis no debe considerarse sinónimo de muerte celular programada, porque existen otros tipos de muerte celular programada que no tienen las características morfológicas de la apoptosis. Tampoco debe considerarse sinónimo de activación de caspasas, ya que la activación de estas también 8 Introducción puede estar asociada a procesos biológicos no letales, aunque para la adquisición de las características apoptóticas se requiera de las caspasas. Muerte celular que cursa con autofagia: morfológicamente se define como un tipo de muerte celular que ocurre en ausencia de condensación de la cromatina pero acompañada por una masiva vacuolización autofágica. Al contrario que las células apoptóticas, las células que mueren con morfología autofágica, no tienen asociación o muy poca con los fagocitos. Como el propio nombre indica esta muerte cursa con autofagia y no debe asumirse que la autofagia es la ejecutora de esta muerte, ya que en principio, la autofagia es un mecanismo de supervivencia celular, como lo indica el hecho de que la inhibición de la autofagia acelera el proceso de muerte celular. Necrosis: muerte celular caracterizada por un aumento de volumen de los orgánulos y del citoplasma celular, moderada condensación de la cromatina y rotura de la membrana plasmática con la consecuente pérdida del contenido intracelular. Muchos orgánulos y procesos celulares se han descrito como mediadores de la muerte celular necrótica, pero aún no está muy claro cúal es la relación existente entre unos y otros. Estos fenómenos incluyen alteraciones mitocondriales (producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), permeabilización de la membrana mitocondrial), cambios lisosomales (producción de ROS por reacciones Fenton, permeabilización de la membrana lisosomal), cambios nucleares (hiperactivación de PARP-1), degradación de lípidos, incremento en la concentración citosólica de calcio (que provoca la activación de proteasas como las calpaínas y las catepsinas). La necrosis siempre se ha considerado como una muerte celular accidental no programada, pero actualmente se están acumulando evidencias de que la muerte celular necrótica puede estar finamente regulada. Así receptores de muerte (TNF-R1, Fas, TRAIL-R) y receptores Toll-like, son capaces de inducir necrosis en presencia de inhibidores de caspasas, principalmente. 9 Introducción Esta muerte celular inducida por estos receptores parece depender de la proteína quinasa RIP1, y se puede inhibir con necrostatinas. Por tanto, se ha propuesto el término de necroptosis para distinguir este tipo de necrosis regulada de la que no lo está. Cornificación: es una muerte celular programada, específica de la epidermis, morfológica y bioquímicamente diferente de la apoptosis. Este proceso permite la formación de corneocitos, que son queranocitos muertos con una mezcla de proteínas y lípidos necesarios para la resistencia mecánica, elasticidad y estabilidad estructural de la epidermis. Figura 1. Morfología de la muerte celular. A) Célula epitelial humana en necrosis. Se observa rotura de la membrana plasmática y pérdida de la integridad mitocondrial. B) Células epitelial humana en apoptosis. Se observa condensación de la cormatina e intergridad de la mitocondria. C) Célula epitelial humana en autofagia. Se observa una morfología normal del núcleo y la formación de vesiculas autofágicas con contenido citoplasmático. D) Amplificación de C) donde se ve la doble membrana característica de las vacuolas de autofagia. Adaptado de Kroemer y El-Deiry, 2005 [1]) Otras modalidades de muerte celular: Catástrofe mitótica: muerte celular que ocurre durante o justamente después de una mitosis fallida. Se acompaña de características morfológicas que incluyen la micronucleación (fragmentos de cromosomas que no han sido bien repartidos entre las células hijas) o multinucleación, debido a una incorrecta separación de núcleos. El hecho de que este fenómeno pueda derivar en apoptosis o necrosis, hace que se recomiende el uso de la 10 Introducción expresión “muerte que ocurre durante la metafase” por ser más preciso e informativo. Anoikis: apoptosis inducida por la pérdida de adhesión al sustrato o a otras células. Sin embargo hay que tener en cuenta que otros procesos de muerte celular pueden darse tras la pérdida de adhesión al sustrato que no tienen características apoptóticas. Entosis: define una modalidad de muerte celular en la que una célula es internalizada por otra célula vecina y, posteriormente, desparece mediante degradación lisosomal. La entosisis no es inhibida por Bcl-2 ni por Z-VADfmk. Se ha descrito que células de cáncer de mama MCF-7 sufren entosis cuando se les priva de adhesión al sustrato. Paraptosis: este término se introdujo para describir un tipo de muerte celular programada con características morfológicas y bioquímicas diferentes de la apoptosis. En muchos tipos celulares la paraptosis se pude disparar por el IGFR-1 (insulin-like growth factor receptor 1) y cursa con una extensiva vacuolización citoplasmática y aumento del volumen mitocondrial. No puede inhibirse por Bcl-2 ni por inhibidores de caspasas y en su señalización están implicados miembros de la familia de MAPK. En la actualidad no está muy claro si la paraptosis representa un tipo de muerte celular realmente diferente a las demás. Piroptosis: esta forma de muerte celular ha sido descrita principalmente en macrófagos e implica la activación de la caspasa-1 y la liberación de IL-1β y de IL-8, citoquinas implicadas en el proceso inflamatorio. Los macrógafos que sufren piroptosis presentan características morfológicas de la apoptosis y de la necrosis. 11 Introducción 2. Apoptosis. La apoptosis tiene un papel fundamental en el desarrollo y en la homeostasis de todos los organismos multicelulares [3]. Estos dependen de la apoptosis para eliminar células que deben ser remplazadas, que no se necesitan más o que están irreparablemente dañados [4]. El término “apoptosis” fué acuñado por Kerr, Wyllie y Currie en 1972 para describir un modo de muerte celular con ciertas características morfológicas [5], [6]. No fue hasta los estudios desarrollados en el nemato C. elegans cuando se descubrió que la apoptosis, además, era un proceso de muerte controlado genéticamente [7] [8]. Los componentes principales de la maquinaria apoptótica en C. elegans son tres proteínas CED (Cell death abnormal) llamadas CED-3, CED-4 y Figura 2. Expansión evolutiva de la CED-9 [9] [10]. El inicio de la maquinaria apoptótica. Adaptado de Alexei apoptosis se da con el aumento Degterv, Nat. Rev. 2008. de expresión génica de egl-1. La unión de EGL-1 a la proteína antiapotótica CED-9 la libera de la unión a la proteína adaptadora CED-4, quien se une y activa a CED-3, proteína con actividad proteasa, la cual degrada múltiples componentes celulares dando lugar a la muerte celular [11] [12]. En humanos, las proteínas homólogas a las proteínas CED, están presentes en 12 Introducción las proteínas de la familia de Bcl-2, proteínas APAF-1/NLR y la familia de las caspasas. El mecanismo apoptótico es similar al de C.elegans aunque mucho más complejo (Figura 1). Por ejemplo, aunque el aumento transcripcional de miembros pro-apoptóticos de la familia de Bcl-2 puede iniciar la apoptosis [13], muchos otros miembros pueden ser activados por diferentes mecanismos como rotura, fosforilación, ubiquitinación y miristoilación [14] [15] [16] [17]. Además, en humanos, la apoptosis también puede iniciarse por una familia de proteínas denominada receptores de muerte, que no están presentes en C.elegans [18]. Con todos los datos obtenidos hasta la actualidad se puede hacer una caracterización secuencial tanto morfológica como bioquímica de los eventos que se dan durante la apoptosis (Figura 3), que de forma resumida sería: tras la inducción de apoptosis, se produce la condensación del citoplasma y la compactación de la cromatina dando lugar a la formación de densos agregados que se deslocalizan para situarse junto a la membrana nuclear. Posteriormente, sobre la cromatina actúan las endonucleasas que cortan el ADN en fragmentos olionucleosomales de 180pb (o múltiplos de estos). Se produce la dilatación del retículo endoplásmico que origina la formación de vesículas que tienden a unirse a la membrana plasmática adquiriendo una forma característica en burbujas (blebbing). Finalmente, la célula se divide en los llamados cuerpos apoptóticos. Estos, son rápidamente reconocidos y fagocitados por los macrófagos y otras células vecinas impidiendo una exposición del material intracelular al sistema inmune, que podría provocar una respuesta inflamatoria. Los fagocitos pueden reconocer a las células apoptóticas por diversas características. El fosfolípido fosfatidilserina (PS), que normalmente se encuentra en la cara interna de la membrana citoplasmática, se transloca a la cara externa en la fase temprana de la apoptosis, [19] siendo la exposición de 13 Introducción la fosfatidilserina esencial para el reconocimiento de la célula apoptótica por los macrófagos [20] [21] [22]. La anexina I es otra molécula que se expone en la superficie de la célula apoptótica. También se pueden producir modificaciones en proteínas de membrana como ICAM-3 y CD31, así como cambios en la composición de azúcares y en la carga eléctrica de la superfice celular [23] [24] . Figura 3. Fases de la apoptosis La crítica importancia de la apoptosis para la homeostasis de los tejidos tiene implicaciones patológicas. Una excesiva apoptosis contribuye en diferentes enfermedades como el SIDA, Alzheimer, enfermedad de Huntington, isquemia cardiaca y daños renales. De forma contraria, una deficiencia en apoptosis es el componente clave en el desarrollo de enfermedades autoinmunes y cáncer [4]. Por ello, las estrategias terapeúticas de manipulación de la apoptosis tienen un gran potencial, y unas de las 14 Introducción áreas más prolíficas a este respecto han sido el desarrollo de agentes antitumorales. Una de las características de la activación de la apoptosis como herramienta antitumoral es su potencial de inducir regresión del tumor más que inhibir su crecimiento. 3. Mediadores de la Apoptosis. Caspasas. 3.1. Características y organización estructural. Las caspasas constituyen una familia de enzimas muy conservadas en la evolución y son los componentes centrales de la respuesta apoptótica. Las caspasas son una familia de cistein-proteasas en cuyo sitio catalítico es esencial un residuo de cisteína y que cortan sus sustratos después de un residuo de aspártico, de ahí su nombre (cysteine-dependent aspartate specific protease). En 1993, se demostró que el gen ced-3, esencial en la apoptosis de C.elegans, codicaba una proteína cistein-proteasa homóloga a la enzima convertidora de Interleuquina-1β de humanos [25] (Cerretti et al 1992) [26] [27]. La sobrexpresión de esta enzima, renombrada Caspasa-1, era suficiente para inducir apoptosis en mamíferos [28]. A partir de entonces se han descrito más miembros homólogos pertencientes a esta conservada familia de proteínas en organismos como, el díptero Drosophila melanogaster [29], el lepidóptero Spodoptera frugiperda [30], e incluso la levadura Saccharomyces cerevisiae [31]. En humanos existen 11 genes que codifican para 11 caspasas, de la caspasa-1 a la 10 y la caspasa 14 (esta sólo se expresa en queranocitos) [32]. Las caspasas se sintetizan en las células como zimógenos inactivos que contienen un prodominio N-terminal, una subunidad grande (p20) y una subunidad pequeña (p10). El centro catalítico se sitúa en la subunidad p20 y contiene un residuo de cisteína (285), que forma parte de una secuencia de cinco aminioácidos muy conservados “QACXG” [33]. El sitio de unión al sustrato lo forman tanto la subunidad p20 como la p10, 15 Introducción pero el residuo determinante para la especificidad del sustrato lo contiene la subunidad p10. La activación del zimógeno por proteolisis, separa el prodominio y la subunidad grande de la pequeña y, posteriormente, el prodominio es eliminado. La forma activa de las caspasas consiste en un homodímero formado por dos monómeros que contienen una subunidad grande y una pequeña y que poseen, por tanto, dos sitios catalíticos. Las caspasas reconocen en sus sustratos una secuencia de al menos cuatro aminoácidos P4-P3-P2-P1 y cortan después del aminoácido carboxi-terminal, el P1, que es un residuo de Aspártico. [6]. El residuo P3 suele ser una glutamina, y los residuos P2 y P4 son variables, por lo que la secuencia de especificidad de corte de una caspasa puede ser X-Glu-X-Asp. Los aminoácidos de la enzima que se unen al sustrato y que, por tanto, reconocen la secuencia P4-P3-P2-P1 se denomina S4-S3-S2-S1. S1 y S3 son residuos muy conservados en las diferentes caspasas, al contrario que S2 y S4, que varían significativamente entre las caspasas y originan las diferentes especificidades por el sustrato en las posiciones P2 y P4. 3.2 Clasificación. Tradicionalmente las caspasas humanas se han dividido en dos grupos bien diferenciados en base a su función: caspasas pro-inflamatorias (caspasa1, -4, -5, -11, -12), que regulan la maduración de las citoquinas durante el proceso inflamatorio y caspasas pro-apoptóticas (caspasa-2, -3, -6, -7, -8, -9, 10), que son la maquinaria ejecutora de la apoptosis. Sin embargo actualmente esta clasificación no es del todo exacta ya que la activación de las caspasas pro-inflamatorias puede derivar en piroptosis, una modalidad de muerte celular asociada con una masiva activación de células inflamatorias y, además, recientemente se están describiendo funciones de las caspasas apoptóticas no relacionadas con la apoptosis sino con 16 Introducción proliferación, diferenciación y migración celular [34] [6] o incluso como supresoras de tumores, como es el caso de la caspasa-2 [35]. De igual forma, las caspasas apoptóticas se han divido en dos grupos: caspasas iniciadoras (-2, -8, -9, -10) y caspasas efectoras (-3, -7,-9) (Figura 4). Las capasas inicadoras poseen un prodominio largo, de unos 100 aminoácidos, que contiene uno de los dos motivos característicos de interacción proteína-proteína, como son el dominio efector de muerte (DED) y el dominio de reclutamiento de caspasas (CARD). Se activan por dimerización y están implicadas en la activación de las caspasas efectoras. Las caspasas efectoras poseen un prodominio corto, de menos de 30 aminoácidos, se activan por el corte del sitio catalítico por caspasas iniciadoras, y están implicadas en la proteolisis de un amplio abanico de componentes celulares que, en última instancia, derivan en la muerte celular. Dentro de los sustratos de caspasas se encuentran componentes estructurales (actina y laminina), proteínas reguladoras (proteinas quinasas dependientes de ADN), inhibidores de deoxirribonucleasas (como DFF45 o ICAD) que permiten la liberación de DFF40 o CAD que degradan el DNA durante la apoptosis [3] y otras proteínas pro-apoptóticas y caspasas. Una información más detallada sobre los sustratos de caspasas se puede encontrar en la base de datos “CASBAH” ( http://www.casbah.ie ) [36]. 17 Introducción Caspasa-3 Efectoras Caspasa-7 Caspasa-6 Caspasa-8 Iniciadoras Caspasa-10 Caspasa-9 Caspasa-2 Caspasa-4 Caspasa-13 Caspasa-5 Inflamatorias y otras Caspasa-11 Caspasa-12 Caspasa-1 Caspasa-14 Figura 4. Clasificación de las caspasas en mamíferos. Excepto las caspasas-11 y -12 (ratón) y la -13 (bovina), todas las demás son humanas.La flecha indica el primer sitio de corte en la activación.Las flechas medianas y más finas represenatan sitios adicionales de corte. El residuo de cisteína responsable de la actividad catalítica se representa con una línea roja. Los segmentos de colores representan las las regiones que corresponden a los bucles que constituyen la actividad catalítica. Adaptada de Shi, Mol. Cell, 2002) 18 Introducción 3.3 Activación de las caspasas. 3.3.1 Activación de caspasas iniciadoras. En estado basal, las caspasas iniciadoras son monómeros inactivos. Tras un estímulo apoptótico, se induce el ensamblaje de las denominadas plataformas de activación, que están formadas por las propias caspasas y por proteínas adaptadoras, y que resulta en la activación de las caspasas iniciadoras. Las proteínas adaptadoras que forman parte de las plataformas se unen específicamente a los dominios DED o CARD de las caspasas. Cada caspasa iniciadora tiene su plataforma de activación: el DISC (Death Inducing Signalling Complex) recluta y activa a la caspas-8 y -10 [37] [38]. El apoptosoma activa a la caspasa-9 [39] [40, 41], y el PIDDosoma está implicado en la activación de la caspasa-2 [42, 43] [44] (Figura 5). Dentro de las caspasas pro-inflamatorias, se ha descrito el inflamosoma como plataforma de activación de la caspasa-1. El mecanismo de activación de las caspasas iniciadoras en las Figura 5. Plataformas de activación de las caspasas iniciadoras apoptóticas. Se muestran los componentes de las plataformas donde se activan las caspasas apoptóticas iniciadoras: el DISC para la activación de las caspasas-8 y-10, el PIDDosoma para la activación de la caspasa-2 y el apoptosoma para la activación de la caspasa-9 (Adaptado de Po-Ki Ho et al, The FEBS Journal 2005). 19 Introducción plataformas no está bien definido y se proponen dos modelos principalmente: 1) Modelo de activación por dimerización inducida por proximidad: este modelo propone que las caspasas iniciadoras deben dimerizarse para activarse y que la dimerización es facilitada en las plataformas de activación. La proteolisis interna no activa a estas caspasas, sino que es un evento secundario que ayuda a la estabilización del dímero activo [34]. 2) El modelo de conformación inducida, propone que, en el apoptosoma, se pueden activar directamente monómeros de caspasa-9 a través de modificaciones en la conformación de su sitio activo [6]. En algunos casos, las moléculas adaptadoras incorporadas en las plataformas pueden señalizar hacia diferentes vías, por ejemplo, la caspasa-2 y la -8 pueden señalizar para muerte celular o para supervivencia a través de NF-kB, aunque poco se conoce aún del mecanismo que subyace dicha señalización. [45], [46], [34]. 3.3.2 Activación de las caspasas efectoras. Activación por proteolisis. Las caspasas efectoras existen ya como homodímeros y requieren de proteolisis en el dominio catalítico para activarse (Figura 6). La proteolisis provoca un correcto posicionamiento del sitio activo y, a su vez, una correcta alineación de los residuos que interaccionan con los sustratos [47] [48] [6] [34] 20 Introducción Figura 6. Mecanismos de activación de las caspasas. A) Organización estructural de las caspasas. Un pro-dominio precede al dominio catalítico compuesto por dos subunidades unidas covalentemente. Los sitios para la (auto)-proteolisis en los residuos de Aspártico están indicados. B) Mecanismos de activación de las caspasas. Las caspasas iniciadoras son monómeros que se activan dimerización mediada por los predominios. Las caspasas ejecutoras son dímeros que se activan por la rotura entre sus subunidades. Tras la activación, pueden ocurrir adicionales eventos proteolíticos que provocan una mayor estabilidad en la estructura y que pueden estar sujetos a regulación.Adaptado de Cristina POP, et al. JBC, 2009. 3.4 Inhibición de las caspasas. IAPs. Debido a que el proceso de proteolisis es irreversible, la activación de las caspasas en las células está finamente regulado. Así, en las células xisten varias estrategias para prevenir la activación de las caspasas: inhibición del sitio activo, degradación proteasomal y proteínas “decoy”. Un modo básico de inhibición de las proteasas en general se basa en ocupar el sitio activo con un segmento proteico que mimetiza a los residuos de unión de los verdaderos sustratos impidiendo la unión de estos con las proteasas. Así con 21 Introducción respecto a la inhibición de las caspasas, encontramos este mecanismo en algunos virus. Dos de los mejores inhibidores virales de caspasas caracterizados, como son las proteínas CmrA y p35/49, procedentes de baculovirus, se unen directamente al sitio activo de la mayoría de las caspasas impidiendo su acción. Un mecanismo de inhibición similar pero mucho más específico lo encontramos en las proteínas humanas pertenecientes a la familia de los IAPs. Los IAPs son las únicas proteínas endógenas que regulan tanto la actividad de las caspasas iniciadoras (caspasa-9), como efectoras (caspasa-3 y -7). Hasta la fecha se han identificado ocho miembros: NAIP, XIAP, c-IAP1, c-IAP2, survivina, MLIAP, ILP2 y Apollon [49]. Esta familia se caracteriza por poseer uno o más dominios de 70-80 aminoácidos agrupados alrededor de un átomo de Zinc, a denominados dominios BIR (Bacuoloviral IAP Reapeat). Dentro de los IAPs que poseen más de un dominio BIR (XIAP, c-IAP1 y cIAP2), parece que cada dominio tiene una función diferente. Así en XIAP, el dominio BIR3 inhibe específicamente a la caspasa-3, mientras que la región existente entre el dominio BIR1 y BIR2 inhibe específicamente a las caspasas-3 y-7. De los IAPs que solo contienen un dominio BIR, ML-IAP, por ejemplo, inhibe caspasa-3 y-9 [49]. Se han descrito proteínas homólogas a los IAPs en Drosophila pero no en nematodos (Figura 7). 22 Introducción Figura 7. Esquema de la familia de las proteínas IAPs y su estructura. Se muestran las proteínas pertenecientes a la familia de los IAPS en mamíferos y en D.melanogaster.Adapatado de Stefan Riedl, Mol Cell Biol. 2004. Las proteínas “decoy”, son proteínas estructuralmente similares a las caspasas y que compiten con ellas por la unión a las proteínas adaptadoras en las plataformas de activación. Por tanto, desde un punto de vista semántico no inhiben a las caspasas sino que previenen su activación. Un ejemplo de este tipo de proteína es cFLIP, que compite con la caspasa-8 para unirse a la proteína adaptadora FADD en el DISC y, cuya estructura y función, se comentan más detalladamente en el apartado 6 de la Introducción. El tercer mecanismo de regulación de las caspasas implica su degradación via proteasoma. Las caspasas activas tienen una vida media muy corta, y se ha propuesto que las proteínas responsables para su degradación por el proteasoma son los IAPs, de hecho, muchos IAPs, 23 Introducción además del dominio BIR, contien un dominio RING y UbA implicados en la ligación de ubiquitina, requisito necesario para la degradación proteasomal de las proteínas [34]. 3.5 Otros mecanismos de regulación de las caspasas: Regulación génica: aunque en la mayoría de los casos la apoptosis no requiere la síntesis de novo de caspasas, la regulación de la transcripción de las caspasas tiene importancia en algunas cirscuntancias. Por ejemplo, los niveles de expresión de caspasa-11 en ratones sanos o células en reposo es muy bajo, pero el tratamiento con LPS u otro estímulo patológico, como una isquemia in vivo, induce un fuerte aumento de la transcripción de esta caspasa. La bajada de expresión de E2F por el adenovirus E1A, la pérdida de Rb o una aumentada expresión de E2F1 resulta en la acumulación de zimógenos de caspasas por una directa regulación génica. Esto puede explicar por qué las células que expresan oncogenes son más sensibles a cualquier estímulo apoptótico, que las células que no los expresan, lo que se está potenciando como terapia antitumoral. Fosforilación: se ha descrito que, en respuesta a factores de crecimiento, AKT y ERK/MAPK son capaces de fosforilar a la caspasa-9 e inhibir su activación y la apoptosis [50] [6]. También se ha descrito que durante la mitosis, la caspasa-9 puede ser inhibida por fosforilación en el residuo Treonina125 por CDK1/ciclina B1 para impedir la apoptosis [51]. La caspasa-2 puede ser fosforilada para inhibir su acción por la calciocalmodulina proteína quinasa-2, en respuesta al metabolismo de la glucosa en oocitos de Xenopus [52]. Recientemente se ha descrito que la caspasa-2 puede ser fosforilada en la Serina122 por la DNA-PK tras un daño al ADN no letal. Esta fosforilación activaría a la caspasa-2 y mediaría la parada en el ciclo celular más que apoptosis. Además la activación de la caspasa-2 se 24 Introducción produciría en un complejo intranuclear, en asociación de la caspasa con PIDD y la subunidad catalítica de DNA-PK pero sin RAIDD [35]. Esta es la primera evidencia de una función no apoptótica de caspasa-2. Aún más reciente es el trabajo de Bouchier-Hayes et al (2009) [43] donde demuestran mediante una nueva técnica de fluorescencia (BiFC) que la activación de la caspasa-2 se da en el PIDDosmoa y en el citoplasma incluso tras estímulos que provocan daño en el ADN como es el inhibidor de la topoisomerasa etopósido. Tras estos resultados, no queda claro si la fosforilación de la caspasa-2 media su activación o si por el contrario la fosforilación inhibiría las funciones apoptóticas de la caspasa-2 e induciría la ejecución de otras funciones no apoptóticas. La familia de tirosin quinasas Scr pueden fosforilar a la caspasa-8 en la Tirosina380 [53]. La fosforilación de la Tirosina380 inhibe la activación de la caspasa-8 inducida por Fas y media la señalización antiapoptótica en células estimuladas con EGF y en células de cáncer de colon. Recientes estudios han sugerido que la fosforilación de la caspasa-8 en la Tirosina380 la dirige a zonas de la membrana donde actúa como proteína puente en una manera que no requiere su actividad enzimática [54] [55] [53]. La caspasa-3 puede ser fosforilada por p38 en la Serina150 y esta fosforilación puede ser inhibida por la asociación de la proteína fosfatasa 2A(PP2a) con la caspasa-3. Por lo que la regulación de la PP2A puede ser un punto clave en la regulación de la caspasa-3 [56] [53]. PKC también puede fosforilar a la caspasa-3 aumentando su actividad proteolítica, aunque el sitio de fosforilación no ha sido determinado. Ubiquitinación. Hasta el momento, existe una única referencia de regulación de la actividad caspasa por ubiquitinación [57]. En el trabajo se demuestra como la caspasa-8 necesita ser ubiquitinada por la E3 ubiquitin 25 Introducción ligasa Cul-3 para su completa activación tras la inducción apoptosis por el ligando de muerte TRAIL. 4. Rutas de apoptosis Las principales causas por las que en las células se induce la respuesta apoptótica son la activación de los receptores de muerte y la inducción de un estrés celular causado por la privación de factores de crecimiento en el medio, pérdida de adhesión al sustrato, daño al ADN, estrés en el retículo endoplámico, activación de oncogenes, infección viral, radiaciones ionizantes, radiaciones ultravioleta, etc. En células de mamíferos la respuesta apoptótica está mediada por dos rutas principales, intrínseca y extrínseca, dependiendo del origen del estímulo apoptótico (Figura 8). 4.1 Ruta intrínseca o mitocondrial. 4.1.1 Papel de la mitocondria en la apoptosis. La ruta intrínseca de apoptosis se activa en respuesta a estímulos de muerte inducidos por estrés o daño celular, como se ha comentado anteriormente. La ruta intrínseca de apoptosis está mediada por la mitocondria y el evento fundamental es la permeabilización de su membrana externa (MOMP). En respuesta a estímulos apoptóticos, se liberan al citosol proteínas mitocondriales como citocromo C, Smac/Diablo, AIF, Omi/HtrA2 y endonucleasa G [58] [59] [60] [49]. La principal proteína implicada en la ruta mitocondrial de apoptosis es el citocromo C. Tras su liberación al citosol, se induce la formación de la plataforma de activación de caspasas iniciadoras denominado apoptosoma. 26 Introducción El apoptosoma está compuesto por APAF-1, citocromo C, y ATP/dADP y es donde se recluta y activa la caspasa-9, iniciando así la ruta de activación de caspasas [61] [62] [41]. Otra proteína liberada desde la mitocondria durante la apoptosis es Smac (second mitochondria-derived activator of caspases) [63] o DIABLO (direct IAP-binding protein with low pI) [64] que actúa uniéndose a los miembros de la familia de los IAPs y neutralizando su actividad antiapoptótica, favoreciendo con ello la activación de las caspasas. Omi/HtrA2, al igual que Smac/Diablo, está implicada en la activación de caspasas por inhibir a los IAPs, aunque también puede estar implicada en la muerte independiente de caspasas por su actividad serín proteasa [65]. La proteína AIF (Factor Inductor de Apoptosis), es una flavoproteína con actividad NADH oxidasa, capaz de inducir muerte independiente de caspasas [66] [67] [68] [69]. Tras su liberación al citosol desde la mitocondria, 27 Introducción se transloca al núcleo y se une al ADN mediante interacciones electrostáticas y mediante la interacción con endonucleasas, como la endonucleasa G, e induce la degradación del ADN en fragmentos grandes no oligonucleosomales de aproximadamente 50 kpb [70] [71]. Tras la inducción de un estrés a la mitocondria, además de la activación de la ruta intrínseca de apoptosis, mediada por el Citocromo C y el apoptosoma, y de la muerte celular independiente de caspasas mediada por AIF, se puede producir la inducción de necrosis, mediada por la liberación desde la mitocondria de especies reactivas de oxigeno (ROS) y de Ca2+ [72]. La ruta mitocondrial de apoptosis está mediada por proteínas de la familia de Bcl-2, que comentamos más en detalle a continuación. 4.1.2 Proteínas de la familia de Bcl-2. Estas proteínas juegan un papel central en la regulación de la muerte celular y participan en mecanismos como apoptosis, necrosis y autofagia [73]. Alteraciones en su expresión y función contribuyen a la patogénesis y progresión del cáncer, por lo que constituyen una fuente de dianas terapeúticas que, actualmente, están siendo exploradas en ensayos clínicos. Bcl-2 fue descrito como un oncogen que se activaba como resultado de la translocación cromosómica que se da en linfomas foliculares de células B humanas y que yuxtapone en el cromosoma 14 el gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas, con el gen bcl-2 proveniente del cromosoma 18 [74] [75]. Un punto clave en su descubrimiento fue que la sobreexpresión de Bcl-2 no inducía proliferación celular, como la mayoría de los oncogenes descritos anteriormente, sino que la sobreexpresión inhibía la muerte celular [76] [77]. En humanos se han descrito al menos 20 miembros de esta familia. Todos poseen entre uno y cuatro dominios de homología con la proteína Bcl-2 (BH1-BH4, Bcl-2 28 Introducción homology), que corresponden a segmentos α-hélices. Clásicamente se han divido en tres grupos de acuerdo a su estructura y función (Figura 9): Figura 9. Clasificación de proteínas de la familia de Bcl-2. La familia se compone de proteínas que contienen uno o varios domnio conservados BH. Se dividen en miembros anti-apoptóticos y proapop´tocios. Estos últimos a su vez se dividen en miembros multidominio y miembros con solo el dominio BH3. El dominio transmembrana (TM) puede estar ausente de algunos de los miembros “sólo BH3” (Adaptado de M. Giam et al. Oncogene 2009) Clase 1: miembros antiapoptóticos: poseen de tres a cuatro de los llamados dominios BH y principalmente se encuentran integradas en la membrana mitocondrial externa, aunque pueden tener una localización citosólica y de membrana nuclear y del retículo endoplásmico. A este grupo pertenecen las proteínas Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, Bcl-B/Boo/DIVA y A1/Bfl-1/Bcl-2A1. La función de estas proteínas en la apoptosis es unir e inhibir directamente a los miembros pro-apoptóticos de la familia. Los dominios BH1-BH3 forman un surco hidrofóbico, mientras que el BH4 estabiliza dicha estructura [78]. Este surco hidrofóbico puede unir la α-hélice del dominio BH3 de una proteína pro-apoptótica de la familia de Bcl-2 [79]. En condiciones basales, no todas las proteínas con un dominio BH3 pueden interaccionar con el surco hidrofóbico de los Bcl-2 antiapoptóticos. Es necesario que los 29 Introducción miembros “sólo BH3” y “tipo Bax” expongan su dominio BH3 tras una modificación pos-traduccional y/o cambio conformacional [80]. Clase 2: miembros pro-apoptóticos multidominios: en este grupo se incluyen las proteínas Bax, Bak y Bok que contienen los dominios BH1-BH3. Bax y Bak, son los responsables de la permeabilización de la membrana mitocondrial externa porque forman un poro proteolipídico en ella que permite la liberación de las proteínas residentes en el espacio intermembranoso y la consecuente inciación de la cascada apoptótica. Células que han perdido la expresión de Bax y Bak son resistentes a multitud de estimulos apoptóticos. Para que Bax y Bak induzcan la permeabilización de la membrana mitocondrial externa deben estar en ella o muy próximos a ella [81] y, además, la formación del poro implica una oligomerización de proteínas Bax o Bak [82] [83]. Bax es una proteína citoplamástica que, por lo tanto, debe translocarse a la membrana mitocondrial tras el estímulo apoptótico. El mecanismo de translocación no es bien conocido pero se sabe que implica un cambio conformacional de la proteína [84. Recientes estudios sobre Bak, determinan que moléculas inactivas de Bak residentes en la membrana mitocondrial, sufren un cambio conformacional tras el estímulo apoptótico que les permite asociarse con otras moléculas de Bak para formar el poro {Dewson, 2008 #87]. Clase 3: miembros pro-apoptóticos “sólo BH3”: estos miembros de la familia Bcl2 solamente comparten entre ellos mismos, y con los otros miembros de la familia, el dominio BH3. Unos diez miembros han sido identificados en mamíferos, entre ellos las proteínas Bad, Bid, Bim/Bod, Bik/NBK, Bmf, Hrk/DP5, Noxa y Puma/BBC3 [85] [86]. Las proteínas “sólo BH3” actúan por encima de los miembros proapoptóticos tipo Bax, ya que no son capaces de inducir apoptosis en ausencia de estos [87] y han sido descrito como sensores y mediadores de la apoptosis ya que podrían transmitir señales de 30 Introducción muerte diferentes y específicas a los miembros de la familia Bcl-2 que poseen varios domios BH. Por ejemplo, Bim es importante para la muerte de linfocitos tras la retirada de citoquinas del medio [88], Bmf y Bim son necesarios en anoikis [89] [90] y Noxa y Puma participan en la apoptosis mediada por p53 como consecuencia de un daño al ADN [91] [92]. En células de mamíferos sanas, las proteínas “sólo BH3” se encuentran inactivas [93] y, en respuesta a un estímulo apoptótico, aumenta su transcripción y/o se modifican pos-traduccionalmente, o se relocalizan para su activación. Cómo interaccionan los miembros de la familia para permitir la permeabilización de la membrana mitocondrial es un tema que provoca una gran controversia y actualmente existen dos modelos principales para explicar cómo se activan Bax y Bak: Modelo de activación indirecta: de acuerdo a este modelo, las proteínas Bax y Bak están siempre unidas a los miembros antiapoptóticos que inhiben su activación. Tras un estímulo apoptótico, las proteínas “sólo BH3” se unen a los miembros antiapoptóticos de la familia liberando a Bax y Bak [94]. Una predicción que surge de este modelo es que Bax y Bak deben estar siempre unidos a proteínas antiapoptóticas tales como Bcl-2 o Mcl-1, sin embargo experimentos de co-inmunoprecipitación de Bax y Bak demuestran que sólo una minoría de estas proteínas están unidas a las antiapoptóticas en estado basal. Nuevas aportaciones de este modelo indican que la fracción de proteínas Bax y Bak que se encuentran unidas a las proteínas antiapoptóticas, son las que están ya activadas, tal vez de forma espontánea o tal vez por otros estímulos desconocidos [95] [96]. Modelo de activación directa: según este modelo proteínas “sólo BH3”, como Bid y Bim directamente interaccionan e inducen cambios conformacionales en Bax y Bak. Estudios donde se utilizan proteínas 31 Introducción recombinantes, lípidos de membrana y la técnica de transferencia de fluorescencia FRET, indican que, efectivamente, estas interacciones se dan y que provocan la permeabilización de la membrana (Novell et al Cell 2008). Los miembros de la familia antiapoptóticos, inhibien la muerte celular porque se unen y secuestran a los miembros “sólo BH3” activadores y también uniendose a las proteínas Bax y Bak que pueden estar activadas. En este modelo los miembros “sólo BH3” son divididos en dos categorías, activadores (Bid y Bim) y sensibilizadores [97]. Los sensiblizadores no pueden unirse y activar a Bax y Bak, pero si pueden unirse a las proteínas antiapoptóticas liberando así a los activadores para que ejerzan su función sobre Bax y Bak. Una predicción que se puede sacar de este modelo es que la deleccion de los “sólo BH3” activadores debería resultar en la inhibición de la apoptosis, como ocurre cuando se elimina la expresión de Bax y Bak al mismo tiempo. Sin embargo, esto no ocurre así, y la inhibición de la expresión de Bid y Bim afecta mínimamente a la inducción de la apoptosis [94]. Esto pone de manifiesto que deben existir otras proteínas que actúen como activadores, de hecho hay datos que asignan esta función a proteínas como Puma y p53 [98] [99]. Resultados muy recientes apoyan este modelo de activación directa, ya que se ha conseguido determinar la interacción entre Bim y Bax, aunque sorprendentemente, la interacción se da en la superficie de Bax opuesta al bolsillo hidrofóbico formado por los dominios BH1, BH2 y BH3 [100]. 32 Introducción Figura 10. Modelos de activación de Bax/Bak. En el modelo de activación directa, proteínas “sólo BH3” activadores como Bim, se mantienen unidas a proteínas antiapoptóticas, hasta que esta unión es desplazada por proteínas “sólo BH3” sensibilizadores como Bad. Una vez libres, los activadores pueden unirse y activar a las proteínas efectoras como Bax. En el modelo indirecto, las proteínas efectoras activas son inhibidas por las proteínas antiapotóticas, hasta que las proteínas “sólo BH3” neutralizan a las antiapoptóticas (Adaptado de M. Giam et al. Oncogene 2009) 4.2 Ruta extrínseca o de receptores de muerte. Ruta extrínseca o de receptores de muerte se activa por la unión de diferentes ligandos a sus receptores en la membrana plasmática. A los receptores responsables de transmitir la señal de apoptosis al interior de la célula se les denomina receptores de muerte y pertenecen a la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). En humanos se han descrito seis receptores de muerte que son CD95 (Fas, APO-1), TNFR1 (p55, CD120Aa), TRAMP (APO-3, DR3, WSL-1,LARD), TRAIL-R1 (DR4), TRAILR2 (DR5, APO-2, KILLER, TRICK2) y DR6 (TR-7) [101]. Los receptores de muerte son proteínas transmembrana de tipo I, que intracelularmente, contienen un dominio de interacción con otras proteínas, denominado 33 Introducción dominio de muerte (DD) de unos 80 aminoácidos. Este dominio es fundamental para la transmisión del impulso apoptótico y sirve de anclaje a una serie de proteínas señalizadoras que también poseen un dominio de muerte (DD). Extracelularmente poseen entre dos y cuatro dominios conservados ricos en cisteínas (CRDs) por los que se unen a su ligando específico. Los ligandos de estos receptores, llamados ligandos de muerte, son proteínas transmembrana tipo II (extremo c-terminal en el espacio extracelular) y también pertenecen a la superfamilia ligandos de TNF. Se unen a sus receptores a través de una región de 150 aminoácidos en el extremo c-terminal denominada dominio de homología a TNF (THD) [102]. La mayoría de los ligandos pueden existir también en forma soluble y ser funcionales (Figura 11). Figura 11. Ligandos y receptores de la familia de TNF. En color morado se representan los dominios ricos en cisteína (CRDs) extracelulares y en verde los dominio de muerte (DD) intracelulares. 34 Introducción El inicio de la señalización a través de los receptores de muerte, requiere de la oligomerización de estos y la yuxtaposición de los dominios de muerte (DD) intracelulares. Inicialmente se pensaba que la unión del ligando en forma de trímero al dominio extracelular del receptor, provocaba la trimerización de este [103]. Sin embargo, este concepto ha cambiado ya que, mediante experimentos de cristalografía de proteínas, se ha establecido que el ligando trimerizado se une a un pre-emsamblado complejo oligomérico del receptor. La formación de estos complejos de receptores independientes de ligando ocurre a través de los dominios ricos en cisteína de la región extracelular de los receptores, denominada PLAD (preligand assembly domain) [104]. Aunque esta región no es la implicada en la unión del ligando, la delección de la misma afecta severamente a la unión de TNFα al TNFR-1, sugiriendo que el pre-ensamblaje de los receptores es un evento crucial en la unión del ligando al receptor. La formación de complejos de receptores independiente de ligando también se han descrito para los receptores de FAS y TRAIL [105] [106]. La unión del ligando provoca un cambio conformacional en el receptor que permite la unión de proteínas adaptadoras mediante los dominios DD [107]. Las proteínas adaptadoras, como por ejemplo, FADD y TRADD, no tienen actividad enzimática por sí mismas sino que sirven como puente para la unión de caspasas iniciadoras (caspasa-8 y -10), a través de los dominios DED presentes tanto en las proteínas adaptadoras como en las caspasas. Todo el conjunto de estas proteínas forman el complejo señalizador de muerte (DISC, Death-Inducing Signalling Complex) descrito por primera vez para el receptor de Fas [108], que sirve como plataforma de activación de las caspasas iniciadoras -8 y -10, lo que a su vez induce la activación de caspasas efectoras (-3, -6y 7) y el consecuente inicio de la apoptosis. Al DISC también pueden unirse proteínas inhibidoras de la activación de las caspasas, como 35 Introducción por ejemplo cFLIP, que inhibe la activación de la caspasa-8 y al que nos referiremos más en detalle en el apartado 6 de la Introducción. La ruta extrínseca de apoptosis (principalmente la mediada por los receptores de muerte Fas y TRAIL-R) está conectada con la intrínseca a través de la proteína de la familia de Bcl-2, Bid. Tras la activación de la caspasa-8 en el DISC, ésta puede procesar a Bid dando lugar su forma truncada, tBid, que es capaz de translocarse a la membrana mitocondrial externa y junto con Bax y Bak inducir la liberación de citocromo C al citosol y la consecuente activación de caspasa-9 en el apoptosoma, lo que provocaría más activación de caspasas efectoras (-3,-6 y -7) (Figura 9). Que tras la activación de la ruta extrínseca de apoptosis se active la ruta intrínseca depende del tipo celular y se ha determinado que las células se clasifiquen en células Tipo I, en las que la activación de caspasa-8 en el DISC es suficiente para activar directamente a las caspasas efectoras, o células Tipo II, en las que o la activación inicial de la caspasa-8 en el DISC no es suficiente para activar a las caspasas efectoras y requiere de la vía mitocondrial para ello, o bien los niveles de IAPs en estas células son tan altos que no permiten la activación de las caspasas efectoras tras la activación de la caspasa-8 en el DISC y requieren de los factores mitocondriales necesarios para inhibir la función de los IAPs (Smac/Diablo). 4.2.1 Señalización a través de TNFR-1/TNF-α. El sistema TNF/receptor de TNF consta de dos receptores, TNFR-1 y TNFR-2 y tres ligandos, TNF-α unido a membrana, TNF-α soluble y TNF-β (soluble). Sólo el TNFR-1 es considerado como receptor de muerte puesto que el TNFR-2 carece del dominio de muerte intracelular y, además, estudios en ratones deficientes para TNFR-1 indican que este receptor es esencial para la apoptosis inducida por TNF en células infectadas [109] [110]. 36 Introducción Figura 12. Señalización mediada por TNFR-1.Modelo de señalización y formación de complejos de señalización mediados por TNF-R1. Para detalles ver el texto (Adaptado de Maria Eugenia Guicciardi et al , The Faseb Journal, 2009) El factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) juega un papel fundamental en inflamación e inmunidad, tanto como en proliferación y diferenciación de diferentes tipos celulares [111]. Tanto el soluble, como el unido a membrana, son biológicamente activos y son producidos principalmente por macrófagos, monocitos y células T en respuesta a infección y condiciones inflamatorias. La unión de TNF-α a TNFR-1 permite la formación de dos complejos, uno inicial (complejo I) que regula la expresión de proteínas antiapoptóticas y que, por tanto, previene la muerte celular y un segundo complejo (Complejo II) que dispara la muerte celular [112]. El Complejo I está formado por el ligando, el receptor, TRADD, RIP, TRAF-2 y c-IAP1/2, aunque la presencia de la proteína adaptadora TRADD en este complejo es 37 Introducción objeto de controversia [112] [113]. La formación del complejo I requiere de la translocación del TNFR-1 a regiones de la membrana plasmática ricas en colesterol y esfingolípidos (lipid-rafts). Aquí, varias de las proteínas del complejo pueden sufrir modificaciones pos-traduccionales, por ejemplo, RIP es poliubiquitinado por cIAP1/2, requisito necesario para la activación de NF-kB [114] [115]. De la formación del complejo I pueden derivar dos vías de señalización diferentes. Una de ellas promueve supervivencia celular y está mediada por la unión de la proteína quinasa TAK1 a RIP ubiquitinado que resulta en la activación de la quinasa y la consecuente fosforilación y degradación del inhibidor de NF-kB, IkBα a través del complejo de IKK. Tras la degradación proteasomal de su inhibidor, NF-kB puede translocarse al núcleo dando lugar a la transcripción de proteínas implicadas en la supervivencia celular como TRAF1, TRAF2, cIAP-1, cIAP-2 y cFLIP entre otros. La otra vía de señalización promovida por el complejo I permite la activación de la proteína quinasa JNK que puede dar lugar a apoptosis, por ejemplo, a través de la fosforilación y activación de la proteína E3 ubiquitin ligasa Itch, la cual promueve la degradación proteasomal de cFLIP, aumentando la activación de caspasa-8 [116]. El complejo I es rápidamente internalizado por endocitosis y se ha sugerido, que durante este proceso el receptor se disocia del resto de proteínas y así el DD de RIP puede interaccionar con el DD de FADD, lo que conlleva el reclutamiento y activación de la caspasa-8. Este complejo II (receptosoma) estaría formado, por tanto, por TRADD, TRAF2, RIP, FADD y caspasas-8/-10 [112]. Sin embargo, la composición del complejo II ha sido cuestionada tras la descripción de vesículas endocíticas que contienen el receptor TNFR-1 [113]. Independientemente de su composición, lo que se puede asegurar es que el complejo II es espacial y temporalmente diferente al complejo I. 38 Introducción Además de por la inhibición de la actividad transcripcional de NF-kB, (inhibiendo la síntesis de proteínas con cicloheximida, por ejemplo), la señalización apoptótica de TNF puede ser facilitada por el uso de moléculas miméticas de Smac, que inhiben XIAP, cIAP-1 y cIAP-2. Aunque tanto la cicloheximida como los miméticos de Smac inducen la activación de caspasa-8, los mecanismos implicados parecen ser diferentes. Así, la cicloheximida inhibie la síntesis de cFLIP inducida por NF-kB, permitiendo la activación de caspasa-8 en el complejo II, sin embargo los miméticos de Smac se unen a cIAP-1 y cIAP-2 promoviendo su actividad E3 ubiquitin ligasa, lo que les hace autoubiquitinarse y degradarse por el proteasoma. Esto permite la deubiquitinación de RIP y su liberación del complejo I, lo que permite su asociación con FADD y el reclutamiento y activación de la caspasa-8 [46]. Así el estado de ubiquitinación de RIP determinaría la señalización hacia supervivencia o muerte [117] (O´Donnell MA, Curr. Biol 2007) [118]. 