XX Congreso Latinoamericano y XVI Congreso Peruano de la

XX Congreso Latinoamericano y XVI Congreso Peruano
de la Ciencia del Suelo
“EDUCAR para PRESERVAR el suelo y conservar la vida en La Tierra”
Cusco – Perú, del 9 al 15 de Noviembre del 2014
Centro de Convenciones de la Municipalidad del Cusco
ÁCIDO ABSCÍSICO Y SU METABOLITO CONJUGADO CON GLUCOSA
EN SUELO Y RAÍCES DE PASTOS DEL MONTE PATAGÓNICO,
ARGENTINA
Cenzano, A.M.1*; Luna, M.V.2
1Lab.
Fisiología Vegetal, UI Ecología Terrestre (CENPAT-CONICET); 2Depto. Cs. Naturales (UNRC)
* Autor de contacto: [email protected]; Boulevard Brown 2915, 9120, Puerto Madryn, Chubut, Argentina;
+54 280 4883184 int. 1338
RESUMEN
La hormona del estrés por sequía, ácido abscísico (ABA), es necesaria para un equilibrio en los
niveles endógenos de la raíz y el medio externo. En la planta, reduce la pérdida de agua y
promueve el crecimiento radical. Con el fin de dilucidar los mecanismos hormonales de resistencia
a la sequía, se determinaron mediante LC/MS-MS los niveles endógenos de ABA y ABAconjugado con glucosa (ABA-GE) en el suelo rizosférico y en las raíces de Poa ligularis y
Pappostipa speciosa, bajo 16% y 4% de humedad gravimétrica. En el suelo, el nivel de ABA fue
mayor en P. ligularis que en P. speciosa y ABA-GE no varió entre ambas especies. El nivel de
ABA-GE en suelo fue mayor que el de ABA libre. La sequía no modificó el nivel de ABA y de ABAGE en el suelo. En las raíces, el nivel de ABA fue mayor en P. ligularis que en P. speciosa y ABAGE no varió entre ambas especies. La sequía incrementó el ABA en las raíces de P. ligularis y no
produjo cambios en P. speciosa. Nuestro hallazgo que el nivel de ABA-GE en suelo fue mayor que
el de ABA libre revela un elevado catabolismo de ABA y una elevada acumulación en el suelo. El
elevado nivel de ABA en raíces de P. ligularis (mesofítica/adquisitiva) podría ser considerado una
estrategia hormonal de evitación a la sequía; mientras que en P. speciosa (xerofítica/conservativa)
el bajo nivel de ABA podría ser una respuesta adaptativa de mayor tolerancia a la sequía.
PALABRAS CLAVE
Ácido abscísico; Monte Patagónico; Poa ligularis
INTRODUCCIÓN
El ácido abscísico (ABA) ), considerado la hormona del estrés por sequía, generalmente mantiene
un equilibrio en los niveles endógenos de la raíz y el medio externo (Sauter et al., 2001). En suelo
el nivel de ABA es muy bajo respecto al de las raíces y demuestra la existencia de un gradiente de
raíz-suelo (Degenhardt et al., 2000). En la planta, a nivel de las hojas su efecto regulador sobre la
apertura y cierre de los estomas constituye una eficiente estrategia para reducir la pérdida de
agua a través de la transpiración y favorecer la economía del agua dentro de la planta (Davies,
1995). El ABA mantiene el crecimiento del tallo y promueve el crecimiento de las raíces y de los
pelos radicales (Srivastava, 2002; Chen et al., 2006). La acumulación de ABA y sus metabolitos
(productos de vías catabólicas de oxidación y/o conjugación) ha sido mayoritariamente descripta
para especies mesofíticas (Jiang y Zhang, 2001; Qin y Zeevaart, 2002; Seiler et al., 2011) que
para especies xerofíticas.
El ABA se sintetiza en el suelo por microorganismos del suelo (Frankenberger y Arshad, 1995), en
las hojas y raíces de la planta, y se mueve desde la planta al suelo y viceversa (Sauter et al.,
2001). Los niveles de ABA en la planta son dinámicamente regulados por un balance entre
síntesis, transporte y degradación (Cutler y Krochko, 1999). ABA puede conjugarse con glucosa
formando el metabolito ABA-GE, el cual puede actuar como forma de transporte mediando la
señal a larga distancia, y como forma de almacenamiento de ABA inactivo (Xu et al., 2002; Sauter
et al., 2002; Jiang y Hartung, 2008). ABA-GE puede ser hidrolizado por β-glucosidasas
produciendo ABA libre activo (Lee et al., 2006; Llanes et al., 2013).
En el Monte patagónico los pastos Poa ligularis y Pappostipa speciosa constituyen el alimento
principal de los herbívoros nativos y domésticos de la Patagonia y, como el resto de los pastos,
tienen un rol importante en la prevención de la erosión del suelo (Chartier y Rostagno, 2006).
Debido a las condiciones medio ambientales de esta región árida, ambas especies están
expuestas a períodos de corta duración en la disponibilidad hídrica y exhiben diferentes
estrategias de resistencia a la sequía (Campanella y Bertiller, 2008; Cenzano et al., 2013). Hasta
el momento, la dinámica de la interacción suelo-raíz explicada en términos de los niveles
endógenos de ABA y ABA-GE no ha sido informada para estas especies. El conocimiento de
caracteres hormonales y bioquímicos (nivel endógeno de ABA y ABA-GE) que poseen un rol
protagónico en la adaptación al estrés por sequía de los pastos perennes del Monte patagónico es
necesario para la conservación y la planificación del manejo de los pastizales. El objetivo general
de este estudio es analizar si existen diferencias en el nivel endógeno de ABA y ABA-GE en el
suelo y en las raíces entre dos condiciones hídricas y entre dos especies de pastos que poseen
diferentes estrategias de resistencia a la sequía.
MATERIALES Y MÉTODOS
Localización geográfica. Este estudio fue realizado al NE de la Provincia de Chubut, Argentina,
correspondiente a la porción S de la Provincia Fitogeográfica del Monte (Soriano, 1950). Dentro de
este área el experimento se realizó en el Centro Nacional Patagónico (CENPAT).
Tipo de suelo y especies en estudio. Los suelos son aridisoles cálcicos con acumulación de
carbonatos (del Valle, 1998). Las especies en estudio fueron los pastos perennes Poa ligularis
Nees. Ap. Steudel y Pappostipa speciosa (Trin. et Rupr.) Romaschenko.
Diseño experimental. Se cosecharon 60 matas de cada especie en la Estancia San Luis
(42º40'49.3''S 65º21’33.6''W) en otoño 2009 para el transplante. Se separaron 200 macollos
individuales de cada especie y se transplantaron en macetas (1 macollo por maceta) rellenas con
1400 g de suelo tamizado con malla de 2mm. Se mantuvieron en invernáculo durante 1 mes hasta
el inicio del experimento. Ambas especies se sometieron a dos niveles de humedad gravimétrica
del suelo: 16% (cercano a capacidad de campo durante otoño-invierno) y 4% (condición de
sequía, verano) durante el período Agosto 2009-Diciembre 2010. Dichos niveles corresponden a
valores informados bajo condiciones naturales en el Monte Patagónico (Coronato y Bertiller,
1997). Las macetas se mantuvieron en umbráculo y la humedad del suelo se controló
semanalmente durante primavera-verano y quincenalmente durante otoño-invierno por pesada y
agregado de agua hasta alcanzar peso estipulado para cada % de humedad.
Determinación del pH del suelo. Se utilizó la relación suelo: agua (p/v), 10 g PF: 25 ml de agua
destilada (Bates, 1954) y se empleó el peachímetro Orion, Model 720A.
Extracción de ABA Y ABA-GE. Suelo: se seleccionaron al azar 4 muestras de suelo de cada
especie y tratamiento al final del experimento (Diciembre 2010). Las muestras se tomaron a una
distancia de 5 cm de profundidad y en proximidad de las raíces. Se pesaron 4 g (PF) y se
agregaron 6 ml de solución de extracción (MeOH 80%). Se adicionaron los estándares (D6-ABA,
50 ng y D5-ABA-GE, 200 ng, National Research Council of Canadá) y se colocaron en agitador
orbital durante 1h. Luego se colocaron a 4ºC durante 24h, se centrifugaron durante 15 min a 5000
rpm y el sobrenadante se colectó en tubos de vidrio Khan. Se realizó una segunda extracción y se
procedió de igual manera que lo descripto anteriormente. Se colectaron ambos sobrenadantes y
se secaron a reducción total empleando la centrífuga evaporadora SpeedVac, Thermo Savant.