4.2.2 Señalización a través de Fas/FasL. El receptor Fas se expresa en la mayoría de los tejidos humanos (esto es real?, en tesis de Menchu se dice otra cosa), pero es particularmente abundante en hígado, corazón, riñón, páncreas, cerebro, timo, tejido linfoide además de en linfocitos T maduros activados. Se puede encontrar unido a la membrana plasmática o en forma soluble por la pérdida del dominio transmembrana por splicing alternativo del ARN mensajero [119]. El ligando de Fas (FasL) se expresa principalmente como estructuras homotriméricas en la membrana de las células T activadas (mFasL), aunque de esta puede derivarse una forma soluble (sFasL) cuya actividad biológica genera controversia [120]. La unión de FasL a complejos preasociados del receptor, induce la formación de agregados (resistentes a SDS y 39 Introducción mercaptoetanol) donde se produce la palmitoilación del receptor [121] [122]. Esta es la señal para la localización de los agregados en lipid- rafts. Posteriormente, los agregados se organizan en otros de mayor peso molecular, que son microscópicamente detectables a los que se les denomina SPOTS (signalling protein oligomerization structures) y donde se recluta a FADD. La interacción entre FADD y el receptor es requisito imprescindible para la formación de los SPOTS [123 {Siegel, 2004 #130]. La función de los SPOTS es reclutar suficientes niveles de caspasa-8 para obtener una completa activación enzimática. Tras la unión de la caspasa-8 se forman unos mayores agregados en grandes plataformas de lipid-rafts, que inducen la internalización del receptor por endocitosis dependiente de clatrina. En los compartimentos endosomales es donde se da una mayor formación del DISC y activación de caspasa-8 [124]. Recientemente se ha descrito la formación de un segundo complejo (complejo II) citosólico que estaría compuesto por FADD, caspasa-8 y cFLIP cuya función sería aumentar la activación de la caspasa-8 y cuya formación no dependería de la internalización del receptor [125]. Tras la activación de la caspasa-8 en el DISC se induciría la activación de caspasas efectoras y, dependiendo del tipo celular, la activación de la ruta mitocondrial de apoptosis a través del corte de Bid por la caspasa-8, activándose así toda la maquinaria apoptótica. En muchos tipos celulares Fas no solo no es citotóxico, sino que induce proliferación, migración y producción de citoquinas [126] [127]. Ejemplos de estas funciones no apoptóticas pueden ser: la señalización de ERK inducida por Fas es esencial en regeneración de las neuronas [128]; Fas puede inducir la regeneración del hígado tras un daño o tras una hepactetomía parcial [129, 130]; Fas aumenta la proliferación de células T y timocitos a través de una vía dependiente de FADD y caspasa-8 [131 40 Introducción {Newton, 1998 #140]; Fas facilita la invasión de células de glioblstoma resistentes a la apoptosis in vivo por activar la via PI3K-AKT [132]. Figura13. Señalización mediada por Fas/FasL. Modelo de la vías apoptótica y no apoptótica de Fas/FasL. Para detalles ver el texto. Adaptado de Maria Eugenia Guicciardi et al. The Faseb Journal, 2009) La compartimentalización del DISC de Fas es critica para determinar la señalización que se inducirá tras la estimulación ya que si la internalización del receptor es alterada o la formación del DISC se reduce, los agregados del receptor señalizan hacia rutas de supervivencia como NFkB y ERK [124]. Recientemente se ha descrito en el receptor de Fas un conservado motivo extracelular de unión a glicoesfingolípidos (GMB, glicosphingolipidsbinding motif) que determina la ruta de internalización. Mutaciones de pérdida de función en este motivo provocan una formación del DISC 41 Introducción defectuosa y causa una endocitosis independiente de clatrina, lo que potencia las funciones no apoptóticas de FAS [133] 5. Señalización mediada por TRAIL. 5.1 TRAIL y sus receptores. TRAIL es una proteína transmembrana tipo II que pertenece a la familia de citoquinas del factor de necrosis tumoral (TNF). Se identificó por homología con el dominio c-terminal de FasL (CD95L) [134]. Aunque se sintetiza como proteína transmembrana puede ser cortado de la superficie celular mediante proteolisis y liberarse al medio extracelular en una forma soluble que mantiene su actividad. Las proteínas encargadas de esta proteolisis pertenecen a la familia de las cistein-proteasas [135]. TRAIL es activo biológicamente como un homotrímero con el residuo de cisteína 230 unido a un átomo de zinc esencial para su actividad [136] [137]. El ARN mensajero de TRAIL está presente en la mayoría de los tejidos pero se expresa principalmente en células del sistema inmune [135], donde juega un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis de las células T y en la muerte mediada por células Natural Killer (NK) y células T Natural Killer (TNK) de células tumorales o transformadas por infección viral [138, 139] [140]. Existen grandes esperanzas en el uso de TRAIL como agente contra el cáncer, ya que se ha visto que es capaz de inducir apoptosis selectivamente en células tumorales y no en células normales, aunque las razones en esta diferencia de sensibilidad aún no están bien esclarecidas [134] [141]. Además, a diferencia de TNF-α y FasL, la administración sistémica de TRAIL es capaz de inducir apoptosis en células tumorales sin ninguna toxicidad en órganos o tejidos normales [142] [143]. Aunque se ha descrito cierta toxicidad en hepatocitos in vitro, ésta depende de la preparación de TRAIL recombinante utilizada [144]. 42 Introducción TRAIL puede unirse específicamente a cuatro receptores transmembrana (TRAIL-R1 a –R4) y, con menor afinidad, a un receptor soluble denominado osteoprotegerina (OPG), aunque en condiciones fisiológicas esta unión no parece darse [145] [146] (Figura 14). Figura 14. Receptores de ApoL2/TRAIL. Los receptores DR4 y DR5 corresponden a TRAIL-R1 y TRAIL-R2 respectivamente. Los receptores señuelo o Decoy, DcR1 y DcR2 corresponden a TRAIL-R· y TRAIL-R4 respectivamente. La osteoprotegerina (OPG) es un receptore soluble capzar de unir Apo2/TRAIL, aunque el significado biológico de la unión no es conocido. Adpatado de Almasan and Ashkenazi, Citokine and Growth Factor Review, 2003. Los receptores transmembrana de TRAIL son proteínas tipo I que pertenecen a la familia de receptores de TNF y, al igual que TRAIL, se expresan constitutivamente en la mayoría de tejidos y tipos celulares humanos. Dos de estos receptores, TRAIL-R1 (DR4) [147] y TRAIL-R2 (DR5) [148] [149] poseen en su región intracelular el dominio de muerte (DD) necesario para la señalización apoptótica y es por eso que se les denomina receptores pro-apoptóticos de TRAIL. Por otro lado, TRAIL-R3 (DcR1) [150] [151] y TRAIL-R4 (DcR2) [152] son incapaces de señalizar para apoptosis porque o bien carecen del dominio citoplasmático y transmembrana como ocurre con TRAIL-R3, o poseen un DD truncado, como es el caso de TRAILR4, por lo que no es capaz de ensamblar la maquinaria de activación de la 43 Introducción apoptosis. Por eso a estos receptores se les denomina receptores antiapoptóticos o señuelo, ya que además de no trasmitir las señales apoptóticas, compiten con los receptores pro-apoptóticos por la unión a TRAIL. 5.2 Señalización apoptótica mediada por TRAIL. La unión de TRAIL a sus receptores pro-apoptóticos TRAIL-R1 y TRAIL-R2 inicia una señalización apoptótica muy similar a la inducida tras la activación de Fas. Sin embargo, parece que TRAIL-R2 juega un papel más importante que TRAIL-R1 en la activación de la apoptosis cuando ambos receptores están expresados en la misma célula [153]. A diferencia de lo que ocurre con Fas, los receptores de TRAIL no tienen que ser internalizados tras la unión del ligando para que se forme el DISC y que se transmita la señalización apoptótica. Tras la unión de ligando y receptor, se reclutan las proteínas FADD y caspasa-8/-10, dando lugar a la formación del DISC de TRAIL y su localización en lipid-rafts, donde se activará la caspasa-8. La caspasa-8 activa puede activar, a su vez, directamente a las caspasas efectoras (-3,-7) o cortar a Bid para activar la ruta mitocondrial de apoptosis. Bid cortado (tBid) se transloca a la mitocondria y junto con Bax y/o Bak induce la permeabilización de la membrana mitocondrial externa. Esto permite la liberación desde la mitocndria de citocromo C y Smac/Diablo, entre otras proteínas. En el citosol, el citocromo C formará el apoptosoma junto con Apaf-1 y caspasa-9 que inducirá la activación de ésta. La caspasa-9 activa puede activar, a su vez, a las caspasas efectoras. Smac/Diablo actúa como ya se describió anteriormente uniendose a los IAPs y provocando su autoubiquitinación y degradación por el proteasoma, permitiendo así la activación de las caspasas. 44 Introducción Figura 15. Señalización apoptótica y de supervivencia mediada por TRAIL.. Adaptado de Kruyt, Cancer Letters, 2008 Al igual que ocurre con la señalización mediada por Fas, parece que tras la formación del DISC de TRAIL, se produce el ensamblaje de un segundo complejo intracelular del que se disocian el ligando y el recptor, manteniendose FADD y caspasa-8 y al que se le unen moléculas como RIP, TRAF-2, IKKγ y TRADD y que conduce a la activación de NF-kB y a vías de las MAPK como JNK y p38 [154]. Aunque TRAIL induce apoptosis en células tumorales y no en células normales, existen muchos tumores que son resistentes a TRAIL. La resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL puede darse a diferentes niveles dentro de su vía de señalización: 45 Introducción Resistencia a nivel de los receptores de muerte en membrana: disfunciones en los receptores proapoptóticos así como sobrexpresión de los antiapoptóticos pueden producir resistencia a TRAIL. La modificación pos-traduccional de los receptores de TRAIL mediante O-glicosilación permite una mayor asociación de receptores tras la estimulación con TRAIL que aumenta la activación de caspasa-8. Parece ser que la expresión de las enzimas oglicosiltransferasas, responsables de la o-glicosiliación, se correlaciona con la sensibilidad a TRAIL en las células tumorales, por lo que puede representar un marcador a tener en cuenta para el uso terapéutico de TRAIL el tratamiento del cáncer [155]. Resistencia a nivel del DISC: la mayoría de los componentes del DISC son esenciales para la apoptosis inducida por TRAIL, y por ello una disfunción en cualquiera de estos, especialmente FADD, Caspasa-8 y FLIP puede permitir el desarrollo de resistencias a TRAIL. Además, recientemente se ha descrito que la ubiquitinación de la caspasa-8 en el DISC es necesaria para una completa activación enzimática. Esta ubiquitinación está mediada por la proteína E3 ubiquitin ligasa Cul-3 y es inducida por TRAIL [57]. Resistencia a nivel de las proteínas de la familia de Bcl-2: la sobrexpresión de Bcl-Xl o Bcl-2 puede proteger de la apoptosis mediada por TRAIL en algunos tipos celulares, por ejemplo, en líneas celulares de cáncer pancreático, la expresión de Bcl-xL correlaciona altamente con la sensibilidad a TRAIL. Asimismo, la inactivación por mutación de Bax o Bak puede sensibilizar a células resistentes a TRAIL o a drogas genotóxica [156]. Resistencia a nivel de los IAPs y Smac/Diablo: en las células de tipo II, dependientes de la ruta mitocondrial, la regulación de los IAPs y de Smac/Diablo es el principal determinante de la sensibilidad a TRAIL. Líneas celulares tumorales resistentes a TRAIL en comparación con líneas sensibles muestran una reducida liberación de citocromo C al citosol, sin embargo la 46 Introducción sobreexpresión de Smac/Diablo por transfección es capaz de restituir la sensibilidad en estas células [156]. 5.3 Señalización no apoptótica mediada por TRAIL. Además de inducir apoptosis, se ha descrito que TRAIL puede promover la activación de rutas de supervivencia, como NF-kB, y MAPK. Así parece que TRAIL-R1, -R2, y –R4 son capaces de activar la ruta de NF-kB a través de una vía dependiente de TRAF-2-NIK-IKK. TRAIL-R1 también puede activar JNK a través de un complejo formado por TRAF2-MEKK1MEKK2 [157]. Además, TRAIL puede señalizar para la activación de ERK [158] [159], lo que induce resistencia a la apoptosis por suprimir la activación de caspasa-8 y el corte de Bid en ciertos tipos celulares [160] [161]. La activación de rutas de supervivencia mediada por TRAIL tiene especial importancia en su uso como agente antitumoral. Así la activación de NF-kB por TRAIL puede derivar en proliferación [162], metástasis e invasión [163]. TRAIL, además de inducir la supervivencia celular a través de la activación de rutas de supervivencia, la puede promover a través de la inducción de autofagia. La inducción de autofagia mediada por TRAIL en células epiteliales normales de mama MCF-10A fue descrito por primera vez por [164]. Más recientemente, se ha descrito la ruta de activación de autofagia mediada por TRAIL en estas células, donde a partir de la formación del DISC de TRAIL, se activa la proteína AMPK, a través de la activación de la proteína quinasa TAK-1, y que deriva en la inhibición de mTOR, señal inductora de autofagia [165]. 5.4 TRAIL y cáncer. Una de las características más atractivas de la activación de la apoptosis como terapia antitumoral es su potencial para inducir regresión de los tumores [4]. Los tratamientos tradicionales contra el cáncer como la 47 Introducción quimioterapia o radioterapia inducen apoptosis solamente como un efecto secundario a todos los daños que causan en la célula. Además, estos tratamientos, afectan a la mayoría de las células en proliferación independientemente de que sean tumorales o no, y no siempre son capaces de erradicar las células tumorales, debido en gran parte a la capacidad adquirida de las células tumorales de bloquear los mecanismos apoptóticos [166]. Por ejemplo, la proteína supresora de tumores p53 se encuentra mutada en el 50% de los tumores, lo que provoca la inactivación de ruta mitocondrial de apoptosis inducida por algún daño al ADN, que es en lo que se basan los tratamientos antitumorales convencionales [167] [168]. El desarrollo de estrategias que activen la vía extrínseca de apoptosis a través de los receptores proapoptoticos se presenta como una alternativa muy atractiva en la terapia antitumoral, por varias razones: los receptores pro-apoptoticos se encuentran expresados en la mayoria de los tumores, oncogenes como MYC o Ras parecen incrementar la sensibilidad a la via extrinseca de apoptosis por facilitar la interacción con la vía intrínseca [169] [170]. Además, los receptores proapoptóticos pueden activar a las caspasas independientemente de p53. La estimulación de los receptores de TRAIL con anticuerpos agonistas o TRAIL recombínante humano, parecen ser los más óptimos para este propósito, ya que al contrario que TNFR-1 [171] [172] y Fas [173] que causan citotoxicidad especialmente en hepatocitos en modelos animales, pueden inducir apoptosis en células tumorales sin afectar a las células normales [142] [174] [175] [144]. Se han diseñado diferentes formas de TRAIL humano recombinante, de los cuales el primero y el único que se ha utilizado en ensayos clínicos ha sido el denominado Apo2L/TRAIL (AMG-951) [176]. De los anticuerpos agonistas de los receptores de TRAIL que se han utilizado para ensayos clínicos destacan Mapatumumab (Anti-TRAIL-R1, Human Genome Sciences-HGS), 48 Introducción Lexatumumab (Antri-TRAIL-R2, HGS), AMG-655 (Anti-TRAIL-R2, Amgen) y Apomab (Anti-TRAIL-R2, Genentech). El uso de anticuerpos agonistas puede presentar, en principio, algunas ventajas sobre el uso del TRAIL recombínante como, por ejemplo, que tienen una vida media más larga, de 14 a 21 dias frente a los 30-60 minutos del recombinante y que no pueden ser inhibidos por receptores señuelo al ir dirigidos específicamente contra TRAIL-R1 o TRAIL-R2 [143]. Debido a la existencia de tumores resistentes a TRAIL, también se ha ensayado el uso de TRAIL recombínante y anticuerpos agonistas de los receptores pro-apoptóticos de TRAIL en combinación con otros agentes antitumorales. Así podemos destacar: TRAIL y quimioterapia quimioterapeúticas que o radioterapia: incluyen varias antraciclinas clases e de drogas inhibidores de topoisomerasas y radiaciones ionizantes sensibilizan a las células tumorales a la apoptosis inducida por TRAIL [177] [178] [179] (Shamimi-Noori S Cancer Gene Therapy 2008) [180] [181]. Además, algunos tratamientos de TRAIL y drogas quimioterapeúticas están en fases tempranas de ensayos clínicos, por ejemplo, Lexatumumab en combinación con 5-flourouracil o doxorrubicina entre otros, está en fase clínica 1b [182]. TRAIL e inhibidores de proteasoma: los inhibidores del proteasoma inducen apoptosis pos sí mismos en células tumorales, pero también se ha descrito que pueden sensiblizar a la apoptosis inducida por TRAIL [183] [184]. Recientes estudios in vivo indican una reducción en la metástasis de cáncer de mama y renal en ratones tratados con Bortezomib y anti-TRAIL-R2 en comparación a los tratados sólo con anti-TRAIL-R2 [185]. Además, el uso combinado de Bortezomib y Mapatumumb en pacientes de mieloma múltiple está actualmente en Phase II de ensayos clínicos. TABLA. TRAIL e inhibidores de histonas deacetilasas: los inhibidores de histonas deacetilasas incluyen una serie de compuestos que inducen parada del ciclo 49 Introducción celular, diferenciación y apoptosis en células tumorales y además pueden sensibilizar a la apoptosis inducida por TRAIL [186] [187]. Recientes estudios in vivo han mostrado que la combinación de un anticuerpo monoclonal contra el receptor de TRAIL en ratones y el inhibidor de histonas deacetilasas Vorinostat, induce regresión de un tumor de mama en ausencia de toxicidad sistémica en el ratón [188]. TRAIL y miméticos de Smac: los miméticos de Smac tienen como diana a los inhibidores de caspasas XIAP, c-IAP1 y c-IAP2 y han mostrado tener una potente actividad antitumoral tanto in vitro como in vivo [189]. Tratamientos que combinan TRAIL con miméticos de Smac provocan la erradicación de tumores pancreáticos en ratón [190]. Además, tanto Mapatumumab como Lexatumumab sinergizan con miméticos de Smac para inducir apoptosis en células de cancer de ovarios in vitro [191]. TRAIL e inhibidores de PI3K/AKT: dada la importancia de la ruta en la proliferación celular, su inhibición ha sido foco de estudio en la terapia antitumoral. Así, se ha descrito que inhibidores de los receptores tirosinquinasa como gefitinib o inhibidores específicos de la ruta de mTOR (una de las principales dianas de la ruta de PI3K/AKT) como rapamicina, sensibilizan a la apoptosis inducida por TRAIL [192] [193] [194]. Aunque por ahora no existen datos clínicos, el diseño y desarrollo de inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR constituye un campo de investigación muy atractivo en terapia antitumoral [195]. TRAIL e inhibidores de NF-kB: se ha descrito que la inhibición de NF-kB a través del uso de de inhibidores de la quinasa IkB como AS602868 y BMS3455541, sensibiliza a la apoptosis inducida por TRAIL [196, 197] [198] por lo que podría convertirse en otra estrategia para el tratamiento del cáncer, aunque aún se requieren más estudios. 50 Introducción 6. FLIP. Como se ha comentado anteriormente, la apoptosis es un proceso fundamental en el mantenimiento de la homeostasis en organismos multicelulares. Debido a que, en principio, todas las células poseen la maquinaria necesaria para la ejecución de la apoptosis, deben existir mecanismos que prevengan la inducción accidental de esta. Por ello, las células poseen una amplia variedad de proteínas antiapoptóticas como, por ejemplo, las pertenecientes a la familia de Bcl-2 y los IAPs. Además, la apoptosis inducida por receptores de muerte está inhibida por la proteína antiapoptótica cFLIP (FLICE- inhibitory protein) [199] Diversos estudios sugieren que alteraciones en la expresión de cFLIP pueden estar relacionadas con cáncer, alteraciones autoinmunes y enfermedes cardiovasculares [200] [201] [202]. 6.1 Estructura molecular de FLIP. FLIP se identificó originalmente como producto de un gen viral durante la búsqueda de proteínas con dominios DED que pudiesen interactuar con las caspasas. FLIP viral (vFLIPS) fue caracterizado en γherpesvirus y moluscipoxvirus [203] [204] [205]. Las proteínas virales de FLIP contienen dos DED y pertenecen a la familia de proteínas con DED que incluye a FADD, caspasa-8, caspasa-10 y PEA-15 (phosphoprotein enriched in astrocytes 15kDa). Su extremo c-terminal puede variar en longitud y secuencia. Posteriormente la proteína homóloga en mamiferos fue caracterizada y nombrada cFLIP [206] aunque también es conocida como CFLAR, CASH, CLARP, Casper, FLAME1, I-FLICE, MRIT o Usurpina [207] [204] [208] [209] [210] [211]. Aunque se han identificado hasta 13 isoformas diferentes de ARNm generadas por splicing alternativo [212], sólo se han detectado tres a 51 Introducción nivel de proteína, que son cFLIPL de 55 kDa, cFLIPS de 26 kDa y la isoforma aislada de la línea celular Raji, cFLIPR de 24 kDa [213]. cFLIPL tiene una estructura similar a la caspasa-8 con dos DED en el extremo amino-terminal y un dominio de actividad proteasa en le extermo cterminal, aunque pierde el residuo de cisteína esencial para la actividad catalítica del motivo Q-A-C-X-G (ya que presenta Q-N-Y-V-V) y el de histidina del motivo H-G, ambos presente en todas las caspasas [214]. Interesantemente, el gen de cFLIP se localiza en el cromosoma 2 en la región q33-q34, donde también se localizan los genes de la caspasa-8 y -10 por lo que es posible que cFLIP provenga de un fenómeno de duplicación del gen de la caspasa-8 [215]. c-FLIPS sólo contiene los DED y es similar en estructura a los vFLIPS, a excepción de que cFLIPS contiene una cola de unos veinte aminoácidos tras los DED que son cruciales para su ubiquitinación y degradación por el proteasoma (K192 y K195). Estos aminoácidos no están presentes en cFLIPL, lo que sugiere la existencia de diferentes mecanismos regulatorios [216] . cFLIPR fue clonado inicialmente por Djerbi et al (2001) y se ha demostrado su expresión en varias líneas celulares linfocitarias y en células T primarias [213]. En estructura, cFLIPR es similar a cFLIPS con dos DED aunque pierde la cola adicional c-terminal. Ambos tienen una vida media corta, se reclutan de forma similar al DISC de los receptores de muerte con actividad antiapoptótica comparable, se expresan de forma similar durante la activación de las células T primarias y ambos se inducen fuertemente durante la coestimulación de las célula T con CD3/CD28 [213]. La expresión de cFLIPS y cFLIPR depende del tipo celular pudiendose expresar sólo una de las dos isoformas o ambas al mismo tiempo. Recientemente se ha descrito que la expresión de uno u otro viene determinada por el polimorfismo de un 52 Introducción sólo nucleótido en el sitio 3´ de la región del splicing del intrón 6. La presencia de una alanina en lugar de una guanina determina la expresión preferente de cFLIPR. Además podría ser que la expresión de cFLIPR esté asociada con el desarrollo de linfomas [217]. Figura 16 . Estructura molecular de vFLIP y cFLIP. Adaptado de Ralph C. Budd et al. Nat. Rev. 2006. 6.2 Regulación de la expresión de cFLIP . 6.2.1 Regulación de la sínteis de cFLIP. cFLIP se expresa constitutivamente en diferentes tipos de células normales como miocitos cardíacos [218], células endoteliales [219], queranocitos [220, células β pancreáticas {Maedler, 2002 #238], células dendríticas [221], células madre hematopoyéticas CD34+ [222] (kim et al 2002) y espermatocitos [223]. Además, se ha encontrado una elevada expresión de cFLIP en células tumorales que, a menudo, suelen ser resistentes a la apoptosis inducida por receptores de muerte. Entre estas se incluyen células de carcinoma colorectal [224] [225] [226] [227], carcinoma 53 Introducción gástrico [228] [229] [230], carcinoma pancreático [231] [232], linfoma de Hodgkin [233] [234], leucemias [235], melanoma [206] [236], carcinoma de ovario [237] [238] [239] y carcinoma de próstata [240]. Se ha descrito que la expresión de cFLIP puede estar regulada por diferentes vías de señalización que parecen depender del tipo celular. Así, la vía de señalización de MAPKs/ERK aumenta los niveles de cFLIP, a través de CREB, en células T [241]. En células de la microglía tratadas con TGF-β, también se observa un aumento de cFLIP que se puede suprimir por la inhibición de la ruta de las MAPKs/ERK [242]. En hepatocitos estimulados con acido biliares y en células de musculatura lisa vascular estimuladas con Notch3 también aumenta la expresión de cFLIP a través de la ruta de MAPKs/ERK [243] [244]. La ruta de señalización de PI3K/AKT parece estar implicada en el mantenimiento de los niveles de expresión de cFLIP en células tumorales, ya que la inhibición de la ruta provoca una bajada en los niveles de cFLIP [245] [229]. El factor de transcripción Foxo3A estaría implicado en dicha regulación. La fosforilación de AKT por PI3K, provocaría, a su vez, la fosforilación de FoxoA y su localización citoplasmática, impidiendo su función represora de la trascripción de cFLIP en el núcleo [246]. Factores de crecimiento como IGF-1 y VEGF (Vascular Endotelial Growth Factor), al igual que la activación de Notch-1, incrementan los niveles de cFLIP a través de AKT [247] [248] [249]. En la señalización mediada por receptores de andrógenos el aumento en los niveles de expresión de cFLIP se ha asociado a la ruta PI3K/AKT y al factor de transcripción Foxo3A [250] [251] [252] [253]. La expresión de cFLIP también puede aumentar por la activación de NF-kB por tratamientos como TNF, IL-1, LPS y tras la activación de células T con anticuerpos específicos CD3 y CD28, o con ésteres de forbol o ionomicia [254] [255]. 54 Introducción La proteína quinasa C-δ (PKC-δ) puede inducir el aumento de expresión de cFLIP células de cancer de colon, en un mecanismo que también implica a NF-kB [256]. Otros factores de transcripción como los pertenecientes a la famalia de los NFAT (nuclear factor of activated T cells) también pueden aumentar los niveles de ARNm de cFLIP. De hecho se ha demostrado la unión de NFATc2 al promotor de cFLIP [257] [258]. En queranocitos, p63, un factor de trascripción miembro de la familia de p53, regula los niveles de expresión de cFLIP aumentando su transcripción [259]. De igual forma ocurre con p53 en células DLD-1 [260]. Pero la expresión de cFLIP también pude estar regulada negativamente a nivel trascripcional. Así, el factor de transcripción cMYC, disminuye los niveles de cFLIP mediante represión directa del promotor [261] y cFos/cJun reprimen la expresión de cFLIP tras activación de cFos por el tratamiento de celulas de próstata de cáncer con el inhibidor del proteasoma MG132 [262]. La estabilidad del ARNm de cFLIP puede estar regulada por diferentes proteínas, así la inhibición de la señalización del IFN regulatory factor 8 (IFR8) aumenta la estabilidad del ARNm de cFLIP en células STS (Soft Tissue Sarcoma) [263], E2F1 disminuye los niveles de ARNm de FLIPS específicamente en células de adenocarcinoma de pulmón [264] y la inhibición de mTOR por rapamicina disminuye la expresión de cFLIPS por inhibir su traducción a proteína [193]. 6.2.2 Regulación de la degradación de cFLIP. Aunque la importancia de la regulación de la expresión de proteínas implicadas en apoptosis se ha demostrado en numerosos estudios, las modificaciones pos-traduccionales como la fosforilación y la ubiquitinación han emergido como importantes reguladores de la transducción de señales 55 Introducción apoptóticas. En este sentido se ha demostrado que cFLIP puede ser fosforilado y ubiquitinado para inducir su degradación por el proteasoma, principalmente. Así se ha descrito que la proteina quinasa C es capaz de fosforiliar a cFLIP y esta fosforilación es la encargada de señalizar para la ubiquitinación y degradación de cFLIPS por el proteasoma [216] [265]. ATM quinasa es otra proteína quinasa que induce la degradación de cFLIP en células linfoides, aunque el mecanismo no es conocido [266]. La inhibición de otra proteína quinasa como es la Casein-quinasa 2, induce un aumento en la degradación de cFLIP que determina la sensiblidad de células de carcinoma endometrial a la apoptosis inducida por receptores de muerte [267]. La degradación proteasomal de cFLIP, además, puede ser inducida bajo diferentes condiciones como, por ejemplo, tras la generación de especies reactivas de oxigeno [268], por la activación de p53 tras el tratamiento con agentes quimioterapeúticos [269] [270] [271], por infección viral [272] o incluso durante las diferentes fases del ciclo celular [273]. La degradación proteasomal de las proteinas es el principal mecanismo citosólico de recambio de proteínas. En este proceso participan una serie de enzimas conjugadoras de ubiqutina denominadas E1, E2 y E3 que, en última instancia, marcarán con ubiqutina la proteina a degradar. La degración de las proteínas via el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS-ubiqutin proteasoma system) tiene vital importancia en procesos celulares como por ejemplo la regulación del ciclo celular, la inflamación, el control de calidad de proteínas y la apoptosis (Figura 17). Dado que cFLIP es una proteína reguladora de la apoptosis inducida por receptores de muerte, recientemente están emergiendo estudios sobre las proteínas E3-ubiquitin ligasas que tiene a cFLIP como proteína diana. La primera en describirse fue la E3-ubiquitin ligasa ITCH, que es capaz de ubiquitinar a cFLIPL en hepatocitos tratados con TNF [116]. ITCH también puede promover la 56 Introducción Figura 17. Sistema de degradación de proteínas mediado por el proteasoma (UPS). Las enzimas conjugadoras de ubiquitina E1, E2 y E3, transfieren moléculas de ubiquitina al sustrato, que ubiquitinado es reconocido por el proteasoma para su degradación. degradación, tanto cFLIPL como de cFLIPS, en células de cáncer de ovario tratadas con cisplatino, en un mecanismo que implica a la proteína p53 [274] y que parece estar regulado por AKT [275]. El estado de activación de AKT, determinado por PTEN, también parece estar implicado en la ubiquitinación de cFLIPS por la E3-ubiquitin ligasa AIP4 (Atrophin-interacting protein 4) en células de glioblastoma. Otra E3-ubiquitin ligasa específicia de cFLIPS es cCbl. La interacción entre ambas proteínas se produce tras la fosforilación de cFLIPS por un mecanismo activado por TNF en macrófagos y que incluye a las proteínas SK1, p38 y c-Abl [276]. La E3-ubiquitin ligasa Mind-Bom es capaz de unirse tanto a cFLIPL como a cFLIPS aunque esta interacción no parece que induzca su degradación, pero si afecta a su actividad antiapoptótica ya que impide que se una caspasa-8 [277]. Otra proteína con actividad E3-ubiquitin ligasa capaz de asociarse a cFLIP es TRAF2, aunque no se ha demostrado que induzca su degradación proteasomal [278]. 6.3 Funciones de cFLIP. 6.3.1 Inhibición de la apoptosis inducida por receptores de muerte. El papel que cFLIP juega como inhibidor de la apoptosis inducida por receptores de muerte está bien documentado y todas las isoformas descritas de FLIP (vFLIP, FLPL, FLIPS, FLIPR) protegen de la apoptosis inducida por diferentes receptores de muerte, incluyendo CD95, TRAIL-R1, TRAIL-R2 y 57 Introducción TNFR-1 [207] [206] [204] [211] [209]. El mecanismo de inhibición es el siguiente: tras la unión del ligando de muerte a su receptor se induce la formación del DISC, como se ha comentado anteriormente, que dará lugar a la activación de la caspasa-8. Mediante sus DED, cFLIP puede competir con la caspasa-8 por su unión a FADD en el DISC, impidiendo así la formación de homodímeros de caspasa-8 necesarios para su activación. La función de cFLIPS y cFLIPR como proteínas inhibidoras de la activación de caspasa-8 en el DISC está bien establecida [206] [279] [213], sin embargo, la función de cFLIPL es mucho más compleja, porque además de inhibir la activación de la caspasa-8 en el DISC, cFLIPL puede activarla[280, 281] [282] [283]. La formación de heterodímeros caspasa-8/cFLIPL, provoca una cierta activación de caspasa-8 por proximidad entre ambas moléculas que, aunque es insuficiente para la señalización de apoptosis, permite que cFLIP se corte (por lo que cFLIP se convierte en activador y sustrato de caspasa-8 en el DISC), generando un fragmento p43, al que se le pueden unir moléculas implicadas en la activación de NF-kB, como se comenta más adelante. Parece ser que los niveles de cFLIP son determinantes en la señalización apoptótica o no apoptótica que se puede derivar de la activación de los receptores de muerte. Así, en ausencia de cFLIP, la caspasa-8 puede ser completamente activada y ejercer su función apoptótica. Sin embargo, si la expresión de cFLIPL es elevada, se podría seguir activando caspasa-8, pero no completamente por lo que no podría señalizar para apoptosis pero si para otras rutas no apoptóticas (Figura 18). Al igual que ocurre con la caspasa-8, se ha descrito que cFLIPL puede activar a caspasa-10 en el DISC [282]. 58 Introducción Figura 18. cFLIP modula la activación de caspasa-8 y NF-kB. Adaptada de Ralph C. Budd et al. Nat. Rev. 2006. El reclutamiento de cFLIP al DISC pude estar regulado por diferentes mecanismos. Así se ha descrito que la fosforilación de cFLIPL por CaMK II (quiinasa Calmodulina dependiente de Ca2+), promueve su reclutamiento al DISC [284]. También parece que la proteína chaperona Hsp90 participa en el reclutamiento de FLIPS al DISC [285]. 6.3.2 Proliferación celular. Activación de células T. La primera vez que se observó que cFLIP podría participar en procesos no apoptóticos fue durante el estudio de la activación de células T, a través del TCR, por co-estimulación de CD3 y Fas [286]. Células Jurkat T que sobrepresaban cFLIPL producían una mayor cantidad de interleuquina2 que las células normales tras la activación. Esto se debía a que en las 59 Introducción células que sobrexpresaban cFLIPL había una mayor activación de las rutas de NF-kB y ERK. Al igual que caspasa-8 y caspasa-10, cFLIPL tiene un residuo aspártico conservado (Asp376) que forma parte del motivo de corte por caspasa-8. Tras la formación de heterodímeros de caspasa-8/FLIPL en el DISC, se produce un corte en este residuo de cFLIPL que provoca la liberación de un fragmento p10 (10kDa) y genera otro de 43kDa (p43FLIPL). El fragmento p43 de cFLIPL puede reclutar proteínas señalizadoras como TRAF2 y RIP1 lo que dará lugar a la activación de la ruta de NF-kB [287] [288]. FLIPS no puede reclutar a estas proteínas y se sugiere que podría inhibir la señalización para NF-kB [287]. Sin embargo, posteriormente se describió otro posible mecanismo de activación de NF-kB por cFLIP que incluiría también a cFLIPS. Para ello se requiere la formación de un heterodímero caspasa-8/FLIP, que en principio no se localizaría en el DISC puesto que sería independiente de la activación de receptores de muerte, en el que cFLIP es cortado por caspasa-8 en el dominio N-terminal, concretamente en el residuo Asp198, que está presente en ambas isoformas, generando un fragmento de 22kDa (p22). p22FLIP es capaz de inhibir el corte y activación de caspasa-8 en el DISC, pero también es un potente activador de la ruta NF-kB por interaccionar físicamente con la subunidad reguladora NEMO (IKKγ) y participa en la proliferación de células T tras la activación del TCR. p22FLIP también se puede generar a partir de p43FLIP, lo que sugiere que este fragmento aún necesita de más proteolisis para la activación de NF-kB [213]. Sin embargo, esto ha generado controversia ya que p43FLIP es capaz de activar NF-kB aún en presencia de inhibidores de caspasas como zVAD-fmk, por lo que, en principio no serían necesarios más procesos de proteolisis para la activación de NF-kB, aunque ésta es menor en presencia del inhibidor [287] [213]. 60 Introducción Como se ha comentado anteriormente, cFLIP también es capaz de activar la ruta de ERK durante la activación de células T, mediante la interacción con RAf-1 [287]. También, cFLIP puede jugar un papel muy importante en la activación de ERK tras la estimulación con TNF, en algunos tipos celulares [289]. En este sistema sólo FLIPS y p43FLIP son capaces de activar a ERK, y además se requiere de la presencia de FADD y caspasa-8. 6.3.3 Adhesión y Migración celular. Se ha descrito que cFLIP puede promover la movilidad de células HeLa a través de la activación de FAK (focal adhesion kinase) y ERK, además de por aumentar la expresión de la Metaloproteasa-9 (MMP-9, matriz metalloproteinase-9) [290]. Aunque el mecanismo de activación de FAK y ERK por cFLIP no está determinada, es posible que la caspasa-8 también esté implicada. El hecho de que cFLIP y caspasa-8 puedan estar implicados en la migración de células tumorales y fibroblastos, es consistente con los datos que muestran que CD95 puede inducir procesos de migración e invasión en células tumorales resistentes a la apoptosis [126]. 6.3.4 Fenotipo del ratón deficiente en cFLIP. La deficiencia en ambos alelos de cFLIP es letal al dia 10.5 del desarrollo embrionario del ratón. Además, estos ratones presentan defectos en el desarrollo cardíaco debido, al parecer, a un endotelio vascular deficiente [291]. Este fenotipo coincide con los ratones nulos para caspasa-8 y FADD, lo que sugiere que estas tres proteínas participan en la misma ruta durante el desarrollo (al menos durante el desarrollo cardíaco). Para poder realizar estudios de la falta de función en células T, se han generado dos tipos de ratones deficientes de cFLIP condicionales. Unos tienen una deficiencia condicional de cFLIP en el compartimento ce células T llamados tFLIP-/-. Los segundos se han generado por complementación de blastocitos 61 Introducción deficientes en Rag1 (recombination activating gen 1) con células madre embrionarias deficientes en cFLIP, llamados blastFLIP-deficientes. En general presentan una reducción del número de células T periféricas y de proliferación después de la activación del TCR. También manifiestan una disminución en la supervivencia tanto espontánea como después de la estimulación del T CR [291]. 6.3.5 Regulación de la autofagia. Muy recientemente se ha descrito un novedoso papel de cFLIP en la regulación de la autofagia inducida por rapamicina o privación de nutrientes [292]. En el estudio se detalla como cFLIP puede interaccionar físicamente con la proteína Atg-3 implicada en la maduración de los autofagosmas, impidiendo así su función. En condiciones normales, en una célula habría un equilibrio entre moléculas de Atg-3 unidas a cFLIP y moléculas de Atg-3 unidas a LC-3 formando parte del proceso de maduración del autofagosoma con lo que habría unos niveles basales de autofagia. Tras un estímulo de inducción de autofagia, como el tratamiento con rapamicina o la privación de nutrientes, cFLIP sería desplazado por moléculas de LC3 de su unión a ATG-3 induciendose un aumento en la autofagia. La sobreexpresión de cFLIP impide la unión LC3 a ATG3, inhibiendo así la autofagia y también la muerte celular que se deriva de ella. La regulación de la autofagia por otras proteínas con DED como FADD y caspasa-8 ha sido descrita anteriormente [293] [294] [295] [296]. 6.3.6 FLIP y cáncer. La expresión de cFLIP es uno de los principales determinantes de la resistencia a la apoptosis inducida por ligandos de muerte como FasL y TRAIL y existen numeros estudios que han mostrado que la bajada de expresión de cFLIP sensibiliza a varios tipos de células tumorales resistentes 62 Introducción [224] [229] [232] [233] [234] [236] [238] [239] [261] [222]. Por el contrario, la sobrexpresión de cFLIP confiere resistencia a la apoptosis inducida por Fas o TRAIL. Estos datos apuntan a que cFLIP puede ser un atractiva diana terapeutica antitumoral. Hasta la fecha se han descrito muchos tipos de tratamientos que son capaces de disminuir la expresión de cFLIP y por ello sensibilizar a las células tumorales a la apoptosis mediada por receptores de muerte. En estas se incluyen agentes que dañan al DNA (cisplatino y doxorrubicina), inhibidores de la síntesis de proteína (actinomicina D y cichoheximida), e inhibidores de histonas deacetilasas (Trichostatin A y Vorinostat) [297] [188]. Además, inhibidores de algunas proteínas quinasas como MEK1/2, PKC, y PI3K, también disminuyen los niveles de expresión de cFLIP por afectar a su ruta de síntesis. Si consideramos que la elevada expresión de cFLIP en las células tumorales es la causa de la resistencia a TRAIL, la combinación de algunos de estos agentes con TRAIL puede ser una atractiva estrategia terapeutica para la eliminación de dichas celulas tumorales. El desarrollo de pequeñas moléculas inhibidoras de proteínas antiapoptóticas como por ejemplo Bcl-2 o IAP se encuentra en ensayos clínicos. Estos inhibidores están diseñados en base a la estructura cristalográfica de la proteína diana. La reciente descripción de la estructura cristalográfica de FLIP viral MC159 puede ayudar al desarrollo de inhibidores específicos dirigidos contra cFLIP. El desarrollo de estos inhibidores junto con el uso de oligos antisentido dirigidos específicamente contra cFLIP puede ser uno de los nuevos campos de investigación en terapia antitumoral. De hecho recientemente se ha descrito que el silenciamiento de cFLIP mediante oligos antisentido disminuye el tamaño de tumores in vivo en un modelo de injerto de células tumorales de mama MCF7 [298]. 63 Introducción 7. Desarrollo morfogenético del epitelio glandular de mama. En el epitelio glandular se coordina la polaridad de las células individuales, en espacio y tiempo, con respecto a las células vecinas y la matriz extracelular (MEC) para dar lugar a organizadas estructuras tridimensionales que formarán los tejidos y órganos, tales como la glandalula mamaria, riñón, pulmón, etc. Uno de los eventos clave en este proceso, denominado morfogénesis, es la distribución asimétrica de las superficies de la membrana celular. Así se distingue una superficie basal, o membrana basal, que está en contacto con la matriz extracelular, superficies laterales que mantienen el contacto con otras células y una superficie apical, que rodea a un espacio libre denominado lumen, al que se vierten las secreciones celulares como, por ejemplo, la leche en la glándula mamaria [299]. Se han descrito dos principales mecanismos de formación de espacios luminales a partir de células no polarizadas que son la cavitación y el “hollowing” aunque en algunos modelos se pude producir una mezcla de ambos [300]. En el proceso de cavitación el lumen se forma por la muerte apoptótica de las células interiores por la pérdida de adhesión al sustrato, en este caso la matriz extracelular, proceso que se conoce como anoikis. Aunque la apoptosis parece ser el principal mecanismo de muerte de estas células, no se descartan otros mecanismos de muerte celular independientes de caspasas, ya que la inhibición de la apoptosis no boloquea sino que retrasa la formación del lumen [301] [302]. En el hollowing, el lumen se forma por una redistribución de las células interiores que incluye procesos de separación de membranas y/o repulsión celular. Defectos en la polaridad celular y en la correcta formación del lumen están asociados con importante enfermedades humanas tales como el cáncer [299]. La mayoría de los cánceres humanos provienen de células y tejidos epiteliales. El estudio histológico de tumores primarios humanos y de 64 Introducción modelos de tumores en ratón han sido cruciales para el entendimiento del desarrollo del cáncer, sin embrago, resulta muy complicado hacer estudios bioquímicos y de procesos celulares a partir de ellos. Por eso, los modelos de cultivos celulares son más apropiados para estudiar las rutas de señalización implicadas en la trasformación oncogénica. Tales estudios se han realizado utilizando cultivos de células en monocapa, principalmente, o mediante ensayos de soft-agar, ninguno de los cuales se asemeja a la organización estructural o a la diferenciación funcional del epitelio glandular in vivo [303] [304]. Los sistemas de cultivos tridimensionales (3D) de células epiteliales, que permiten que las células se reorganicen en estructuras similares a las que forman in vivo, han emergido como modelos de estudio de las funciones y rutas de los genes tumorales en un contexto biológico más relevante. Figura 19. Morfogénesis de los acinos de celulas epiteliales de mama en cultivos 3D. Durante los primeros dias del cultivo tridimensional, tiene lugar una polarización apicobasal. Entre los dias 5 y 8 se distinguen dos poblaciones de células: una situada en el exterior de la estructura acinar y que está en contacto con la matriz extracelular, y otra en el interior del acino que han perdido el contacto con la matriz extracelular.Durante el proceso de morfogéneis, la capa externa de células se mantie polarizada con respecto al centro del acino. Se pueden observa distintas señales dicotómicas entre las dos poblaciones y se activan señales de supervivencia mediada por AKT en las células de la capa externa. A partir del dia 8 las células del centro del acino empiezan a sufrir muerte celular apoptótica caracterizada por un incremento en la actividad caspasa-3. Esta muerte celular contribuye al vaciamiento del acino y a la formación del lumen. Adaptado de Debnath and Brugge Nat. Rev. 2005). 65 Introducción Bajo las condiciones de cultivo 3D, las células normales epiteliales proliferan y se organizan formando estructuras esféricas denominadas comúnmente acinos (Figura 19). Éstos se caracterizan por tener un lumen central rodeado de una capa de células polarizadas, poseer un preciso control del crecimiento y la proliferación celular y por el establecimiento de una membrana basal[305] [306] [307]. Estas características, junto con la posibilidad de manipulación experimental, así como la facilidad de un estudio microscópico detallado y análisis bioquímico, diferencian a estos sistemas de cultivos 3D de los cultivos celulares convencionales en monocapa (2D) o incluso modelos animales. Existen dos métodos principales para generar estructuras acinares. En el primero, las células son introducidas y cubiertas completamente en una capa de matriz extracelular a la que posteriormente se le añade medio de cultivo complementado con factores de crecimiento y hormonas necesarias para la superviviencia celular. En el segundo, las células son sembradas sobre una capa de matriz extracelular, añadiendoles de igual foma medio de cultivo. La elección de la matriz extracelular óptima para los cultivos en 3D, depende del tipo celular, así las células epiteliales de riñón de perro Madin-Darby (MDCK) se desarrollan correctamente en estructuras tridimesionales con un lumen central formado por hollowing cuando crecen embebidas en matriz extracelular que contiene colágeno [308]. Otras células epiteliales, como por ejemplo la linea epitelial de mama inmortalizada no transformada MCF10A, forma estructuras acinares cuando crecen en una matriz extracelular derivada de los tumores Engelbreth-Holm-Swarm (ESH), comercializado como MATRIGEL [309] [303]. Los cultivos 3D han permitido abordar importantes cuestiones con respecto a la arquitectura de epitelios normales frente a los tumorales, como por ejemplo, cuales son los mecanismos y vías de señalización implicados 66 Introducción en la correcta organización estructural de los epitelios y si la disrupción de estas vías influye en la progresión tumoral. Con respecto al cáncer de mama, se conoce que la sobrexpresión de oncogenes puede dar lugar a fenotipos morfológicos en células epiteliales cultivadas en 3D que son similares a las características histológicas que presentan los tumores in vivo, como por ejemplo el relleno del lumen con células, fenómeno que ocurre tras la sobrexpresión de ERBB2 [310]. Pero además de un aumento en la proliferación inducida por la sobreexpresión de oncogenes debe producirse una inhibición de la muerte celular para que se inhiba la formación del lumen [303]. En acinos de células epiteliales de mama MCF-10A, el lumen se forma por un fenómeno de cavitación, en el que las células del interior del acino mueren por la apoptosis inducida por anoikis o pérdida de adhesión a la matriz extracelular [301] [303]. En esta apoptosis, la proteína proapoptótica “solo BH3” de la familia de Bcl-2, Bim parece jugar un papel fundamental ya que la bajada de su expresión por RNA de interferencia provoca que el lumen no se vacíe correctamente [311] [90]. También se ha descrito un papel fundamental de Bim en la formación del lumen durante el desarrollo de la glándula mamaria en ratones [302]. Además de Bim, otra proteína pro-apoptótica de la familia de Bcl-2 como es Bmf también ha sido implicada en el proceso de anoikis durante la morfogénesis de células MCF10 en ensayos en 3D [312] y durante la involución de la glándula mamaria en ratones tras la lactancia [302]. Pero como se comentó anteriormente, la inhibición de la apoptosis durante la morfogénesis de células MCF-10A en cultivos en 3D, no inhibe la formación de lumen, sólo la retrasa, por lo que otros mecanismos de muerte deben estar implicados [301] (Figura 20). Así, parece que un proceso de muerte celular con autofagia inducido por TRAIL tendría un papel en la morfogénesis [164]. Estudios más recientes indican que además de apoptosis, otro de los procesos que se inducen tras pérdida 67 Introducción de adhesión al sustrato es autofagia. Sin embargo, durante la morfogénesis, la autofagia inducida por la pérdida de contacto con la matriz extracelular tendría un papel citoprotector, ya que su inhibición, mediante RNA de interferencia de proteínas necesaria para la autofagia como Atg-5 o Atg-7, provoca una mayor rapidez en la formación del lumen [313]. Figura 20. Formación y manteniendo del lumen en acinos epiteliles in Vitro. La figura muestra algunas condicones en las cuales el proceso de formación del lumen está alterado por oncogenes. Además se indican las moléculas implicadas en el proceso.En verde se muestran las proteínas que permiten el vaciamiento del acino y en rojo las que impiden la correcta formación del lumen. Para más detalles consultar el texto. Adpatado de Debnath and Brugge, Nat. Rev. 2005) Como se ha comentado anteriormente, la sobreexpresión del oncogen ERBB2 provoca defectos en la correcta formación del lumen por inducir un aumento en la proliferación celular y por inhibir la apoptosis. Recientemente se ha descrito que la inhibición de la apoptosis por la sobreexpresión de ERBB2 viene determinada por la pérdida de polaridad que sufren estas células [314]. Por lo que la polarización de las células durante el proceso de 68 Introducción morfogénesis es otro factor determinante en el correcto desarrollo de la formación del lumen. Además, ERBB2 también puede participar en la recuperación de los niveles de ATP, que disminuyen drásticamente durante el proceso de anoikis, lo que permite una mayor supervivencia celular [315]. 69 IV. OBJETIVOS 70 Objetivos OBJETIVOS. La apoptosis desempeña un papel fundamental en muchos procesos fisiológicos, desde el desarrollo embrionario hasta el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos en el adulto. Asimismo, la apoptosis también está implicada en una variedad de situaciones patológicas, entre las que podemos destacar el cáncer, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades autoinmunes, etc. El mal funcionamiento de los mecanismos de inducción y regulación de apoptosis contribuye en gran medida a la transformación neoplásica. Por otra parte, la apoptosis también está presente en el tratamiento del cáncer, ya que la mayoría de los tratamientos inducen apoptosis directa o indirectamente. El descubrimiento del ligando de muerte TRAIL (TNF-Related ApoptosisInducing Ligand), capaz de inducir apoptosis en células tumorales sin afectar a células no transformadas lo convierte en un agente con potencial terapéutico. Sin embargo, se ha descrito que muchas células tumorales son resistentes a dicho ligando de muerte, sobre todo células tumorales de mama. El estudio de los mecanismos responsables de esta resistencia ha sido objeto de estudio. En concreto, los objetivos de esta tesis han sido los siguientes: 1. Estudio de la implicación de la proteína antiapoptótica cFLIP en el mecanismo de resistencia de células tumorales de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. 2. Análisis de la función de cFLIP como proteína implicada en la viabilidad tanto de de células epiteliales de mama no trasformadas como de células tumorales. 71 Objetivos 3. Estudio de la participación de cFLIP en el proceso de morfogénesis de células epiteliales de mama. 4. Estudio de la regulación de la expresión de cFLIP. 72 V. MATERIALES Y MÉTODOS. 73 Materiales y Métodos 1. MATERIALES. Cultivos celulares. Las lineas celulares humanas de cáncer de mama MCF-7 [316], MCF-7Bcl-2 que expresan establemente la proteína BCL-2 [317], MCF-7 E6 que establemente expresan la proteína E6 del papilomavirus humano[318], se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de penicilina. Las células MCF-7-Bcl-2 y MCF-7E6 fueron ademas suplementadas con 0,5mg/ml de Geneticina (G418). Las líneas celulares humanas tumorales de mama MDA-MB231 [319] y MDA-MB231-FLIPL, que expresa establemente la proteína FLIPL [320] se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de penicilina. Las líneas celulares humanas de cáncer de mama BT474 [321] y MDAMB435s [322], se cultivaron en medio DMEM igualmente suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de penicilina. Las células MDA-MB435s fueron además suplementadas con 10µg/ml de insulina. Las células MCF-10A son células epiteliales derivadas de tejido mamario humana normal (Pauley, Soule et al, 1993) y fueron amablemente cedidas por el Dr. Mauricio Reginato (Drexel University, Filadelfia, USA). Se cultivaron en medio DMEM F12 (1:1) suplementado con 5% de suero de caballo inactivado (HS), 10µg/ml de insulina, 20ng/ml de factor de crecimiento epidermal (EGF), 10ng/ml de toxina colérica, 500ng/ml de hidrocortisona, 2mM de L-glutamina 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de penicilina. Las células MCF-10A–FLIPL, MCF-10A-FLIPS, MCF-10A–Bcl2 y MCF-10A–dnFADD se crearon mediante infecciones retrovirales como se especifica en el apartado correspondiente. 74 Materiales y Métodos Las células HEK293T, son una línea primaria de células embrionarias de riñón humano, transformadas con ADN de adenovirus humano tipo 5 (AD5) y nos fueron amablemente cedidas por el Dr. Antonio Rodríguez (CNIO, Madrid). Se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de penicilina. Todas las células fueron mantenidas en un incubador humificado a 37ºC, 5% de CO2 y 95% de aire. Reactivos. Los medios RPMI 1640, DMEM y DMEM F12 (1:1), así como el EGF, la hidrocortisona, la insulina, el suero bovino fetal (FBS), la L-glutamina y los antibióticos (penicilina/estreptomicina) se obtuvieron de Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA). El suero de caballo se obtuvo de Gibco (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA). El TRAIL recombinante con cola de histidinas, así como el TRAIL recombinante biotinilado (TRAIL-b) fueron producidos en nuestro laboratorio como se describe más adelante. El TRAIL-R2/Fc recombinante humano se adqurió de R&D Systems. Doxorrubicina, Rapamicina, Cicloheximida, Wortmanina, LY294002, LY303511, Nocodazol, Roscovitina, TBB, MG132 e Insulina se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). El Vorinostat (SAHA) se obtuvo de Selleck Chemicals, USA. El Interferón gamma se obtuvo de Peprotech EC LTD (London, UK). Flavopiridol fue amablemente cedido por Dr. José Ramón Suarez (Aventis Pharmaceutical, Bridgewater, NJ). El 17-DMAG fue obtenido de LC Laboratorios (Woburn, USA). BMS fue otenido de Calbiochem Novabiochem GMBH (Band Soden, Alemania). La epoxomicina fue obtenida de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). El inhibidor general de 75 Materiales y Métodos caspasas benzyloxy-carbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethylketone (ZVAD-FMK) fue proporcionado por Bachem, AG (Bachem, Bubendorf, Suiza). Las sondas Taqman para la amplificación de mRNA de cFLIPL y cFLIPS mediante PCR cuantitativa fueron diseñadas por Applied Biosystems. La sonda Taqman para la amplificación de mRNA de HPRT como gen endógeno en la RT-PCR Real time se obtuvo de Applied Biosystems (Número de catálogo 4331182). La Taqman Universal PCR Master Mix se obtuvo de Applied Byosistems (Número de catálogo 4304437). Las placas de 96 pocillos para la realización de la PCR en tiempo real se adquirieron de Sorensan TM y el adhesivo para sellar la placa se obtuvo de Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemania). Anticuerpos. El anticuerpo anti-FLIP NF6 se obtuvo de Alexis (San Diego, Ca, USA). Los anticuepos anti-FADD, anti-Bid, anti-XIAP, anti-ITCH y anti-RIP se obtuvieron de BD Transduction Laboratorios (New Jersey, USA). Los anticuerpos anti-Bax, anti-TRAF2, anti-Mcl-1, anti-pERK y anti-GAPDH se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Los anticuerpos anti-pIkB, anti-pJNK, anti-pAKT, anti-p-P70SK6, anti-AKT, antip-sustratos de AKT, anti Cul-3 fueron de Cell Signalling Technology; CA, USA). Los anticuerpos anti-TRAIL-R2 y anti-TRAIL fueron de R&D Systems (Mn, USA). El anticuerpo anti-Bcl-2 se obtuvo de DAKO (Glostrup, Dinamarca). El anticuerpo anti-Tubulina se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). El anticuerpo anti-Citocromo C se obtuvo de Pharmingen (San Diego, CA, USA). El anticuerpo anti-Caspasa-8 fue amablemente cedido por el Dr. Gerald Cohen (Leicester University, UK). El anticuerpo anti-Actina fue amablemente cedido por el Dr. Mauricio Reginato (Drexel University, Philadelphia, USA). Los anticuerpos frente a los receptores de 76 Materiales y Métodos TRAIL utilizados para citometría de flujo (TRAIL-R1 (HS101), TRAIL-R2 (HS201), TRAIL-R3 (HS301) y TRAIL-R4 (HS401)) fueron adquiridos de Alexis Corp. (San Diego, CA, USA). Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP) o con isotiacinato de fluoresceína (FITC) fueron adquiridos de DAKO (Glostrup, Dinamarca). El reactivo quimioluminiscente ECL se obtuvo de Millipore (Billerica, MA, USA). ARN de interferencia (siRNA). Los siRNA de interferencia utilizados corresponden a las secuencias de cDNA humano para las siguientes proteínas y se obtuvieron de SigmaProligo (Woodlans, TX, USA). cFLIP: 5´-GGGACCUUCUGGAUAUUUUdTdT-3´, cFLIPL (5´-GAGCAUACCUGAAGAGAGAdTdT-3’), cFLIPS: 5´-CACCCUAUGCCCAUUGUCCTTdTdT-3´, Caspasa-8: 5´-GGAGCUGCUCUUCCGAAUUdTdT-3´, FADD: 5´-GAAGACCUGUGUGCAGCAUdTdT-3´, TRAIL-R2: 5´-GACCCUUGUGCUCGUUGUCdTdT-3´, Bid: 5´-GAAGACAUCAUCCGGAAUAdTdT-3´, ITCH-1: 5´-AAGUGCUUCUCAGAAUGAUGAdTdT-3´, ITCH-2: 5’-AACCACAACACACGAAUUACAdTdT-3’, XIAP: 5´-GCUGUAGAUAGAUGGCAAUdTdT-3´, Cul-3: 5´-GUCGUAGACAGAGGCGCAAdTdT-3´, RIP: 5´-CCACUAGUCUGACGGAUAAdTdT-3´, TRAF-2#1: 5´-GUGUCGAGUCCCUUGCAGAdTdT-3´, TRAF-2#2: 5’-UCUGCAAGGGACUCGACACdTdT-3’ MULE: 5´-GAGUUUGGAGUUUGUGAAG-3´, siRNA Control (Scrambled): 5’-CUUUGGGUGAUCUACGUUAdTdT-3’ 77 Materiales y Métodos 2. METODOLOGÍA. Cuantificación de la viabilidad celular (Cristal Violeta). La viabilidad celular se determinó por tinción con cristal violeta (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA) tal y como lo describen Sanchez et al J. Biol. Chem. 271: 7416-7422. Resumidamente: 35.0000 células fueron sembradas en placas de 24 pocillos y tras el tratamiento correspondiente, se retiró el medio de cultivo y se lavaron tres veces con PBS 1X. A continuación, las células que quedaban adheridas a la placa se tiñieron con 250 µl de una solución de 0.2% de Cristal violeta en etanol al 2%, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se lavaron los pocillos con agua, y una vez secos, se lisaron las células con una solución de SDS al 1%. La densidad óptica de cada pocillo se midió en el lector de placas Varioskan Flash (Termo Electrón Corporation) a la longitud de onda de 590 nm. Cuantificación de apoptosis. La apoptosis se cuantificó por citometría de flujo mediante la detección de células hipodiploides. Para ello, se sembraron 3x105 células por pocillo y, tras el tratamiento correspondiente, se recogieron con Tripsina. Se fijaron y permeabilizaron con 900 µl de una solución de etanol frío al 70%, agitando suavemente en el vórtex e incubando 5 minutos en hielo. Después de lavar, se añadieron 250 µl de Solución de Extracción de ADN (0’2M Na 2HPO4, 0’1M ácido cítrico en PBS; pH 7’8) y se incubaron durante 10 minutos a 37ºC. A continuación y, tras lavarlas, las células se resuspendieron en 250 µl de Solución PI/RNasa (100 µg/ml RNasa, 40 µg/ml de Yoduro de Propidio en PBS) y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC en oscuridad. Las células apoptóticas se detectaron y cuantificaron en la población del ciclo celular con menor contenido en ADN que las células el pico G1 (SubG1). La 78 Materiales y Métodos citometría de flujo fue realizada en un citómetro FACScan, utilizando el programa Cell Queso Pro (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) para el análisis de los datos. En células tumorales de mama MCF-7 la cuantificación de la apoptosis se realizó mediante el estudio por citometría de flujo de la externalización de la fosfatidilserina utilizando la proteína Anexina V-FLUOS (Roche), la cual se une a este fosfolípido en presencia de Ca2+. Las células se resuspendieron en un tampón de incubación (Hepes NaOH 10mM pH 7’4, NaCl 140 mM, CaCl2 5mM) con Anexina V-FLUOS a la concentración indicada por el fabricante durante 15 minutos a temperatura ambiente. El porcentaje de células positivas para la externalización de la fosfatifilserina se analizó en el citómetro de flujo por la cuantificación de células postivas para la tinción con Anexina V-FLUOS. Inmunodetección de proteínas por western-blot. Para el análisis de expresión de proteínas, tras recoger las células, estas se lavaron una vez en PBS 1X y posteriormente se resuspendieron en tampón de carga Laemli (Sample buffer, 50mM de Tris-HCl pH 6’8, urea 6M, 2-Mercaptoetanol 6%, SDS 3%, 0’003% de Azul de brofofenol). Posteriormente se sonicaron e hirvieron las muestras y las proteínas se separaron mediante electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida, a un porcentaje del 7,5%, 10% o 12% dependiendo del peso molecular de la proteína a detectar. Para la preparación del gel se utilizó Lower Buffer (1), Upper Buffer (2), Acrimalmida, Agua, APS (ammonium persulfate, SigmaAldrich), TEMED (Sigma-Aldrich). La electroforesis se realizó en Running Buffer (3), a un voltaje constante de 140 voltios durante 1 hora aproximadamente. Las proteínas de este gel se transfierieron a una membrana de PVDF (Immobilon, Millipore), previamente tratadas con 79 Materiales y Métodos metanol y mantenidas en Buffer de Transferencia (4), mediante la técnica de transferencia semiseca con el sistema Trans-Blot, SD (Bio-Rad) a 50mA constantes (por gel a transferir) durante una hora, o a 15 voltios constantes (independientemente del número de geles a transferir) durante 30 minutos. La membrana se bloqueó con una solución PBS 0’1% Tween 20 (PBS/Tween) con 5% de leche en polvo durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente se lavó la membrana con PBS-Tween y se incubó con el anticuerpo correspondiente durante 1 hora a temperatura ambiente, o a 4ºC durante toda la noche en agitación. Tras la incubación con el anticuerpo, se lavó la membrana 3 veces con PBS-Tween durante cinco minutos cada lavado, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con una solución PBS-Tween 5% de leche en polvo y el anticuerpo secundario correspondiente, que lleva acoplado la peroxidasa del rábano picante (HRP). De nuevo se hiceron tres lavados de cinco minutos cada uno con PBS-Tween y se incubó la membrana con el reactivo ECL (Millipore) durante cinco minutos, tras lo cual se reveló mediante quimioluminiscencia. Para el análisis de muestras tras la medida de concentración de proteínas, las células se lisaron con tampón de lisis (250mM Tris-Hcl pH 7’5, 5mM EDTA, 5nM EGTA, 5% Tritón X-100, 50mM Na-β-glicerofosfato, 250mM NaF, 5mM ortovanadato sódico, 25mM NaPPi, 27mM Sacarosa, 1X inhibidores de proteasas) y se recogieron con un raspador. Se dejaron 30 minutos en hielo y se centrifugaron a 4ºC durante 10 minutos a 13.000 rmp. Se recogió el sobrenadante y se le calculó la concentración de proteínas. A la misma cantidad de proteína se le añadió el volumen correspondiente de tampón de carga Laemli. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel SDS-poliacrilamida como se ha comentado anteriormente. Bufferes utilizados: 80 Materiales y Métodos 1) Lower Buffer 4X (pH 8’8) 90’85 g Tris-base (Roche) 20 ml SDS 10% (Sigma) Agua hasta 500 ml 3) Runnig Buffer 5X (pH 8’3) 2) Upper Buffer 4X (pH 6’8) 6’06 g Tris-base 4 ml SDS 10% Agua hasta 100 ml 4) Buffer de Trasferencia 10X 15 g Tris-base 58 g Tris-base 72 g Glicina (Sigma) 29 g Glicina 3’7 g SDS 5g SDS Agua hasta 1 litro Agua hasta 1 litro Medida de la concentración de proteínas. Con el fin de cuantificar la cantidad de proteínas que se ha obtenido tras recoger las células, se utilizaron los reactivos de BioRad (Hercules, CA, USA): Bio-Rad Dc Protein Assay Reagent A, B y S. Para ello se hizo una curva patrón con BSA desde 1µg/µl hasta 8µg/µl, sobre la cual se extrapolaron los valores obtenidos de las muestras y se obtuvo la concentración de proteína. En primer lugar se añadieron 5µl de muestra (o una cantidad menor, pero siempre completando hasta 5µl con el buffer en que estuviera diluída la muestra), a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano. En el caso del blanco, se añadieron 5µl del buffer. A continuación se añadieron 25µl de la Solución A´ (1ml de Solución A + 20µl de solución S). Posteriormente se añadieron 200µl del reactivo B. Se dejó incubando 15 minutos a temperatura ambiente y se midió la fotometría a una longitud de onda de 750 nm en el lector de placas Varioskan Flash (Termo Electron Corporation). Análisis de los receptores de TRAIL en la superficie celular mediante citometría de flujo. 81 Materiales y Métodos Para detectar la expresión de receptores de TRAIL en la superficie celular, se utilizaron 2x106 células. Se despegaron del sustrato con un rascador en PBS y, una vez lavadas, se resuspendieron en 100µl de PBS. Posteriormente se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (5 µg/ml) a 4ºC durante 30 minutos. Después de lavar con PBS para eliminar el exceso de anticuerpo primario, se incubaron con un anticuerpo secundario anti-inmunoglobulinas de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) en una dilución 1:20 durante 30 minutos a 4ºC en oscuridad. Las células se volvieron a lavar con PBS y se resupendieron en 200µl de PBS. La detección de los receptores de muerte se realizó con un citómetro de flujo FACScan, utilizando el programa Cell Queso Pro (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) para el análisis de los datos. Producción de TRAIL recombinante y TRAIL biotinilado recombínate (Trail-b). El TRAIL recombinante, así como el el TRAIL recombinante biotinilado (TRAIL-b), fueron producidos a partir de una construcción amablemente cedida por la Dra. Marion MacFarlane (MCR Toxicology Unit. Univerisity of Leicester, UK) que codifica para TRAIL recombinante (aminoácidos 95-281) insertada en BamHI/XhoI del vector pET-28b(+) con resistencia a kanamicina y una cola de seis histidinas para facilitar la purificación de la proteína recombinante (MacFarlane et al., 1997). Brevemente: se transformaron bacterias BL21 con 1-2 µg de ADN por choque térmico y se crecieron en medio LB (Luria-Bertani), con 20mM de glucosa y 30µg/ml de kanamicina. Cuando el precultivo alcanzó la densidad óptica de 0.6-0.8 a la longitud de onda de 600nm se indujo la síntesis de la proteína recombinante añandiendo al cultivo 0.5µM de IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido). Tras tres horas de inducción a temperatura ambiente, las bacterias se 82 Materiales y Métodos recogieron por centrifugación y se lisaron, tras un lavado con PBS 1X, en un tampón de lisis que contiene 30mM de Tris-HCl (pH 7,5), 150mM de NaCl, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100 e inhibidores de proteasas. Este lisado se incubó en un rotor circular durante 16 horas a 4ºC, en una columna de sefarosa quelada con Niquel (Quelatin Sepharose Fast Flow; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suiza), a la que el TRAIL quedará unido por la cola de histidinas. Transcurrido este tiempo, se lava la columna seis veces con PBS frío antes de eluir el TRAIL con una solución 100mM de EDTA en PBS. Las fracciones más purificadas se titularon en actividad realizando un ensayo de apoptosis en células HeLa, sensibles a TRAIL y se almacenaron a 80ºC. En el caso del TRAIL biotinilado, antes de eluir la proteína de la columna, se incubó con 50 µg/ml de reactivo de biotinilización (Ácido Dbiotil-ε-aminocaproico N-Hidroxisuccinimida éster; Roche) durante 1 hora a 4ºC, tras lo cual, se eluyó con una solución 150 mM de EDTA en PBS. Análisis del DISC de TRAIL. El aislamiento del DISC de TRAIL fue realizado utilizando TRAIL biotinilado recombínate (TRAIL-b), sintetizado en nuestro laboratorio. Las células, 20x106 por tratamiento fueron incubadas con o sin doxorrubicina 500ng/ml durante 15 horas. Tras este tiempo, las células se trataron con 1µg/ml de TRAIL-b durante 15, 30 ó 60 minutos. Posteriormente se lavaron las células con PBS frío tres veces y se lisaron en 3ml de tampón de lisis (30mM Tris-HCl pH 7’5, 150mM de NACl, 10% de glicerol, 1% de Triton X100, 0’1% de deoxicolato, inhibidores de proteasas (Complete Inhibitors de Roche)) durante 30 minutos en hielo. El lisado se recogió en tubos eppendorfs y centrifugó en una minifuga durante 30 minutos a máxima velocidad. Se recogieron los sobrenadantes, guardando 50µl como control 83 Materiales y Métodos interno (Input). El DISC de TRAIL fue aislado de la misma cantidad de proteína en cada caso utilizando 30 µl de sterptavidina-agarosa (Sigma) incubando toda la noche a 4ºC en frío en un rotor circular. Los precipitados se lavaron 6 veces con 500 µl de tampón de lisis y posteriormente se añadió 30 µl de tampón de carga 1X y se hirvieron a 95ºC durante 5 minutos para su análisis protéico por western blot. Fraccionamiento celular. Para detectar la liberación de citocromo C de la mitocondria al citosol y la translocación de Bax desde el citosol a la membrana mitocondrial tras un estímulo apoptótico se separó la fracción mitocondrial (membranosa) de la citosólica. Para ello se lavaron las células en PBS y se resuspendieron en 30µl de tampón de lisis frío (80 mM de KCl, 250mM de sacarosa, 100µg/ml de digitonina (Sigma-Aldrich), 0’1 mM de PMSF (Fenilmetilsulfonil Fluoruro, Boehringer Ingelheim GmbH; Ingelheim, Alemania), 1mM de DTT (1,4Dithiothreitol, Roche) e inhibidores de proteasas en PBS. Tras incubar en hielo durante 8 minutos (en células MCF-7), se centrifugaron 5 minutos a 10.000 rpm en frío y se recogió el sobrenadante (fracción citosólica). El sedimento (fracción membranosa) se lavó con PBS y se resuspendió en Laemli Buffer. Se utilizaron 50 µg de proteína de la fracción citosólica y una cantidad proporcional de la fracción membranosa para la detección de las proteínas citocromo C y Bax mediante western blot. RT-PCR ( Transcripción reversa de ARN y amplificación de ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). El ARN total de las células se aisló utilizando el sistema de aislamiento de ARN, TRIzol (Invitrogen; Eugene, Oregon, USA), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Partiendo de 2 µg de ARN total y utilizando un kit de transcriptasa reversa M-MLV (Gibco BRL 28025-013) se sintetizó el 84 Materiales y Métodos ADN complementario. De este ADN se tomaron 4 µl para su amplificación por PCR. Los cebadores utilizados para la amplicación de mRNAs se obtuvieron de Sigma-Genosys y las secuencias son: FLIPL-sentido: 5’-AATTCAAGGCTCAGAAGCGA-3’ FLIPL-antisentido: 5’-GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3’ FLIPS-sentido: 5’-ATGTCTGCTGAAGTCATCCAT-3’ FLIPS-antisentido:5’-TCACATGGAACAATTTCCAAG-3’ Actina-sentido: 5’-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3’ Actina-antisentido: 5’-CATGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3’ Los productos de amplificación que se producen son de 667 pb para cFLIPS, 230pb para cFLIPL y 661 pb para la actina. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 2 minutos a 94ºC, 27 ciclos de: 40 segundos a 94 ºC, 40 segundos a 60ºC y 40 segundos a 72ºC. Se finaliza con 10 minutos a 72 ºC. Los productos amplificados se visualizaron en un gel de agarosa (AppliChem) a 1% en tampón TAE con 0’5 µg/ml de bromuro de etidio (Sigma-Aldrich). Electroporación y sorting. Los experimentos de electroporación se realizaron basados en el protocolo descrito por Agami R. et al, Cell, 2000. Brevemente: 1.500.000 células tumorales MCF-7 se resupendieron en 100 µl de tampón de electroporación que contenía 2mM HEPES (pH 7’2), 15 mM K2HPO4/KH2PO4, 250mM Manitol y 1mM MgCl2 a un pH final de 7’2. 1µg total de ADN (0’3 µg del plámido que codifica para GFP y 0’7 µg del plásmido que codifica para una forma constitutivamente activa de AKT (pcDNA3-Myr-AKT, amablemente cedido por el Dr. Kenneth Wals) o del plásmido que codifica para una forma dominante negativa de AKT (pcDNA3-dnAKT, amablemente cedido por el Dr. Kenneth Walsh) fue 85 Materiales y Métodos añadida a esta suspensión y transferida a una cubeta de electroporación de 0.1 cm (Sigma-Aldrich). Posteriormente las células se electroporaron en el aparato de electroporación Gene pulser II (BIORAD) con las condiciones 140 voltios, 10 pulsos, 1.5 ms de duración de pulso y un intervalo de tiempo entre pulsos de 1.5 segundos. 48 horas después de la electroporación, se seleccionaron las células positvas para GFP utilizando un citómetro FACSAria Cell Sorter (Becton Dickinson). Las células se tripsinizaron y se lavaron con PBS antes de resuspenderlas en 1 ml de un tampón que contenía 5mM de EDTA y 25mM de Hepes pH 7 en PBS. Con el objetivo de evitar agregados, las células se filtraron utilizando filtros de 70 µm. Tras el proceso de selección, las células recuperadas, se lisaron y se analizaron las proteínas pertinentes mediante western-blot. Transfección transitoria con oligos de ARN de interferencia (siRNA). El silenciamiento transitorio de proteínas celulares mediante siRNA se llevó a cabo con el reactivo de transfección Dharmafect (Dharmacon, Colorado, USA). Para ello se sembraron 250.000 células por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillo y en medio completo sin antibiótico. Al dia siguiente, el medio completo fue sustituído por 2 ml de medio de transfección durante 24, 48 o 72 horas. El medio de transfección se compone de 10 ó 50nM de oligos, 2’5 µl de Dharmafect y 2ml de medio Optimen (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY, USA). La preparación del medio de transfección consta de dos pasos. En primer lugar se mezclan durante 5 minutos a temperatura ambiente el Dharmafect con el medio Optimen. Pasado este tiempo, se añade esta mezcla a los oligos y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. En ese tiempo, se lavan los pocillos con medio Optimen y se les añade 1’6 ml del mismo a cada pocillo. Tras los 20 minutos de incubación, se añaden 400 µl de la mezcla Optimen/Dharmafect/oligos al pocillo correspondiente. 86 Materiales y Métodos Producción viral. Para la producción de retrovirus y lentivirus, se utilizó la línea celular HEK293T (amblemente cedida por el Dr. Antonio Rodríguez Márquez, CNIO, Madrid) y los siguientes plásmidos: Plásmidos retrovirales: el plásmido pCI-VSV-G, que codifica para la expresión del gen de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), comunmente utilizada para el pseudotipaje de lentivirus y retrovirus y el plásmido pVpack-GP-dl, que codifica para la expresión de los genes virales gag, pol, fueron amablemente cedidos por el Dr. Antonio Rodríguez. El plásmido pBabe.Puro y el plásmido pLPCX, que sirvieron de base para la contrucción de los plásmidos pBabe-FLIPL, pLPCX-FLIPS, que codifican para la expresión de las proteínas cFLIPL y cFLIPS, fueron amablemente cedidos por el Dr. Mauricio Reginato (Drexel University, Filadelfia). Los plásmidos pBabe-Bcl2 y pBabe-dnFADD, que codifican para la expresión de la proteína Bcl2 y de una forma negativa de FADD, respectivamente, fueron amablemente cedidos por el Dr.Mauricio Reginato (Drexel University, Filadelfia). Para la construcción de los plásmidos pBabeFLIPL y pLPCX-FLIPS se siguió la siguiente estrategia: la secuencia de ADN que codifica para la proteína cFLIPL, se subclonó del vector pCR3.V64-MetFlag-Stop (amablemente cedido por el Dr. J. Tschopp) utilizando las dianas de restricción para XhoI/BamHI, al vector pBabe.Puro utilizando las dianas de restricción para BamHI/SalI. La secuencia de ADN que codifica para la proteína cFLIPS, se subclonó del vector pCR3.V62-Met-Flag (amablemente cedido por el Dr. J. Tschopp) al vector pLPCX utilizando las dianas de restricción para HindIII/NotI. 87 Materiales y Métodos Plásmidos lentivirales: el plásmido pMD2.G, que codifica para la expresión del gen de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) comummente utilizada para el pseudotipaje de lentivirus y retovirus, el 88 Materiales y Métodos plásmido psPAX2, que codifica para la expresión de los genes virales gag, pol y rev y el plásmido pLVTHM que codifica para la expresión del shRNA de interés y que sirvió de base para la construcción de los plásmidos pLVTHM-shFLIPL y pLVTHM-shScrambled, fueron amablemente cedidos por la Dra. Rosa Mª Rios (CABIMER). Para la construcción de los plásmidos pLVTHM-shFLIPL y pLVTHM-shScrambled(Control) se siguió la siguiente estrategia: la secuencia de ADN correspondiente al shRNA de cFLIPL y del shRNA-Scrambled se clonaron en las dianas de rescticción para BglII y HindIII del vector pSUPER.RETRO. Posteriormente la secuencia de ADN codificante para el promotor HI (incluída en el vecotr pSUPER-RETRO) unida a la secuencia de los shRNA fue subclonada en el plámido pLVTHM utilizando las dianas de restricción para EcoRI/CLAI del plásmido pLVTHM. La producción de retrovirus y lentivirus se realizó mediante la transfección, con los plásmidos correspondientes, de las células HEK293T por el método del fosfato cálcico (Ausubel, F.M. et al. 1994) basado en la obtención de un precipitado de cloruro cálcico y ADN en una solución salina de fosfatos. El precipitado forma agregados que pueden ser endocitados/fagocitados por las células. Brevemente: se sembraron 2x106 células en placas de 90 mm en 10 ml de medio completo, para que al dia siguiente, al transfectar, tengan una confluencia de entre el 50-80%. 3 horas antes de la transfección se sustituyó el medio de cultivo por 8 ml de medio fresco. Las células se transfectaron con 30 µg de ADN total en una proporción 1:2:3 de plasmido pMD2.G (4’5 µg), plásmido psPAX2 (9 µg) y plásmido pLVTHM-shFLIPL o pLVTHM-shScrambled (13’5 µg), en el caso de lentivirus, y 4’5 µg de plásmido pCI-VSV-G, 9 µg de plásmido pVpackGP-dl y 13’5 µg de plásmido pBabe-FLIPL, pLPCX-FLIPS, pBabe-Bcl2 o 89 Materiales y Métodos pBabe-dnFADD según corresponda, en el caso de retrovirus. El ADN de los tres plásmidos se mezcla suavemente y se añade gota a gota a un tubo con 0’5 ml de HBS 2X. Tras mezclar suavemente, se añaden, despacio y gota a gota, 30 µl de CaCl2 2’5M y se agita inmediatamente. Se deja incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos y se añaden 0’5 ml de la mezcla a cada placa de células gota a gota. Las células se dejan en un incubador a 37ºC y 5% de CO2 durante 12 horas. Tras este tiempo se retira el medio de transfección y se añaden 8 ml de medio fresco, incubandose bajo las mismas condiciones durante 48 horas más, en el caso de lentrivirus y 72 horas en el caso de retrovirus. Tras este tiempo, se recoge el medio celular y se centrifuga 5 minutos a 3000 rpm para eliminar los restos celulares. Posteriormente, se purifica pasándolo a través de filtros de 0’45 µm. Una vez filtrado, los virus presentes en el medio celular se concentran mediante centrifugación en filtros Vivaspin 20 Polyethersulfone 100.000 MWCO (Sartorius Gropu-DICSA), a una velocidad de 1.800xg y a una temperatura de 4ºC. Tras la concentración se almacenan a -80ºC. Para conocer el título viral, se sembraron 80.000 células MCF-10A en pocillos de placas de 6 pocillos. A la mañana siguiente, se añadieron a cada pocillo cantidades crecientes de virus. Se completó hasta 1ml con medio fresco y se añadió Polybrene a la concentración de 8 µg/ml. Tras 48 horas, se midió el porcentaje de células positivas para GFP mediante citometría de flujo y se obtuvo una curva de infección, mediante la cual podemos conocer la cantidad de virus obrtenida y el volumen de virus necesarios para infectar a un determinado número de células. En el caso de la producción de retrovirus, tras eliminar los restos celulares y purificar el medio celular con los filtros de 0.45 µm se alícuota el sobrenadante y se mantiene a -80ºC. 90 Materiales y Métodos HBS 2X 280 mM NaCl 100mM Hepes 1’5mM Na2HPO4 Ajustar el pH a 7’5. Infecciones virales. Infección retroviral: Para la obtención de células MCF-10A que sobrexpresan cFLIPL, cFLIPS, Bcl-2 o una forma dominante negativa de FADD, se sembraron 500.000 células en una placa de 90 mm. Al día siguiente se infectaron con una mezcla de 2 ml de sobrenadante viral obtenido como se comenta en el apartado anterior, 2 ml de medio fresco y Polybrene a una concentración de 8µg/ml. A las 5-6 horas de la infección se la añaden 6ml de medio freco y se dejan otras 15-16 horas. Pasado este tiempo, se retira el medio de infección y se añade medio fresco nuevo. Tras 48 horas, se añade el antibiótico de selección puromicina a una concentración de 1’5 µg/ml y se seleccionan durante otras 48 horas. Infección lentiviral: Para la obtención de células MCF-10A que expresan el shRNA-FLIPL o el shRNA-Scrambled se sembraron 80.000 células en pocillos de placas de 6 pocillos. Se infectaron con el volumen adecuado de virus según la titulación viral, se completó hasta 1 ml con medio completo y se añadió Polybrene a una concentración de 8µg/ml. Tras 5 horas se le añadió 2 ml de medio freco al pocillo. Al día siguiente se retira el medio de infección y se añaden 2 ml de medio freco. Ensayos de anoikis. 91 Materiales y Métodos Sembrar en placas de 6 pocillos tratadas con polyHema (SIGMA P3932 Poly 2-hydroxyethyl methacrylate) 400.000 células por pocillo en medio completo suplementado al 50% con medio completo más Methocel (Sigma/Fluka BioChemika, 64670). Al mismo tiempo sembrar el mismo número de células en placas de 6 pocillos sin tratar con polyHema. Tras 24 o 48 horas recoger las células para western blot. Para tratar las placas con olyHema, preparar una solución cuya concentración de polyHema sea 120 mg/ml en etanol absoluto (por ejemplo: 2.5 g Polyhema + 20.75 ml etanol 95%). Dejar en agitación a 37ºC toda la noche cerrando bien el tubo para evitar la evaporación del etanol. Centrifugar 30min a 2500rpm a temperatura ambiente. Después de centrifugar a veces sale un poco turbio, pero dejando el tubo de pie a T.A. se va quedando translúcido. De la solución stock 120mg/ml se hace una dilución 1:20 con etanol absoluto para obtener una concentración final de Polyhema de 6 mg/ml. Al diluir el polyhema suelen formarse algunos grumos. Dejar de nuevo en agitación a 37ºC con el tubo bien cerrado hasta que se disuelvan los grumos. Se necesita 1 ml de Polyhema por pocillo (placa de 6 pocillos). Lavar los pocillos con 2mL/p de PBS estéril 2 veces antes de sembrar la placa. Para preparar medio de crecimiento celular con methocel al 1%, pesamos 5 gramos de methocel y lo añadimos a una botella de 500 ml esterilizada. Añadimos también a la botella un agitador magnético. Autoclavamos el methocel durante 20 minutos. Añadimos a la botella con methocel 500ml de medio de crecimiento de las células MCF-10A y dejamos agitando a 4ºC durante toda la noche o hasta que el methocel se haya disuelto. Estudios de morfogénesis Cultivos tridimensionales de células epiteliales. 92 Materiales y Métodos En primer lugar, se repartieron 50 µl de Matrigel (GFR BD; Ref. 354230) previamente descogelado en hielo, en cada pocillo de la placa (BD Transduction, Ref. 354118). Se dejó la placa en el incubador celular durante 20 minutos para que el Matrigel gelificase y a continuación se añadieron 5.000 células por pocillo resuspendidas en 400 µl de medio de ensayo 3D, al que se suplementó con 5ng/ml de EGF (Peprotech) y 2% de Matrigel. Las células se incubaron a 37ºC y 5% de CO2 durante 7, 10, 15 o 18 días, para el estudio de formación de acinos. Cada 4 días el medio era sustituido por otros 400 µl de medio de ensayo 3D, suplementado con 5ng/ml de EGF (Peprotech) y 2% de Matrigel. Inmunofluorescencia en 3D. Para el estudio de la formación de acinos mediante microscopia, los acinos se fijaron, en la propia placa de cultivo, con 400 µl de una solución al 4% de Formalin (Sigma HT501128) en PBS, durante 20 minutos y a temperatura ambiente. Después se lavaron 3 veces durante 10 minutos con 400 µl de una solución pBS/Glicina 1X a temperatura ambiente. A continuación se realizó un primer bloqueo con 400 µl de Buffer IF Wash 1X + 10% de suero de cabra (Sigma, G9023) durante 1 hora a temperatura ambiente. El segundo bloqueo se realizó con 200 µl de una solución IF Wash 1X + 10% de suero de cabra + 1:100 de F (ab)2 (Jackson Immunoresearch 115006-006) durante 30-30 minutos a temperatura ambiente. A continuación se puede dejar incubando toda la noche en agitación muy suave a 4ºC con el anticuerpo primario deseado, generalmete caspasa-3 activa para determinar apoptosis, a una concentración de 1:100 en 200 µl de bloqueo secundario. Al día siguiente se lavan los pocillos 3 veces con 400 µl de IF Wash 1X a temperatura ambiente, con agitación muy suave durante 20 minutos. Seguidamente se incuban las muestras con el anticuerpo 93 Materiales y Métodos secundario correspondiente en 200 µl de una solución IF Wash + 10% de suero de cabra, en oscuridad, a temperatura ambiente y en agitación muy suave durante 1 hora. Tras la incubación se vuelven a lavar 3 veces durante 20 minutos cada una, con IF Wash 1X, en oscuridad, a temperatura ambiente y en agitación muy suave. Posteriormente, se incubaron con 20ng/ml de una solución DAPI (Sigma, D9542) en PBS, durante 15 minutos en oscuridad y se realizó un último lavado en IF Wash 1X, antes de montar las muestras y analizarlas en el microscopio. Si no se van a teñir las muestras con ningún anticuerpo, tras el segundo bloqueo se puede añadir directamente la solución de DAPI/PBS, y seguir a partir de ahí. Análisis de las muestras por microscopia confocal. El correcto desarrollo de la morfogénesis y formación de lumen, se analizó en un microscopio confocal espectral (Leica TCS-SP5), utilizando un objetivo HCXPLAPO con un aumento 20X y una apertura numérica de 0.7 de inmersión. El sofware para la adquisición y análisis de imágenes fue LAS AF. Se analizaron un mínimo de 100 acinos por muestra, obteniendo el porcentaje de acinos vacios (4 o menos células en el interior del lumen), en los diferentes dias del desarrollo morfogénico. Western blot. Para el análisis de proteínas a partir de acinos las células se sembraron en placas de doce pocillos y se siguió el siguiente protocolo: se reparten 150 µl de matrigel en los pocillos de las placas. Se deja gelificar el matrigel a 37ºC durante 15-20 minutos y se añaden 20.000 células por pocillo. El medio de los pocillos se debe cambiar cada 4 dias al igual que en los ensayos de morfogénesis para inmunofluorescencia. El dia deseado de la morfogénesis, para obtener extractos celulares a partir de los acinos, se aspira el medio de 94 Materiales y Métodos los pocillo y se lava dos veces con 500 µl de tripsina. Se añaden otros 800 µl y con la punta de la pipeta se rasca el pocillo y su contenido se vierte en un tubo de 15 ml. Se deja incubar a 37ºC durante 10 minutos y se centrifuga a 1000 rpm durate 4 minutos. Tras esta centrifugación deberíamos observa un pellet de células en el fondo del tubo. Si no es así, debemos añadir tripsina fresca e incubar de nuevo 10 minutos a 37ºC. Lavamos el pellet con PBS 1X, y volvemos a centrifugar. Aspirar el PBS y añadir entre 100-140 µl de buffer de lisis. Mantener en hielo durante 15 minutos y centrifugar durante 15 minutos a 4ºC. Medir la concentración de proteína del lisado y realizar una electoforesis SDS-PAGE como se ha comentado anteriormente. Medio de ensayo 3D: DMEM F12 500 ml Suero de caballo 10 ml Hidrocortisona (5mg/ml) 50 µl Toxina colérica (1mg/ml) 50 µl Insulina (10mg/ml) 500 µl Glutam/Pen/Strep 5 ml PBS/Glicina 10X 38 gr NaCl 9’38 gr Na2HPO4 2’07 gr NaH2PO4 37’5 gr Glicina Hasta 500 ml con agua. pH 7’4 IF Wash 10X 95 Materiales y Métodos 38 gr NaCl 9’38 gr Na2HPO4 2’07 gr NaH2PO4 2’5 gr NaN3 5 gr BSA 10 ml Triton X-100 2’05 ml Tween 20 Hasta 500 ml con agua pH 7’4 Análisis estadístico. La significación estadística se evaluó mediante la aplicación de la prueba estadística T-Test. Un valor de p menor de 0’05 se consideró estadísticamente significativo. 96 VI. RESULTADOS 97 Resultados 1. Sensibilización de células de cáncer de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. Papel de cFLIP. 