Raíz: 4 plantas de cada especie y tratamiento previamente seleccionadas se cosecharon en
Diciembre 2010. Se separaron las raíces y se lavaron con agua sobre un tamiz de1000 µm. Luego
del secado manual se colocaron a -20º C hasta su liofilización (72h). Se emplearon 200 mg (PS),
el cual se trituró en mortero con nitrógeno líquido y se adicionaron 3 ml de solución de extracción
(Acetona:H2O:AcH, 80:19:1). Se adicionaron los estándares (D6-ABA, 50 ng y D5-ABA-GE, 200
ng), agitó y colocó a 4ºC durante 1h. Se centrifugó durante 15 min a 5000 rpm, colectó el
sobrenadante en tubos de vidrio Khan y secó hasta reducción total. Toda la metodología se realizó
bajo penumbra.
Purificación y cuantificación de ABA y ABA-GE. La muestra se resuspendió en 500 µl de
MeOH, filtró sobre columna con filtro de celulosa en cámara de vacío Phenomenex, y secó hasta
evaporación total. La muestra se disolvió en 100 µl de la solución MeOH:AcH 1% (99:1) y se
vortereó. Se realizó una extracción en fase sólida mediante cromatografía en columna C-18 de
fase reversa. Previamente, se preacondicionó la columna con 1,5 ml de MeOH, equilibró con 1,5
ml de MeOH:H2O:AcH (10:89:1), y cargaron las muestras. La columna se lavó con 1,5 ml de
MeOH:H2O:AcH (10:89:1), se eluyó ABA y ABA-GE con 1,5 ml de MeOH:H2O:AcH (80:19:1), y
evaporaron hasta sequedad total. El extracto se diluyó en el 100 µl MeOH puro grado HPLC para
cuantificación por Cromatografía Líquida-Espectrometría de Masa (LC/MS-MS) empleando el
equipo Micromass Quattro Ultima Pt (Waters) con detector de arreglo de diodos. Se utilizó un
sistema binario de solventes compuesto por solvente A: MeOH, y solvente B: AcH 0.2% en agua,
programado para cambiar linealmente desde 40% solvente A hasta 80% a los 25 min, con un flujo
constante de 0.2 ml/min. Ambos compuestos se identificaron de acuerdo al tiempo de retención
(Rt): ABA-GE Rt 2.30 min y ABA Rt 9.55 min. Se obtuvieron diferentes cromatogramas mediante
el Software MassLynx version 4.1 y se procedió al cálculo de área de cada compuesto endógeno
comparado con el área de su respectivo estándar (Zhou et al., 2003, con modificaciones).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Mediciones de pH del suelo revelaron valores correspondientes a suelos alcalinos, menor pH en
suelos de P. speciosa bajo sequía, y no se encontraron diferencias significativas en el pH del
suelo de ambas especies (Tabla I). Valores de pH alcalinos conjuntamente con reducido contenido
de agua han sido encontrados en suelos de ambiente áridos (Jiang y Hartung, 2008).
Tabla I: Valores de pH correspondientes al suelo bajo dos niveles de humedad 16% (cercano a
capacidad de campo) y 4% (condición de sequía). Letras diferentes indican diferencias
significativas (P ≤ 0.05). Media ± SE (n = 4).
Especies
Tratamiento
pH suelo
P. ligularis
P. ligularis
P. speciosa
P. speciosa
16% Humedad
4% Humedad
16% Humedad
4% Humedad
8,59 ± 4,2 ab
8,47 ± 4,1 ab
8,99 ± 4,5 b
8,21 ± 4,0 a
En el suelo el nivel de ABA fue bajo (Fig. 1a) comparado con el encontrado en las raíces (Fig. 1b)
tal lo informado por otros estudios (Degenhardt et al., 2000). Sin embargo, el nivel de ABA-GE en
suelo fue elevado respecto al ABA (Fig. 1a) en coincidencia con lo hallado por otros autores
(Sauter y Hartung, 2000) sugiriendo un mecanismo de homeostasis de la hormona al actuar como
forma de almacenamiento en el suelo (Sauter et al., 2002).