1.1 Doxorrubicina y SAHA sensibilizan a células de cáncer de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. Aunque muchos tipos de tumores son sensibles a la apoptosis inducida por TRAIL, existe un importante número de células tumorales como las de neuroblastoma, cáncer pancreático, melanoma o cáncer de mama, principalmente, que son resistentes [4, 323, 324]. Más aún, repetidas aplicaciones de TRAIL a células sensibles, permiten la selección y expansión de células que han adquirido resistencia [324]. Por ello la caracterización de los mecanismos de resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL, no sólo es importante para el estudio de la transducción de señales de muerte, sino que también es esencial para el diseño de estrategias que ayuden a eliminar esta resistencia en futuras aplicaciones clínicas. Así, una de estas estrategias puede ser el uso combinado de TRAIL con agentes quimioterapéuticos que sensibilicen a la acción de éste. La doxorrubicina es un antibiótico de la familia de las antraciclinas, utilizado ampliamente en la quimioterapia del cáncer. El mecanismo de acción es complejo y aún no está plenamente esclarecido, aunque se piensa que actúa mediante su intercalación en el ADN. Se sabe que, al intercalarse, inhibe el avance de la topoisomerasa II en la replicación del ADN. La doxorrubicina se usa habitualmente en el tratamiento de algunas leucemias y en el linfoma de Hodgkin, así como en mieloma múltiple, cáncer de vejiga, pulmón, estómago, ovarios, tiroides y mama, entre otros [325] [326]. El principal inconveniente del uso de la doxorrubicina como antitumoral es la alta toxicidad cardiaca a dosis elevadas y los múltiples efectos secundarios que se producen en pacientes. Por ello, las 98 Resultados investigaciones se han centrado en desarrollar derivados de la doxorrubicina que tengan los mismos o mejores efectos antitumorales pero con menos toxicidad. Muchos análogos han sido probados como agentes antitumorales pero la doxorrubicina sigue siendo la antraciclina más usada y su uso en combinación con otros fármacos puede ser una alternativa para evitar la toxicidad de la doxorrubicina por sí misma [326]. Actualmente, en cotratamiento con TRAIL se encuentra en fase 1B de ensayos clínicos [4] [323]. Vorinostat o SAHA (suberoylanidile hydroxamic acid) es un miembro de una gran familia de compuestos inhibidores de las histonas deacetilasas que, actualmente, se están utilizando como terapia antitumoral. Se ha demostrado que los inhibidores de las histonas deacetilasas alteran el crecimiento de ciertos tipos de cánceres [327, 328]. Estas moléculas, muchas de las cuales han sido aisladas de fuentes naturales, han demostrado capacidad de inhibir la proliferación, inducir diferenciación y causar apoptosis en células tumorales. Una de las características de estas moléculas es la baja toxicidad que han mostrado en las pruebas preliminares. Aunque muchas de las pruebas para las potenciales terapias se han realizado sólo en cultivos celulares y modelos animales, los resultados de estas pruebas han sido muy prometedoras y varios fármacos ya se encuentran en ensayos clínicos. También se ha observado que los inhibidores de histonas deacetilasas afectan varios tipos de cánceres sólidos y hematológicos, incluyendo el neuroblastoma, el melanoma, leucemias, cáncer de próstata, de pulmón, de ovarios, de colon y de mama [327]. Los inhibidores de histonas deacetilasas se encuentran clasificados en categorías basadas en su estructura química. El mecanismo exacto por la cual estos compuestos funcionan no es todavía bien entendido y se piensa que cada inhibidor actúa sobre una histona deacetilasa 99 Resultados en concreto. La verdadera eficacia de los inhibidores de histonas deacetilasas todavía queda por determinar, pero en las evaluaciones han demostrado el potencial de ser tratamientos efectivos y selectivos para ciertas formas de cánceres. Estos compuestos pueden ser a su vez usados en combinación con otros agentes contra el cáncer [327, 329], como por ejemplo con TRAIL, y actualmente se encuentra en ensayos clínicos. Por todos estos antecendentes, decidimos estudiar si la doxorrubicina y el SAHA en combinación con TRAIL eran capaces de inducir apoptosis en células de cáncer de mama resistentes a TRAIL y determinar el mecanismo molecular. En cáncer de mama, la doxorrubicina es el agente quimioterapéutico más utilizado y está descrito que puede inducir apoptosis a través de la ruta mitocondrial en estas células [317]. La doxorrubicina provoca la acumulación de p53 en las células que deriva en un aumento de los niveles de receptores de TRAIL TRAIL-R1, R2 y R3. Así, para el estudio, utilizamos diferentes líneas de células epiteliales de cáncer de mama con diferencias en los niveles de expresión de p53. Las células MCF-7 que expresan niveles normales de p53 (MCF-7 C4), células MCF-7 que mantienen unos niveles reducidos de p53 porque sobrexpresan la proteína E6 de papilomavirus humano (MCF-7 E6) y células MDA-MB231 que expresan una isoforma de p53 mutada. Estas células fueron pretratadas con doxorrubicina antes de la acción de TRAIL y como se observa en la Figura 1A, el tratamiento combinado es capaz de inducir apoptosis, lo que no se da con los tratamientos por separado. 100 Resultados A) B) Figura 1. Sensibilización de las líneas tumorales de mama por doxorrubicina o SAHA a la apoptosis inducida por TRAIL. A) Las líneas celulares MCF-7 C4, MCF-7 E6 y MDA-MB231 fueron tratadas o no con doxorrubicina 500ng/ml durante 15 horas. Posteriormente se trataron con TRAIL 50ng/ml (MCF-7) o 500ng/ml (MDA-MB231) durante 8 horas. La viabilidad celular (MCF-7) fue determinada mediante el ensayo de cristal violeta y la apoptosis fue determinada mediante citometría de flujo por la cuantificación de SubG1 (MDA-MB231). B) Para el estudio de sensibilización con SAHA, las células fueron tratadas con 5µM de SAHA durante 8 horas y posteriormente tratadas con TRAIL 50ng/ml (MCF-7) o 500ng/ml (MDA-MB231) durante 15 horas. La apoptosis fue determinada mediante citometría de flujo por la cuantificación de SubG1 (MDAMB231) o la cuantificación de la externalización de la fosfatidilserina mediante tinción con Anexina V FLUOS (MCF-7). El aumento de los niveles de TRAIL-R2 tras el tratamiento con DXR podría explicar la sensibilización de las células de cáncer de mama a TRAIL 101 Resultados y, por eso, decidimos estudiar cómo se afectaban los niveles de receptores de TRAIL en membrana tras el tratamiento con DXR. Como se puede observar en la Figura 2, los niveles de expresión de TRAIL-R2 en membrana tras el tratamiento con DXR tan sólo aumentan en la línea tumoral MCF-7 C4, sin que el aumento sea significativo en las línas celulares tumoralels MCF-7 E6 y MDA-MB231. Estos resultados nos indican que el mecanismo de sensibilización a TRAIL mediado por DXR es, en primer lugar, independiente de p53, ya que células tumorales donde los niveles de dicha proteína se encuentra reducidos (MCF-7 E6), o bien mutados (MDA-MB231) también se sensibilizan y, en segundo lugar, parece independiente de un aumento de la expresión del receptor pro-apoptótico TRAIL-R2 en membrana. Así, decidimos profundizar en el mecanismo de sensibilización por doxorrubicina en células MCF-7 a la apoptosis inducida por TRAIL. Para determinar qué eventos de la ruta de señalización de TRAIL se afectan durante la sensibilización, decidimos comprobar, en primer lugar, si la mitocondria participaba en la apoptosis inducida por dicha sensibilización. Para llevar a cabo este estudio, utilizamos un clon de células MCF-7 que sobrexpresa la proteína antiapoptótica Bcl-2 (MCF-7 B6) y el clon control (MCF-7 A1). Como podemos observar en la Figura 3A, el tratamiento con ambos agentes provoca un aumento en la muerte en la línea celular MCF-7 control (A1), efecto que está completamente bloqueado en la que sobrexpresan Bcl-2 (B6). Así podemos concluir que la mitocondria juega un papel importante en la apoptosis inducida tras sensibilizar a las células a la acción de TRAIL con doxorrubicina, puesto que las células que sobreexpresan Bcl-2 se ven protegidas de la muerte. 102 Resultados A) B) C) Figura 2. Los niveles de receptores de TRAIL en membrana no aumentan significativamente tras el tratamiento con doxorrubicina. A) Las líneas celulares MCF-7 C4, (B) MCF-7 E6 y (C) MDA-MB231 se trataron con doxorrubicina 500ng/ml durante 15 horas y la expresión de los receptores de TRAIL en membrana fue determinada mediante citometría de flujo con anticuerpos primarios contra los receptores TRAILR1, TRAIL-R2, TRAIL-R3 y TRAIL-R4 (línea negra) o con un anticuerpo irrelevante P (línea gris) tal y como se describe en Materiales y Métodos. a Para profundizar aún más en el mecanismo molecular implicado en la sensibilización y estudiar de qué forma contribuye la mitocondria en este proceso, decidimos analizar qué ocurría con proteínas implicadas en la vía mitocondrial de apoptosis, como son citocromo C y Bax, tras el tratamiento DXR/TRAIL. Para ello, utilizamos células MCF-7 E6 y mediante experimentos de fraccionamiento celular, analizamos la liberación de 103 Resultados A) C) B) Figura 3. Participación de la mitocondria en el mecanismo de sensibilización por doxorrubicina a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama. (A) Células MCF-7 que sobrexpresan la proteína Bcl2 (B6) y sus células controles (A1) fueron tratadas con doxorrubicina (500ng/ml) durante 15 horas. Posteriormente se trataron con TRAIL (50ng/ml) durante 8 horas y la apoptosis se determinó mediante la cuantificación de la externalización de la fosfatidil serina por tinción con Anexina V FLUOS tal y como se describe en Materiales y Métodos. (B) Células MCF-7 E6 se trataron o no con doxorrubicina (500ng/ml) durante 15 horas. Posteriormente se trataron con TRAIL a las dosis indicadas durante 2 horas. Tras el tratamiento se realizó un fraccionamiento celular y por western-blot se analizaron los niveles de citocromo C y Bax en las diferentes fracciones celulares tal y como se describe en Materiales y Métodos. (C) las células MCF-7 E6 se trataron como en (B) y la activación de Caspasa-8 y la pérdida de Bid se determinaron mediante western-blot. citocromo C desde la mitocondria al citosol, y la translocación de Bax desde el citosol a la membrana mitocondrial. Como observamos en la Figura 3B, ya a las dos horas de tratamiento con TRAIL después de haber pretratado a las células con DXR, se observa una liberación de citocromo C al citosol, y una 104 Resultados pérdida de éste en la fracción membranosa. Esto ocurre en menor medida en las células que han sido tratadas sólo con DXR, y no se da en las que sólo se han tratado con TRAIL. Con Bax ocurre todo lo contrario, tras el tratamiento con DXR/TRAIL se ve un aumento de éste en la fracción membranosa y su pérdida en la fracción citosólica. Esto nos lleva a concluir que tras el tratamiento con DXR, dos horas con TRAIL son suficientes para que se observe un sinergismo entre ambos agentes, así que nos planteamos si este sinergismo podía observarse en eventos anteriores a la activación de la mitocondria en la vía de señalización apoptótica de TRAIL. Por tanto, decidimos estudiar la activación de caspasa-8 y el corte de Bid. Para ello células MCF-7 E6 fueron tratadas con DXR/TRAIL y la activación de caspasa-8 y de Bid fue analizada mediante western blot. Como se observa en la Figura 3C, el corte de procaspasa-8 y por lo tanto su activación se ve aumentada en las células que han sido pretratadas con DXR con respecto a las que no. Al mismo tiempo se observó un aumento del procesamiento de Bid. Estos datos pueden tener una doble interpretación: puede que el sinergismo actúe a niveles tempranos de la señalización de TRAIL (durante la formación del DISC), o puede que el aumento de caspasa-8 activa y de procesamiento de Bid sean consecuencia de la activación de la mitocondria, puesto que tras la salida de citocromo C desde la misma, éste se agrupa con caspasa-9 y Apaf-1 para formar el apoptosoma lo que lleva a la activación de caspasas efectoras como las caspasas 3 y 7 (en estas células no se produciría activación de caspasa-3 puesto que carecen de ella), y así activar a la caspasa-8 para potenciar la apoptosis iniciada desde la mitocondria. Por ello decidimos realizar un estudio de formación del DISC de TRAIL y activación de la caspasa-8 en el mismo en células MCF-7 E6 tratadas con DXR/TRAIL. 105 Resultados Figura 4. Aumento de formación del DISC de TRAIL en células tumorales de mama tratadas con Doxorrubicina. Las células MCF-7 E6 se trataron con doxorrubicina durante 15 horas (500 ng/ml) y posteriormente se trataron con TRAIL-b (biotinilado ,1µg/ml) durante 15, 30 y 60 minutos. El DISC de TRAIL se precipitó con bolitas de streptavidinaagarosa y se analizó por western blot para detectar los niveles de Caspasa-8 y FADD, como está descrito en Materiales y Métodos. Como se observa en la Figura 4, en el DISC de células pretratadas con DXR y posteriormente con TRAIL, se produce un aumento de procaspasa-8 y se observan los fragmentos resultantes de su activación, así como también podemos observar un aumento de los niveles de FADD. Según todos estos datos podemos concluir que la sensibilización a TRAIL por el tratamiento con DXR, tiene lugar ya desde los eventos más tempranos de la señalización de TRAIL. En relación al mecanismo que explique este aumento en la formación del DISC, no podemos descartar que el aumento de expresión del receptor TRAIL-R2 en membrana que se produce en algunas de las líneas celulares estudiadas tras el tratamiento con DXR sea suficiente para disparar este efecto. Pero también pude ocurrir que la DXR afecte la expresión de proteínas inhibidoras del DISC, como por ejemplo cFLIP, y una disminución de éste podría aumentar la formación del DISC y explicar con ello los datos observados. Así, decidimos estudiar qué ocurre con los niveles de expresión de cFLIP durante el tratamiento con DXR. Para ello células MCF-7 y MDAMB231 se trataron con DXR y la expresión de cFLIP fue analizada por western blot. Como observamos en la Figura 5, el tratamiento con DXR 106 Resultados disminuye los niveles de cFLIPs principalmente, lo que puede facilitar la activación de caspasa-8 en el DISC de TRAIL. Por tanto, podemos concluir que el mecanismo de sensibilización a TRAIL por doxorrubicina en células de cáncer de mama, se debe a un aumento de la activación de caspasa-8 en el DISC, favorecido por la bajada de expresión de cFLIPs inducida por DXR (evento común a células MCF-7 y MDA-MB231), además de por un aumento de expresión de TRAIL-R2 en membrana, también inducido por DXR (en células MDA-MB 231 principalmente). La mitocondria amplificaría el efecto apoptótico puesto que, como hemos demostrado, la ruta mitocondrial de apoptosis está activada en las células sensibilizadas. B) A) C) Figura 5. Doxorrubicina y SAHA disminuyen los niveles de cFLIP en células de cáncer de mama. Las células MDA-MB231 y MCF-7 fueron tratadas con doxorrubicina (A y B) durante 4, 8 y 15 hora. Posteriormente se determinaron los niveles de cFLIP mediante western blot. (C) Las células se trataron con SAHA (5µM) durante 24 horas y los niveles de cFLIP se determinaron mediante western blot. En la misma membrana, como control de carga, se determinaron los niveles de α-tubulina. Igualmente hemos analizado el mecanismo de la sensibilización a TRAIL por el inhibidor de histonas deacetilasas, SAHA (Figura 1B). En el tratamiento con SAHA también se produce una bajada en los niveles de expresión de cFLIP, lo que podría ser una de las causas de la sensibilización a TRAIL en células de cáncer de mama. Pero es más, la disminución en los niveles de expresión de cFLIP se puede extender a diferentes tratamientos sensibilizadores a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de 107 Resultados mama. Así lo refleja a modo de resumen la Tabla 1.Tanto la deprivación de glucosa, como el flavopiridol y la roscovitina (inhibidores de ciclinas dependientes de quinasas), o el nocodazol (inhibidor de la polimerización de microtúbulos) sensibilizan a la apoptosis inducida por TRAIL afectando de forma particular a los niveles de la proteína cFLIP, que se ven disminuidos tras el tratamiento, favoreciendo con ello la proporción caspasa-8/cFLIP en el DISC. El interferón gamma no disminuye los niveles de cFLIP (datos no mostrados), pero aumenta los de caspasa-8 con lo que el cociente caspasa8/cFLIP en el DISC de nuevo es favorable a la caspasa-8. Tratamiento Sensibilización Mecanismo a TRAIL IFN-γ Sí ↑ Formación del Ruiz-Ruiz C, et al. DISC . (Cancer Research ↑ Caspasa-8 Deprivación de Sí glucosa ↑ Formación del DISC ↓ FLIP 2000) Muñoz-Pinedo C et al. (JBC 2003). García-García C et al. (Biochem. Pharmacol 2009) Flavopiridol Roscovitina Sí Sí ↑ Formación del Palacios C, et al. DISC . (Cancer Research ↓ FLIP 2006) ↑ Formación del Ortiz-Ferrón G, et al. DISC. (Cell Research, 2008) ↓ FLIP Nocodazol Sí ↓ FLIP Sanchez-Perez et al. (Cell Death and Differentiation 2009) Tabla 1. Implicación de cFLIP en el mecanismo molecular de sensibilización a la apoptosis inducida por TRAIL. 108 Resultados cFLIP actúa a un nivel muy apical de la señalización de TRAIL impidiendo la completa activación de caspasa-8 en el DISC, por lo que se podría pensar que constituye un gran freno en la señalización apoptótica y que, por tanto, su grado de expresión en las células sería un determinante fundamental de la resistencia de las células a la acción de TRAIL. Es por ello, que decidimos estudiar más en detalle el papel que esta proteína tiene en la resistencia de células de cáncer de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. 1.2 cFLIP juega un papel fundamental en la resistencia de células de cáncer de mama a la acción de TRAIL. cFLIP ha sido descrito como proteína clave en la resistencia de células de tumorales a la apoptosis inducida por TRAIL. Para determinar la importancia que cFLIP puede tener en la resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama, decidimos suprimir los niveles de la proteína mediante ARN de interferencia (siRNA) y estudiar en estas condiciones la sensibilidad a TRAIL. Como se observa en la Figura 6, todas las líneas celulares testadas se sensibilizan a TRAIL cuando los niveles de cFLIP se han disminuido mediante la transfección de oligos de siRNA específicos para cFLIP, y no ocurre lo mismo cuando las células se han transfectado con un oligo control cuya secuencia consta de la misma composición de nucleótidos que el de cFLIP pero ordenados de forma aleatoria (oligo scrambled o SC), corroborándose la importancia de esta proteína en la resistencia a TRAIL en cáncer de mama. 109 Resultados Figura 6. La bajada de niveles de cFLIP por RNA de interferencia sensibiliza a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama. Células BT474 (A), MDA-MB435s (B) y MDA-MB231 (C) fueron transfectadas con el oligo de RNA de interferencia de cFLIP o el oligo control (scrambled) durante 24 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente las células fueron tratadas con TRAIL durante 15 h a las concentraciones indicadas. La apoptosis de determinó mediante la cuantificación de SubG1 por citometría de flujo.Los resultados muestran la media de tres exprerimentos independientes. Los niveles de cFLIP proteína se determinaron mediante western blot tras 24 horas de transfección con los oligos de RNA de interferencia. En la misma membrana y, como control de carga se determinaron los niveles de α-tubulina. 110 Resultados Existen, al menos 11 isoformas de ARN mensjero de cFLIP, pero sólo tres se traducen a proteína. Estas son FLIPL, FLIPS y FLIPR, aunque la expresión de esta última se ha observado principalmente en células Raji[213]. El papel de FLIPS como inhibidor de la apoptosis inducida por receptores de muerte está bien descrito pero no sucede lo mismo con el de FLIPL, para el que hay una mayor controversia y se le atribuyen funciones tanto de inhibidor como de activador de la caspasa-8 en el DISC. Es por ello que decidimos estudiar qué papel jugaba cada una de estas isoformas en la resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama. Así mediante siRNA suprimimos la expresión de cada una de las isoformas de cFLIP por separado y como se observa en la Figura 7, el grado de implicación en la resistencia a TRAIL depende de los niveles basales de expresión de dichas isoformas en cada una de las líneas celulares testadas. Así en células donde la expresión de ambas isoformas es similar, como en MDA-MB231, es necesario suprimir los niveles de ambas para sensibilizar a TRAIL. Sin embargo en otra línea celular como las BT474, donde predomina la expresión de cFLIPL, sólo eliminando la expresión de este conseguimos sensibilizar a TRAIL. Llegados a este punto podemos concluir que cFLIP es una proteína fundamental en la resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama, puesto que bajando sus niveles de expresión conseguimos sensibilizar a las células a la acción de TRAIL, lo que está en consonancia con lo descrito por otros en líneas celulares tumorales de diferente origen. 111 Resultados A) B) Figura 7. Papel de cada una de las isoformas de cFLIP en la resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama. A) MDA-MB231 y BT474 fueron transfectadas con el oligo de RNA de interferencia de cFLIPL, cFLIPS o el oligo control (scrambled) durante 24 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente las células fueron tratadas con TRAIL 500 ng/ml durante 15 h. La apoptosis de determinó mediante la cuantificación de SubG1 por citometría de flujo. B) Los niveles de proteína de cFLIP se determinaron mediante western blot tras 24 horas de transfección con los oligos de RNA de interferencia y en la misma membrana y como control de carga se determinaron los niveles de α-tubulina. 112 Resultados 1.3 Implicación de la mitocondria en la apoptosis inducida por la sensibilización de células de cáncer de mama a TRAIL. Para determinar si la mitocondria participa en la apoptosis que se produce al sensibilizar las células de cáncer de mama a TRAIL, decidimos utilizar la herramienta del RNA de interferencia y suprimir los niveles de una proteína implicada en la activación de la vía mitocondrial de apoptosis inducida por TRAIL, como es Bid, comprobando si el grado de sensibilización de las células se afectaba. Como se observa en la Figura 8, la bajada de niveles de Bid mediante RNA de interferencia, bloquea en gran medida la sensibilización a TRAIL inducida por IFN gamma, Doxorrubicina y Flavopiridol. Aunque tambiénhay una disminución en la sensibilización a TRAIL por Roscovitina, ésta no es tan significativa como en los tratamientos anteriormente citados. Esto puede ser debido a que la Roscovitina tiene un efecto más pleitrópico afectando a diferentes componentes celulares en su mecanismo de sensibilización a TRAIL [320]. Por lo tanto podemos concluir que la mitocondria participa en la apoptosis derivada de la sensibilización de las células a TRAIL por estos agentes quimioterapeúticos. Además, la mitocondria también está implicada en la apoptosis que se da en las células sensibilizadas a TRAIL por la bajada de expresión de cFLIP mediante RNA de interferencia, como se observa en la Figura 8F lo que nos demuestra el papel generalizado que tiene la mitocondria en la apoptosis inducida por sensibilización a TRAIL en células de cáncer de mama. 113 Resultados A) C) B) D) E) Figura 8. La ruta mitocondrial de apoptosis participa en los mecanismos de sensibilización a TRAIL en células de cáncer de mama. (A-D) Lás células MDAMB231 fueron transfectadas con el oligo de RNA de interferencia de Bid o el scrambled como se determina en Materiales y Métodos durante 48 horas. Tras este tiempo, las células fueron tratadas con Interferon gamma (10ng/ml) durante 15horas, Doxorrubicina (500ng/ml) durante 7 horas, flavopiridol (100nM) durante 7 horas o Roscovitina (20µM) durante 7 horas. Posteriormente las células se trataron con TRAIL 500ng/ml durante 15 horas, excepto en el caso del interferón gamma donde el tratamiento con TRAIL fue de 24 horas. La apoptosis se determinó mediante la cuantificación de SubG1 por citometría de flujo. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. E) Células tumorales de mama MDA-MB231 fueron transfectadas con el oligo de RNA de interferencia de Bid o scrambled como se determina en Materiales y Métodos durante 48 horas. Pasado este tiempo los niveles de Bid se determinaron por western blot. En la misma membrana y, como control de carga, se determinaron los niveles de α-tubulina. 114 Resultados F) Figura 7. La ruta mitocondrial de apoptosis participa en los mecanismos de sensibilización a TRAIL en células de cáncer de mama. F) Las células BT474 fueron cotransfectadas con los oligos de RNA de interferencia para cFLIP y Bid durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente las células se trataron con TRAIL (500ng/ml) durante 15 horas y la apoptosis se determinó mediante la cuantificación de SubG1 por citometría de flujo. Los resultados muestran la media de tres experimentos independientes. 115 Resultados 2. Papel de cFLIP en la supervivencia celular. 2.1 La disminución de cFLIP por RNA de interferencia induce apoptosis en células de cáncer de mama. Durante la realización de los experimentos de siRNA de cFLIP, observamos una cierta muerte basal en aquellas células a las que les suprimíamos los niveles de cFLIP, y no ocurría lo mismo en las células controles o las transfectadas con un oligo control (scrambled o SC). Así decidimos prolongar el tiempo de transfección de 24 a 72 horas y ver si esta muerte basal aumentaba o, por el contrario, se mantenía al mismo nivel, con lo que asumiríamos que la muerte se debía al propio proceso de transfección. Como se observa en la Figura 9A, tras 72 horas de transfección con los oligos de siRNA, la muerte inducida por la pérdida de cFLIP aumenta significativamente. Al igual que en el proceso de sensibilización, la eliminación de la isoforma larga en las células BT474, es suficiente para provocar esta muerte espontánea, sin embargo en células como las MDAMB231, donde ambas isoformas se expresan a niveles similares, es preciso eliminar las dos para inducir la muerte. Esta muerte es además dependiente de caspasas, puesto que al tratar las células con el inhibidor general de caspasas benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethyl ketone (Z- VAD-fmk) conseguimos bloquearla completamente (Figura 9C). Además al sobrexpresar FLIPL, también bloqueamos esta apoptosis (Figuara 9D) con lo que podemos confirmar que la muerte es debida al silenciamiento de la expresión de cFLIP y no a efectos inespecíficos de los oligos de siRNA. 116 Resultados A) B) Figura 9. Disminuir los niveles de cFLIP mediante siRNA induce apoptosis en células de cáncer de mama. A) Células MDA-MB231, BT474, y EVSA-T fueron transfectadas con los oligos de RNA de interferencia de cFLIPL, cFLIPS o scrambled como se describe en Materiales y Métodos durante 72 horas. La apoptosis se determinó por citometría de flujo mediante la cuantificación de SubG1. Los resultados muestran la media de tres experimentos independientes. (B) Las células MDA-MB231, BT474 y EVSA-T se trataron como en (A) y los niveles de proteína cFLIP se determiaron mediante western blot. En la misma membrana, y como control de carga se determinaron los niveles de α-tubulina. 117 Resultados C) D) Figura 8. Disminuir los niveles de cFLIP mediante RNA de interferencia induce apoptosis en células de cáncer de mama. C) Células tumorales de mama MDAMB231 y BT474 fueron transfectadas como se describe en Materiales y Métodos con los oligos de RNA de interferencia de cFLIP en presencia o no del inhibidor general de casapasas Z-VAD (50 uM) durante 72 horas. La apoptosis fue determinada por la cuantificación de SubG1 mediante citometría de flujo. Los resultados muestran la media de tres experimentos independientes. D) Las células MDA-MB231 que sobrexpresan cFLIPL o células MDA-MB231 control (pBabe) fueron transfectadas con el oligo de RNA de interferencia para cFLIP o con el oligo scrambled durante 72 horas. La apoptosis se cuantificó como en (A). Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. Los niveles de cFLIP fueron determinados mediante western blot. La inducción de una apoptosis espontánea independiente de ligando por la bajada de expresión de cFLIP, ha sido descrito recientemente en células de cáncer [330] [331], por lo que se le atribuye un papel no sólo antiapoptótico en la señalización por receptores de muerte sino también como proteína implicada en la supervivencia celular. Por todo ello, en los 118 Resultados últimos años se está proponiendo a cFLIP como diana terapeútica del cáncer, pero poco se conoce del papel de cFLIP en la supervivencia y como regulador de la apoptosis en células no transformadas. Cabe destacar que el ratones deficientes en el gen cFLIP creados por recombinación homóloga, mueren durante el período embrionario por defectos en el desarrollo del corazón. También se ha descrito el papel que FLIP tiene en la proliferación y activación en células no transformadas, principalmente del sistema inmune. Por todos estos antecedentes, otro de los objetivos de esta tesis ha sido estudiar si cFLIP regulaba la apoptosis inducida por TRAIL en células epiteliales de mama no tumorales MCF-10A y si también en estas células se producía una apoptosis espontánea como consecuencia de la bajada de expresión de cFLIP, además de profundizar en el mecanismo molecular que subyace a esta apoptosis y conocer la repercusión biológica de esta pérdida de expresión. 2.2 La bajada de expresión de cFLIP por siRNA induce apoptosis en céleulas epiteliales no transformadas de mama MCF-10A. Como vemos en la Figura 10A, el silenciamiento de cFLIP sensibiliza a células epiteliales de mama no transformadas, MCF-10A a la apoptosis inducida por TRAIL. También observamos que estas células expresan niveles más altos de cFLIPL que de cFLIPS (Figura 10B), con lo que, al igual que en las tumorales BT474, el sólo hecho de disminuir la expresión de cFLIPL sensibiliza a TRAIL. Al igual que en las tumorales, que la bajada de proteína cFLIPL induce una apoptosis espontánea dependiente de caspasas (Figura 10C-D) y que se inhibe al sobrexpresar cFLIPL (Figura 10E). 119 Resultados A) C) E) B) D) Figura 10. Disminuir los niveles de cFLIP mediante siRNA induce apoptosis en células epiteliales no transformadas de mama. (A) Las células epiteliales de mama normales transformadas MCF-10A se transfectaron con los oligos de RNA de interferencia de cFLIP o el oligo scrambled durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos.Las últimas 24 horas se mantuvieron en presencia de TRAIL 100ng/ml Pasado este tiempo la apoptosis fue determinada por citometría de flujo. mediante la cuantificación de SubG1. Los datos representan la media de tres experimentos independientes (B) Las células se trataron como en (A) y los niveles de cFLIP se determinaron por western blot. En la misma membrana y como control de carga se determinaron los niveles de α-tubulina. C-D) Las células se trataron como en (A) en presencia o no del inhibidor general de caspasas Z-VAD (50µM). La apoptosis se cuantificó como en (A). Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. E) Células MCF-10A que sobrexpresan FLIPL o las células MCF-10A controles (pBabe) se trataron como en (A). La apoptosis también se cuantificó como en (A). Los resultados muestran la media de tres experimentos independientes. Los niveles de cFLIP se determinaron mediante western blot. 120 Resultados Con el objetivo de estudiar más a fondo el mecanismo molecular por el que se producía esta muerte espontánea, decidimos comprobar si las proteínas implicadas en la activación de la ruta extrínseca de apoptosis, también estaban implicadas en esta muerte. 2.3 La apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP por siRNA requiere del receptor de TRAIL, TRAILR2. Tanto las células MCF-10A como las tumorales MDA-MB231 expresan TRAIL-R2 principalmente, y éste es el receptor implicado en la sensibilización a TRAIL de estas células [165]. Así, decidimos reducir los niveles de proteína de TRAIL-R2 en MCF-10A mediante RNA de interferencia, al mismo tiempo que bajamos los de cFLIPL, y comprobamos que la apoptosis inducida por el silenciamiento de la proteína cFLIPL era significativamente inhibida (Figua 11A). Estos resultados nos indican que la muerte inducida por siFLIP está mediada por el receptor de TRAIL TRAILR2. Mediante western blot comprobamos la bajada de expresión de TRAILR2 y cFLIPL (Figura 11B). Para determinar si otro receptor de muerte podría estar implicado en la inducción de apoptosis mediada por la bajada de expresión de cFLIP por RNA de interferencia, comprobamos que las células MDA-MB231 no se sensibilizan a TNF al disminuir los niveles de cFLIP (Figura 11C), aunque éste es capaz de señalizar para activar NF-kB en estas células (Figura 11D), con lo que en principio se puede descartar la implicación del receptor de TNF en la apoptosis espontánea inducida por la bajada de expresión de cFLIP por siRNA. 121 Resultados B) A) C) D) Figura 11. El receptor TRAIL-R2 está implicado en la apoptosis inducida por la disminución de los niveles de cFLIP mediante RNA de interferencia. (A) Las células MCF-10A fueron co-transfectadas con los oligos de RNA de interferencia para cFLIP y TRAIL-R2 durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente se determinó la apoptosis mediante citometría de flujo por cuantificación de SubG1. Los resultados muestran la media representativa de dos experimentos independientes. (B) Las células fueron tratadas como en (A) y mediante western blot se determinaron los niveles de cFLIP y TRAIL-R2. En la misma membrana y como control de carga se determinaron los niveles de GADPH. (C) Las células MDA-MB231 se transfectaron con los oligos de RNA de interferencia de cFLIP durante 24 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente las células se trataron con TRAIL (500ng/ml las MDA-MB231) o TNF 50ng/ml durante 15 horas. La apoptosis se determinó mediante citometría de flujo por cuantificación de SubG1. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. D) Las células MDA-MB231 fueron transfectadas con el plásmido NFkBLuc o el plásmido control pXP2 durante 24 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente se tratatron con TNF (50ng/ml) durante 15 horas. La actividad transcripcional de NF-kB medida como actividad luciferasa y expresada como unidades relativas de luciferasa (RLUs), se determinó como se describe en Materiales y Métodos. Los datos muestran la media representativa de dos experimentos. 122 Resultados 2.4 La apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP es independiente de ligando. A continuación investigamos si la bajada de expresión de cFLIP por siRNA inducía la expresión de TRAIL y la activación autocrina o paracrina de apoptosis en células de mama. Como se observa en la Figura 12A, la bajada de cFLIP no provoca cambios en la expresión de TRAIL en células tumorales BT474. Como control positivo de inducción de TRAIL, tratamos células MCF-7 con interferón gamma que provoca un aumento en los niveles de expresión de TRAIL [332]. Además, mediante array de ARN comprobamos que la bajada de expresión de cFLIP no inducía cambios significativos en la expresión génica de TRAIL ni de otros genes relacionados con apoptosis en células tumorales BT474. Aunque la bajada de expresión de cFLIP no provocaba un aumento en los niveles de expresión de TRAIL, no podíamos descartar un aumento en su secreción al medio. Por ello, decidimos bloquear la acción de TRAIL extracelular mediante el tratamiento de la células con una proteína de fusión entre el receptor TRAILR2 y el dominio Fc de las inmunoglobulinas (TRAILR2-Fc) que tiene la capacidad de unirse al TRAIL del medio impidiendo que éste, a su vez, se una al receptor TRAIL-R2 de la membrana plasmática, evitando así su activación. Así comprobamos que las apoptosis inducida por siFLIP se producia independientemente del bloqueo de la unión de TRAIL a su receptor en membrana TRAIL-R2 (Figura 12B). Sin embargo el anticuerpo TRAIL-R2-Fc era capaz de inhibir la apoptosis inducida por TRAIL cuando éste era añadido al medio extracelular como se ve en la Figura 12 C. Estos resultados nos indican que la apoptosis inducida por siFLIP es independiente del ligando de muerte TRAIL. 123 Resultados A) B) C) Figura 12. La apoptosis inducida por la bajada de niveles de FLIP por RNA de interferencia es independiente del ligando de muerte TRAIL. (A) Las células BT474 se transfectaron con los oligos de siRNA de cFLIP, cFLIPL o el oligo scrambled durante72 h como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente mediante western blot se analizaron los niveles de cFLIP y de TRAIL. Como control positivo de inducción de TRAIL, las células MCF-7 fueron tratadas con interferón gamma (10ng/ml) durante 24 horas. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de αtubulina. B) Las células MCF-10A fueron transfectadas con los oligos de RNA de cFLIPL o el oligo scrambled como se describe en Materiales y Métodos durante 72 horas. A las 24 horas de transfección de trataron con el anticuerpo TRAIL-R2-Fc. La apoptosis se determinó mediante citometría de flujo por cuantificación de SubG1. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. (C) Las células MCF-10A fueron tratadas con TRAIL 100ng/ml en presencia o ausencia de TRAIL-R2-Fc durante 24 horas. Posteriormente la apoptosis se determinó mediante citometría de flujo por cuantificación de SubG1. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. 124 Resultados 2.5 Los componentes del DISC de TRAIL, FADD y Caspasa-8 participan en la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP. La unión de TRAIL a TRAIL-R2 induce la formación del DISC que se constituye con el propio receptor, la proteína adaptadora FADD y caspasa-8 con la consecuente activación de ésta. Para estudiar si los componentes del DISC de TRAIL eran necesarios para la apoptosis inducida por siFLIP, decimos eliminar cada una de estas proteínas por separado y ver el efecto que esto causaba en la muerte inducida por siFLIP. Para comprobar la participación de FADD, disminuimos los niveles de la proteína mediante siRNA y comprobamos que, tanto en células tumorales como en células no transformadas, FADD participaba en la muerte, porque al reducir sus niveles la apoptosis inducida por siFLIP se inhibía (Figura 13A). Además, la sobreexpresión de una forma dominante negativa de FADD mediante infección retroviral en células MCF-10A también inhibía la apoptosis inducida por siFLIP (Figura 13 C). Del mismo modo estudiamos el requerimiento de la caspasa-8. Mediante siRNA disminuimos la expresión de caspas-8 como se observa en la Figura 14A y comprobamos que la muerte inducida por la bajada de expresión de cFLIP por RNA de interferencia se inhibía totalmente tanto en células MCF-10A como en células tumorales BT474 (Figura 14B). 125 Resultados A) B) C) Figura 13. FADD participa en la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP por siRNA. (A) Las células BT474 y MCF-10A fueron co-tansfectadas con los oligos de RNA de interferencia de cFLIP y FADD durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente se determinó la apoptosis mediante citometría de flujo por cuantificación de células hipodiploides. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. (B) Las células BT474 y MCF-10A se trataron como en (A) y los niveles de proteína de cFLIP y FADD se analizaron mediante western blot. (C) Las células MCF-10A que sobrexpresan una isoforma dominante negativa de FADD (dnFADD) fueron tratadas como en (A) y la apoptosis también fue determinada como en (A). Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. 126 Resultados A) B) Figura 14. Caspasa-8 es necesaria para la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP por siRNA. (A) Las células BT474 y MCF-10A fueron co-tansfectadas con los oligos de RNA de interferencia de cFLIP y Caspasa-8 o con el oligo scrambled durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos. Los niveles de proteína de cFLIP y FADD se analizaron mediante western blot. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de GAPDH. B) Las células BT474 y MCF-10A se trataron como en (A) y además las células BT474 fueron tratadas con 500ng/ml de TRAIIL a las 48 horas de transfección. Posteriormente se determinó la apoptosis mediante citometría de flujo por cuantificación de SubG1. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. 2.6 La muerte inducida por la bajada de expresión de cFLIP siFLIP requiere la ruta mitocondrial de apoptosis. A continuación, quisimos comprobar si la mitocondria participaba en esta apoptosis y para ello disminuimos los niveles de expresión de Bid, proteína proapoptótica que se procesa por caspasa-8 para dar lugar a su forma truncada activa y participa en la señalización mitocondrial de 127 Resultados apoptosis inducida por TRAIL. Como se observa en la Figura 15A, la bajada de expresión de Bid mediante RNA de interferencia, inhibe la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP. Igualmente comprobamos que la sobrexpresión de la proteína antiapoptótica Bcl2 en células MCF-10A mediante infección retroviral también inhibía la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP (Figura 15C). Estos datos nos indican que la ruta mitocondrial de apoptosis participa en la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP mediante RNA de interferencia. Todos estos datos demuestran que la ruta de apoptosis de TRAIL está implicada en la apoptosis inducida por siFLIP, aunque como hemos mostrado parece independiente del ligando TRAIL. Estos resultados puenden indicar al menos dos posibles mecanismos. Uno, que los componentes del DISC de TRAIL esten asociados, aún en ausencia del ligando, y que la unión de TRAIL al receptor o bien una variación en los niveles de sus componente como, por ejemplo, una bajada en la expresión de cFLIP, induzca la activación de caspasa-8 y la consecuente cascada apoptótica. Por otra parte puede ocurrir que al igual que con TNF [104] o Fas [105], los receptores de TRAIL estén pre-asociados en condiciones basales [106] y que una bajada en la expresión de cFLIP favorezca la asociación de FADD y caspasa-8 a este. Por otra parte, se ha descrito que FLIPL se encuentra asociado al receptor TRAIL-R2 en condiciones normales, y que la inhibición de esta asociación induce apoptosis independiente de ligando [333]. Para determinar qué ocurre con los componentes del DISC de TRAIL, y si hay asociación entre ellos en ausencia de ligando cuando bajamos la expresión de cFLIP, decidimos inmunoprecipitar TRAIL-R2 en células donde bajamos los niveles de cFLIPL mediante infección lentiviral de un shRNA para cFLIPL, o en células infectadas con un shRNA control (scrambled). Sin embargo no hemos sido capaces de detectar asociación del 128 Resultados receptor TRAIL-R2 con ninguno de los componentes del DISC de TRAIL en ausencia de ligando, ni en células infectadas con el shScrambled (Control) ni en las células infectadas con el shFLIPL. Es importante indicar que la apoptosis que se induce por la bajada de expresión de cFLIPL es un proceso lento ya que tras 72 horas de inhibir su expresión el porcentaje de células apoptóticas que detectamos está en el mejor de los casos en torno al 50%, por lo que esta aproximación metodológica puede no ser la más adecuada para detectar asociación entre proteínas. Otra aproximación metodológica más directa sería la detección de la asociación de los componentes del DISC de TRAIL mediante inmunofluorescencia, pero en cualquier caso, los datos obtenidos harían referencia a una co-localización de estos y no asegurarían una asociación física entre ellos. Por todo esto sólo podemos concluir que la bajada de expresión de cFLIP tanto en células tumorales como normales trasformadas de mama, induce apoptosis. Esta apoptosis requiere de los componentes del DISC de TRAIL, TRAIL-R2, FADD y Caspasa-8 pero es independiente del ligando TRAIL. También demostramos que esta apoptosis activa la ruta mitocondrial, puesto que la inhibición de la expresión de la proteína proapoptótica Bid, o la sobrexpresión de la antiapoptótica Bcl-2 bloquea parcialmente dicha apoptosis. 129 Resultados A) B) C) Figura 15. La ruta mitocondrial de apoptosis participa en la muerte inducida por la bajada de expresión de cFLIP por siRNA. (A) Las células MCF10A fueron co-tansfectadas con los oligos de RNA de interferencia de cFLIPL y Bid o con el oligo scrambled durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente se determinó la apoptosis mediante citometría de flujo por cuantificación de células hipodiploides. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. (B) Las células BT474 y MCF-10A se trataron como en (A) y los niveles de proteína de cFLIP y Bid se analizaron mediante western blot. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de GAPDH. (C) Las células MCF-10A que sobrexpresan Bcl-2 se transfectaron con el oligo de RNA de interferencia de cFLIPL o con el oligo scrambled durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos. La apoptosis se determinó como en (A). Los datos muestran la media representativa de dos experimentos Los niveles de expresión de Bcl-2 se determinaron mediante western blot. 130 Resultados 2.7 cFLIP regula la morfogénesis de células epiteliales de mama. Los sistemas de cultivos tridimensionales (3D) de células epiteliales, que permiten que las células se reorganicen en estructuras similares a las que forman in vivo, han emergido como modelos de estudio de las funciones y rutas de los genes tumorales en un contexto biológico más relevante. Bajo las condiciones de cultivo 3D, las células normales epiteliales proliferan y se organizan formando estructuras esféricas denominadas comúnmente acinos. Éstos se caracterizan por tener un lumen central rodeado de una capa de células polarizadas, poseer un preciso control del crecimiento y la proliferación celular y por el establecimiento de una membrana basal [303]. Está descrito que las células de cáncer de mama no forman acinos cuando crecen en 3D, sino que se desarrollan como estructuras de células no polarizadas y con una limitada diferenciación [303]. Estos experimentos muestran las diferencias fenotípicas del desarrollo de células epiteliales normales y tumorales en 3D, diferencias que no se aprecian en los cultivos en 2D. El uso de los sistemas 3D ha permitido conocer múltiples procesos y moléculas reguladoras que están implicadas en la formación y el mantenimiento del espacio luminal. Recientemente se ha descrito un papel para TRAIL en la formación de lumen de células epiteliales no transformadas MCF-10A [164]. Por todo ello, y conociendo la importancia de cFLIP en la ruta de señalización de TRAIL, así como por su implicación en la supervivencia de células epiteliales de mama, decimos estudiar si cFLIP participaba en el proceso de morfogénesis de células MCF-10A. Lo primero que quisimos determinar fue si los niveles de proteína de cFLIP variaban durante el proceso de morfogénesis. Para ello, células MCF-10A se sembraron en medio con Matrigel y se recogieron muestras a diferentes días del proceso para analizar por western-blot los niveles de cFLIP. Cómo se 131 Resultados observa en la Figura 16A, los niveles de cFLIP van aumentando a medida que aumenta el tiempo de cultivo en 3D. A) B) Figura 16. Los niveles de cFLIPL aumentan durante la morfogénesis de células epiteliales de mama MCF-10A. (A) Lisados celulares procedentes de acinos a los días indicados se prepararon como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente por western blot se analizaron los niveles de cFLIPL. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de actina. (B) Las células MCF-10A se mantuvieron en suspensión durante 24 y 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente los lisados celulares fueron analizados mediante western blot para determinar los niveles de las proteína indicadas. La formación del lumen durante la morfogénesis de estructuras acinares implica la muerte celular por anoikis de las células que pierden la adhesión al sustrato [301]. Esta muerte por anoikis se puede reproducir en experimentos de cultivo celular en placas recubiertas del polímero poliHEMA. En estas condiciones existe una muerte celular dependiente del tiempo de incubación. De esta forma, el cultivo de células MCF-10A en suspensión es una metodología que se ha utilizado frecuentemente para determinar los cambios bioquímicos que sufren las células del lumen durante el desarrollo de la morfogénesis y que determinan su muerte. Por ello, decimos cultivar las células MCF-10A en suspensión y comprobar si los niveles de expresión de cFLIPL variaban. Como se observa en la Figura 16B, los niveles de proteína de cFLIPL aumentan tras 24 ó 48 en suspensión. 132 Resultados También se puede observar un aumento en la expresión de la proteína “BH3-only” Bim, al mismo tiempo que disminuye los niveles de p-ERK como está descrito que ocurre en este proceso [90]. Como se ha demostrado en esta tesis, cFLIP es una proteína necesaria para la supervivencia de células MCF-10A y además inhibe la señalización apoptótica de TRAIL que, como hemos comentado anteriormente, parece tener un papel en la morfogénesis en 3D de estas células. Por todo ello decidimos sobrexpresar cFLIP en células MCF-10A, y comprobar mediante ensayos en 3D, si el aumento en la expresión de cFLIP afecta al proceso de formación del lumen durante la morfogénesis. Así, células MCF-10A que sobrexpresan FLIPL (pBabe-FLIPL), FLIPS (pLPCX-FLIPS) o el vector vacío (pBabe), se sembraron en medio con Matrigel y se determinó el porcentaje de acinos que mantenían células en el lumen durante el proceso de morfogéneisis. Como se observa en la Figura 17, las células que sobrexpresan alguna de las isoformas de cFLIP desarrollan acinos que tienen un retraso en el vaciamiento de lumen, comparados con las acinos desarrollados a partir de células control. Esto nos indica que la sobrexpresión de cFLIP afecta al correcto vaciamiento del lumen durante el proceso de morfogénesis de células MCF-10A. 133 Resultados Figura 17. La sobrexpresión de cFLIP impide el correcto vaciamiento del lumen durante la morfogénesis de células epiteliales de mama MCF-10A. Células MCF-10A que sobrexpresan establemente cFLIPL( pBabe-FLIPL) , cFLIPS (pLPCX-FLIPS) o las células controles (pBabe) se utilizaron para ensayos de morfogénesis en 3D como se describe en Materiales y Métodos (A). (B) El porcentaje de acinos con 4 o menos núcleos de células en el lumen fue medido a los tiempos indicados durante la morfogénesis. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. En cada experimento se analizaron al menos 100 acinos. Datos de array de ARN no mostrados, indican que la sobrexpresión de cFLIPL no afecta a la transcripción génica generalizada por lo que un aumento de actividad NF-kB y, por tanto, de genes de supervivencia mediado por un aumento en la expresión de FLIPL no parece ser la causa de que las células del lumen sean más resistente a la muerte por anoikis. Mediante western blot también hemos determinado que las células que 134 Resultados sobrexpresan cFLIPL (Figura 18), no tienen aumentada la señalización de NF-kB o ERK. Por otra parte está descrito que cFLIP participa en la resistencia de las células a la muerte por anoikis [334] [335], pero nosotros no hemos sido capaces de determinar experimentalmente si las células MCF10A que sobrexpresan cFLIPL son más resistentes a la apoptosis inducida por anoikis que las células control, debido a que durante el periodo en suspensión estas células también sufren otro tipo de muerte celular independiente de caspasas denominado entosis [336], que ocurre al mismo tiempo que la apoptosis y que puede enmascarar el fenómeno apoptótico, dificultando con ello la cuantificación de la apoptosis que se da en estas células en suspensión. Figura 18. La sobrexpresión de cFLIP impide el correcto vaciamiento del lumen durante la morfogénesis de células epiteliales de mama MCF-10A. La expresión de p-AKT, p-ERK y p-NF-kB fue determinada por western blot en células MCF-10A que sobrexpresan cFLIPL (pBabe-FLIPL) o en células controles (pBabe). En la mima membrana y como control de carga se determinaron los niveles de GAPDH. TRAIL induce autofagia en células MCF-10A [164] [165] y cFLIP inhibe la señalización apoptótica de TRAIL pero no la autofágica [165]. Por otra parte, las células de lumen durante la morfogénesis sufren autofagia como mecanismo de supervivencia ante la muerte inducida por anoikis. Si la sobreexpresión de cFLIP está favoreciendo que, además de esta autofagia 135 Resultados inducida por la perdida de adhesión a la matriz extracelular, se favorezca la inducida por TRAIL y estos efectos pueden resultar en un aumento de la supervivencia de las células del lumen y por tanto en un retraso del vaciamiento luminal, es un tema que requiere de un estudio más detallado y en profundidad. De manera inversa, decidimos estudiar el efecto de la supresión de la expresión de cFLIPL en células MCF-10A tenía sobre la morfogénesis de dichas células en cultivos 3D. Por los datos mostrados en esta tesis sabemos que suprimir la expresión de cFLIPL en estas células induce apoptosis, pero todos estos experimentos han sido realizados en cultivos en monocapa, así que no sabíamos si al realizar los experimentos en cultivos 3D ocurriría lo mismo o, por el contrario, al estar las células en un medio rico en factores de crecimiento y matriz extracelular este efecto se suprimiría. Así, disminuimos la expresión de cFLIPL mediante infección lentiviral de un shRNA de cFLIPL. El vector lentiviral codifica igualmente para la proteína fluorescente GFP, por lo que la expresión de esta sería indicativa a su vez de la expresión del shRNA. Así tras 48 horas de infección de células MCF-10A en monocapa, nos quedamos con las células viables que aún seguían adheridas al sustrato. En esta población celular cuantificamos el porcentaje de células apoptóticas y el porcentaje de expresión de GFP. Además realizamos un análisis por western blot de la expresión de cFLIPL en estas células (Figura 19A-C). Tras determinar que estas células expresaban niveles muy resucidos de cFLIPL y el porcentaje de apoptosis era menor del 5%, procedimos a realizar el cultivo en 3D y estudiar la morfogénesis. Como se puede observar en la Figura 19 (D-E), en el dia 10 del proceso, el número de acinos positivos para GFP y por tanto que expresan el shRNA era claramente menor en las células que expresaban el shFLIPL que las que expresaban el shScrambled (Control), probablemente debido a que las células que expresan el shFLIPL mueren por 136 Resultados apoptosis no pudiendo proliferar para desarrollar los acinos. Estos datos nos indican que al igual que ocurre en cultivo en monocapa, las células MCF10A requieren de la expresión de cFLIP para su supervivencia, independientemente de que en cultivos en 3D las células tengan un mayor aporte de factores de crecimiento que puedan activar rutas de supervivencia para inhibir la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP. A) B) C) Figura 19. cFLIPL es necesario para la supervivencia de células epiteliales de mama MCF-10A no solo en cultivos en monocapa (2D) sino también en cultivos en 3D. Células MCF-10A se infectaron con un shRNA para cFLIPL (pLVTHM-FLIPL) o con un shRNA control (pVLTHMScrambled) durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Pasado este tiempo, se utilizaron las células que aún estaban adheridas al sustrato para determinar la apoptosis por citometría de flujo mediante cuantificación de SubG1(A), analizar el porcentaje de expresión de GFP mediante citometría de flujo (B), analizar por western blot los niveles de expresión de cFLIP (C) o realizar un ensayo de morfogénesis en 3D (D) como se describe en Materiales y Métodos. 137 Resultados D) E) Figura 19. cFLIPL es necesario para la supervivencia de células epiteliales de mama MCF-10A no solo en cultivos en monocapa (2D) sino también en cultivos en 3D. (E) El porcentaje acinos con expresión positivos para la expresión de GFP fue analizado en el dia 10 de la morfogénesis. Los resultados muestran la media representativa de dos experimentos independientes. En cada experimento al menos 100 acinos fueron analizados. Puesto que la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP también se da en células tumorales de mama, resultados mostrados en esta tesis y [330], decidimos extender el estudio de morfogénesis de células que 138 Resultados no expresana cFLIP a las células tumorales MCF-7. Las células tumorales de mama MCF-7 cuando crecen en matrigel no desarrollan acinos, sino unas estructuras esferoides de células no polarizadas sin lumen central y sin inhibición de la proliferación [337]. Como se observa en la Figura 20, al igual que en las células MCF-10A, la expresión de cFLIPL es necesaria para la proliferación y formación de las estructuras esferoides, ya que hay una disminución significativa de estas estructuras en células GFP positivas que expresan el shFLIP. A) B) C) Figura 20. cFLIPL es necesario para la supervivencia de células de cáncer de mama MCF7 no solo en cultivos en monocapa (2D) sino también en cultivos en 3D. Células MCF-7 se infectaron con un shRNA para cFLIPL (pLVTHMFLIPL) o con un shRNA control (pVLTHMScrambled) durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Pasado este tiempo, se utilizaron las células que aún estaban adheridas al sustrato para determinar la apoptosis por citometría de flujo mediante cuantificación de la externalización de la fosfatidilserina mediante tinción con Anexina V FLUOS (A), analizar el porcentaje de expresión de GFP mediante citometría de flujo (B), analizar por western blot los niveles de expresión de cFLIP (C) o realizar un ensayo de morfogénesis en 3D (D) como se describe en Materiales y Métodos 139 Resultados D) E) Figura 20. cFLIPL es necesario para la supervivencia de células de cáncer de mama MCF-7 no solo en cultivos en monocapa (2D) sino también en cultivos en 3D.. (E) El porcentaje acinos con expresión positivos para la expresión de GFP fue analizado en el dia 10 de la morfogénesis. Al menos 100 acinos fueron analizados. 140 Resultados 3. Regulación de la expresión de cFLIP. Todos los datos mostrados en esta tesis nos llevan a la conclusión general del importante papel de cFLIP en células epiteliales de mama, tumorales o no, en cuanto a la supervivencia celular y como regulador de la apoptosis mediada por el ligando de muerte TRAIL. Por ello es de gran relevancia conocer los mecanismos de regulación de los niveles basales de expresión de cFLIP. Está descrito que cFLIP es una proteína de vida media corta, cuya degradación está mediada por el sistema ubiquitinación/proteasoma [216]. Por todos estos antecedentes y para profundizar en el mecanismo que mantiene los niveles basales de cFLIP en las células, decidimos estudiar, por una parte, cómo se regula la degradación de cFLIP y por otra, cómo se regula su síntesis. 3.1 Regulación de la degradación de cFLIP. Para determinar si el proteasoma está implicado en la degradación de cFLIP en células de mama, tratamos células MCF-10A y MDA-MB231 con el inhibidor de la síntesis de proteína cicloheximida y, al mismo tiempo, tratamos con el inhibidor del proteasoma MG-132. Como se observa en la Figura 21, tras tres horas de tratamiento con cicloheximida se ha perdido casi la totalidad de la proteína, y esta pérdida se ve bloqueada en presencia del inhibidor de proteasoma. Estos resultados se confirmaron utilizando epoxomicina como inhibidor del proteasoma. 141 Resultados A) B) C) Figura 21. La degradación de los niveles basales de cFLIP es mediada por el proteasoma. Células MCF-10A (A) o MDA-MB231 (C) se trataron con el inhibidor del proteasoma MG-132 a las dosis indicadas una hora antes del tratamiento con el inhibidor de la síntesis de proteína cicloheximida (5µg/ml). La cicloheximida se mantuvo durante 3 horas y posteriormente los niveles de cFLIP se analizaron mediante western blot. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de GAPDH (A) y αtubulina (C). (B) células MCF-10A se trataron con los inhibidores del proteasoma MG132 (50µM) y Epoxomicina (200nM) una hora antes del tratamiento con cicloheximida (5 µg/ml). La cicloheximida se mantuvo durante 3 horas y posteriormente los niveles de cFLIP se analizaron mediante western blot. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de GAPDH. El mecanismo de degradación de proteínas por el proteasoma implica la ubiquitinación previa de las proteínas a degradar. Esto significa que cFLIP debe ubiquitinarse, lo cual ha sido descrito [216] y para ello requiere de una proteina E3-ubiquitin ligasa específica. Se conocen pocas proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasas que puedan tener como proteína diana a cFLIP. Recientemente se ha descrito a ITCH como la E3-ubiquitin ligasa de cFLIPL que promueve la degradación proteasomal de éste tras el tratamiento con TNF [116]. Por ello decidimos comprobar si esta proteína era también la E3-ubiquitin ligasa de cFLIP en condiciones basales. Así, inhibimos la síntesis de cFLIP mediante cicloheximida, cuando los niveles de ITCH estaban reducidos por siRNA (utilizamos dos siRNA diferentes) y comprobamos si en estas condiciones la degradación de cFLIP se bloqueaba. 142 Resultados Como se observa en la Figura 22 A-B, aunque los niveles de ITCH están muy reducidos, cFLIP sigue degradándose. Esto nos lleva a la conclusión de que ITCH no es probablemente la proteína E3-ubiquitin ligasa responsable de mantener los niveles basales de expresión de cFLIP en estas células. A) B) Figura 22. Estudio de la implicación de la proteína E3-ubiquitin ligasa ITCH en la degradación proteasomal de cFLIP. Células MCF-10A fueron transfectadas con oligos de siRNA para ITCH, o con el oligo scrambled (A-B) durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente las células se trataron con cicloheximida (5µg/ml) durante 3 horas y los niveles de cFLIP se determinaron por western blot. De igual modo se comprobó que los niveles de ITCH. Como control de carga se midieron los niveles de GAPDH. Dado este inesperado resultado, decidimos estudiar si alguna de las proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasas que en la literatura se asocian a cFLIP o a proteínas relacionadas con este, podrían ser la responsable de la ubiquitinación para la degradación de cFLIP en condiciones basales. Por ello decidimos testar si Cul-3 (E3-ubiquitin ligasa de caspasa-8), MULE (E3ubiquitin ligasa de Mcl-1), XIAP (recientemente se han descrito funciones 143 Resultados A) D) B) E) C) F) Figura 23. Estudio de la implicación de diferentes proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasa en la degradación proteasomal de cFLIP. Las líneas celulares indicadas en la figura, se transfectaros con oligos de siRNA para Cul-3 (A), XIAP (B), RIP, TRAF2 (C), Mule (D,E,F,) o el oligo scrambled durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Tras este tiempo, las células se trataron con cicloheximida (5µg/ml) durante 3 horas y los niveles de cFLIP se determinaron por western blot. Como control de carga se midieron los niveles de GAPDH. F) Para comprobar si los nivles de MULE disminuían con el siRNA, realizamos un ensayo funcional donde células MDA-MB 231 fueron trasfectadas con oligos de siRNA para MULE o con el oligo scrambled durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Pasado este tiempo se trataron con Nocodazol (400ng/ml) durante 24 horas. Los niveles de cFLIP y MCL1 se analizaron por western blot, ya que está descrito que MULE es la ubiquitin ligasa de MCL1, por lo tanto una bajada de expresión de MULE provoca una acumulación de MCL1 o una no degradación de esta por Nocodazol. ubiquitin ligasa para los IAPs durante la señalización por receptores de muerte [338] [118]), y TRAF2 (se ha descrito que puede unirse cFLIP y además tiene actividad E3-ubiquitin ligasa) [278], podrían tener como proteína diana de ubiquitinación a cFLIP. Así, disminuimos los niveles de dichas proteínas mediante siRNA y comprobamos si al inhibir la síntesis de cFLIP, su degradación se bloquea. Como se observa en la Figura 23, la degradación de cFLIP no es bloqueada por la bajada en la expresión de 144 Resultados ninguna de las proteínas testadas, lo que nos indica que en principio, ninguna de estas proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasa responsable de la degradación de cFLIP por el proteasoma en condiciones basales. 3.2 Regulación de la síntesis de cFLIP. Se ha descrito que la expresión inducible de cFLIP en células de cáncer de mama está regulada principalmente por la ruta de PI3K/AKT, a través del factor de trascripción FOXO3A [246]. Por ello decidimos estudiar si el RNA mensajero de cFLIP (cFLIPL y cFLIPS) se afectaba al inhbir la ruta de PI3K-AKT con el inhibidor específico LY294002. Como se observa en la Figura 24A, en diferentes líneas celulares de cáncer de mama, la inhibición de la ruta PI3K-AKT induce una bajada en los niveles de ARN mensajero de FLIPS, pero no de cFLIPL que tras 8 horas de tratamiento incluso parece que aumentan. Con estos datos sobre el efecto de la inhibición de la ruta de PI3K-AKT sobre el ARN mensajero de cFLIP, decidimos analizar cómo se afectaba la proteína. Como se observa en la Figura 24B, tras 4 horas de tratamiento con diferentes dosis de LY294002, se induce una bajada de los niveles de proteína cFLIPS, lo que se corresponde con la bajada del ARN mensajero. Sin embargo y, aunque es más leve, también se produce una disminución en los niveles de proteína cFLIPL, lo que no tiene relación con los efectos observados sobre el ARN mensajero. Además resulta bastante sorprendente, que a la dosis de LY294002 de 10µM en la que la ruta de PI3KAKT se encuentra inhibida, esto es, se inhibe la fosforilación de AKT, los niveles de proteína no se vean afectados. 145 Resultados A) B) Figura 24. LY294002 regula los niveles de ARN mensajero y proteína de cFLIP en células de cáncer de mama. A) Diferentes líneas celulares de cáncer de mama fueron tratadas con LY294002 (50 µM) durante los tiempos indicados. Los niveles de ARN mensajero de cFLIPL y cFLIPS se determinaron mediante RT-PCR y RT-PCR cuantitativa como se describe en Materiales y Métodos. B) Células MDA-MB231 se trataron con las dosis indicadas de LY294002 durante 4 horas y los niveles de cFLIP y p-AKT se determinaron por western blot. Por ello, y para determinar si el efecto del LY294002 sobre cFLIP era específico o no de la inhibición de la ruta PI3K-AKT, decidimos utilizar otro inhibidor de la ruta como es wortmanina. En este caso (Figura 25A), los niveles de proteína de cFLIP no se afectan como con LY294002, aunque en ambos casos la ruta PI3K/AKT está inhibida como se determina por la bajada de fosforilación de AKT. Estos resultados se confirmaron utilizando un compuesto análogo estructuralmente al LY294002, el LY303511 con una reducida actividad como inhibidor de la fosforilación de AKT. 146 Resultados A) B) Figura 25. La disminución de los niveles de proteína de cFLIP por LY294002 es independiente de la inhibición de la ruta PI3K-AKT. (A) Células MDA-MB231 fueron tratadas con los inhibidores de PI3K-AKT a las dosis indicadas durante 4 horas y los niveles de proteína cFLIP y p-AKT se determinaron por western blot. (B) Células MDAMB231 se trataron con LY294002 (50µM), LY303511 (50µM ) y wortmanina (100nM) durante 4 horas. Los niveles de proteína de cFLIP y p-AKT se determinaron por western blot. Como se observa en la Figura 25B, aunque LY303511 es capaz de inhibir parcialmente la fosforilación de AKT, no consigue el grado de inhibición de la ruta como LY2094002 y sin embargo el efecto sobre cFLIP es el mismo. Con estos datos confirmamos que el efecto del LY294002 sobre los niveles de cFLIP es independiente de su actividad como inhibidor de la ruta PI3KAKT. Por tanto, para corroborar la no participación de la ruta PI3K/AKT en la regulación de la síntesis de cFLIP, decidimos sobrexpresar en las células una proteína AKT constitutivamente activa (Myr-AKT) que mantiene la ruta activada, o una proteína dominante negativa de AKT (dnAKT) que, por el contrario, inhibe la ruta. Como se observa en la Figura 26A activando la ruta de PI3-K/AKT mediante la transfección de la proteína constitutivamente activa de AKT, no conseguimos aumentar los niveles de cFLIP. Por el contrario, la transfección de las células con la proteína dominante negativa 147 Resultados de AKT no consigue bajar los niveles de cFLIP (Figura 26B), aunque la ruta se encuentra inhibida, como lo muestra la bajada de sustratos fosforilados de AKT tras el tratamiento con insulina en células donde se expresa el dominante negativo. A) B) Figura 26. La regulación de cFLIP en células tumorales de mama es independiente de la actividad PI3K/AKT. Células MDA-MB231 fueron electroporadas con construcciones constitutivamente activa (A) y dominante negativa (B) de AKT como se describe en Materiales y Métodos. Los niveles de cFLIP y el estado de fosforilación de AKT se determinó mediante western blot. Así concluimos que la ruta PI3-K/AKT no participa en la regulación de los niveles basales de cFLIP en células de cáncer de mama. 148 Resultados Por otra parte, la activación de la ruta de NF-kB puede derivar en el aumento de expresión de cFLIP [254] [255]. En estos trabajos se describe cómo el aumento de actividad de NF-kB mediante TNF o LPS aumentan los niveles de cFLIP y con ello la resistencia de las células a la apoptosis inducida por TRAIL o Fas ligando. En células de glioblastoma, la resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL está determinada por el aumento de cFLIPS mediado por mTOR [193]. La inhibición de la ruta por rapamicina, provoca una bajada en los niveles de cFLIPs, al no permitir la traducción del ARN mensajero de cFLIPS a proteína, permitiendo la sensibilización de estas células a la apoptosis inducida por TRAIL. La caseina quinasa 2, también controla la sensibilidad de células de carcinoma endometrial a la apoptosis inducida por TRAIL o Fas ligando, por regular los niveles de cFLIP [267]. Con estos antecedentes decidimos utilizar inibidores estas rutas y comprobar si alguna era la responsable del mantenimiento de los niveles basales de expresión de cFLIP en células de cáncer de mama. Así utilizamos BMS 345541 como inhibidor de NF-kB, rapamicina como inhibidor de mTOR y TBB como inhibidor de la caseina quinasa 2. Como se ve en la Figura 27, sólo el BMS 345541 parece tener un claro efecto sobre los niveles de cFLIP. Si este efecto se da también a nivel del ARNm y si es un efecto específico de inhibir la ruta y no un efecto inespecífico del inhibidor, necesita de un estudio más detallado. 149 Resultados A) C) B) D) Figura 27. Regulación de los niveles de expresión de cFLIP por los inhibidores de diferentes rutas de señalización. A) Células MDA-MB231 se trataron con rapamicina (100nM) durante los tiempos indicados. Los niveles de cFLIP se analizaron mediante western blot. (B) Células MDA-MB231 se trataron con rapamicina (100nM) 30 minutos, 4 horas o 8 horas antes de tratar con insulina (10µg/ml) durante 30 minutos. Los niveles de p-p70SK6, p-AKT y AKT se determinaron por western blot. Como control de carga se analizó la expresión de α-tubulina. (C) Células MDA-MB231 se trataron con las dosis indicadas de BMS345541 durante 6 horas y los niveles de cFLIP y p-NF-kB se determinaron por western blot. (D) Células MDA-MB231 fueron tratadas con DRB (40µM) o con las dosis indicadas de TBB durante 6 horas y los niveles de cFLIP se analizaron por western blot. 150 VII. DISCUSIÓN 151 Discusión DISCUSIÓN. El cáncer de mama es una de las neoplasias más comunes en mujeres de todo el mundo. Por eso, es de enorme interés para la sociedad encontrar tratamientos efectivos para combatirlo. Tanto la terapia con fármacos genotóxicos, como la radioterapia son ampliamente utilizadas para combatir estos tumores [339] [340]. En estos tratamientos, una acumulación de la proteína supresora de tumores p53 es generalmente necesaria para una efectividad positiva de estos tratamientos ya que esta acumulación provocaría una activación de la vía intrinseca de apoptosis. Sin embargo, en células de cáncer de mama, las mutaciones en p53, que hacen que la proteína sea inactiva, son muy frecuentes [341] [342]. Por ello, el desarrollo de estrategias que activen la vía extrínseca de apoptosis a través de los receptores proapoptóticos, se presenta como una alternativa muy atractiva en la terapia antitumoral. El hecho de que TRAIL sea un ligando de muerte que induce apoptosis en células tumorales sin afectar a las células normales lo convierte en un buen candidato para su uso en terapia antitumoral. Sin embargo, el hecho de que existan muchas células tumorales de diferente origen que son resistentes a TRAIL, hace que el uso de TRAIL recombinante o de anticuerpos agonistas de los receptores de TRAIL en combinación con otros agentes antitumorales, sea mucho más efectivo como terapia antitumoral. Así, tratamientos quimioterapeúticos convencionales pueden sinergizar con la señalización de los receptores de TRAIL e inducir apoptosis en celulas tumorales, aunque los mecanismos de sensibilización a TRAIL aún no están totalmente definidos. Este es el caso de la doxorrubicina, una antraciclina comunmente utilizada en la terapia antitumoral y, que en combinación con el anticuerpo agonista de TRAIL-R2 Lexatumumab, se encuentra en fase 1b de ensayos clínicos [4] [323]. Además, en estudios in vivo, se ha demostrado la eficacia del tratamiento conjunto en la regresión 152 Discusión del tamaño de tumores de próstata [177]. A su vez, en los últimos años, el tratamiento combinado de SAHA, miembro de un grupo de compuestos inhibidores de histonas deacetilasas, con TRAIL, parece representar una gran promesa en la terapia antitumoral [343] [188] [344] [345]. Por todos estos antecedentes, decidimos estudiar la eficacia de combinación de estos agentes con TRAIL para la inducción de apoptosis en células de cáncer de mama resistentes al ligando de muerte. Así, durante el desarrollo de este trabajo se ha demostrado que ambos agentes en combinación con TRAIL son capaces de sensibilizar a células tumorales de mama resistentes a la acción de TRAIL y, además, se ha profundizado en el mecanismo molecular que subyace dicha sensibilización. En estos estudios hemos observado que el tratamiento con doxorrubicina o SAHA comparten, como evento clave en el mecanismo de sensibilización a la apoptosis inducida por TRAIL, la disminución de los niveles celulares de proteína cFLIP. cFLIP es una proteína cuya principal función descrita en las células es inhibir la activación de la caspasa-8 durante la apoptosis inducida por receptores de muerte. En el caso de la doxorrubicina, el mecanismo de sensibilización de células de cáncer de mama a la apoptosis inducida pr TRAIL, además, es independiente de la proteína supresora de tumores p53, lo que hace que el cotratamiento sea aún más atractivo, ya que esta proteína se encuentra mutada en el 50% de los tumores. Como se muestra en los resultados, la doxorrubicina disminuye los niveles de cFLIPS específicamente sin afectar a los niveles de cFLIPL. Este efecto puede ser debido a una regulación diferencial del splicing alternativo que sufre el ARNm de cFLIP y que dará lugar a ambas isoformas, o bien, a una regulación diferencial de la degradación específica de cFLIPS por el proteasoma. Se requieren más estudios para poder verificar cualquiera de las dos posibilidades. 153 Discusión Con respecto al efecto que el SAHA tiene sobre los niveles de proteínas de cFLIP, la expresión de cFLIPL y cFLIPS disminuye y esta disminución se bloquea si inhibimos el proteasoma con el compuesto MG132 (datos no mostrados). Esto nos indica que el SAHA induce una degradación proteasomal de cFLIP. Este fenómeno no sólo ocurre con estos dos agentes, sino, que tras el tratamiento de células de cáncer de mama con compuestos como Flavopiridol y Roscovitina (inhibidores de ciclinas dependientes de quinasas), Nocodazol y Taxol (agentes que afectan a los microtúbulos) y AICAR (activador directo de AMPK), todos capaces de sensiblizar a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama, observamos que los niveles de cFLIP se encuentran disminuídos [346] [320] [347] [348]. Por ello y para corroborar el papel fundamental que cFLIP parece tener en el mecanismo de sensibilización a TRAIL en células tumorales de mama, decidimos utilizar la herramienta del ARN de interferencia (siRNA) para eliminar específicamente los niveles de proteína de cFLIP, evitando así efectos secundarios que se puedan derivar de los tratamientos farmacológicos. Así, tras los resultados obtenidos con el siRNA, comprobamos que efectivamente, la bajada de niveles de proteína de cFLIP es un evento clave en la sensibilización de las células de cáncer de mama a TRAIL. Además los niveles basales de cada una de las isoformas determinarán la sensibilización de las células a la apoptosis inducida por TRAIL. Es decir, en células tumorales de mama que expresen niveles similares de ambas isoformas, como es el caso de las células MDA-MB231, se requiere del silenciamiento de ambas isoformas de cFLIP para que se sensibilicen a la acción de TRAIL. Sin embargo, en una línea celular tumoral, como las células BT474, que expresa principalmente la isoforma cFLIPL, el silenciamiento específico de estra isoforma predominante de cFLIP es suficiente para obtener una clara sensibilización a la apoptosis tras el 154 Discusión tratamiento con TRAIL. Así pues, en células tumorales de mama, podemos confirmar los datos obtenidos en otras líneas tumorales de diferente origen, donde cFLIP es el principal determinante de la sensibilización a la apoptosis inducida por TRAIL, de forma particular, y por ligandos de muerte de forma más general [207] [206] [204] [211] [209]. Además, la sensibilización de células tumorales de mama a la apoptosis inducida por TRAIL, ya sea con tratamientos farmacológicos como Doxorrubicina, Flavopiridol, Interferón gamma o Roscovitina, o bien por el silenciamiento de la expresión de cFLIP, activa una ruta mitocondrial de apoptosis, como se demuestra por los resultados en los que si suprimimos la expresión de la proteína Bid, implicada en la activación de la ruta mitocondrial de apoptosis. La sensilibilización de las células por dichos tratamientos se encuentra significativamente afectada en la mayoría de los casos. Tras los datos obtenidos en este trabajo, podemos indicar que cFLIP no sólo es una proteína fundamental en la resistencia que las células tumorales de mama presentan al tratamiento con TRAIL, sino que esta proteína es además clave en la superviencia de dichas células. Si inhibimos la expresión de cFLIP mediante siRNA, las células tumorales de mama mueren por apoptosis. Esta apoptosis “espontánea” debido al silenciamiento de la expresión de cFLIP requiere de los componentes del DISC de TRAIL: el receptor TRAIL-R2, la proteína adaptadora FADD, y la caspasa-8, pero es un fenómeno independiente del ligando TRAIL. Esto nos indica que el papel que cFLIP tiene como proteína que favorece la supervivencia celular, es como inhibidor de una apoptosis independiente de ligando de muerte, que, a priori, podría producirse en las células, más que como regulador positivo de rutas de supervivencia. Además, cabe destacar, que mediante la realización de experimentos de expresión génica por array de ARN, hemos 155 Discusión determinado que tras el silenciamiento de cFLIP, no se produce en las células tumorales de mama un cambio en el patrón de expresión de genes implicados en supervivencia celular ni de genes proapoptóticos (datos no mostrados). Estos resultados nos hacen plantearnos varias posibles hipótesis para explicar lo que puede estar ocurriendo. Una de ellas implicaría la posibilidad de que los componentes del DISC de TRAIL estén pre-asociados, aún en ausencia del ligando en la membrana plasmática (en zonas de lipid-rafts) y que la unión de TRAIL al receptor o bien una variación en los niveles de sus componentes como, por ejemplo, una bajada en la expresión de cFLIP, induzca la activación de caspasa-8 y la consecuente cascada apoptótica. Por otra parte puede ocurrir que al igual que con TNF [104] o Fas [105], los receptores de TRAIL estén pre-asociados en condiciones basales [106] y que una bajada en la expresión de cFLIP favorezca la asociación de FADD y caspasa-8. Por otra parte, se ha descrito que FLIPL se encuentra asociado al receptor TRAIL-R2 en condiciones normales, y que la inhibición de esta asociación induce apoptosis independiente de ligando [333]. Para determinar qué ocurre con los componentes del DISC de TRAIL, y si hay asociación entre ellos en ausencia de ligando cuando bajamos la expresión de cFLIP, decidimos inmunoprecipitar TRAIL-R2 en células donde silenciamos la expresión de cFLIPL mediante infección lentiviral de un shRNA para cFLIPL, o en células infectadas con un shRNA control (scrambled). Sin embargo no hemos sido capaces de detectar asociación del receptor TRAIL-R2 con ninguno de los componentes del DISC de TRAIL en ausencia de ligando, ni en células infectadas con el shScrambled ni en las células infectadas con el shFLIPL. Es importante indicar que la apoptosis que se induce por la bajada de expresión de cFLIPL es un proceso lento ya que tras 72 horas de inhibir su expresión el porcentaje de células apoptóticas que 156 Discusión detectamos está, en el mejor de los casos, en torno al 50%, por lo que esta aproximación metodológica puede no ser la más adecuada para detectar asociación entre proteínas. Otra aproximación metodológica más directa sería la detección de la asociación de los componentes del DISC de TRAIL mediante inmunofluorescencia, pero en cualquier caso, los datos obtenidos harían referencia a una co-localización de estos y no asegurarían una asociación física entre ellos. La inducción de una apoptosis independiente de ligando ha sido descrito para tipos celulares como células tumorales de colon [331] y más recientemente también se ha descrito en células tumorales de mama [330]. Pero el mecanismo que subyace esta apoptosis aún no se ha determinado, y actualmente es objeto de estudio en nuestro laboratorio. Nuestros resultados, junto con otros descritos en bibliografía donde se demuestra la importacia de cFLIP en la resistencia a la apoptosis inducida por receptores de muerte en células tumorales, o incluso el hecho de que el simple silenciamiento de la expresión de cFLIP provoque la muerte celular, convierten a esta proteína en una interesante diana terapeútica del cáncer. De hecho, durante los últimos años, muchos han sido los trabajos donde esta posibilidad ha sido propuesta e incluso, recientemente, se han realizado ensayos in vivo donde mediante oligos de siRNA de cFLIP inyectados en modelos tumorales de mama en ratón se ha conseguido reducir el tamaño del tumor [298] . Sin embargo, el papel que cFLIP juega en el control de la apoptosis en células epiteliales de mama no tumorales, aspecto muy importante a la hora de diseñar estrategias antitumorales es bastante desconocido. Por ello, otro de los objetivos de esta tesis ha sido determinar si cFLIP, al igual que ocurre en las células tumorales de mama, ejerce un papel fundamental como inhibidor y regulador de la apoptosis en células epiteliales de mama no 157 Discusión tumorales y, si ese papel, afecta al correcto desarrollo de la mama mediante estudios en cultivos tridimensionales. Así, tras los resultados obtenidos en la línea epitelial de mama inmortalizada no tumoral MCF-10A, podemos concluir, que el silenciamiento de cFLIP, sensibiliza a la apoptosis inducida por TRAIL y, además, provoca, al igual que en las líneas tumorales, una apoptosis independiente de ligando, que requiere los componentes del DISC de TRAIL. Las células MCF-10A, al igual que la células tumorales BT474, expresan principalmete la isoforma cFLIPL, y el silenciamiento de esta isoforma es suficiente para sensibilizarlas a la apoptosis inducida por TRAIL y para inducir la apoptosis independiente de ligando, con mayor eficacia incluso que en las células tumorales. Además, hemos demostrado que cFLIP juega un papel en el desarrollo de los acinos durante el proceso de morfogénsesis de células epiteliales MCF10A. Bajo las condiciones de cultivo 3D, las células normales epiteliales proliferan y se organizan formando estructuras esféricas denominadas comúnmente acinos. Estos se caracterizan por tener un lumen central rodeado de una capa de células polarizadas, poseer un preciso control del crecimiento y la proliferación celular y por el establecimiento de una membrana basal [305] [306] [307]. En acinos de células epiteliales de mama MCF-10A, el lumen se forma por un fenómeno de cavitación, en el que las células del interior del acino mueren por la apoptosis inducida por anoikis o pérdida de adhesión a la matriz extracelular [301] [303]. En esta apoptosis, la proteína proapoptótica “solo BH3” de la familia de Bcl-2, Bim parece jugar un papel fundamental ya que la bajada de su expresión por RNA de interferencia provoca que el lumen no se vacíe correctamente. Sin embargo, la inhibición de la apoptosis durante la morfogénesis de células MCF-10A en cultivos en 3D, no inhibe la formación de lumen, sólo la retrasa, por lo que otros mecanismos de muerte parecen estar implicados [301]. Así, 158 Discusión se ha descrito que un proceso de muerte celular con autofagia inducido por TRAIL tendría un papel en la morfogénesis [164] ya que, sólo tras bloquear la apoptosis con la sobreexpresión de la proteína antiapoptotica Bcl-xL y la señalización de TRAIL mediante formas dominantes negativas de FADD o receptores de TRAIL truncados, se consigue inhibir completamente el vaciamiento del lumen. Durante la morfogénesis se pueden distinguir dos tipos celulares bien diferenciados, las células de la capa exterior que están en contacto directo con la matriz extracelular, y las células del interior del acino, que son la que sufren los procesos de muerte, favoreciendo la formación del lumen central. La expresión de TRAIL aumenta a los largo del proceso morfogenético,lo que nos lleva a pensar que debe ser en las células de la capa externa donde se induzca su expresión puesto que la inducción comienza el dia 10 de la morfogénsis y tiene un pico máximo a dias 22- 27 donde el lumen ya se encuentra formado y sólo queda una capa de células recubriendolo. Este aumento en la expresión de TRAIL es el que parece estar implicado en la muerte con autofagia observada durante la morfogénesis [164]. En esta tesis se ha demostrado que la expresión de cFLIP también aumenta durante el proceso de morfogénesis de las células MCF-10A. Si este aumento de cFLIP se produce para inhibir la señalización apoptótica que TRAIL pueda tener en las células de la capa externa, que de hecho son resistentes a TRAIL puesto que en condiciones normales el acino se desarrolla correctamente y las células de la capa externa no mueren, es una posibilidad que requiere de un estudio más en profundidad. Otra opción que se nos plantea para explicar el aumento de expresión de cFLIP durante la morfogénesis de células epiteliales de mama, es que este aumento provenga de las células del interior del acino puesto que se ha descrito que el durante el proceso de anoikis (muerte por pérdida de adhesión al sustrato) las células MCF-10A ven aumentada su actividad NF-kB [349]. El 159 Discusión aumento de actividad NF-kB, parece ser una respuesta celular de supervivencia ante la pérdida de adhesión al sustrato que, de no corregirse, lleva a la muerte celular mediada por la pérdida de señalización de receptores de EGF, con la consecuente bajada de actividad de ERK y el aumento de la proteína proapoptótica Bim[90, 311]. Está descrito que cFLIP es un gen susceptible de regulación por NF-kB [255] [254], por lo que puede que el aumento en los niveles de cFLIPL en células en suspensión sea consecuencia de un aumento en la actividad NF-kB y que ocurra lo mismo durante el proceso de morfogénesis con las células del interior del acino. El hecho de que la sobreexpresión de cFLIP retrase la formación del lumen y de que el silenciamiento de cFLIPL mediante shRNA impida incluso la formación acinos, seguramente porque las células que expresan niveles reducidos de cFLIP no son viables, nos indica la importancia de la regulación de los niveles de expresión de cFLIP durante el proceso de morfogénesis. Aunque no hemos determinado el mecanismo molecular por el que los acinos derivados de células MCF-10A que sobreexpresan cFLIPL o cFLIPS presentan un retraso en el proceso de formación de lumen, este hecho se podría explicar mediante el planteamiento de varias hipótesis. Una de ellas podría ser que tanto cFLIPL como cFLIPS inhiban la muerte con autofagía inducida por TRAIL durante la morfogénesis. Como se ha comentado anteriormente, parece que TRAIL juega un papel como inductor autofagia durante el proceso de morfogénesis de célula epiteliales de mama y parece que esta autofagia desencadena en muerte porque, como se ha comentado anteriormente, sólo tras bloquear la apoptosis con la sobreexpresión de la proteína antiapoptotica Bcl-xL y la señalización de TRAIL, se consigue inhibir completamente la formación del lumen. Recientemente se ha descrito que tanto la sobreexpresión de cFLIPL como de cFLIPS son capaces de inhibir la muerte que cursa con autofagia inducida 160 Discusión por privación de nutrientes o rapamicina, por impedir la unión de la proteína ATG3 con la proteína LC3, impidiendo así el proceso de elongación de los autofagosomas [292]. Por lo tanto, en principio, la sobreexpresión de cFLIP también podría inhibir la elongación de los autofagosomas inducidos por la señalización autofágica de TRAIL. TRAIL induce autofagia en células MCF-10A [164] [165] y además la sobreexpresión de cFLIP no impide dicha señalización [165] por lo que la sobreexpresión de cFLIP no impediría la activación de autofagia mediada por TRAIL, sino que estaría bloqueando a nivel de la formación de los autofagosomas. Sin embargo, existen datos contradictorios a cerca de la finalidad de la inducción de autofagia durante el proceso de morfogénesis y de la inducción de autofagia mediada por TRAIL. Esto es: la autofagia mediada por TRAIL en células epiteliales de mama MCF-10A, tiene un papel citoprotector, puesto que su inhibición desecadena en apoptosis [165]. Si bien estos experimentos se han realizado en cultivos 2D, que como sabemos pueden dar lugar a resultados muy diferentes a lo que ocurre en los sistemas tridimiensionales. Además, se ha descrito que durante la formación del lumen, también se desencadena un proceso de autofagia inducido por la pérdida de adhesión al sustrato de las células, cuyo papel también sería citoprotector, puesto que la inhibición de esta autofagia mediante el silenciamiento de genes como ATG-5 o ATG-7, desencadena una formación más rápida del lumen de los acinos [313]. Pero como hemos comentado, esta autofagia citoprotectora está inducida por falta de adhesión al sustrato, por lo que en realidad la posibilidad de que TRAIL sea capaz de inducir muerte que cursa con autofagia durante el proceso de morfogénesis puede ser plausible, aunque para demostrarlo se requieren más estudios. Otra posibilidad, que podría darse si se demostrase que cFLIP no inhibe la formación de los autofagosomas tras la inducción de autofagia mediada por TRAIL sería la siguiente: TRAIL induce autofagia en células 161 Discusión MCF-10A [164] [165] y cFLIP inhibe la señalización apoptótica de TRAIL pero no la autofágica [165]. Por otra parte, las células de lumen durante la morfogénesis sufren autofagia como mecanismo de supervivencia ante la muerte inducida por anoikis. Si la sobreexpresión de cFLIP está favoreciendo que, además de esta autofagia inducida por la perdida de adhesión a la matriz extracelular, se favorezca la inducida por TRAIL y estos efectos pueden resultar en un aumento de la supervivencia de las células del lumen y por tanto en un retraso del vaciamiento luminal, es un tema que requiere de un estudio más detallado y en profundidad. Recientemente también se ha descrito que la aparición de especies reactivas de oxígeno es un fenómeno que ocurre durante la formación del lumen y que deriva en muerte celular [315]. Se ha descrito que la bajada de niveles de proteína cFLIP provoca una acumulación de especies reactivas de oxigeno, otorgando un papel a cFLIP semejante al de los antioxidantes. Por tanto podría ocurrir que la sobreexpresión de cFLIP estuviese provocando una eliminación de las especies reactivas de oxígeno que se desencadenan durante el proceso de morfogénesis favoreciendo así la supervivencia celular retrasando de esta forma la formación del lumen. Durante el desarrollo de este trabajo hemos demostrado que cFLIP es un regulador fundamental de la apoptosis, y no sabemos si de otros procesos de muerte celular, tanto en células epiteliales tumorales como en células epitiliales no tumorales de mama, y que una variación en su expresión puede repercutir en el correcto desarrollo del epitelio glandular de mama, efectos a tener en cuenta a la hora del diseño de terapias antitumorales que tengan como posible diana la proteína cFLIP. Por todo ello, el estudio de la regulación de la expresión de cFLIP en células epiteliales de mama cobra aún si cabe más importancia. Se ha descrito que cFLIP es una proteína de vida media corta, que se sintetiza y 162 Discusión degrada por el proteasoma constantemente. [216] Conocer tanto la señalización que media para su síntesis como la que está implicada en su degradación se presenta como un aspecto clave para el estudio de los mecanismos de control de la apoptosis en estas células. Se ha descrito que la expresión inducible de cFLIP en células de cáncer de mama está regulada principalmente por la ruta de PI3K/AKT, a través del factor de trascripción FOXO3A [246]. Por ello, decidimos abordar el estudio la regulación de la expresión basal de cFLIP en células de cáncer de mama por esta ruta de señalización. Tras los resultados obtenidos, en los que diferentes inhibidores farmacológicos de la ruta no se consigue el mismo efecto de bajada de expresión, y tras los experimentos con formas constitutivamente activas y dominantes negativas de AKT, donde no se aprecia una variación en los niveles de expresión de cFLIP, llegamos a la conclusión de que la ruta de señalización de PI3K/AKT no es la responsable absoluta de la expresión basal de cFLIP. Tras estos resultados decidimos bloquear la rutas de señalización que, a priori, se habían relaciónado con la regulación a nivel transcripcional de cFLIP. Así hemos llegado a la conclusión de que tras la inhibición de la ruta de NF-kB con el inhibidor específico BMS, los niveles de cFLIP se reducen. Pero se requieren más estudios para realmente confirmar si la bajada en los niveles de expresión de cFLIP se deben a una inhibición transcripcional por el bloqueo de la ruta de NF-kB. Como se ha comentado anteriormente, se ha descrito que cFLIP es una proteína de vida media corta, cuya degradación está mediada por el sistema ubiquitinación/proteasoma. Esto significa que cFLIP debe ubiquitinarse [216], y para ello requiere de una proteina E3-ubiquitin ligasa específica. Se conocen pocas proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasas que puedan tener como proteína diana a cFLIP. Recientemente se ha descrito a ITCH como la E3-ubiquitin ligasa de cFLIPL que promueve la degradación 163 Discusión proteasomal de éste tras el tratamiento con TNF [116] en hepatocitos. ITCH también puede promover la degradación, tanto cFLIPL como decFLIPS, en células de cáncer de ovario tratadas con cisplatino, en un mecanismo que implica a la proteína p53 [274] y que parece estar regulado por AKT [275]. El estado de activación de AKT, determinado por PTEN, también parece estar implicado en la ubiquitinación de cFLIPS por la E3-ubiquitin ligasa AIP4 (Atrophin-interacting protein 4) en células de glioblastoma. Otra E3ubiquitin ligasa específicia de cFLIPS es c-Cbl. La interacción entre ambas proteínas se produce tras la fosforilación de cFLIPS por un mecanismo activado por TNF en macrófagos y que incluye a las proteínas SK1, p38 y cAbl [276]. Sin embargo, poco se conoce sobre el mecanismo de la degradación proteasomal de cFLIP en células de mama. En este trabajo se ha demostrado que el preteasoma desempeña un importante papel en el mantenimiento de los niveles basales de proteína cFLIP, puesto que al inhibir su síntesis con cicloheximida, los niveles de cFLIP disminuyen drásticamente y, esta pérdida puede evitarse si bloqueamos el proteasoma con el inhibidor MG132. Hemos demostrado que la proteína E3-ubiquitin ligasa ITCH, no es la implicada en la degradación de los niveles basales de cFLIP, y que otras proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasa relacionadas de algún modo con cFLIP como TRAF2, Cul-3 o incluso XIAP tampoco son indispensables para dicha degradación. Es por ello, y en vista de la importancia del conocimiento de los mecanismo y/o proteínas implicadas en la regulación del mantenimiento de los niveles basales de expresión de cFLIP, que hemos decido abordar el estudio de la caracterización de la proteína E3-ubiquitin ligasa implicada en la ubiquitinación y degradación de cFLIP en condiciones basales. Para ello, hemos hecho uso de la metodología de estudio de interacción entre proteínas mediante ensayos Phage-display, para determinar las 164 Discusión interacciones que tiene una proteína cFLIPL recombinante con las proteínas expresadas en la envuelta de fagos generados a partir de una genoteca de cáncer de mama clonada en el fago T7. Principalmente estamos interesados en proteínas que interaccionen con cFLIPL y que tengan actividad E3ubiquitin ligasa. Sin embargo, y dada la importacia de cFLIP en control de la apoptosis y por lo tanto en la superviviencia celular, es posible que tanto su síntesis como su degradación no se encuentren reguladas exclusivamente por una determinada vía de señalización, en el caso de la síntesis, y que no exista una única proteína con actividad E3-ubiquitin ligasa implicada en su degradación, pudiendose dar fenómenos de redundancia funcional. Por todo lo expuesto anteriormente, el estudio de la regulación de la expresión de cFLIP en células epiteliales de mama, tumorales o no, representa un objetivo fundamental a resolver para el conocimiento de los procesos que regulan el desarrollo de la mama y toda la repercusión que ello puede tener,a su vez, en el conocimiento del desarrollo de tumores, así como para el diseño de estrategias antitumorales eficaces contra el cáncer de mama. 165 VIII. CONCLUSIONES 166 Conclusiones CONCLUSIONES. 