300
16 % Humedad
4 % Humedad
200
Suelo
Aa
Aa
Aa
Aa
100
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Aa Aa
Ba Ba
Ps
Pl
Ps
Pl
_____________________________
ABA
ABA-GE
b
Ácido abscísico y metabolite
-1
(ng . g PS)
Ácido abscísico y metabolite
-1
(ng . g PF)
a
400
50
Raíces
16 % Humedad
4 % Humedad
40
30
*
Ab
20
Aa
10
0
Aa
Aa
Aa
Aa
Ba Ba
Ps
Pl
Ps
Pl
_____________________________
ABA
ABA-GE
Fig. 1. Nivel de ABA y ABA-GE en el suelo y en las raíces de Pappostipa speciosa (Ps) y Poa ligularis (Pl) a 16% y 4%
de humedad gravimétrica. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias significativas entre especies y letras
minúsculas diferentes indican diferencias significativas entre los niveles de humedad (P ≤ 0.05). Asterisco indica
interacción significativa entre especies y % de humedad. Media ± SE (n = 4).
El nivel de ABA en el suelo de P. ligularis fue mayor que en suelo de P. speciosa (Fig. 1a). Valores
cercanos a 0,2-0,4 nM de ABA en suelos alcalinos han sido informados (Degenhardt et al., 2000);
sin embargo en este estudio se informaron valores próximos a 0,2-0,6 pmol ABA/g PF y 0,6-0,8
nmol ABA-GE/g PF. Este ABA podría provenir de la exudación por las raíces y/o síntesis por
microorganismos de la rizósfera (Jiang y Hartung, 2008). Se conoce que bajo condiciones
alcalinas las raíces que carecen de exodermis pueden perder ABA hacia el suelo (Degenhardt et
al., 2000). Sin embargo, según la bibliografía las dos especies tendrían exodermis, por lo tanto, el
mayor nivel de ABA en suelo de P. ligularis podría deberse a la mayor biosíntesis de ABA por
microorganismos del suelo circundante.
El nivel de ABA-GE en el suelo no varió entre ambas especies, para ninguna condición hídrica
(Fig. 1a). En raíces no hubo diferencia significativa entre el nivel de ABA y el de ABA-GE (Fig. 1b).
Sin embargo, este último tendió a aumentar en P. speciosa en coincidencia con menor nivel de
ABA libre, con 16% de humedad. La sequía incrementó el ABA en las raíces de P. ligularis y no
produjo cambios en P. speciosa, lo cual podría correlacionarse con una mayor síntesis de
hormona a fin de mantener el crecimiento de la raíz (Sharp, 2002), lo que responde a una
respuesta de planta mesofítica. La mayor proporción de ABA-GE encontrada en el suelo respecto
a raíces, la cual no es afectada por la condición hídrica, podría deberse a que el ABA libre
excretado, es inmediatamente conjugado por los microorganismos y devuelto al medio. La
propiedad de conjugación de hormonas ha sido citada para algunas bacterias (Cassán et al.,
2012).
Por otra parte, a valores de pH alcalinos (pH= 8) el ABA se encuentra en su forma aniónica por lo
cual no atraviesa la corteza de la raíz (Degenhardt et al., 2000). Esto sugiere que el ABA
encontrado en las raíces proviene de la síntesis en estos órganos y no de su incorporación desde
el suelo. Además, el ABA-GE presente en el suelo no puede atravesar las barreras apoplásticas
de la raíz debido a sus propiedades hidrofóbicas (Sauter y Hartung, 2000) por lo cual debe ser
previamente hidrolizado (Lee et al., 2006).
CONCLUSIÓN
Este trabajo informa por primera vez el nivel de ABA y ABA-GE en suelo y en raíces de dos
especies de pastos del Monte Patagónico, y la existencia de un metabolismo de ABA diferencial
(síntesis y conjugación) en las raíces, que se correlaciona con estrategias de resistencia a la
sequía e historias de vida contrastantes de cada grupo funcional de pastos del desierto. Estos
resultados sugieren que el mayor nivel de ABA libre en raíces de P. ligularis (decidua de verano,
adquisitiva y mesofítica) podría ser considerado una estrategia hormonal importante en la
respuesta de evitación a la sequía de esta especie; mientras que en P. speciosa (siempreverde,
conservativa y xerofítica) el bajo nivel de ABA libre indicaría una respuesta adaptativa de mayor
tolerancia a la sequía asociada a la presencia de otros atributos constitutivos.
AGRADECIMIENTOS
Al Sr. F. Sarasa por posibilitarnos la cosecha de plantas madres en su propiedad y a ALUAR
Aluminio Argentino S.A.I.C. (Sr. J. Groizard) por el suministro de nitrógeno líquido. Este trabajo fue
financiado por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas de Argentina
(CONICET) y por la Secretaría de Ciencia, Tecnología e Innovación Provincia del Chubut.
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