1. Tratamientos farmacológicos como Doxorrubicina o SAHA sensibilizan a células epiteliales de cáncer de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. 2. La disminución de cFLIP por tratamientos farmacológicos o por el silenciamiento de su expresión mediante siRNA es un evento fundamental en la sensibilización de células epiteliales de cáncer de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. 3. El silenciamiento de la expresión de cFLIP mediante siRNA induce apoptosis tanto en células epiteliales de mama normales como en tumorales. 4. La apoptosis inducida por el silenciamiento de la expresión de cFLIP requiere los componentes de la vía extrínseca de apoptosis inducida por TRAIL (TRAIL-R2, FADD y caspasa-8), pero es independiente del ligando de muerte TRAIL. 5. La activación de la ruta mitocondrial es necesaria para la inducción de apoptosis por tratamientos farmacológicos o silenciamiento de cFLIP en combinación con TRAIL. 6. La sobreexpresión de cFLIP, así como el silenciamiento de su expresión, afectan a la correcta formación del lumen durante la morfogénesis de células epiteliales de mama MCF-10A en cultivos 3D. 7. La degradación de cFLIP en células tumorales y no tumorales de mama está mediada por el sistema ubiquitina-proteasoma, independientemente de la ligasa E3 Itch. 8. El nivel basal de expresión de cFLIP en células epiteliales de mama está mantenido por la señalización de la ruta de NF-kB y es independiente de la actividad de la ruta PI3K/Akt. 167 IX. BIBLIOGRAFÍA 168 Bibliografía BIBLIOGRAFÍA. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Kroemer, G., et al., Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death. Cell Death Differ, 2005. 12 Suppl 2: p. 1463-7. Kroemer, G., et al., Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ, 2009. 16(1): p. 3-11. Shi, Y., Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol Cell, 2002. 9(3): p. 459-70. Ashkenazi, A., Directing cancer cells to self-destruct with pro-apoptotic receptor agonists. Nat Rev Drug Discov, 2008. 7(12): p. 1001-12. Kerr, J.F., A.H. Wyllie, and A.R. Currie, Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. 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Reginato2 and Abelardo López-Rivas1@ 1 Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC), Sevilla, Spain. 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine, Philadelphia, USA. @ Address correspondence to: Abelardo López-Rivas, Ph.D., Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), CSIC, Avda Américo Vespucio s/n, 41092 Sevilla, Spain. Phone: 34954467997; Fax: 34954461664; e-mail: [email protected] 2 Summary Strong evidences support the inhibitory activity of cellular FLICEinhibitory protein (cFLIP) in the apoptotic signaling by death receptors in tumor cells. However, little is known about the role of cFLIP in the regulation of apoptosis in normal cells. In this report, we demonstrate that cFLIPL plays an important role both as a survival protein and an inhibitor of TRAIL-induced apoptosis in normal breast epithelial cells. Silencing of cFLIPL by siRNA methodology induces a caspase-dependent, ligandindependent cell death process in breast epithelial cells. This cell death requires the expression of TRAIL-R2, FADD and procaspase-8 proteins. A mitochondria-operated apoptotic pathway is partially required for cFLIPL siRNA-induced apoptosis. Interestingly, cFLIPL silencing markedly abrogates formation of acinus-like structures in a three-dimensional basement membrane culture model (3D) of the human mammary MCF-10A cell line. Furthermore, over-expression of either FLIPL or FLIPS in MCF-10A cells delayed lumen formation in 3D cultures. Our results highlight the central role of cFLIP in maintaining breast epithelial cell viability and suggest that the mechanisms regulating cFLIP levels should be finely controlled to prevent unwanted cell demise. Key words: Apoptosis, TRAIL, cFLIP, morphogenesis Abbreviations: TRAIL, tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; TNF, tumor necrosis factor; DISC, death-inducing signalling complex; FADD, Fas-associated death domain; z-VAD.FMK, benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(OMe) fluoromethyl ketone 3 Introduction Apoptosis is a highly regulated cell death process that is required for integrity and homeostasis of multicellular organisms and is also important in embryonic development (1). Deregulation of apoptosis contributes to different pathological states (2,3). Moreover, defects in the apoptosis machinery can result in drug resistance by tumor cells (4). The past decade has witnessed an enormous progress in our knowledge of the pathway for the execution of apoptotic cell death and both mitochondriadependent and –independent mechanisms have been involved in the induction of apoptosis by different treatments (5). By exploiting this knowledge base, a number of innovative strategies for treating cancer have been implemented (4). In contrast to many therapeutic drugs that induces apoptosis by acting at the mitochondrial level, the socalled extrinsic pathway of apoptosis utilises membrane-localized “death receptors” to activate the caspase cascade and apoptosis upon ligand binding. These receptors are members of TNF receptor superfamily (6). Amongst their ligands, TRAIL (APO-2 ligand), a member of the TNF family, is a type II transmembrane protein with important functions as an apoptosis inducer in the immune system (7). Moreover, TRAIL selectively induces apoptosis in many tumor cells while leaving normal cells intact and thus is an attractive candidate for antitumor therapies (8), although resistance to TRAIL has been reported in certain tumor cells (9,10). Activation of TRAIL receptors leads to the formation of a DISC, which includes the receptor itself, the adapter molecule FADD and procaspase-8 (11). Processing and activation of caspase-8 at the DISC leads to a cascade of apoptotic events which results in the death of the cell. At the DISC level, the apoptotic signal may be inhibited by cFLIP, the homologue of vFLIP in vertebrate cells (12). In most cells, cellular FLIP exists as two alternative spliced isoforms: cFLIPL, a homologue of caspase-8, which lacks critical amino acids for proteolytic caspase activity, and cFLIPS, consisting only of two death effector domains (DED) [Irmler, 1997 #30]. A third 23 kDa recently identified form, called cFLIPR with properties similar to those of cFLIPS is also expressed in some cells (13). FLIP expression fluctuates in a cell-type-specific manner and in response to various stimuli, transcriptionally through the NF-κB pathway (14), and at the protein level via altered rates of proteasomal degradation (15), which makes it a versatile inhibitor of apoptotic responses mediated by death receptors. Accumulating evidence indicates an anti-apoptotic function for cFLIPL in many types of human cancer cells (16,17), although it could also play a pro-apoptotic role under certain conditions (18). In non-transformed cells, cFLIP is an important regulator of cell proliferation, particularly in the immune system (19). However, little is known about the role of cFLIP as an inhibitor of apoptosis in normal cells. In this study, we examined the importance of cFLIP as a survival factor for normal breast epithelial cells in conventional cultures of cells in monolayers as well as in three-dimensional (3D) cultures that better resemble the in vivo architecture of a glandular epithelium (20). We show that knockdown of cFLIPL in normal breast epithelial cells by RNA interference induces spontaneous apoptosis through a ligand-independent TRAIL receptor-mediated pathway. We also demonstrate that in 3D cultures, cFLIPL regulates the formation of acini-like structures. 4 Experimental Procedures Reagents and Antibodies –Soluble human His-tagged recombinant TRAIL (residues 95-281) was produced as described (21). Anti-cFLIP monoclonal antibody (NF6) was from Alexis Corp. (San Diego, CA). Anti-caspase 8 was generously provided by Dr. Gerald Cohen (Leicester University, UK). Antibody anti-FADD and Growth factor reduced Matrigel were obtained from BD Bioscience (Erembodegem, Belgium). Monoclonal antibody to alpha-tubulin and puromycin were purchased from Sigma Chemical Corp. Antibody anti-GAPDH was from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Anti-Bid was generously provided by Dr. X Wang (Howard Hughes Institute, Dallas, Texas). Antibodies against TRAIL-R2/DR5 and TRAIL were from R&D Systems (Minneapolis, USA). Anti-cleaved caspase-3 was from Cell Signalling (MA, USA). Anti-Bcl2 and Horseradish peroxidase conjugated secondary antibodies were obtained from DAKO (Cambridge, United Kingdom). benzyloxycarbonyl-ValAla-Asp-(OMe) fluoromethyl ketone (zVAD-fmk) was purchased from Bachem AG (Bachem, Bubendorf, Switzerland). Cell Lines. Cell lines were either maintained in RPMI medium (MDA-MB231) or in DMEM medium (HEK293-T and BT-474) containing 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 50 U of penicillin/ml, and 50 µg of streptomycin/ml. MCF-10A cells were maintained in DMEM/F12 supplemented with 5% donor horse serum, 2 mM Lglutamine, 20 ng of epidermal growth factor (EGF)/ml, 10 µg of insulin/ml, 100 ng of cholera toxin/ml, 0.5 µg of hydrocortisone/ml, 50 U of penicillin/ml, and 50 µg of streptomycin/ml. All cell lines were maintained at 37°C in a humidified 5% CO2, 95% air incubator. siRNA: siRNA against cFLIP (5’-GGGACCUUCUGGAUAUUUUdTdT-3’), cFLIPL (5’-GAGCAUACCUGAAGAGAGAdTdT-3’), cFLIPS (5`CACCCUAUGCCCAUUGUCCdTdT-3’), Caspase-8 (5’-GGAGCUGCUC UUCCGAAUUdTdT-3’), FADD (5’-GAAAGACCUGUGUGCAGCAUdTdT-3’), DR5 (5’-GACCCUUGUGCUCGUUGUCdTdT-3’), Bid (5’GAAGACAUCAUCCGGAAUAdTdT-3’), Scrambled (5’GAGCGCUAGACAAUGAAGdTdT-3’) were from SIGMA-Proligo (Boulder, CO). Cells were transfected with siRNAs using DharmaFECT 1 (Dharmacon, Lafayette, CO) as described by the manufacturer. Retroviral and lentiviral vectors and virus production cFLIPL and cFLIPS (in pCR3.V64 vector, a kind donation of Dr. J. Tschopp, University of Lausanne) were cloned into BamHI/SalI sites of pBabepuro and HindIII/NotI sites of pLPCX, respectively. pBabe-dnFADD and pBabe-Bcl2 vectors have been previously described (22). Retroviruses for protein overexpression were produced by transfection of HEK293-T cells with the corresponding retroviral vectors. Retrovirus-containing supernatants were collected at days 5–7 after transfection and were stored at –80ºC. shRNA against FLIPL in a pSUPER vector (OligoEngine) was digested and cloned between EcoR1 and Cla1 into a H1 promoter-driven pLVTHM lentiviral vector (23). Lentiviruses were produced by transient cotransfection of 293T cells with the corresponding lentiviral vector, packaging plasmid psPAX2 and envelope plasmid pMD2.G. Lentivirus-containing supernatants were collected at day 3 after transfection by centrifugation. 5 Generation of MCF-10A Cell Lines MCF-10A cells were plated at 5×105 cells per 10-cm dish and infected with the retroviruses mentioned above. Stable populations were obtained by selection with 2 µg/ml puromycin. MCF-10A cells were plated at 8x104 cells per 35-mm dish and infected with the lentiviruses during 48 hours. Then the cells were used for 3D morphogenesis assays. Morphogenesis assay. Assays were performed as previously described (24,25). Briefly, MCF-10A cells were resuspended in assay medium (DMEM/F12 supplemented with 2% donor horse serum, 10 µg of insulin/ml, 100 ng of cholera toxin/ml, 0.5 µg of hydrocortisone/ml, and 5 ng of EGF/ml). Eight-well RS glass slides (BD Falcon) were coated with 40µl of Matrigel per well. Then, 5x103 cells were plated per well in assay medium containing a final concentration of 2% Matrigel. Assay medium containing 2% Matrigel was replaced every 4 days. Immunofluorescence and image acquisition. Structures were prepared as previously described (24,25). Briefly, acini were fixed in 4% formalin for 25 min at room temperature. Fixed structures were washed with PBS-glycine (130 mM NaCl, 7mM Na2HPO4, 100 mM glycine) three times for 15 min each time. The structures were then blocked in IF buffer (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3.5 mMNaH2PO4, 7.7 mM NaN3, 0.1% bovine serum albumin, 0.2% Triton X-100,0.05% Tween 20) plus 10% goat serum for 1 to 2 h, followed by 2% blocking buffer (i.e., IF buffer containing 10% goat serum and 20 µg of goat anti-mouse F(ab)2/ml) for 40 min. Primary antibodies were diluted in 2% blocking buffer, followed by incubation overnight at 4°C. Structures were washed three times in IF buffer for 15 min each. Anti-mouse or anti-rabbit secondary antibodies coupled with Alexafluor dyes (Molecular Probes) were diluted in IF buffer containing 10% goat serum, followed by incubation for 60 min. After a wash with IF buffer as described above, structures were incubated with 0.5 ng of DAPI (4-6diamidino-2-phenylindole; Sigma)/ml before being mounted with the antifade agent Prolong (Molecular Probes). Confocal analysis was performed in a Leica TCS-SP5 laser microscope. Analysis of Apoptosis - Hypodiploid apoptotic cells were detected by flow cytometry according to published procedures (Gong, J et al. Anal. Biochem. 218, 314-319). Immunoblot analysis of proteins - Proteins were resolved on SDS-polyacrylamide minigels and detected as described previously (26). Statistical analysis - Data are presented as mean ± S.E.M. of at least three independent experiments. Differences between treatment groups were determined by using Student's test. Statistical significance was evaluated by calculating P values. P values below 0.05 were considered significant. 6 Results Dual role of cFLIP as inhibitor of TRAIL-induced apoptosis and survival protein in breast epithelial cells Recent results from our laboratory have demonstrated the existence of intracellular mechanisms of resistance to TRAIL-induced apoptosis in a variety of breast tumor cell lines. Our data indicated that treatments like IFN gamma, glucose deprivation and inhibitors of cyclin-dependent kinases sensitize breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis (27-29). This sensitization process involves the increased formation of the death-inducing signalling complex (DISC), mediated by regulating the expression of DISC proteins. To understand the mechanism underlying the resistance of breast tumor cells to TRAIL we determined the role of cFLIP isoforms by siRNA methodology. Results shown in figure 1 demonstrate that simultaneous silencing of both cFLIPL and cFLIPS isoforms resulted in an increased sensitivity to TRAIL-induced apoptosis in the cell lines studied. We next examined the role of individual cFLIP isoforms in the sensitivity of breast tumor cells to TRAIL. In BT474 cells, knockdown of cFLIPL was sufficient to markedly sensitize these cells to TRAIL-induced apoptosis. In contrast, silencing of cFLIPL expression did not sensitize MDA-MB231 cells to TRAIL. A likely explanation for these results may be the different levels of cFLIPS isoform between these two cell lines (Fig. 1), with MDA-MB231 cells expressing higher levels of cFLIPS than BT-474 cells. On the other hand, cFLIPS knockdown did not induce sensitivity to TRAIL in any of the cell lines tested, all of them expressing elevated levels of cFLIPL isoform. These results suggest that cFLIPL levels are important determinants of breast tumor cells sensitivity to TRAIL-induced apoptosis. We also examined the role of cFLIP isoforms in the sensitivity of MCF-10A normal breast epithelial cells to TRAIL-induced apoptosis. Silencing expression of either isoform markedly sensitized these cells to TRAIL-induced apoptosis (Fig. 2a). Interestingly, we observed that knockdown of cFLIPL caused spontaneous apoptosis in the absence of TRAIL. In contrast, silencing cFLIPS expression by siRNA did not induce apoptosis in MCF-10A cells (Fig. 2a). We then studied the mechanism of apoptosis induced by cFLIPL knockdown. Spontaneous apoptosis following cFLIPL knockdown was completely inhibited by the pan-caspase inhibitor Z-VAD-fmk (Fig. 2b), demonstrating the participation of caspases in this cell death process. Overexpression of cFLIPL with a retroviral vector clearly inhibited spontaneous apoptosis in MCF-10A cells (Fig. 2c), further indicating that knockdown cFLIPL by siRNA is responsible for the observed apoptosis and is not due to off-target effects of this oligonucleotide. Ligand-independent activation of TRAIL-R2-mediated apoptosis in normal breast epithelial cells by cFLIPL knockdown We next determine the requirements for the activation of apoptosis by cFLIPL siRNA in MCF-10A cells and whether the extrinsic pathway is involved in this process. MCF-10A cells mainly express TRAIL-R2/DR5 and this receptor is responsible for the apoptosis observed in sensitized cells treated with TRAIL (30). To find out whether the apoptosis induced by cFLIPL knockdown requires the expression of TRAIL-R2/DR5, MCF-10A cells were incubated with siRNAs to TRAIL-R2/DR5 and cFLIPL and apoptosis was then measured. Results shown in figure 3a indicate that silencing TRALR2/DR5 expression significantly reduces spontaneous apoptosis caused by cFLIPL knockdown. Activation of the extrinsic pathway upon engagement of the pro-apoptotic TRAIL receptors by TRAIL requires the formation of a death-inducing signaling 7 complex (DISC), which includes the receptor itself, the adapter molecule FADD and procaspase-8 (11). To determine the role of FADD in the apoptosis induced by cFLIPL silencing in normal breast epithelial cells, we used two different experimental approaches. In the first place, FADD expression was reduced in MCF-10A cells by a specific siRNA (Fig. 3b) and the effect on spontaneous apoptosis by cFLIPL silencing was determined. Results shown in figure 3b indicate that FADD knockdown partially inhibited apoptosis induced by cFLIPL siRNA. Residual FADD present in cells incubated with FADD siRNA may explain the finding that only partial inhibition of apoptosis was observed. To further explore the role of FADD in spontaneous apoptosis by cFLIPL siRNA, we performed some experiments in MCF-10A cells over-expressing a dominant negative form of FADD (DN-FADD). Data shown in figure 3c demonstrate that DN-FADD markedly reduced apoptosis induced by silencing cFLIPL expression in normal breast epithelial cells. We next assessed whether caspase-8 was required for the apoptotic process induced by cFLIPL silencing in MCF-10A cells. To this end, caspase8 expression was reduced by RNA interference and apoptosis induced by cFLIPL knockdown was determined (Fig. 3d). Our results demonstrate that caspase-8 silencing completely abrogated the apoptosis mediated by cFLIPL knockdown in these cells. Taken together, these data point out to a role of the TRAIL DISC components in spontaneous apoptosis induced upon a reduction in cFLIPL levels in normal breast epithelial cells. TRAIL DISC formation is normally triggered by binding of trimeric ligand to specific death receptors (11,31). We then analyzed whether cFLIPL knockdown induced the expression of TRAIL in MCF-10A cells. However, we could not detect TRAIL protein in cells in which cFLIPL has been silenced by siRNA (results not shown). Furthermore, a recombinant TRAIL-R2/Fc chimeric protein did not inhibit apoptosis mediated by the cFLIPL knockdown whereas it completely prevented TRAILinduced apoptosis (Fig. 3e). Ligand-independent assembly of the DISC has been demonstrated in the TNF family of death receptors (32), most likely due to the homotypic association of receptors mediated by the pre-ligand-binding assembly domain (PLAD) (33). We are currently investigating whether cFLIPL knockdown induces ligand-independent DISC formation and the mechanisms regulating this process in normal breast epithelial cells. Ligation of pro-apoptotic TRAIL receptors by their ligand activates both mitochondria-dependent and independent mechanisms of apoptosis in various cell types (34,35). We then asked whether ligand-independent, TRAIL-R2-dependent apoptosis induced by cFLIPL silencing required the activation of a mitochondria-operated pathway. For this purpose, we used MCF-10A cells over-expressing Bcl-2 as described in Materials and Methods. Knockdown of cFLIPL expression induced apoptosis in cells infected with an empty retrovirus (Fig. 4a). In contrast, in cells over-expressing Bcl-2 apoptosis induced by cFLIPL siRNA was partially inhibited, which suggested a role of mitochondria in this apoptotic pathway. To further confirm these results, we silenced the expression of the BH3-only protein Bid, a protein substrate of caspase-8 involved in the mitochondrial pathway activated by death receptors and determined apoptosis in MCF-10A cells. Results shown in figure 4b demonstrate that Bid is at least partially involved in the apoptosis induced by cFLIPL knockdown, which supports a role of the mitochondria in this apoptotic pathway. Role of cFLIPL in morphogenesis of acinar structures in 3D cultures of MCF-10A cells 8 MCF-10A is a nontransformed human mammary epithelial cell line which shows many features of normal breast epithelium, including dependence on growth factors and hormones for proliferation and survival, lack of anchorage-independent growth and lack of tumorigenicity in nude mice (36). Interestingly, when grown in a matrix of reconstituted basement membrane components, MCF-10A cells form acinar structures that retain many characteristics of a glandular epithelium in vivo (37). Although it has been reported that TRAIL may play a role during morphogenesis in vitro (22), nothing is known about the role of cFLIP in the formation of acinar structures in 3D cultures. We then examined whether cFLIPL silencing may affect acini development in MCF-10A cells cultured in matrigel. To stably silence the expression of cFLIPL we generated lentiviral vectors expressing GFP and either short hairpin RNA (shRNA) against cFLIPL or an irrelevant shRNA. As shown in figure 5a, after 48 hours in culture cFLIP expression was drastically reduced in viable MCF-10A cells infected with lentiviral shRNA-cFLIPL as compared to a control shRNA. At this time, viable cells were seeded in matrigel dishes to allow the formation of acinar structures. Interestingly, after nine days in culture, the percentage of GFP-expressing acini was markedly reduced in 3D cultures of MCF-10A infected with cFLIPL shRNA lentivirus as compared to cultures of MCF-10A cells infected with control shRNA lentiviral particles (Fig. 5b). These results indicate that down-regulation of cFLIPL expression impedes the development of acini-like structures and suggest that cFLIPL plays a survival role not only in monolayers cultures but also in 3D cultures of normal breast epithelial cells by preventing the onset of an apoptotic cell death process mediated by TRAIL receptors. When cultured on Matrigel, MCF-10A cells undergo a series of proliferative and morphogenetic events resulting in the formation of growth-arrested acini-like spheroids, composed of a single layer of polarized epithelial cells surrounding a hollow lumen. In this cell system, lumen formation requires the activation of an apoptotic process together with the inhibition of proliferation (37). As we have demonstrated in this work that cFLIPL is a survival factor for MCF-10A cells and it could also transmit proliferative signals in certain cell types (19), we asked whether over-expressing it could have an effect in the morphogenesis of acinar structures in 3D cultures of MCF10A cells. Cells were retrovirally transduced to express either cFLIPL or cFLIPS (Fig. 6a) before culturing then in matrigel containing-medium to investigate morphogenesis. Luminal clearing was determined after staining the acini with DAPI and counting the number of intact nuclei in the lumen. As shown in figure 6b and c, cFLIPL overexpression in MCF-10A cells significantly delayed lumen formation when compared to cells infected with a control pBabe retrovirus. We also investigated morphogenesis in MCF-10A cells overexpressing the short form of cFLIP (cFLIPS). Similarly to cFLIPL-overexpressing cells, cells with elevated levels of cFLIPS also showed a delay in the formation of the lumen (Fig. 6b and c). Our findings that constitutive expression of cFLIP isoforms delays luminal clearing in 3D cultures suggest that the anti-apoptotic properties and perhaps the proliferative potential of these proteins may play a relevant role in the regulation of the morphogenetic process during acini formation. 9 Discussion In tumor cells, cellular FLIP is an important modulator of procaspase-8 activation and thereby controls induction of apoptosis mediated by death receptors. As an important regulator of caspase-8, cFLIP is responsible for the resistance to death receptor-mediated apoptosis in many types of tumor cells and has been proposed as a potential target for therapeutic intervention (38). At the protein level, of the three expressed forms of cFLIP, cFLIPS is clearly an antiapoptotic molecule with potent activity as inhibitor of caspase-8 at the DISC (12). cFLIPR has been also reported to inhibit death receptorinduced apoptosis when overexpressed in cells (13) although its physiological functions are yet not fully understood. In contrast, the role of cFLIPL in apoptosis regulation has been rather controversial, with studies indicating an antiapoptotic function (12,39) and others reporting an allosteric activation of procaspase-8 and enhancement of apoptosis following death receptor activation (18,40). Despite these conflicting data, available evidences suggest that cFLIPL can either promote or inhibit death receptor-mediated apoptosis depending on its expression levels in the cell. In normal cells, cFLIP has been shown to exert other functions related to cell activation and proliferation (41-44). In this respect, mice embryos deficient in cFLIP exhibit impaired heart development independently of its antiapoptotic function (45). However, little is known about the role of cFLIP as a survival factor and regulator of apoptosis in normal cells. Our data indicate that cFLIP levels are important determinants of the resistance of normal breast epithelial cells to TRAIL-induced apoptosis since a reduction in the cellular levels of cFLIP by RNA interference markedly sensitizes these cells to apoptosis. On the other hand, we have recently reported that activation of autophagy by TRAIL is a requirement for the observed resistance of normal epithelial cells to TRAIL (30). Whether cFLIP is inhibiting apoptosis in normal cells by its direct action on procaspase-8 activation or through the regulation of cytoprotective autophagy is unknown at present and we are currently investigating this issue in nontransformed human epithelial cells. Interestingly, our data demonstrate for the first time that cFLIPL knockdown in normal breast epithelial cells is sufficient to induce apoptosis in a ligand-independent TRAIL-R2/DR5-dependent manner. This cell death mechanism requires the DISC components FADD and procaspase-8 and is partially inhibited by interfering with the mitochondriaoperated apoptotic pathway. These results either suggest that a TRAIL DISC is formed in breast epithelial cells when the cellular concentration of cFLIPL protein decreases below a threshold level or that an inactive, preformed DISC is activated as a consequence of the drop in cFLIPL levels in the cell. Our attempts to demonstrate which of these possibilities is correct have failed as we have not been able to detect the TRAIL DISC in the absence of ligand, due perhaps to the slow kinetic of DISC formation and spontaneous cell death in cFLIPL knockdown cells. Activation of spontaneous apoptosis upon silencing of cFLIP has been reported in various tumor cells and these findings have led to propose that cFLIP could be a potential target for antitumor therapy (17,39,46). However, our results imply that targeting cFLIP could also affect viability of normal cells and hence this therapeutic strategy may not be acceptable. Development and involution of the mammary gland are prototypical examples of the importance of apoptosis in morphogenesis and function of this organ (47). Thus, the mammary gland provides an interesting model to characterise the control mechanisms of apoptosis in a physiological system that are disrupted during the pathogenesis of epithelial tumours (20). The mammary gland, a glandular epithelium, is formed by units called acini with a central cavity, the lumen surrounded by polarised epithelial cells. Apoptosis accompanies clearing of the terminal end buds in the developing mammary gland and lumen formation. Many types of early breast cancer lesions such as ductal carcinoma in situ are characterized by loss of acinar organization and filling of the luminal space (48). In culture, MCF-10A cells retain many characteristics of normal breast epithelium and form acinar structures when grown in Matrigel. Our results demonstrate that cFLIPL knockdown with lentiviral vectors expressing shRNA markedly reduces the number of acini in 3D cultures of MCF-10A cells, which suggests that maintenance of cFLIPL levels may have an important role in the control of morphogenesis in the mammary gland. In this respect, it has been reported that TRAIL is up-regulated during morphogenesis of MCF-10A mammary epithelial cells in 3D basementmembrane cultures and inhibition of TRAIL signalling during morphogenesis delays lumen formation (22). Our data in cells over-expressing cFLIP further support the role of this caspase inhibitor in regulating lumen 10 formation during morphogenesis in 3D cultures. Moreover, we have recently described that TRAIL induces cytoprotective autophagy in monolayer cultures of MCF-10A cells through the activation of a novel signalling pathways that involves TAK1, AMPK and mTOR (30). In these cells, downregulation of cFLIPL expression by siRNA abrogates TRAIL-induced autophagy and promotes TRAILinduced apoptosis (our unpublished observations). Thus, cFLIPL may be playing a central role in the morphogenetic process by regulating the outcome of TRAIL receptor activation. On the other hand, it has been recently reported that matrix detachment induces autophagy in breast epithelial cells and inhibition of autophagy in MCF-10A enhances anoikis and luminal apoptosis during morphogenesis (49), further indicating that autophagy plays a cytoprotective role in these processes. Moreover, the DISC components FADD and caspase-8 have been involved in matrix detachment-induced apoptosis in a ligand independent manner (50). Our unpublished observations demonstrate that cFLIP levels are up-regulated following detachment from the extracellular matrix and during morphogenesis. Increased cFLIP levels in the cell may presumably prevent epithelial cells from undergoing anoikis following ECM detachment (51), allowing them to survive provided that they reattach in a timely manner. Therefore, cFLIP levels may be controlling not only TRAIL-induced apoptosis but also anoikis during morphogenesis of the mammary gland. 11 References 1. Danial, N. N., and Korsmeyer, S. J. (2004) Cell 116, 205-219 2. Bredesen, D. E., Rao, R. V., and Mehlen, P. (2006) Nature 443, 796-802 3. Green, D. R., and Evan, G. I. (2002) Cancer Cell 1, 19-30 4. Reed, J. C. (2006) Nat Clin Pract Oncol 3, 388-398 5. Green, D. R., and Kroemer, G. (2004) Science 305, 626-629 6. Ashkenazi, A., and Dixit, V. M. (1998) Science 281, 1305-1308 7. Lamhamedi-Cherradi, S. E., Zheng, S. J., Maguschak, K. A., Peschon, J., and Chen, Y. H. 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Apoptosis was measured as percentage of cells with sub-G1 DNA content. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. *P <0.05, **P<0.01. We also verified protein knockdown by immunoblot analysis. Cells were harvested prior to the addition of soluble recombinant TRAIL. Tubulin was used as a protein loading control. Figure 2. Knockdown of endogenous cFLIPL induced apoptosis in MCF-10A breast epithelial cells. a) MCF-10A cells were transfected with siRNA oligonucleotides targeting both cFLIP isoforms (FLIP), FLIP long (FLIPL) or FLIP short (FLIPS) for 48h as described in materials and methods. Then TRAIL (100ng/ml) was added for a further 24h period. Apoptosis and protein knockdown were determined as in figure 1. Results show the average and range (apoptosis analysis) or a representative experiment (protein silencing) from of two different experiments. b) MCF-10A cells were transfected either with a siRNA oligonucleotide targeting the long isoform of cFLIP or a scrambled RNA oligonucleotide, as described in materials and methods. At the same time, cells were treated with or without z-VAD-fmk (50µM). After 72 h apoptosis was measured as in figure 1. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. **P<0.01. c) MCF-10A cells over-expressing FLIPL or control MCF-10A (pBabe) were transfected with siRNA for FLIPL or a scrambled RNA. After 72h apoptosis was measured as in figure 1. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. *P <0.05. Figure 3. TRAIL-R2, FADD and Caspase-8 but not TRAIL are involved in siRNA FLIPL-induced apoptosis in MCF-10A breast epithelial cells. a) MCF-10A cells were transfected with siRNA for FLIPL or TRAIL-R2, or both of them at the same time. After 72 h apoptosis was measured as in figure 1. Results show the average and range of two different experiments. For immunoblot analysis to verify protein knockdown, cells were harvested 72h after transfection. b) MCF-10A cells were transfected with siRNA for FLIPL or FADD, or both of them at the same time. After 72 h apoptosis was measured as in figure 1. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. *P<0.05. Protein knockdown was determined by immunoblot analysis 72h after transfection. c) MCF-10A cells over-expressing a dominant negative form of FADD (DN-FADD) or control MCF-10A cells (pBabe), were transfected either with siRNA for FLIPL or scrambled RNA oligonucleotide. After 72h apoptosis was measured as in figure 1. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. *P<0.05. Western blot shows the level of FADD in both control MCF10A cells and cells over-expressing DN-FADD. d) MCF-10A cells were transfected with siRNA for FLIPL or Caspase-8, or both of them at the same time. After 72h apoptosis was determined. Results show the average and S.E.M. of three different 14 experiments. **P<0.01. For immunoblot analysis to verify protein knockdown, cells were harvested 72h after transfection. e) MCF-10A cells were transfected either with siRNA for FLIPL or scrambled RNA oligonucleotide (left panel). At the same time, cells were treated with or without a recombinant human TRAIL-R2/Fc chimeric protein (TR2-Fc, 150ng/ml) (RD systems) to block TRAIL signalling. After 72 h apoptosis was measured. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. **P<0.01. In right panel MCF-10A cells were treated with TRAIL for in the presence or absence ofTRAIL-R2/Fc and apoptosis was determined as described. Figure 4. The mitochondria-regulated pathway is partially involved in siRNA FLIPL-induced apoptosis. a) MCF-10A cells over-expressing Bcl2 protein or MCF-10A control (pBabe) were transfected either with siRNA for FLIPL or scrambled RNA oligonucleotide. After 72h, apoptosis was measured. Results show the average and range of two independent experiments. Western blot shows Bcl2 levels if control (pBabe) and Bcl2 cells. b) MCF-10A cells were transfected either with siRNA for FLIPL or Bid, or both of them at the same time. After 72 h apoptosis was determined. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. *P<0.05. For immunoblot analysis to verify protein knockdown, cells were harvested 72h after transfection. Figure 5. FLIPL is required for MCF-10A cells survival in 3D cultures. MCF-10A cells were infected with lentiviral vectors for the expression of shRNA FLIPL or shRNA scrambled as described in Materials and Methods. After 48 h cells were harvested to verify protein knockdown (a) or for 3D morphogenesis assay (b). For morphogenesis assays cells were cultured for 9 days in matrigel, and then the percentage of GFP-positive acini was determined. Data show the average and range of two independent experiments. Figure 6. Over-expression of cFLIP delays luminal clearing in MCF-10A morphogenesis assay. MCF-10A cells stably over-expressing either FLIPL or FLIPS, or MCF-10A control cells (pBabe, pLPCX) (a) were used for 3D morphogenesis assay (b). The percentage of acini containing four or less intact nuclei in lumen was measured at the indicated time points during morphogenesis. At least 100 acini were counted in each experiment. Values represent the mean and the S.E.M of three independent experiments. *P<0.05. 15 Acknowledgements This work was supported by grants from Ministerio de Educación y Ciencia (SAF200600633), Red Temática de Investigación Cooperativa en Cáncer (RTICC) (RD06/0020/0068) and Junta de Andalucía (CTS-211) to AL-R. RY was supported by a contract from Instituto de Salud Carlos III. We are grateful to Dr. Didier Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) for donation of pLVTHM vector. We thank Ana Isabel López-Pérez for excellent technical assistance. a No TRAIL TRAIL 40 20 siRNA BT474 60 ** No TRAIL TRAIL * 40 20 0 0 siRNA b Apoptotic cells (%) Apoptotic cells (%) 60 MDA-MB231 MDA-MB231 SC FLIP FLIPL FLIPS SC F FL FS siRNA SC siRNA SC FLIPL FLIPS Tubulin FLIP F FL FLIPL FLIPS FS FLIPL FLIPS FLIPS (Long exposure) Tubulin Figure 1 a 100 Apoptotic cells (%) No TRAIL 80 TRAIL 60 40 20 0 siRNA SC FLIP FLIPL FLIPS FLIPL FLIPS Tubulin Figure 2 c b 100 pBABE FLIPL Apoptotic cells (%) 80 NT Z-VAD ** 60 40 20 0 siRNA Apoptotic cells (%) 60 FLIPL * pBABE FLIPL Actin 40 20 0 SC FLIPL siRNA SC FLIPL Figure 2 Apoptotic cells (%) a 60 40 20 0 siRNA SC FLIPL TR2 FLIPL TR2 FLIPL TR2 GAPDH Figure 3 * b c 60 Apoptotic cells (%) Apoptotic cells (%) 60 40 20 pBABE DN-FADD 40 20 0 0 siRNA * SC FLIPL FADD FLIPL FADD siRNA SC pBabe FLIPL DN-FADD FADD GAPDH Figure 3 ** Apoptotic cells (%) d 60 40 20 0 siRNA SC FLIPL C8 FLIPL C8 Figure 3 e 100 Apoptotic cells (%) Apoptotic cells (%) 60 40 20 0 siRNA 80 No TR2-Fc TR2-Fc ** 60 40 20 0 SC FLIPL FLIPL + TR2-Fc Control TRAIL Figure 3 b 60 Apoptotic cells (%) Apoptotic cells (%) a pBabe Bcl2 40 20 0 siRNA SC FLIPL pBabe Bcl2 60 * 40 20 0 siRNA SC FLIPL Bid FLIPL Bid FLIPL GAPDH Bid Bcl-2 GADPH Figure 4 a pLVTHM FLIPL SC FLIPL FLIPS GAPDH Figure 5 b GFP positive acini (%) pLVTHM-SC pLVTHM-FLIPL 100 80 60 40 20 0 siRNA SC FLIPL Figure 5 a pLRCX pLRCX/ FLIPS pBABE pBABE/ FLIPL FLIPL FLIPS Actin Figure 6 b pBABE FLIPs FLIPL c Acini whith 4 or more cells in lumen (%) pBabe 100 FLIPL FLIPS 80 60 * 40 20 0 Day 7 Day 10 Day 15 Morphogenesis Day 18 Figure 6 npg Roscovitine and TRAIL-induced apoptosis 664 ORIGINAL ARTICLE Cell Research (2008) 18:664-676. © 2008 IBCB, SIBS, CAS All rights reserved 1001-0602/08 $ 30.00 www.nature.com/cr Roscovitine sensitizes breast cancer cells to TRAILinduced apoptosis through a pleiotropic mechanism Gustavo Ortiz-Ferrón1, Rosario Yerbes1, Adriana Eramo2, Ana I López-Pérez1, Ruggero De Maria2, Abelardo López-Rivas1 Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC), Avda Américo Vespucio s/n, 41092 Sevilla, Spain; 2Department of Hematology, Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, Rome, Italy 1 The tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/APO2L) is a member of the TNF gene superfamily that induces apoptosis upon engagement of cognate death receptors. While TRAIL is relatively non-toxic to normal cells, it selectively induces apoptosis in many transformed cells. Nevertheless, breast tumor cells are particularly resistant to the effects of TRAIL. Here we report that, in combination with the cyclin-dependent kinase inhibitor roscovitine, exposure to TRAIL induced marked apoptosis in the majority of TRAIL-resistant breast cancer cell lines examined. Roscovitine facilitated TRAIL death-inducing signaling complex formation and the activation of caspase-8. The cFLIPL and cFLIPS FLICE-inhibitory proteins were significantly down-regulated following exposure to roscovitine and, indeed, the knockdown of cFLIP isoforms by siRNA sensitized breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. In addition, we demonstrate that roscovitine strongly suppressed Mcl-1 expression and up-regulated E2F1 protein levels in breast tumor cells. Significantly, the silencing of Mcl-1 by siRNA sensitized breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. Furthermore, the knockdown of E2F1 protein by siRNA reduced the sensitizing effect of roscovitine in TRAIL-induced apoptosis. In summary, our results reveal a pleitropic mechanism for the pro-apoptotic influence of roscovitine, highlighting its potential as an antitumor agent in breast cancer in combination with TRAIL. Keywords: apoptosis, roscovitine, CDK, TRAIL, DISC, FLIP, Mcl-1, E2F1 Cell Research (2008) 18:664-676. doi: 10.1038/cr.2008.54; published online 6 May 2008 Introduction The tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosisinducing ligand (TRAIL/APO-2L), a member of the TNF gene superfamily, induces apoptosis upon binding to the death domain (DD)-containing receptors TRAIL-R1/DR4 and TRAIL-R2/DR5 [1]. However, TRAIL can also bind to the decoy receptors TRAIL-R3/DcR1 and TRAIL-R4/ DcR2, which do not transduce apoptotic signals [2]. Since Correspondence: Abelardo López-Rivas Tel: +34-95-446-7997; Fax: +34-95-446-1664 E-mail: [email protected] Received 17 October 2007; revised 3 December 2007; accepted 11 December 2007; published online 6 May 2008 Abbreviations: tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL); tumor necrosis factor (TNF); death-inducing signaling complex (DISC); Fas-associated death domain (FADD); cyclin-dependent kinase (CDK); FLICE-inhibitory protein (FLIP); benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(OMe) fluoromethyl ketone (z-VAD.FMK); poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) TRAIL induces apoptosis selectively in transformed cells of diverse origin but not in most normal cells in vitro, it is an attractive candidate for antitumor therapies [2-4]. However, some cancer cells show either partial or complete resistance to the apoptotic effects of TRAIL [3], although it appears that in certain instances this resistance can be overcome by combining TRAIL with chemotherapeutic drugs [5-7]. In the western world, breast cancer is the most common neoplasia amongst women, emphasizing the importance of developing effective treatments. Recently, different combined strategies have been studied to improve the effects of chemo- and radiotherapy. Indeed, we and others have reported that interferon-gamma, DNA-damaging drugs and ionizing radiation can sensitize breast cancer cells to TRAIL-induced apoptosis [8-10]. Upon binding to its proapoptotic receptors TRAIL induces the formation of the death-inducing signaling complex (DISC), recruiting the dual adaptor Fas-associated death domain (FADD) molecule through its DD. In turn, this complex recruits the initiator caspase-8 through Cell Research | Vol 18 No 6 | June 2008 npg Gustavo Ortiz-Ferrón et al. npg 665 its death effector domain (DED) [11], which is activated at the DISC by oligomerization. The processing and activation of caspase-8 at the DISC stimulates an apoptotic cascade that provokes cell death. The apoptotic signal from the DISC may be inhibited by the cellular FLICE-inhibitory protein (FLIP) [12]. In most cells, two alternatively spliced isoforms of cFLIP exist: a caspase-8 homologue cFLIPL that lacks the amino acids critical for proteolytic caspase activity; and cFLIPS, which is comprised of the two death effector domains alone [12]. Although the role of cFLIP in apoptotic signaling remains controversial, there is strong evidence that it displays antiapoptotic activity [13-15]. The expression of cFLIP varies in a cell type-specific manner and it fluctuates in response to various stimuli. While it can be transcriptionally controlled by the nuclear factorκB (NF-κB) pathway [16], altered rates of proteasomal degradation also regulate its protein activity [17], making it a versatile inhibitor of the apoptotic responses mediated by death receptors. Cyclin-dependent kinases (CDKs) are serine/threonine kinases that play a crucial role in regulating both the cell cycle and transcription, through the phosphorylation of transcription factors and tumor suppressor proteins involved in DNA replication and cell division [18]. Therefore, CDKs are attractive therapeutic targets for cancer therapy. Roscovitine (CYC202, Seliciclib) is a purine analogue that competes with ATP for binding to the active site of CDKs and it displays a potent in vitro activity against CDK1, CDK2, CDK5, CDK7 and CDK9 [19]. The growth of a wide range of tumor cell types is inhibited by roscovitine in vitro and, likewise, it inhibits the growth of human tumor xenografts in nude mice [20, 21]. Roscovitine causes not only cell cycle arrest but also apoptosis in cancer cells [22] and, accordingly, it is currently being evaluated in phase II clinical trials [23]. While the mechanism by which CDK inhibitors induce apoptosis remains unclear, the CDK inhibitor flavopiridol, a semisynthetic flavone, reduces the levels of antiapoptotic proteins such as XIAP, Mcl-1 or cFLIP [24-26] and up-regulates the transcription factor E2F1, known to be involved in apoptosis [27]. Roscovitine may also downregulate Mcl-1 or XIAP [28] and it could sensitize glioma cells to TRAIL-induced apoptosis by reducing the levels of survivin and XIAP. However, the down-regulation of these factors may not be sufficient to trigger the activation of caspases [6]. Here we report that TRAIL-resistant human breast cancer cell lines can be sensitized to TRAIL-induced apoptosis by exposure to roscovitine. The molecular mechanisms underlying the effects of roscovitine involve an increase in the formation of the TRAIL DISC, the down-regulation of cFLIP and Mcl-1, and the up-regulation of the transcripwww.cell-research.com | Cell Research tion factor E2F1. Results Roscovitine sensitizes human breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis To analyze whether roscovitine sensitizes breast tumor cells to the apoptotic ligand TRAIL, the breast tumor cell line MDA-MB231 was treated with different concentrations of roscovitine to determine the sub-toxic dose capable of sensitizing them to TRAIL-induced apoptosis (Figure 1A). Subsequently, six more breast tumor cell lines were tested to determine whether similar doses also induced roscovitine sensitization to TRAIL-induced apoptosis (Figure 1B). In all the cell lines tested, roscovitine alone induced little cell death at the concentration indicated. However, if the cells were exposed to roscovitine for 7 h before adding TRAIL overnight, apoptotic cell death was significantly increased in all the cell lines tested, even in the highly resistant BT474 and SKBr3 cell lines that over-express the ErbB2/Her-2/neu oncogene. Proteolytic processing of the caspase substrate poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), a hallmark of apoptosis, was observed in the cells treated with roscovitine and TRAIL (Figure 2A). These results demonstrate that the combined treatment with roscovitine and TRAIL induces significant apoptotic cell death in these breast tumor cell lines. Roscovitine enhances TRAIL-induced activation of caspase-8 without affecting the cell surface expression of TRAIL receptors To elucidate the mechanism underlying the sensitization to TRAIL-induced apoptosis promoted by roscovitine in breast tumor cells, we examined different biochemical events that occur upon TRAIL binding to its receptors at the cell surface. TRAIL initiates apoptosis by inducing the recruitment of the adapter molecule FADD to the apoptotic TRAIL receptors and the subsequent engagement and activation of procaspase-8 [29, 30]. We determined whether caspase-8 was activated in MDA-MB231 cells by analyzing the processing of the pro-caspase to the 43/41 kDa intermediate proteolytic fragments, and through the generation of the mature p18 caspase-8 subunits upon TRAIL stimulation. Accordingly, TRAIL-induced activation of caspase-8 was clearly enhanced by pre-treatment with roscovitine (Figure 2A). Several treatments have been shown to up-regulate the expression of the TRAILR1 (DR4) or TRAILR2 (DR5) death receptors, resulting in enhanced TRAIL-induced apoptosis [31]. We therefore examined the effect of roscovitine on the surface expression of TRAIL death and decoy receptors by flow cytometry (Supplementary information, npg Roscovitine and TRAIL-induced apoptosis 666 A 100 –TRAIL 80 +TRAIL Apoptosis (%) ** 60 40 ** 20 0 0 5 10 Roscovitine (µM) B 20 40 Control Roscovitine TRAIL Apoptosis (%) Apoptosis (%) Roscovitine + TRAIL 60 BT 474 60 EVSA-T 60 40 40 40 20 20 20 0 0 0 60 MDA-MB-231 60 SKBr-3 60 40 40 40 20 20 20 0 0 0 MCF-7 MDA-MB-435-S Figure 1 Roscovitine sensitizes breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis. (A) MDA-MB231 cells were incubated with the indicated concentrations of roscovitine for 7 h prior to the addition of TRAIL. Apoptosis was measured 15 h after the addition of TRAIL (500 ng/ml) as the percentage of cells with sub-G1 DNA content, as described in Materials and Methods. Error bars represent S.D. from three independent experiments. ** P<0.0001. (B) Different breast tumor cell lines were incubated in the presence or absence of roscovitine (20 µM) and subsequently exposed to TRAIL (500 ng/ml) in the same culture media. Alternatively, the MDA-MB435-S and MCF-7 cells were treated with 25 and 50 ng/ml TRAIL, respectively. In all cell lines with the exception of MCF-7, apoptosis was measured as in (A). In MCF-7 cells apoptosis was determined by measuring PS externalization by flow cytometry as described in Materials and Methods. Figure S1). MDA-MB231 cells only express TRAIL-R2 and R4 on the cell surface and, furthermore, the expression of these TRAIL receptors at the cell membrane was not significantly altered by exposure to roscovitine (Supple- mentary information, Figure S1). Hence, roscovitine does not appear to sensitize MDA-MB231 cells to TRAIL-induced apoptosis by modulating the surface expression of TRAIL receptors. Cell Research | Vol 18 No 6 | June 2008 Gustavo Ortiz-Ferrón et al. npg 667 – – – + + – + + the formation of the TRAIL DISC. Using biotinylated TRAIL (TRAIL-b), we could monitor DISC formation by precipitating it from MDA-MB231 cell lysates with streptavidin-agarose beads. We found an increase in the recruitment of procaspase-8 and FADD into the DISC of roscovitine-treated cells (Figure 3). Furthermore, there was an increase in the cleavage of procaspase-8 to the p43/41 intermediate fragments and to the p18 subunit following exposure of the cells to roscovitine. The levels of cFLIPL and cFLIPS recruited to the TRAIL DISC were slightly lower in the cells treated with roscovitine (Figure 3, compare lanes 3-4, 5-6 and 7-8). In addition, in both the control and pretreated cells, cFLIPL was cleaved by caspase-8 to a 43 kDa fragment (FLIPC), which probably represents the product obtained by removal of the C-terminal p10 fragment. Thus, we observed an increase in the caspase-8/FLIP ratio in the DISC of roscovitine-treated cells, suggesting that this ratio may influence the sensitivity to TRAIL-induced apoptosis as indicated previously [32]. TRAIL Roscovitine PARP p85 Casp 8 p43/41 p18 α-Tubulin Figure 2 Roscovitine enhances the caspase-8 activation and PARP cleavage induced by TRAIL without affecting the expression of TRAIL receptor at the cell membrane. MDA-MB231 cells were incubated with roscovitine (20 µM) for 7 h prior to the addition of TRAIL (500 ng/ml) for 15 h. Caspase-8 activation and PARP-1 cleavage were assessed by immunoblotting. Roscovitine treatment induces the redistribution of TRAIL DISC components to lipid rafts and enhances the redistribution after TRAIL treatment As we indicated previously, the induction of apoptosis by TRAIL can be regulated at different levels. Indeed, it was recently shown that lipid rafts may also be involved in signaling through TRAIL and other death receptors [33, Recruitment of caspase-8 and FADD to the TRAIL DISC is augmented in MDA-MB231 cells exposed to roscovitine TRAIL binding to its receptors provokes the formation of the DISC, which contains FADD and caspase-8, the main proximal initiators of apoptosis. Therefore, roscovitine may render cells more susceptible to apoptosis by enhancing u/s – – 15 – + + – 30 + + + – 60 + + + – u/s + + – – 15 – + + – 30 + + + – Time (min) 60 + + + – + + TRAIL-b Roscovitine FADD Casp 8 p43/41 p18 FLIPL FLIPc FLIPLs Lysates DISC Figure 3 The recruitment of caspase 8 and FADD to the TRAIL DISC is enhanced after roscovitine treatment. MDA-MB231 cells incubated in the presence or absence of roscovitine (20 µM, 15 h) were treated with biotinylated-TRAIL (TRAIL-b, 1 µg/ml) for the times indicated. TRAIL receptor complexes were collected with streptavidin-conjugated agarose beads and analyzed by Western blotting for the TRAIL DISC components FADD, caspase-8, FLIPL and FLIPS. Unstimulated receptor controls (u/s) represent the addition of biotinylated-TRAIL to an equivalent volume of lysate isolated from unstimulated cells. Lysates are included as a positive control for the expression of these proteins in MDA-MB231 cells. The data shown are representative of three independent experiments. www.cell-research.com | Cell Research npg Roscovitine and TRAIL-induced apoptosis 668 34]. Accordingly, the redistribution of death receptors to lipid rafts facilitates the emission of signals that induce apoptosis. To determine whether lipid rafts are involved in the roscovitine sensitization to TRAIL apoptosis, MDA-MB231 cells were incubated with roscovitine for 15 h, treated with TRAIL for 5 min, and lipid rafts were then isolated by sucrose density gradient centrifugation as described in Materials and Methods (Figure 4A). Roscovitine treatment caused a redistribution of procaspase-8, FADD and TRAIL R2 to rafts (I fraction), and, although exposure to TRAIL alone also induced a redistribution of these proteins into rafts, pre-treatment with roscovitine enhanced this redistribution. However, the disruption of lipid rafts using methyl-β-cyclodextrin (MBCD) or Imipramine (Supplementary information, Figure S2), did not prevent the sensitization of tumor cells to TRAIL apoptosis promoted by roscovitine, suggesting that the localization to lipid rafts does not play a significant role in roscovitine sensitization. Treatment with roscovitine impairs cFLIPL and cFLIPS mRNA and protein expression Several studies have suggested that a decrease in cFLIP, a short-lived protein, sensitizes cells to death receptor-induced apoptosis. Although this is somewhat controversial [13, 35], the antiapoptotic activity of this protein is clearly supported by data obtained from cells stably over-expressing cFLIP, from mice deficient in cFLIP and from the selective knockdown of cFLIP [13, 14]. When protein synthesis was inhibited in breast tumor cells with cycloheximide (CHX) before exposure to TRAIL (Figure 5A), all tumor cell lines tested were sensitized to the effects of TRAIL. Hence, short-lived inhibitory proteins NT I S Roscovitine TRAIL I S I S Roscovitine TRAIL I S Fraction Casp 8 FADD DR5 Actin Figure 4 Roscovitine redistributes the TRAIL receptor-2 into lipid rafts. MDA-MB231 cells maintained in the presence or absence of roscovitine (20 µM) for 15 h were stimulated with TRAIL-b (500 ng/ml) for 5 min. The cells were then lysed in buffer containing 1% Triton; the detergent-soluble (S) and insoluble (I) fractions were isolated as described in Materials and Methods, and the expression of the indicated proteins was analyzed by western blotting. appear to play an important role in preventing TRAIL-induced apoptosis. Thus, we investigated whether roscovitine treatment affected the levels of cFLIPL and cFLIPS protein in MDA-MB231 cells. The protein levels of both cFLIPL and cFLIPS decreased in these cells following exposure to roscovitine (Figure 5B). The main decrease was found after 15 h of treatment and partial recovery of cFLIPL was observed after 24 h of treatment. To determine whether caspases were required for the roscovitine-mediated decrease in cFLIP expression, MDA-MB231 cells were treated with the pancaspase inhibitor benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(OMe) fluoromethyl ketone (z-VAD.FMK) for 1 h prior to the addition of roscovitine (20 µM). Inhibition of caspase activity did not prevent the decline of either cFLIPL or cFLIPs levels upon roscovitine treatment, indicating that a caspase-independent mechanism was involved in reducing cFLIP expression (Figure 5C). Post-translational regulation of cFLIP protein can occur through proteasome-mediated degradation [17, 24, 36]. Hence, we determined whether the reduction of cFLIP after roscovitine treatment was due to protein degradation through the proteasome machinery. In the presence of the proteasome inhibitors MG132 or epoxomicin, there was an increase in the accumulation of cFLIP protein (Figure 5D). Nevertheless, despite the inhibition of cFLIP degradation by the proteasome, roscovitine treatment still caused a decrease in the levels of cFLIP protein when compared with cells exposed to proteasome inhibitor alone, suggesting that roscovitine may down-regulate cFLIP at the mRNA level. Indeed, roscovitine diminishes the endogenous levels of cFLIPL and cFLIPS mRNA in MDA-MB231 cells (Figure 5E and 5F). Moreover, there was a correlation between the cFLIP protein and mRNA levels following roscovitine treatment (Figure 5B and 5E) which suggests that roscovitine mainly down-regulates cFLIP at the mRNA level. However, we cannot completely exclude that treatment with roscovitine is also affecting cFLIP protein degradation by the ubiquitin/proteasome pathway. Knockdown of endogenous cFLIPL and cFLIPS with siRNA oligonucleotides promotes apoptosis induced by TRAIL in breast tumor cells Our data clearly show that roscovitine decreases cFLIP expression and sensitizes breast tumor cells to TRAILinduced apoptosis. Thus, we tested whether the specific silencing of cFLIP expression by siRNA has a similar effect on TRAIL-induced apoptosis. In MDA-MB231 cells, the levels of both cFLIPL and cFLIPS were substantially reduced by a specific siRNA (Figure 6A), whereas a similar concentration of a scrambled control siRNA did not modify cFLIP protein expression. Transfection with cFLIP siRNA had no effect on the expression of procaspase-8, a strucCell Research | Vol 18 No 6 | June 2008 Apoptosis (%) A 100 80 60 40 20 0 Apoptosis (%) Gustavo Ortiz-Ferrón et al. npg 669 100 80 60 40 20 0 B 100 80 60 40 20 0 BT 474 100 80 60 40 20 0 MDA-MB-231 Roscovitine 0 8 15 100 80 60 40 20 0 EVSA-T 100 80 60 40 20 0 SKBr-3 CHX 24 0 8 15 24 C Time (h) FLIPL Control Cycloheximide TRAIL Cycloheximide + TRAIL MCF-7 MDA-MB-435-S – – – + + – + + – – ZVAD – + + – + + 53 50 35 44 68 54 100 100 55 19 32 2 Roscovitine FLIPL FLIPC FLIPS FLIPS FLIPL 100 FLIPL 100 TRAIL 40 12 α-Tubulin α-Tubulin D – – + – – + + + MG132 Roscovitine – – – + + – FLIPL FLIPS + Epoxomicin + Roscovitine FLIPL E 0 Roscovitine 8 15 24 8 CHX 15 24 Time (h) FLIPL FLIPS FLIPS α-Tubulin F mRNA expression (fraction of control) α-Tubulin 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Actin cFLIPL Control cFLIPs 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Roscovitine Control Roscovitine Figure 5 Exposure to roscovitine reduces cFLIP protein and mRNA levels. (A) Different breast tumor cell lines were incubated for 1 h in the presence or absence of cycloheximide (CHX, 5 µg/ml) and then treated with TRAIL at 500 ng/ml (BT-474, SKBr3, EVSA-T, MDA-MB231), 50 ng/ml (MCF-7) or 25 ng/ml (MDA-MB435S), for a further 15 h period. Apoptosis was assessed as in Figure 1B. (B) Cells were incubated with roscovitine (20 µM) or CHX (5 µg/ml) for the times indicated. Levels of cFLIP protein were determined by western blotting as described in Materials and Methods. Densitometric analysis of cFLIP levels is presented as percentages of control (time 0), using tubulin levels as an internal control for normalization. (C) Cells were treated with roscovitine (20 µM) for 15 h, and then exposed to TRAIL 500 ng/ml for 7 h in the presence or absence of Z-VAD (50 µM) added 1 h before TRAIL. The cells were then processed as in (A) to detect cFLIP protein levels. (D) MDA-MB231 cells were treated with roscovitine (20 µM) for 24 h in the presence or absence of the proteasome inhibitors MG132 (25 µM) or epoxomicin (100 nM). Proteasome inhibitor was added 30 min before roscovitine and the cFLIP protein levels were analyzed by western blotting as in (A). (E) Cells were treated as in (B); the total RNA was isolated and cFLIPL and cFLIPS mRNA transcripts were analyzed by RT-PCR as described in Materials and Methods. PCR amplification of β-actin was used as a control of the input RNA. (F) MDA-MB231 cells were treated with roscovitine (20 µM) for 15 h and cFLIPL and cFLIPS mRNA levels were determined by real time RT-PCR as described in Materials and Methods. Results are the average and range of two independent experiments in triplicate. www.cell-research.com | Cell Research npg Roscovitine and TRAIL-induced apoptosis 670 turally related proapoptotic protease (Figure 6A). Most importantly, silencing of cFLIP expression resulted in a clear sensitization to TRAIL-induced apoptosis (Figure 6B). These data correlated well with the effects of roscovitine and support the hypothesis that down-regulation of cFLIP expression by this CDK inhibitor is critical for the sensitization to TRAIL-induced apoptosis in breast tumor cells. To further substantiate the role of cFLIP in the sensitization observed, we generated MDA-MB231 cells over-expressing cFLIPL and determined the effect of roscovitine treatment on apoptosis by TRAIL. Results shown in Figure 6C demonstrate that cells over-expressing cFLIPL were clearly more resistant to roscovitine-induced A sensitization to TRAIL apoptosis than cells expressing normal cFLIP levels. Down-regulation of antiapoptotic Mcl-1 protein expression by roscovitine contributes to sensitization to TRAILinduced apoptosis Roscovitine alters the expression of different proteins involved in apoptosis [6, 28] and these modifications are associated with the induction of apoptosis by CDK inhibitors. On the other hand, it is known that the antiapoptotic Bcl-2 family member Mcl-1 protects cells from apoptosis and that it is up-regulated in different types of cancer [37, 38]. Furthermore, Mcl-1 down-regulation induces apoptosis B 50 Scrb FLIP siRNA FLIPL 40 Apoptosis (%) – ** no siRNA scrambled FLIP 30 20 10 FLIPS Casp8 0 Control TRAIL C MDA-MB231/mock 100 80 Apoptosis (%) α-Tubulin * MDA-MB231/FLIPL Mock FLIPL FLIPL GAPDH 60 40 20 0 Control R T R/T Figure 6 Knockdown of endogenous cFLIPL and cFLIPS enhances the apoptosis induced by TRAIL in MDA-MB231 cells. (A) MDA-MB231 cells were transfected with either a siRNA oligonucleotide targeting both cFLIP isoforms, or a scrambled RNA oligonucleotide, as described in Materials and Methods. After 24 h, the cells were harvested for immunoblot analysis to verify protein knockdown using Tubulin as a protein loading control. The results are representative of three independent experiments. (B) MDA-MB231 cells were transfected as in (A), and after 24 h TRAIL (500 ng/ml) was added to the cultures. Apoptosis was measured 24 h after the addition of TRAIL as described in Figure 1. Error bars represent S.D. from three independent experiments. ** P<0.0001. (C) Mock-transfected and MDA-MB231 cells transfected with the pCR3.V64-Met-Flag-FLIPL vector were treated with roscovitine (R) (20 µM) for 7 h prior to the addition of TRAIL (T) (500 ng/ml). Apoptosis was measured 15 h after the addition of TRAIL as the percentage of cells with sub-G1 DNA content, as described in Materials and Methods. The inset shows western blot analysis of FLIPL expression in mock and FLIPL transfected cells. GAPDH was used as an internal protein loading control. Error bars represent S.D. from three independent experiments.* P<0.005. Cell Research | Vol 18 No 6 | June 2008 Gustavo Ortiz-Ferrón et al. npg 671 [39] or sensitizes tumor cells to the apoptosis induced by different stimuli, including TRAIL [40-42]. Exposure to roscovitine markedly down-regulated Mcl-1 protein levels in MDA-MB231 cells (Figure 7A, top panel), suggesting that the decline in Mcl-1 may be a key event by which roscovitine sensitizes cells to TRAIL-induced apoptosis. In this respect, knockdown of Mcl-1 expression by siRNA (Figure 7A, bottom panels) significantly sensitized MDA-MB231 cells to TRAIL-induced apoptosis. E2F1 plays a significant role in roscovitine sensitization to TRAIL-induced apoptosis The transcription factor E2F1 is involved in the induction of apoptosis and its over-expression in various cell types sensitizes cells to apoptosis induced by ionizing radiation, chemotherapeutic drugs or death receptors [43, 44]. Here we show that roscovitine clearly up-regulates E2F1 protein levels (Figure 7B) in breast tumor cells. Interestingly, E2F1 has also been associated with the regulation of different apoptotic proteins including Mcl-1 and cFLIPS [44, 45]. By transfecting small specific interference RNAs, we disrupted E2F1 expression in MDA-MB231 cells to determine if the up-regulation of E2F1 induced by roscovitine affects Mcl-1 and/or cFLIP expression. The transfected cells were exposed to roscovitine (for 15 h) 24 h after siRNA transfection and the levels of the different apoptotic proteins were evaluated by immunoblotting. Knockdown of E2F1 did not alter the response of MDA-MB231 to roscovitine in terms of the expression of Mcl-1, cFLIP, XIAP, BID or Caspase-2 (Supplementary information, Figure S3), BAX and Apaf-1 (not shown) protein. However, although these protein levels remained unperturbed, there was a reversion of the roscovitine sensitization to TRAIL apoptosis when E2F1 was silenced (Figure 7C), demonstrating the importance of E2F1 in this sensitization process. Discussion Antitumor therapy based on the apoptosis-inducing properties of TRAIL and agonistic TRAIL receptor antibodies is currently under consideration [46]. However, despite the fact that TRAIL induces selective cell death in human tumor cells, sparing most untransformed cells, resistance to TRAIL is not uncommon in certain tumor cell lines. Furthermore, TRAIL might also promote cell migration and invasion in some apoptosis-resistant cells A + Roscovitine (15h) siRNA Scrb Mcl-1 Mcl-1 Mcl-1 α-Tubulin α-Tubulin Apoptosis (%) 25 – 20 15 – 8 + – 15 + – + 24 – + Time (h) Roscovitine 5 0 E2F1 α-Tubulin Scrambled 20 10 0 Mcl-1 siRNA * 30 Apoptosis (%) 4 * 10 C B Untreated TRAIL CTRL E2F1 Scrambled UT Roscovitine TRAIL Roscovitine TRAIL siRNA Figure 7 Down-regulation of Mcl-1 and up-regulation of E2F1 protein levels after roscovitine treatment in MDA-MB231 cells. MDA-MB231 cells were treated with roscovitine (20 µM) for the times indicated and then Mcl-1 (A) or E2F1 (B) protein levels were analyzed by immunoblotting. The results are representative of at least three independent experiments. In A (bottom panel, left) cells were transfected with either a siRNA oligonucleotide targeting Mcl-1, or a scrambled RNA oligonucleotide, as described in Materials and Methods. After 48 h, the cells were collected and Mcl-1 protein expression was analyzed by western blotting. In A (bottom panel, right) cells were siRNA transfected as in the left panel, and after 48 h TRAIL was added to the cultures. Apoptosis was measured 15 h after the addition of TRAIL as described in Figure 1. Error bars represent S.D. from three independent experiments. * P<0.005. (C) Cells were transfected and treated with roscovitine as in Supplementary information, Figure S3 following prior treatment with TRAIL for 2 h. Apoptosis was determined as the percentage of subG1 cells. Error bars represent S.D. from three independent experiments. * P<0.005. www.cell-research.com | Cell Research npg Roscovitine and TRAIL-induced apoptosis 672 [47]. Hence, sensitization of cells to TRAIL-induced apoptosis through different strategies would augment the therapeutic potential of TRAIL against its capacity to stimulate invasion, resolving the potential risk to patients with TRAIL-resistant cancers. Combination strategies have been implemented to facilitate TRAIL apoptotic signaling [48], and we have been investigating the resistance of human breast tumor cells to TRAIL and on how to overcome it. We previously indicated that the formation of the DISC is a common target for different sensitizing regimes [24, 49]. Indeed, CDK inhibitors have been reported to downregulate the expression of antiapoptotic proteins and to up-regulate the levels of pro-apoptotic regulatory proteins [24-27, 50]. The apoptosis-inducing potential of the CDK inhibitor roscovitine led us to investigate its effects on the resistance of breast tumor cells to TRAIL. We found that roscovitine sensitizes different breast tumor cell lines to TRAIL, including the highly resistant cell lines BT474 and SkBr3 that over-express the ErbB2 receptor. Indeed, roscovitine sensitizes breast tumor cell lines to TRAIL irrespective of their p53 status (see Table 1). While roscovitine did not alter surface expression of TRAIL receptors, the step(s) involved in the sensitization to TRAIL may reside downstream of ligand binding. A DISC is formed upon TRAIL binding to its proapoptotic receptors [11]. In breast tumor cells treated with roscovitine, an increase in the recruitment of procaspase-8 and FADD to the TRAIL DISC was observed, together with the complete activation of caspase-8. Whether or not roscovitine treatment induces post-translational modifications of FADD or TRAIL receptors that affect the binding affinities of the DISC components [51] remains to be ascertained. In this respect, it is noteworthy that treatments such as glucose deprivation, inhibition of CDKs and histone deacetylase (HDAC) inhibitors, all seem to enhance the formation of the TRAIL DISC in the absence of TRAIL receptor upregulation [24, 49, 52]. The localization of death receptors and other DISC components into lipid rafts may play a role in mediating sensitization to apoptotic stimuli [33, 53]. Indeed, roscovitine itself caused a redistribution of DISC proteins into lipid rafts fractions and facilitated that induced by TRAIL in breast tumor cells. However, the disruption Table 1 p53 status in breast tumor cell lines MDA-MB231 MCF-7 MDA-MB435-S SKBr-3 BT-474 p53 mutated normal mutated mutated mutated of either cholesterol or ceramide-enriched lipid rafts by specific inhibitors did not prevent roscovitine-induced sensitization to TRAIL in breast tumor cells. Hence, the redistribution of DISC components to membrane lipid rafts is not absolutely necessary to induce apoptosis by TRAIL in these cells. In this respect, the treatment of cells with MBCD failed to block CD95-mediated apoptosis in the Blymphoblastoid cell line SKW6.4 [35]. Furthermore, it has been demonstrated that acid sphingomyelinase-deficient hepatocytes and mice are protected from CD95-induced apoptosis or death. In contrast, acid sphingomyelinasedeficient and wild-type thymocytes, or Concanavalin- or lipopolysaccharide-pre-stimulated lymphocytes, were equally sensitive to CD95-induced apoptosis [54]. Together these results suggest that the requirement for death receptor localization in lipid rafts to activate apoptosis may be cell type dependent. Since a protein synthesis inhibitor could restore the sensitivity of various breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis, short-lived inhibitory proteins are likely to be important to prevent TRAIL-induced signaling and apoptosis. We analyzed the expression of several antiapoptotic proteins such as cFLIP, Mcl-1 and XIAP, known to have a short half-life [55-57]. In cells treated with a sensitizing dose of roscovitine cFLIPL, cFLIPS and Mcl-1 were markedly down-regulated. Moreover, the down-regulation of cFLIP protein was associated with a decrease in the mRNA levels for both cFLIPL and cFLIPS in cells treated with roscovitine. These results are in agreement with other data indicating that CDK inhibitors regulate transcription through the potent inhibition of positive transcription elongation factor b (P-TEFb), comprised of CDK9 and cyclin T1, thereby controlling the elongation phase of transcription by RNA polymerase II [58]. However, whereas flavopiridol has been shown to reduce global mRNA levels, at the doses used here roscovitine mostly affects a subset of cellular genes resulting in down-regulation of several short-lived proteins, including Mcl-1 [23, 59, 60]. In contrast, despite reports that roscovitine treatment down-regulates XIAP expression in glioma cells [6], we did not observe a decrease in XIAP protein levels in breast tumor cells treated with roscovitine. This is consistent with our previous results indicating that specific siRNA knockdown of XIAP did not sensitize breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis [24]. The importance of cFLIP down-regulation by roscovitine in the sensitization process was supported by the finding that siRNA silencing of cFLIP was sufficient to sensitize breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. Competition between FADD and cFLIPL for the DD of TRAIL receptor DR5 [61] could also modulate DISC formation. The decrease in cFLIPL levels upon roscovitine treatment observed in our work could favor binding of FADD and proCell Research | Vol 18 No 6 | June 2008 Gustavo Ortiz-Ferrón et al. npg 673 caspase-8 to the TRAIL DISC. The increased recruitment of FADD and caspase-8 to the TRAIL DISC observed in roscovitine-treated cells, together with a decrease in cFLIP levels, resulted in an elevation of the caspase-8/cFLIP ratio in the DISC of roscovitine-treated cells, which should facilitate caspase-8 activation and promote apoptosis [32]. In breast tumor cells, TRAIL has been reported to induce apoptosis through a mitochondrial pathway, involving the translocation of truncated Bid and Bax to the mitochondria followed by the release of cytochrome c from this organelle [62]. The anti-apoptotic Bcl-2 family member Mcl-1 has recently been reported to bind truncated Bid and to prevent death-receptor mediated apoptosis [40, 63]. Furthermore, Mcl-1 down-regulation by siRNA has also been demonstrated to restore the sensitivity of tumor cells to TRAIL-induced apoptosis [26]. Our results also demonstrate that silencing of Mcl-1 expression by siRNA partly sensitizes breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. Based on these evidence, it seems very likely that Mcl-1 down-regulation upon exposure to roscovitine could cooperate with cFLIP depletion to facilitate TRAILinduced release of apoptotic factors from the mitochondria in breast tumor cells. Our data show that treatment with a sensitizing dose of roscovitine caused a marked increase in E2F1 protein expression in breast tumor cells. The role played by E2F1 in the sensitization process was evaluated by siRNA silencing, indicating that the knockdown of E2F1 expression significantly reduced roscovitine-induced sensitization to TRAIL. A previous report has demonstrated that over-expression of E2F1 in human lung adenocarcinoma cell lines caused the down-regulation of cFLIPs expression and sensitized these cells to death receptor-induced apoptosis [44]. Furthermore, E2F1 directly represses Mcl-1 expression by binding to the Mcl-1 gene promoter. Together, these data suggest that the roscovitine-induced depletion of both cFLIP and Mcl-1 in breast tumor cells may be mediated by E2F1 up-regulation. However, we failed to observe reversal of cFLIP and Mcl1 down-regulation in cells that were depleted of E2F1 by siRNA silencing. Clustering of the death receptor CD95/Fas and formation of the DISC in the absence of ligand have been also reported in cells over-expressing E2F1 [44]. Whether the increased recruitment of procaspase-8 and FADD to the TRAIL DISC observed in roscovitine-treated breast tumor cells is mediated by up-regulation of E2F1 is an issue that requires further study. In conclusion, roscovitine can induce apoptosis in different tumor cell lines and causes regression of human xenograft tumors in mice [20]. Since it also seems less toxic for normal cells than other CDK inhibitors [28], it might be a good candidate to use in combined strategies against breast cancer. In fact, treatment with CDK inhibitors sensitizes www.cell-research.com | Cell Research tumor cells to apoptosis induced by different anti-tumor agents [64, 65]. In the present study, we show that roscovitine treatment sensitizes human breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis, independent of the p53 and ErbB-2 receptor status, through a pleiotropic mechanism that involves increased DISC formation, cFLIP and Mcl1 down-regulation, and E2F1 up-regulation. The present findings provide further support for the general strategy of combining TRAIL and CDK inhibitors in anti-cancer regimens against TRAIL-resistant tumor cells. Materials and Methods Reagents and antibodies Roscovitine, MBCD, Imipramine, streptavidin-agarose beads, and MG 132 were obtained from SIGMA Chemical Corp. (St Louis, MO). Soluble human His-tagged recombinant TRAIL and biotin-labeled recombinant TRAIL (bTRAIL) were generated in our laboratory as described [66]. Anti-human TRAIL-receptor R1, R2, R3 and R4 antibodies and anti-cFLIP monoclonal antibody (NF6) were from Alexis Corp. (San Diego, CA). Anti-caspase 8 was a gift from Dr Gerald Cohen (Leicester University, UK). Bax, XIAP FADD and RIP antibodies were from BD Bioscience (Erembodegem, Belgium). The PARP polyclonal antiserum was from Roche Molecular Biochemicals (Germany). The monoclonal antibody to alpha-tubulin was purchased from Sigma Chemical Corp. Antibodies against GAPDH, Mcl-1 (S19), E2F1 (KH95), DR5 (N19) and Caspase-2-L were from Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Horseradish peroxidase or FITC conjugated, goat anti-mouse and goat anti-rabbit secondary antibodies were obtained from DAKO (Cambridge, UK). zVAD-fmk was from Bachem AG (Bachem, Bubendorf, Switzerland). Cell culture The human tumor cell lines MDA-MB231 and EVSA-T were maintained in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM l-glutamine, and 40 µg/ml gentamycin. MDAMB468, SKBr-3, MDA-MB435-S and BT-474 were maintained in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM l-glutamine, and 40 µg/ml gentamycin. MDA-MB435-S was also supplemented with insulin (10 µg/ml). The cells were maintained at 37 °C in a humidified 5% CO2, 95% air incubator. A stable cell line over-expressing cFLIPL was generated upon transfection of MDA-MB231 cells with pCR3. V64-Met-Flag-FLIPL (a kind donation of Dr J Tschopp, University of Lausanne) by electroporation. Mock-transfected cells and cells over-expressing FLIPL were selected in culture medium with 1 mg/ ml G418 (Sigma Chemical Co.) and analyzed for the expression of cFLIPL by Western blot. Analysis of apoptosis Hypodiploid apoptotic cells were detected by flow cytometry according to published procedures [10]. Phosphatidylserine (PS) exposure on the surface of apoptotic cells was detected by flow cytometry after staining with Anexin-V-FLUOS (Roche Molecular Biochemicals). Immunoblot analysis of proteins The assay for measurements of cytochrome c and Bax was npg Roscovitine and TRAIL-induced apoptosis 674 performed as described previously [49]. Proteins were resolved on SDS-polyacrylamide minigels and visualized as described previously [10]. dependent experiments. The differences among different groups were determined by the Student’s t test. P < 0.05 was considered significant. Analysis of TRAIL receptors by flow cytometry References MDA-MB231 cells were detached with RPMI 1640/EDTA, washed in ice-cold PBS, and resuspended in PBS. Cells were then labeled with anti-TRAIL receptor antibodies (5 µg/ml) or no antibody (negative control), and then incubated with goat anti-mouse FITCconjugated antibody F(ab´)2 fragment. Labeled cells were analyzed by flow cytometry using the CellQuest software (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Isolation of the TRAIL DISC DISC precipitation was performed using biotin-tagged recombinant TRAIL (bio-TRAIL) [66]. MDA-MB231 cells were incubated for 15 h in the presence or absence of 20 µmol/l roscovitine and they were then exposed to bio-TRAIL for the times indicated in Figure 3. DISC formation was determined as reported previously [66]. Reverse transcriptase (RT) and PCR assays Total RNA was isolated from MDA-MB231 cells with the Trizol reagent (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) as recommended by the supplier. Total RNA (2 µg) was used as a template for cDNA synthesis using a RT-PCR kit (Perkin-Elmer). PCRs were carried out using specific primers for cFLIPL and cFLIPS as described previously [24]. Real-time RT-PCR MDA-MB231 cells were treated with roscovitine (20 µM) for 15 h. Total RNA was isolated from cells as described before. Total RNA (1 µg) was used as a template for cDNA synthesis using a RT-PCR kit (Perkin-Elmer) with the supplied random hexamers and under the conditions described by the manufacturer. mRNA expression was analyzed in triplicate by quantitative RT-PCR on the ABI Prism 7500 sequence detection system using predesigned Assay-on-demand primers and probes (Applied Biosystems). mRNA expression was determined by the comparative cycle threshold (Ct) method (∆∆Ct). Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase was used as an internal control and mRNA expression levels of cFLIPL and cFLIPS were given as fraction of mRNA levels in control cells. TRAIL stimulation and isolation of lipid rafts Sixty million cells were left untreated or stimulated for the indicated time points with 1 µg/ml TRAIL-biotinylated after pre-incubation with Roscovitine (20 µM, 15 h) where indicated. Treated samples were routinely collected to subsequently evaluate cell viability as described [67]. Lipid raft extraction was performed according to standard protocols [68]. Briefly, the cell pellet was dissolved in 750 µl of 1% Triton X-100/25 mM MES/150 mM NaCl buffer at 4 °C. After homogenization, the cell lysates were subjected to sucrose gradient centrifugation at 45 000 rpm for 16 h in an SW60 rotor (Beckman Instruments). Twelve 375-µl fractions were collected from the top to the bottom of each gradient. For cholesterol depletion studies, cells were treated with 10 mM MBCD for 30 min at 37 °C in serum-free medium before lipid raft isolation. Statistical analysis All data are presented as the mean ± SE of at least three in- 1 Ashkenazi A, Dixit VM. Death receptors: signaling and modulation. Science 1998; 281:1305-1308. 2 Sheridan JP, Marsters SA, Pitti RM, et al. Control of TRAILinduced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors. Science 1997; 277:818-821. 3 Ashkenazi A, Pai RC, Fong S, et al. Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand. 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Oncogene 2001; 20:7128-7133. 63 Certo M, Del Gaizo Moore V, et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell 2006; 9:351-365. 64 Dai Y, Grant S. Cyclin-dependent kinase inhibitors. Curr Opin Pharmacol 2003; 3:362-370. 65 Edamatsu H, Gau CL, Nemoto T, Guo L, Tamanoi F. Cdk inhibitors, roscovitine and olomoucine, synergize with farnesyltransferase inhibitor (FTI) to induce efficient apoptosis of human cancer cell lines. Oncogene 2000; 19:3059-3068. 66 Harper N, Farrow SN, Kaptein A, Cohen GM, MacFarlane M. Modulation of tumor necrosis factor apoptosis-inducing ligandinduced NF-κ B activation by inhibition of apical caspases. J Biol Chem 2001; 276:34743-34752. 67 De Maria R, Lenti L, Malisan F, et al. Requirement for GD3 ganglioside in CD95- and ceramide-induced apoptosis. Science 1997; 277:1652-1655. 68 Parolini I, Sargiacomo M, Lisanti MP, Peschle C. Signal transduction and glycophosphatidylinositol-linked proteins (lyn, lck, CD4, CD45, G proteins, and CD55) selectively localize in Tritoninsoluble plasma membrane domains of human leukemic cell lines and normal granulocytes. Blood 1996; 87:3783-3794. (Supplementary Information is linked to the online version of the paper on the Cell Research website) Cell Research | Vol 18 No 6 | June 2008 Research Article Flavopiridol Induces Cellular FLICE-Inhibitory Protein Degradation by the Proteasome and Promotes TRAIL–Induced Early Signaling and Apoptosis in Breast Tumor Cells Carmen Palacios, Rosario Yerbes, and Abelardo López-Rivas Centro Andaluz de Biologı́a del Desarrollo, Consejo Superior de Investigaciones Cientı́ficas-Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, Spain Abstract The cyclin-dependent kinase inhibitor flavopiridol is undergoing clinical trials as an antitumor drug. We show here that pretreatment of different human breast cancer cell lines with flavopiridol facilitates tumor necrosis factor–related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)–induced apoptosis. In breast tumor cells, apoptosis induction by TRAIL is blocked at the level of apical caspase-8 activation. Flavopiridol treatment enhances TRAIL-induced formation of death-inducing signaling complex and early processing of procaspase-8. Subsequently, a TRAIL-induced, mitochondria-operated pathway of apoptosis is activated in cells treated with flavopiridol. Down-regulation of cellular FLICE-inhibitory proteins (c-FLIP; c-FLIPL and c-FLIPS) is observed on flavopiridol treatment. c-FLIP loss and apoptosis sensitization by flavopiridol are both prevented in cells treated with an inhibitor of the ubiquitinproteasome system. Furthermore, targeting c-FLIP directly with small interfering RNA oligonucleotides also sensitizes various human breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis. Our results indicate that flavopiridol sensitizes breast cancer cells to TRAIL-induced apoptosis by facilitating early events in the apoptotic pathway, and this combination treatment could be regarded as a potential therapeutic tool against breast tumors. (Cancer Res 2006; 66(17): 8858-69) Introduction Flavopiridol is a semisynthetic flavone with potent inhibitory effects on cell proliferation in cultured tumor cell lines (1). This effect has also been observed in vivo, xenografting different human tumor cell lines in nude mice (2). The antitumor activity of flavopiridol has been related not only to cell cycle arrest but also to induction of apoptosis (3–6) and antiangiogenic activity (7). In clinical trials of flavopiridol as a single agent and in drug combinations, evidence of antitumor activity has been observed at plasma concentrations that inhibit cyclin-dependent kinase (CDK)–related functions (8). Tumor necrosis factor (TNF)–related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a ligand of the TNF family capable of inducing apoptosis in a wide variety of cancer cells on binding to the proapoptotic receptors TRAIL-R1 and TRAIL-R2 but with no effect in the majority of normal human cells tested. However, despite the ubiquitous expression of TRAIL receptors, some cancer cells show Requests for reprints: Abelardo López-Rivas, Centro Andaluz de Biologı́a del Desarrollo, Consejo Superior de Investigaciones Cientı́ficas-Universidad Pablo de Olavide, Carretera de Utrera km. 1, 41013 Sevilla, Spain. Phone: 34-954-348396; E-mail: [email protected]. I2006 American Association for Cancer Research. doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-0808 Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 either partial or complete resistance to TRAIL (9). Resistance of tumor cells to TRAIL can be overcome by treatment with protein synthesis inhibitors, which suggests the presence of apoptosis inhibitors in those cell lines (10). Activation of TRAIL receptors leads to the formation of the death-inducing signaling complex (DISC), which includes the receptor itself, the adapter molecule Fas-associated death domain (FADD), and procaspase-8 (11). Processing and activation of caspase-8 at the DISC leads to a cascade of apoptotic events that results in the death of the cell. Inhibition of this cascade may occur at different stages in tumor cells (12). At the DISC level, the apoptotic signal may be inhibited by cellular FLICE-inhibitory proteins (c-FLIP), the homologue of viral FLIP in vertebrate cells (13). In most cells, c-FLIP exists as two alternative spliced isoforms: c-FLIPL, a homologue of caspase-8, which lacks critical amino acids for proteolytic caspase activity, and c-FLIPS, consisting only of two death effector domains (13). A third 23-kDa recently identified form called c-FLIPR , with properties similar to those of c-FLIPS, is also expressed in some cells (14). Although the role of c-FLIP in apoptotic signaling has been controversial, data obtained from cells stably overexpressing c-FLIP and from mice deficient in c-FLIP clearly support an antiapoptotic function ( for review, see ref. 15). c-FLIP expression fluctuates in a cell type–specific manner and in response to various stimuli: transcriptionally through the nuclear factor-nB (NF-nB) pathway (16) and at the protein level via altered rates of proteasomal degradation (17), which makes it a versatile inhibitor of apoptotic responses mediated by death receptors. To induce apoptosis in tumor cells through activation of death receptors represents a new therapeutic strategy against different types of cancer. However, whereas agonistic antibodies that activate death receptor CD95/Fas are very toxic for liver cells (18), TRAIL and agonistic antibodies that trigger TRAIL receptors may be considered as more suitable tools (19). TRAIL does not show toxic effects in preclinical studies with mice and nonhuman primates when given at doses that inhibit the growth of tumor xenografts (20). Although it has been reported that a particular form of human recombinant TRAIL may be toxic for human hepatocytes (21), more recent data have shown that different recombinant versions of TRAIL vary considerably in toxicity toward normal human cells while maintaining their antitumor properties (22). Recent reports have described that the combination of flavopiridol and TRAIL induces apoptosis in various cancer cells, although the molecular mechanism of this synergistic action remains unclear. Flavopiridol has been reported to sensitize human non–small cell lung carcinoma (NSCLC) and colon cancer cells to TRAIL-induced apoptosis by inhibiting NF-nB (23). A reduction in the cellular levels of XIAP has been suggested to be responsible for the antileukemic effects of flavopiridol and TRAIL (24). On the 8858 www.aacrjournals.org Flavopiridol Promotes Caspase-8 Activation by TRAIL other hand, it was reported that flavopiridol down-regulates Mcl-1 expression in human cholangiocarcinoma cells (25). Despite the fact that many cancer cells are sensitive to TRAIL-induced apoptosis, a number of them, in particular breast cancer cells, are resistant to this death ligand (26). In these cells, resistance to TRAIL seems to reside in the initial activation of caspase-8 (27). Taken together, these results prompted us to investigate whether flavopiridol could abrogate the resistance to TRAIL-induced apoptosis observed in breast tumor cells and, if so, elucidate the mechanisms of this sensitization. In this study, we show that flavopiridol sensitizes all human breast cancer cell lines examined to a mitochondria-operated, TRAIL-induced apoptotic process. In the highly resistant to TRAIL, ErbB2-overexpressing cell line SKBR-3, flavopiridol facilitates DISC formation and caspase-8 activation at the DISC on TRAIL receptor ligation, without altering the levels of TRAIL receptors, FADD or caspase-8. In these cells, flavopiridol markedly down-regulates the levels of c-FLIPL and c-FLIPS proteins by a mechanism involving the proteasome. Moreover, we show that knocking down c-FLIP proteins with specific small interfering RNA (siRNA) oligonucleotides is sufficient to sensitize various breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis. Materials and Methods Reagents and antibodies. Flavopiridol was kindly provided by Dr. José Ramón Suarez (Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ). MG-132, streptavidin-agarose beads, and mouse anti-a-tubulin antibody were obtained from Sigma Chemical Corp. (St. Louis, MO). Recombinant human TRAIL (residues 95-281) was produced as described previously (28). Caspases inhibitor benzyloxy-carbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethyl ketone (Z-VAD-FMK) was from Enzyme System, Inc. (Dublin, CA). Antihuman caspase-8 monoclonal antibody was purchased from Cell Diagnostica (Münster, Germany). Anti-FADD monoclonal antibody was from BD Transduction Laboratories (Heidelberg, Germany). Anti-poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) monoclonal antibody was from Roche Molecular Biochemicals (Monza, Italy). Anti-c-FLIP monoclonal antibody (NF6) and anti-TRAIL-R1, anti-TRAIL-R2, anti-TRAIL-R3, and anti-TRAIL-R4 antibodies were from Alexis Corp. (Lausen, Switzerland). Anti-cytochrome c, Bax, and XIAP monoclonal antibodies were from Biosciences PharMingen (San Jose, CA). Anti-cyclooxygenase IV (COX IV) rabbit polyclonal antibody was from Abcam (Cambridge, United Kingdom). Horseradish peroxidase– or FITC-conjugated secondary antibodies, goat anti-mouse and goat antirabbit, were obtained from DAKO (Cambridge, United Kingdom). Rabbit anti-Bid polyclonal antibody was generously provided by Dr. X. Wang (Howard Hughes Medical Institute, Dallas, TX). Cell lines. Stable MCF-7 cell line overexpressing human Bcl-2 protein has been described previously (27). The cell lines were either maintained in RPMI 1640 (MCF-7, MDA-MB-231, EVSA-T, and Jurkat) or in DMEM (MDAMB-468, SKBR-3, and BT474) containing 10% fetal bovine serum, 1 mmol L-glutamine, and gentamicin in a 5% CO2 humidified atmosphere. Culture medium of MDA-MB-435S cells was also supplemented with insulin (10 Ag/mL). Determination of cell viability and apoptosis. Cell viability was determined by the crystal violet method as described (27). Hypodiploid apoptotic cells were assessed by flow cytometry according to published procedures (29). Immunoblot analysis of proteins. The assay for measurements of cytochrome c and Bax was done as described (29). Proteins were resolved on SDS-polyacrylamide minigels and detected as described previously (27). Isolation of the TRAIL DISC. DISC precipitation was done using biotintagged recombinant TRAIL (bio-TRAIL; ref. 30). SKBR-3 cells were incubated for 16 hours in the presence or absence of 100 nmol/L flavopiridol. After this incubation, cells were treated with bio-TRAIL for www.aacrjournals.org the times indicated in the figure legends. DISC formation was determined as reported (29). Analysis of TRAIL receptors by flow cytometry. SKBR-3 cells were detached with RPMI 1640/3 mmol/L EDTA, washed in ice-cold PBS, and resuspended in PBS. Cells were then labeled with anti-TRAIL receptor antibodies (5 Ag/mL) or no antibody (negative control) and then incubated with goat anti-mouse FITC-conjugated antibody F(ab¶)2 fragment. Labeled cells were analyzed by flow cytometry using the CellQuest software. siRNA. siRNAs against c-FLIP (5¶-GGGACCUUCUGGAUAUUUUtt-3¶ and 5¶-AAAAUAUCCAGAAGGUCCCtg-3¶) and XIAP (5¶-GCUGUAGAUAGAUGGCAAUtt-3¶ and 5¶-AUUGCCAUCUAUCUACAGCtg-3¶) were synthesized by Ambion, Inc. (Austin, TX). Nontargeting scrambled siRNAs were synthesized by Proligo LLC (Boulder, CO). Cells were transfected with either c-FLIP, XIAP, or scrambled siRNAs (50 nmol/L for SKBR-3 cells or 10 nmol/L for MDA-MB-231, BT474, and MDA-MB-435S cells) using DharmaFECT 1 (Dharmacon, Lafayette, CO) as described by the manufacturer. After 48 (SKBR-3) or 24 (MDA-MB-231, BT474, and MDA-MB-435S) hours of transfection, medium was replaced with regular medium before further analysis. Cell transfections and luciferase assays. Cells were cotransfected with 0.7 Ag of a NF-nB luciferase reporter plasmid (pKBF-Luc; Dr. J.M. Redondo, Centro de Biologia Molecular, Madrid, Spain) and 0.25 Ag hgalactosidase expression plasmid using Fugene reagent (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). After transfection, cells were harvested, and luciferase activity was measured in an FB12 luminometer (Berthold Detection Systems, Pforzheim, Germany) according to the instructions of the Luciferase system kit (Promega, Madison, WI). Transfection experiments were done in duplicate. NF-nB activity was always normalized by measuring h-galactosidase activity and expressed as relative luciferase units. Reverse transcription-PCR. Total RNA was isolated from cells with Trizol reagent (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) as recommended by the supplier. cDNA was synthesized from 2 Ag total RNA using a RNA PCR kit (Perkin-Elmer, Indianapolis, IN) with the supplied random hexamers under conditions described by the manufacturer. PCRs were done using specific primers for c-FLIPL and c-FLIPS as described previously (31). Statistical analysis. All data are presented as mean F SE of at least three independent experiments. The differences among different groups were determined by the Student’s t test. P < 0.05 was considered significant. Results Flavopiridol sensitizes human breast tumor cells to TRAILinduced apoptosis. To investigate the mechanism of flavopiridolinduced sensitization to TRAIL, we initially used the human breast carcinoma cell line SKBR-3 that express elevated levels of ErbB2 and is markedly resistant to TRAIL-induced apoptosis (32). Cells were first incubated with different flavopiridol doses and subsequently treated with TRAIL, and apoptosis was determined as percentage of sub-G1 population. Results shown in Fig. 1A show that these cells are very resistant to TRAIL-induced apoptosis and a marked sensitization to apoptosis by TRAIL can be observed in the range between 50 and 500 nmol/L flavopiridol. In subsequent experiments, we normally used 100 to 200 nmol/L flavopiridol because these concentrations produced almost maximal sensitization and were not toxic for the cells. We next examined the effect of different TRAIL concentrations in SKBR-3 cells preincubated with 200 nmol/L flavopiridol. As can be seen in Fig. 1B, flavopiridol promoted TRAIL-induced apoptotic cell death at the lowest concentration of TRAIL used (50 ng/mL) and a maximal effect was observed at doses between 250 and 500 ng/mL TRAIL. The later TRAIL concentration was subsequently used in the experiments done in SKBR-3 cells. 8859 Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 Cancer Research Figure 1. Flavopiridol sensitizes human breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis. A, SKBR-3 cells were incubated with the indicated flavopiridol concentrations for 7 hours before the addition of soluble recombinant TRAIL. Apoptosis was measured 17 hours after the addition of TRAIL as percentage of cells with sub-G1 DNA content as described in Materials and Methods. B, SKBR-3 cells were treated with flavopiridol for 7 hours before the addition of soluble TRAIL at the indicated concentrations. Apoptosis was measured 17 hours after the addition of TRAIL as in (A). C, cells were incubated with the indicated flavopiridol concentrations for 7 hours before the addition of soluble TRAIL at the concentrations shown in the different panels. Apoptosis was assessed 17 hours after the addition of TRAIL. Columns, average of three different experiments; bars, SE. *, P < 0.005; **, P < 0.0001. Sensitization to TRAIL-induced apoptosis by flavopiridol was a general phenomenon of breast tumor cells. In a panel of breast tumor cell lines (BT474, MDA-MB-231, MCF-7, MDA-MB-468, and EVSA-T) differing in variables, such as expression of ErbB2, presence of estrogen receptors, p53 status, or sensitivity to TRAIL, flavopiridol markedly sensitized all of them to TRAIL-induced apoptosis (Fig. 1C; data not shown). Down-regulation of XIAP or abrogation of NF-KB activity by flavopiridol is not sufficient to promote TRAIL-induced apoptosis in breast tumor cells. Down-regulation of XIAP by flavopiridol has been reported to be responsible for the antileukemic effects of flavopiridol and TRAIL (24). We have examined the role of XIAP in the resistance of breast tumor cells to TRAILinduced cell death and the sensitization to TRAIL observed on flavopiridol treatment. Flavopiridol caused a marked decrease in XIAP protein levels in SKBR-3 cells in a dose-dependent manner (Fig. 2A), with maximal effects being observed at doses that induced a clear sensitization to TRAIL (Fig. 1A). We next determined whether specific down-regulation of XIAP by siRNA methodology could be sufficient to abrogate resistance to TRAIL in SKBR-3 cells. Results shown in Fig. 2B show that a siRNA targeted against XIAP efficiently down-regulated XIAP protein to levels Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 similar to those achieved on flavopiridol treatment (Fig. 2A). However, in contrast to the sensitization observed with flavopiridol, down-regulation of XIAP with siRNA failed to promote sensitization to TRAIL-induced apoptosis (Fig. 2C). Flavopiridol inhibits NF-nB activity in tumor cells and sensitizes NSCLC and colon cancer cells to TRAIL-induced apoptosis (23). We have studied the role of NF-nB in the regulation of TRAIL-induced apoptosis by flavopiridol in breast tumor cells. In SKBR-3 cells, flavopiridol caused an important inhibition of NF-nB activity as measured with a NF-nB promoter-driven luciferase reporter plasmid (Fig. 2D). In these experiments, the specific inhibitor of NF-nB activation Bay 11-7085 decreased NF-nB promoter activity to a similar extent as observed for flavopiridol. Although it has been reported that TRAIL can stimulate the NF-nB pathway in various human tumor cell lines (33), in SKBR-3 cells, TRAIL failed to induce NF-nB promoter activity (Fig. 2D). Similar results were obtained in other breast tumor cell lines (data not shown). Furthermore, in the presence of TRAIL, both flavopiridol and Bay 11-7085 reduced NF-nB activity to a similar extent (Fig. 2D). However, in contrast to the sensitization observed with flavopiridol, Bay 11-7085 was not able to promote TRAIL-induced apoptosis in SKBR-3 breast tumor cells (Fig. 2E), which suggests that inhibition 8860 www.aacrjournals.org Flavopiridol Promotes Caspase-8 Activation by TRAIL of NF-nB by flavopiridol is not sufficient to cause sensitization to TRAIL-induced apoptosis. Treatment with flavopiridol enhances TRAIL-induced activation of caspase-8 and the mitochondrial apoptotic pathway. To further establish the mechanism of flavopiridol-promoted, TRAIL-induced cell death, we examined the caspase dependency of this cell death process. We found that the generation of sub-G1 cells induced by the combination of flavopiridol and TRAIL was dependent on caspase activation as it was completely prevented by the general caspase inhibitor Z-VAD-FMK (Fig. 3A). During TRAIL-induced apoptosis, procaspase-8 is recruited and processed at the DISC in a FADD- and TRAIL receptor–dependent manner (34). Procaspase-8 is first cleaved to the p43/p41 intermediate fragments releasing the small subunit p12 and then subsequently processed to generate the large catalytically active p18 subunit (11). To test if caspase-8 activation by TRAIL was blocked in the TRAIL-resistant cell line SKBR-3, processing of procaspase-8 was determined by Western blotting in cells treated with TRAIL following incubation in the absence or presence of flavopiridol. As shown in Fig. 3B, TRAIL-induced processing of procaspase-8 to its 43- to 41-kDa intermediate fragments was observed only in the cells previously treated with flavopiridol. Activation of caspase-8 leads to the processing of its substrate Bid generating a 15-kDa fragment, which translocates to mitochondria (35). Moreover, on death receptor activation, the cytoplasmic protein Bax migrates to the mitochondria where it Figure 2. Down-regulation of endogenous XIAP and abrogation of NF-nB activity by flavopiridol are not sufficient to promote apoptosis induced by TRAIL. A, SKBR-3 cells were not treated or treated with the indicated concentrations of flavopiridol for 24 hours. XIAP levels were analyzed by Western blotting. Tubulin was used as a protein loading control. Results are representative of two independent experiments. B, SKBR-3 cells were transfected either with siRNA oligonucleotide targeting XIAP or with a scrambled RNA oligonucleotide as described in Materials and Methods. After 72 hours, cells were harvested for immunoblot analysis to verify protein knockdown. Tubulin was used as a protein loading control. Results are representative of three independent experiments. C, SKBR-3 cells were transfected as in (B ), and after 72 hours, TRAIL was added to the cultures. Apoptosis was measured 24 hours after the addition of TRAIL as described in Fig. 1. Columns, average of two different experiments; bars, range. D, SKBR-3 cells were transfected with a NF-nB reporter plasmid, and 6 hours later, some of the transfected cultures were treated with flavopiridol for 17 hours. Next day, another set of transfected cells were treated with Bay 11-7085 (Bay ) 1 hour before the addition of TRAIL. Luciferase activity was determined 6 hours after the addition of TRAIL and normalized to the h-galactosidase activity. Columns, average of three different experiments; bars, SE. *, P < 0.005. E, SKBR-3 cells were incubated either with flavopiridol for 7 hours or with Bay 11-7085 for 1 hour before the addition of soluble recombinant TRAIL. Apoptosis was measured 17 (flavopiridol pretreatment) or 24 (Bay 11-7085 pretreatment) hours after the addition of TRAIL as described in Fig. 1. Columns, average of three different experiments; bars, SE. **, P < 0.001. www.aacrjournals.org 8861 Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 Cancer Research Figure 3. Apoptosis induced by the combination of flavopiridol and TRAIL requires caspase activation and involves activation of caspase-8 and the mitochondrial pathway of apoptosis. A, SKBR-3 cells were pretreated with flavopiridol (200 nmol/L) for 7 hours before the addition of soluble TRAIL (250 ng/mL) for 17 hours; Z-VAD-FMK (50 Amol/L) was added 2 hours before TRAIL. Apoptosis was measured as percentage of sub-G1 cells. Columns, average of three different experiments; bars, SE.**, P < 0.001. B, SKBR-3 cells were treated with 100 nmol/L flavopiridol for 16 hours before 8 hours of incubation with 500 ng/mL TRAIL. Activation of caspase-8 was assessed by Western blotting as described in Materials and Methods. Results are representative of three independent experiments. C, SKBR-3 cells were treated as in (B ). Loss of Bid was assessed by Western blotting. Results are representative of two independent experiments. D, SKBR-3 cells were treated as in (B ). Translocation of cytosolic Bax and release of cytochrome c from mitochondria were assessed by Western blotting. Results are representative of two independent experiments. COX IV was used as a mitochondrial loading control. E, SKBR-3 cells were treated as in (B). PARP degradation was assessed by Western blotting. Results are representative of three independent experiments. In all the previous experiments, tubulin was used as a protein loading control. F, MCF-7pc and MCF-7Bcl-2 were pretreated or not with 100 nmol/L flavopiridol during 6 hours before the addition of 50 ng/mL TRAIL. After 18 hours, cellular viability was measured by crystal violet staining. Columns, average of three different experiments; bars, SE. **, P < 0.001. cooperates with truncated Bid in the release of cytochrome c (36). Thus, we examined the activation of the mitochondria-controlled apoptotic pathway by TRAIL in flavopiridol-treated SKBR-3 cells by determining the loss of intact Bid, Bax translocation from citosol to mitochondria, and the release of cytochrome c from mitochondria. Results shown in Fig. 3C indicate that the amount of intact Bid was clearly diminished in the cells treated with flavopiridol and TRAIL in comparison with the cultures treated only with TRAIL. We next analyzed the loss of Bax and the presence of cytochrome c in cytosolic extracts from SKBR-3 cells on TRAIL receptor ligation. We observed that pretreatment with flavopiridol highly enhanced both events (Fig. 3D). These effects were associated with the increase of Bax and the loss of Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 cytochrome c levels in the mitochondria-containing membrane fraction of lysed SKBR-3 cells. To confirm that the apoptosis cascade was fully active in SKBR-3 cells treated with both flavopiridol and TRAIL and that caspase activation was involved in the process, we analyzed the proteolytic degradation of the nuclear protein PARP, a substrate of effector caspases. As shown in Fig. 3E, PARP cleavage was only clearly induced in cells pretreated with flavopiridol and subsequently treated with TRAIL. To get further insight into the importance of mitochondriamediated events in flavopiridol-induced sensitization to TRAIL in breast cancer and because it is difficult to obtain stable transfectants of SKBR-3 cells overexpressing Bcl-2 protein, we 8862 www.aacrjournals.org Flavopiridol Promotes Caspase-8 Activation by TRAIL studied whether TRAIL-induced apoptosis was facilitated by flavopiridol in a clone of MCF-7Bcl-2 cells, which we have described previously as resistant to TRAIL (37). As shown in Fig. 3F, flavopiridol failed to promote TRAIL-induced loss of cell viability in MCF-7Bcl-2 cells, in contrast to what was observed in cultures of cells transfected with an empty vector (MCF-7pc). In these experiments, Bcl-2 overexpression did not affect caspase-8 activation by the combination of TRAIL and flavopiridol (data not shown). Treatment with flavopiridol does not affect the expression levels of TRAIL receptors but increases DISC formation on TRAIL treatment in SKBR-3 cells. To investigate the possibility that flavopiridol treatment might change TRAIL receptor levels at the cell surface, SKBR-3 cells were cultured in the presence or absence of 100 nmol/L flavopiridol for 16 hours, and the expression of both proapoptotic and antiapoptotic receptors was analyzed by flow cytometry. Results in Fig. 4A show that SKBR-3 cells express the proapoptotic receptors TRAIL-R1 and TRAIL-R2 and the antiapoptotic receptor TRAIL-R4. Expression of the antiapoptotic receptor TRAIL-R3 was not detected in these cells. Results shown in this figure show that flavopiridol treatment did not change the expression of either proapoptotic or antiapoptotic TRAIL receptors in SKBR-3 cells. As the resistance to TRAIL occurred at a step before caspase8 activation in SKBR-3 cells, it was possible that these cells were not able to form a functional DISC. In SKBR-3 cells incubated in the absence of flavopiridol, TRAIL induced the formation of a DISC with maximal recruitment of procaspase-8 and FADD in 30 minutes (Fig. 4B). Within the DISC, procaspase-8 was processed to its p43 and p41 forms at the different times tested, with maximal procaspase-8 processing at 30 minutes after TRAIL addition. Interestingly, pretreatment with flavopiridol clearly promoted an increase in TRAIL DISC formation and procaspase-8 processing when compared with cells cultured in the absence of flavopiridol as indicated by the higher amounts of procaspase-8 and FADD in the DISC. Most importantly, in flavopiridol-treated cells but not in untreated cells, activation of procaspase-8 processing at the DISC following TRAIL addition proceeded to completion as determined by the appearance of the p18 subunit of mature caspase-8 at 30 and 90 minutes on TRAIL stimulation. Flavopiridol induces down-regulation of c-FLIP proteins in breast tumor cells. Because flavopiridol did not alter the levels of TRAIL receptors (Fig. 4A) but promoted TRAIL DISC formation and caspase-8 activation in SKBR-3 cells (Fig. 4B), we hypothesized that the mechanism of action of this CDK inhibitor could involve either the up-regulation of other proapoptotic DISC components or the down-regulation of intracellular inhibitory proteins. In this respect, we observed that FADD and procaspase-8 levels were not altered by flavopiridol treatment (Fig. 4C). One of the antiapoptotic proteins acting at the level of death receptors is c-FLIP, a shortlived protein with homology to caspase-8 that lacks caspase activity and inhibits death receptor–mediated activation of caspase-8 (13). Two alternatively spliced forms of c-FLIP, c-FLIPL and c-FLIPS, exist in different cell types (13). To investigate whether these short-lived proteins could be involved in the sensitization process induced by flavopiridol in SKBR-3 cells, we examined the effect of flavopiridol in c-FLIP protein levels in SKBR-3 cells. Cells were treated with 100 nmol/L flavopiridol for different periods and the levels of c-FLIP isoforms in cell lysates were analyzed by Western blotting. As shown in Fig. 4C, treatment with flavopiridol caused a marked decrease in the levels of both c-FLIP isoforms at 8 hours, and down-regulation of the short form of c-FLIP was www.aacrjournals.org complete after 16 hours of treatment. Down-regulation of c-FLIP isoforms by flavopiridol was dose dependent (Fig. 4D) and correlated well with the flavopiridol concentrations that promoted TRAIL-induced apoptosis in SKBR-3 cells (Fig. 1A). Moreover, down-regulation of c-FLIP isoforms by flavopiridol was observed in all the human breast cancer cell lines tested (Fig. 4E). Studies with metabolic inhibitors acting on either transcription or translation have indicated that these drugs sensitize resistant cells to death receptor–mediated apoptosis by down-regulating c-FLIP protein expression (38). We have examined in SKBR-3 cells whether the protein synthesis inhibitor cycloheximide could render these cells sensitive to TRAIL. Data not shown indicate that treatment of SKBR-3 cells with TRAIL in the presence of cycloheximide resulted in a marked induction of apoptosis. Both c-FLIP isoforms were lost on incubation of the cells with cycloheximide (data not shown). A proteasome inhibitor blocks down-regulation of c-FLIP by flavopiridol and apoptosis induced by the combination of flavopiridol and TRAIL in SKBR-3 cells. It has been shown that flavopiridol down-regulates gene expression broadly (39), possibly through its inhibitory action on the positive transcription elongation factor b (P-TEFb; cyclin T1/CDK9) complex (40). On the other hand, it has been described previously that c-FLIP levels can be modulated through a ubiquitin-proteasome pathway (17). We first examined by reverse transcription-PCR (RT-PCR) whether SKBR-3 cells express mRNA for both c-FLIPL and c-FLIPS isoforms using the human leukemic T-cell line Jurkat as a positive control and specific oligonucleotide primers for c-FLIPL and c-FLIPS as described in Materials and Methods. Results are shown in Fig. 5A, where it can be seen that breast tumor SKBR-3 cells only have mRNA for c-FLIPL, whereas Jurkat cells express both mRNAs. In agreement with these data, we have observed that the short c-FLIP isoform present in SKBR-3 cells is slightly smaller than c-FLIPS (Fig. 5A). In this respect, a third splice isoform of c-FLIP named c-FLIPR has been described recently in certain cell types (14). Whether the short c-FLIP isoform present in SKBR-3 cells corresponds to c-FLIPR is an issue that requires further investigation. To test whether modulation of c-FLIP expression by flavopiridol in SKBR-3 cells occurred at the mRNA level, we did RT-PCR analysis of c-FLIPL mRNA in cells treated for different times with 100 nmol/L flavopiridol. Results shown in Fig. 5B indicate that, in contrast to the observed down-regulation by flavopiridol of c-FLIPL protein levels, treatment with flavopiridol did not change the levels of c-FLIPL mRNA at any of the time points examined. Higher doses of flavopiridol (1 Amol/L) strongly reduced c-FLIPL mRNA expression (data not shown) as reported previously (39). To assess the role of the proteasome in the down-regulation of c-FLIP protein levels on flavopiridol treatment, SKBR-3 cells were treated with the proteasome inhibitor MG-132 before the addition of 100 nmol/L flavopiridol. After different periods, the levels of c-FLIP in cell lysates were analyzed by Western blotting. As shown in Fig. 5C, treatment with MG-132 blocked flavopiridol-induced down-regulation of both c-FLIP isoforms at all the times tested. In contrast, a general caspase inhibitor (Z-VAD-FMK) did not prevent flavopiridol-induced loss of c-FLIP expression (Fig. 5D). Then, we determined whether the proteasome inhibitor could abrogate flavopiridol-induced sensitization to TRAIL-induced apoptosis. MG-132 markedly inhibited the apoptosis induced by the combination of flavopiridol and TRAIL in SKBR-3 cells (Fig. 5E), under the same conditions that blocked c-FLIP degradation by flavopiridol. These data indicate that c-FLIP protein is 8863 Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 Cancer Research Figure 4. Treatment with flavopiridol does not affect the expression levels of TRAIL receptors in SKBR-3 cells but enhances DISC formation and induces down-regulation of c-FLIPL and c-FLIPS proteins in several breast tumor cell lines. A, SKBR-3 cells cultured in six-well plates were incubated either with or without flavopiridol (100 nmol/L) for 16 hours. Cells were then harvested, and cell surface receptor expression was assessed by flow cytometry using monoclonal antibodies to TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, or TRAIL-R4 as described in Materials and Methods. Discontinuous line, cells labeled with secondary antibody alone were used as a control for background fluorescence. Data are representative of two independent experiments. B, SKBR-3 cells were either treated or not with 100 nmol/L flavopiridol for 16 hours before the incubation with bio-TRAIL (1 Ag/mL) for the indicated times. Unstimulated receptor controls (u/s ) are the addition of bio-TRAIL to an equivalent volume of lysate isolated from unstimulated cells. DISC was isolated as described in Materials and Methods, and its components caspase-8 and FADD were analyzed by Western blotting. Lysates are included as a positive control for the expression of these proteins in SKBR-3 cells. Two different exposures of the caspase-8 DISC Western blot are presented to clearly show the differences in procaspase-8 recruitment and processing in the DISC between untreated or flavopiridol-treated cells. Data are representative of four independent experiments. C, analysis by Western blotting of c-FLIPL, c-FLIPS, caspase-8, and FADD in SKBR-3 cells treated or not with 100 nmol/L flavopiridol for the indicated times. a-Tubulin was blotted to show equal loading. Data are representative of three independent experiments. D, SKBR-3 cells were treated or not with the indicated concentrations of flavopiridol for 24 hours. c-FLIPL and c-FLIPS levels were analyzed by Western blotting. Tubulin was used as a protein loading control. Results are representative of two independent experiments. E, analysis by Western blotting of c-FLIPL and c-FLIPS in the indicated cells treated or not with 100 nmol/L flavopiridol during 17 hours. a-Tubulin was blotted to show equal loading. Data are representative of three independent experiments. Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 8864 www.aacrjournals.org Flavopiridol Promotes Caspase-8 Activation by TRAIL Figure 5. A proteasome inhibitor, but not Z-VAD-FMK, prevents down-regulation of c-FLIPL and c-FLIPS by flavopiridol. A, top, c-FLIP mRNA was analyzed by RT-PCR (40 cycles) in Jurkat and SKBR-3 cells using specific primers for c-FLIPL and c-FLIPS. h-Actin was included as a control for mRNA input. Data are representative of two independent experiments. Bottom, c-FLIPL and c-FLIPS isoforms were analyzed in cell extracts from Jurkat and SKBR-3 cells. B, c-FLIPL protein and mRNA levels were analyzed by Western blotting (WB ) and RT-PCR in SKBR-3 cells after incubation with or without 100 nmol/L flavopiridol for the indicated times. RT-PCR was done using c-FLIPL primers for 27 cycles. RT-PCR product of h-actin was used as a control for mRNA input. Data are representative of two independent experiments. C, SKBR-3 cells were pretreated or not with 25 Amol/L MG-132 for 30 minutes before culturing them in the presence or absence of 100 nmol/L flavopiridol for the indicated periods. c-FLIPL and c-FLIPS levels were analyzed by Western blotting. Arrow, c-FLIPS band; asterisks, two protein bands that are up-regulated by MG-132. Tubulin was used as a protein loading control. Results are representative of two independent experiments. D, SKBR-3 cells were pretreated or not with either 25 Amol/L MG-132 or 50 Amol/L Z-VAD-FMK for 30 minutes before culturing them in the presence or absence of 100 nmol/L flavopiridol during 17 hours. c-FLIPL and c-FLIPS levels were analyzed by Western blotting. Arrow, c-FLIPS band; asterisks, two protein bands up-regulated by MG-132. Tubulin was used as a protein loading control. Results are representative of two independent experiments. E, SKBR-3 cells were treated or not with 25 Amol/L MG-132 for 30 minutes before culturing them with or without flavopiridol for 7 hours. TRAIL was then added to the cultures and apoptosis was measured 16 hours after the addition of TRAIL as described in Fig. 1. Columns, average of three different experiments; bars, SE. **, P < 0.001. www.aacrjournals.org 8865 Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 Cancer Research down-regulated in SKBR-3 cells treated with flavopiridol through a proteasome-mediated pathway and that this decrease in c-FLIP protein levels could be responsible for the apoptosis induced by flavopiridol and TRAIL in these breast tumor cells. Knockdown of endogenous c-FLIPL and c-FLIPS with siRNA oligonucleotides promotes apoptosis induced by TRAIL in several breast cancer cell lines. Our data indicate that flavopiridol decreases c-FLIP expression and sensitizes breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. Next, we tested the possibility that specific ablation of c-FLIP expression by siRNA has a similar effect on TRAIL-induced apoptosis. In SKBR-3 cells, the levels of both c-FLIPL and c-FLIPS were substantially reduced with a specific siRNA (Fig. 6A), whereas a similar concentration of scrambled siRNA did not modify c-FLIP protein expression. Transfection with c-FLIP siRNA had no effect on the expression of procaspase-8, a structurally related proapoptotic protease (Fig. 6A). Most importantly, silencing of c-FLIP expression resulted in a clear sensitization to TRAIL-induced apoptosis (Fig. 6B). These data correlate well with the effect of flavopiridol and support the hypothesis that down-regulation of c-FLIP expression by this CDK inhibitor is critical for the induced sensitization to TRAIL in breast tumor cells. To further substantiate the role of c-FLIP in the resistance of breast tumor cells to TRAIL, we conducted siRNA experiments in other breast tumor cell lines. Results shown in Fig. 6C show that c-FLIP siRNA specifically knocked down the expression of both c-FLIP isoforms in different breast tumor cell lines. Furthermore, silencing of c-FLIP proteins caused a marked sensitization to TRAIL-induced apoptosis in the various cell lines analyzed (Fig. 6D), a further indication of the relevance of c-FLIP proteins in contributing to the resistance of breast tumor cells to TRAIL. These results also point to the importance of c-FLIP downregulation by flavopiridol in the mechanism of sensitization to TRAIL-induced apoptosis by this CDK inhibitor. Discussion TRAIL has emerged recently as a potential anticancer agent due to its ability to induce apoptosis in numerous tumor cells, although normal cells are not killed by this death ligand (9, 22). However, despite the fact that many cancer cells are sensitive to TRAILinduced apoptosis, a number of them, in particular breast cancer cells, are resistant to TRAIL (26). In these cases, a combination therapy using chemotherapeutic agents and TRAIL may be more suitable than using TRAIL as a single agent, and in fact, several studies in this direction have been conducted (reviewed in ref. 41). In our study, we show that pretreatment of human breast cancer cells with flavopiridol, a potent inhibitor of CDKs undergoing clinical trials (42, 43), promotes the activation by TRAIL of a caspase-dependent mechanism of apoptosis in these cells. We show that sensitization to TRAIL-induced cell death by flavopiridol is a general phenomenon occurring in all human breast cancer cell lines examined. Our results also show for the first time that, in breast tumor SKBR-3 cells treated with TRAIL, full activation of apical caspase-8 at the DISC is blocked. When resistant cells were treated with flavopiridol, we detected an increased recruitment of both procaspase-8 and FADD to the TRAIL DISC and complete activation of caspase-8 as the earliest event occurring in the sensitization process. Because there are not changes in the levels of TRAIL receptors, FADD or procaspase-8, on flavopiridol treatment of SKBR-3 cells, one possibility to explain the increased recruitment of FADD to the DISC could be that post-translational modifications Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 of either FADD or TRAIL receptors that reduce the binding affinity of the DISC components (30) are affected by flavopiridol treatment. Alternatively, competition between FADD and c-FLIPL for the death domain of TRAIL receptor DR5 (44) could also modulate DISC formation. A reduction in c-FLIPL levels on flavopiridol treatment, as observed in our work, would favor binding of FADD and procaspase-8 to the TRAIL DISC. The hypothesis that short-lived inhibitory protein(s) may be involved in the resistance of SKBR-3 cells to TRAIL was confirmed by our data using the protein synthesis inhibitor cycloheximide, which rendered SKBR-3 cells sensitive to TRAIL, as has been shown in other systems (10). In this regard, a potential mechanism involved in the regulation of TRAIL sensitivity is the modulation of the expression of the death receptor inhibitors c-FLIPL and c-FLIPS (13), proteins with a very short half-lives (17) that are expressed at high levels in breast tumors (45). Metabolic inhibitors, such as cycloheximide or actinomycin D, sensitize cells to death receptor– induced apoptosis by strongly down-regulating c-FLIP expression (38). Although enhancement of TRAIL-induced caspase-8 activation and apoptosis does not always correlate with c-FLIP levels (29), it has been shown that different treatments can induce downregulation of c-FLIP and subsequent sensitization to TRAILinduced apoptosis (46, 47). In our study, treatment of different breast tumor cells with flavopiridol induced a marked downregulation of both c-FLIPL and c-FLIPS, which suggests that loss of c-FLIP expression may underlie the observed sensitization to TRAIL. It has been described that flavopiridol could inhibit NF-nB activation (23), and it is well documented that TRAIL can also activate this pathway (48), modulating the sensitivity to TRAIL. On the other hand, because c-FLIP can be transcriptionally regulated through the NF-nB pathway (16), it is plausible to think that flavopiridol could inhibit c-FLIP expression through NF-nB inhibition. However, we did not observe a decrease in c-FLIP mRNA in SKBR-3 cells treated with flavopiridol concentrations that caused maximal sensitization to TRAIL, therefore excluding the transcriptional regulation of c-FLIP as the target for the inhibitory action of flavopiridol. Furthermore, the NF-nB inhibitor Bay 11-708 at a dose that inhibits NF-nB activation failed to down-regulate c-FLIP expression (data not shown). It has been reported that c-FLIP protein levels can be downregulated by proteasomal degradation (17) and this modulation may lead to TRAIL sensitization (49). In this respect, our results show that, in breast tumor cells, flavopiridol treatment leads to the proteasome-mediated degradation of both c-FLIP isoforms, and a proteasome inhibitor abolishes the sensitization by flavopiridol to TRAIL-induced apoptosis. At present, we do not know the mechanism by which flavopiridol induces the proteasomal degradation of c-FLIP proteins. Flavopiridol has been reported to activate the c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) pathway (50). On the other hand, JNK activation by TNF-a reduces c-FLIPL stability by a mechanism involving JNK-mediated phosphorylation and activation of the E3 ubiquitin ligase Itch, which ubiquitinates c-FLIPL and induces its proteasomal degradation (51). Whether a similar mechanism is responsible for the flavopiridol-induced proteasomal degradation of c-FLIP in breast tumor cells is an issue that requires further investigation. It has been shown recently that flavopiridol induces apoptosis in combination with TNF-a or TRAIL in some human cancer cell lines (23). It was proposed that inhibition by flavopiridol of TNF-ainduced NF-nB activation was responsible for the observed synergism on apoptosis. However, the mechanism involved in the 8866 www.aacrjournals.org Flavopiridol Promotes Caspase-8 Activation by TRAIL sensitization to TRAIL was not elucidated. More recently, a reduction of XIAP or Mcl-1 levels by flavopiridol has been also suggested to be involved in the sensitization to TRAIL-induced apoptosis (24, 25). In our work, we have assessed the role of NF-nB and XIAP on flavopiridol-promoted, TRAIL-induced apoptosis in breast tumor cells. Our data clearly show that, in these cells, TRAIL does not stimulate NF-nB activity. Furthermore, although flavopiridol reduced basal NF-nB activity, this effect was not sufficient to explain the sensitization of breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis because a more specific NF-nB inhibitor did not exhibit a similar sensitizing effect. On the other hand, we have evaluated the role of XIAP in TRAIL resistance in breast tumor cells. Experiments with siRNA oligonucleotides clearly showed that elimination of XIAP protein did not abrogate resistance to TRAIL. Therefore, the down-regulation of XIAP levels observed in cells treated with flavopiridol is not sufficient to explain the sensitization observed. Besides its effects on the cell cycle (52), flavopiridol regulates transcription due to the potent inhibition of P-TEFb, composed of Figure 6. Knockdown of endogenous c-FLIPL and c-FLIPS in several breast cancer cell lines enhances apoptosis induced by TRAIL. A, SKBR-3 cells were transfected with either a siRNA oligonucleotide targeting both c-FLIP isoforms or scrambled RNA oligonucleotide as described in Materials and Methods. After 72 hours, cells were harvested for immunoblot analysis to verify protein knockdown. Tubulin was used as a protein loading control. Results are representative of two independent experiments. B, SKBR-3 cells were transfected as in (A ), and after 48 hours, TRAIL was added to the cultures. Apoptosis was measured 24 hours after the addition of TRAIL as described in Fig. 1. Columns, average of two independent experiments; bars, range. C, BT474, MDA-MB-435S, and MDA-MB-231 cells were transfected with either a siRNA oligonucleotide targeting both c-FLIP isoforms or a scrambled RNA oligonucleotide as described in Materials and Methods. After 24 hours, cells were harvested for immunoblot analysis to verify protein knockdown. Tubulin was used as a protein loading control. Results are representative of two independent experiments. D, BT474, MDA-MB435S, and MDA-MB-231 cells were transfected as in (C ), and after 24 hours, TRAIL was added to the cultures. Apoptosis was assessed 24 hours after the addition of TRAIL as described in Fig. 1. Columns, average of two different experiments; bars, range. www.aacrjournals.org 8867 Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 Cancer Research CDK9 and cyclin T1, which controls the elongation phase of transcription by RNA polymerase II (40). In this respect, it has been reported that flavopiridol decreases the mRNA levels of the antiapoptotic proteins XIAP, cIAP-2, Mcl-1, Bcl-x(L), and survivin in breast cancer cells (5). However, because all these proteins block TRAIL-induced apoptosis downstream caspase-8 activation, their down-regulation by flavopiridol does not explain the early sensitization induced by this flavonoid in SKBR-3 cells. The mechanism underlying prevention of initiator procaspase8 activation by c-FLIP within the DISC is still unclear. Although c-FLIPS seems to inhibit the activation of this initiator caspase, the role of c-FLIPL as an antiapoptotic protein is more controversial. c-FLIPL is processed within the DISC to a 43-kDa subunit that remains at the DISC and a 12-kDa fragment that is released (53). In the presence of c-FLIPL, procaspase-8 is partially cleaved to its p43/p41 fragments within the DISC, and the cleavage intermediates of both caspase-8 and c-FLIPL remain bound to the receptor, preventing further recruitment of procaspase-8 to replace the processed caspase-8 at the DISC. On the contrary, recent data have indicated that heterodimerization of caspase-8 with c-FLIPL leads to increased proteolytic activity of caspase-8 (54). Our results are compatible with the presence of c-FLIPL at the DISC of SKBR-3 cells treated with TRAIL, where we detect the initial processing of procaspase-8. In cells pretreated with flavopiridol, there is full activation of caspase-8, which could correspond to a decreased c-FLIP/caspase-8 ratio within the DISC. In this respect, a high References 1. Kaur G, Stetler-Stevenson M, Sebers S, et al. Growth inhibition with reversible cell cycle arrest of carcinoma cells by flavone L86-8275. J Natl Cancer Inst 1992;84: 1736–40. 2. 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In our studies with siRNA methodology, we have shown clearly the important role of c-FLIP levels in the resistant of different breast tumor cells to TRAIL. These results, in conjunction with the data indicating that flavopiridol markedly reduces c-FLIP expression and potently sensitizes breast tumor cells to TRAIL, further support the hypothesis that activation of the proteasome-mediated degradation of c-FLIP by flavopiridol is responsible for the elimination of resistance to TRAIL. Flavopiridol can be a useful approach in tumor therapy because it is able to modulate the sensitivity of tumor cells to other therapeutic strategies. In this respect, our data indicate that the sensitizing effects of flavopiridol to nontoxic death receptor ligands, such as TRAIL, could have therapeutic potential in the treatment of human breast cancer. Acknowledgments Received 3/3/2006; revised 5/25/2006; accepted 7/11/2006. Grant support: Ministerio de Educación y Ciencia grant SAF-2003-00402 and Association for International Cancer Research (AICR) grant AICR-03-031 (A. López-Rivas), AICR contract (C. Palacios), and Junta de Andalucı́a and Ministerio de Educación y Ciencia contract (R. Yerbes). The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact. We thank Gema Robledo for her excellent technical assistance and Drs. José Ramón Suarez, C. Ruiz-Ruiz, C. Ruiz de Almodóvar, and G. Ortiz-Ferrón for critical reading of the article. imide-sensitive factor occurs at the level of or upstream of Fas-associated death domain protein (FADD). J Biol Chem 2000;275:24357–66. 11. Sprick MR, Weigand MA, Rieser E, et al. FADD/ MORT1 and caspase-8 are recruited to TRAIL receptors 1 and 2 and are essential for apoptosis mediated by TRAIL receptor 2. 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