Tècnicas de histoquimica ,IHQ y utilidad diagnostica en patología
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Técnicas de Histoquímica e Inmunohistoquímica en Patología Neuromuscular: utilidad diagnóstica Soraya Barrera Cabañeros ( TEAP) Servicio de Anatomía Patológica y Neuropatología. Hospital Meixoeiro Complexo Hospitalario Universitario de Vigo – CHUVI Instituto de Investigación Biomédica de Vigo ¿QUÉ SON LAS ENFERMEDADES NEUROMUSCULARES? • Son enfermedades crónicas de evolución variable • La mayoría son de origen genético y algunas adquiridas • Se caracterizan por debilidad muscular, miotonía, calambres… • Afectan al SNC, SNP, unión n-m y fibra muscular • Pueden afectar a otros órganos • Su aparición puede ser en cualquier etapa de la vida SARCÓMERO: Unidad contráctil del músculo Enfermedades Neuromusculares Biopsia muscular + Historia clínica Datos paraclínicos Laboratorio Miopatología Disección - Orientación M/E Inmunogold Banco de Tejidos Congelación Cortes criostato Histoquímica Inmunohistoquímica Microscopía Confocal DIAGNÓSTICO Extracción de DNA Wb Bioquímica Banco de DNA PCR multiplex RFLP Secuenciación Otras Consejo genético 250-300 biopsias de músculo y nervio/año (85% de la Comunidad Gallega) Histoquímica Morfología Estudio de proteínas Estudio genético Inmunohistoquímica Microscopía electrónica Estudio bioquímico ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS I TAMAÑO Y FORMA Fibras atróficas, anguladas o no Fibras hipertróficas Fibras hipercontraídas Fibras redondeadas Figuras de “splitting” NÚCLEOS Múltiples Internalizados Agregados (“clumps”nucleares) ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS II CITOPLASMA Degeneración – necrosis Miofagia Vacuolización: lípidos, glucógeno, vacuolas autofágicas Invasión parcial ESPACIO EXTRACELULAR Infiltrados inflamatorios Fibrosis Sustitución adiposa TRICRÓMICO DE GOMORI (Modificado por Engel y Cunningham, 1963) Patrón intermiofibrilar Mitocondrias (RRF) Bastones nemalínicos Cuerpos citoplásmicos Retículo sarcoplásmico Vacuolas autofágicas Fibras(“ragged red fibers”) Bastones nemalínicos Vacuolas ribeteadas TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS 1- Valorar el exceso de un sustrato determinado: glucógeno, lípidos 2- Mostrar cambios estructurales no visibles con técnicas histológicas 3- Evaluar los tipos de fibras musculares: 1, 2A, 2B, 2C 4- Ausencia de un enzima determinado OIl RED Gotas lipidicas, lipofucsina PAS Tipos de fibras Glucógeno (lisosomal, libre) HISTOQUÍMICA. PRINCIPIOS BÁSICOS IV ENZIMAS OXIDATIVAS • NADH (Nicotinamida adenina dinucleótido) – Patrón intermiofibrilar: • Retículo sarcoplásmico • Mitocondrias • SDH (Succino-Deshidrogenasa) – Mitocondrias • COX-SDH (Citocromo oxidasa ) – Mitocondrias NADH Central core Targets Fibras apolilladas Fibras anulares Miopatía mitocondrial HE SDH Gomori COX-SDH Miopatía por agregados tubulares HE TRI NADH SDH ATP-asas 4.6 9.4 4.3 Fibras tipo 1 Fibras tipo 2a Fibras tipo 2b Fibras tipo 2c ATPasa 9.4 Marrón claro Marrón oscuro Marrón oscuro Marrón oscuro ATPasa 4.63 Marrón oscuro Blancas Marrón claro Marrón claro ATPasa 4.35 Marrón oscuro Blancas Blancas Marrón claro Atrofia por denervación 4.3 Atrofia neurógena HE Miofosforilasa PAS Miofosforilasa Mioadenilato Desaminasa CONTROL (MAD+) MAD NEGATIVO Miopatía por déficit de MAD INMUNOHISTOQUÍMICA • Permite visualizar y localizar proteínas específicas déficit primario déficit secundario • Debe valorarse conjuntamente con las técnicas histológicas e histoquímicas Guillaume- Benjamin Amand Duchenne (1806-1875) 1868: Paralysie pseudo-hypertrophique, or myosclerotique, de l’Enfance (Archives Générales de Médecine) ANTICUERPOS • Espectrina • Merosina • Distrofina (Dys 1, 2 y 3) • Alfa2-laminina • DRP1 • Emerina • DRP2 • LAMP2 • Alfa-SG • Caveolina • Beta-SG • Miotilina • Gamma-SG • Miosina (slow, fast) • Delta-SG • Troponina PGP 9.5 • Alfa-DG • Colágeno VI • Beta-DG • Notch 3 • Disferlina • Serie linfoide, desmina, • Calpaína 3 marcadores vasculares, actina, etc Duchenne Distrofina Espectrina Utrofina (DRP2, Control) Utrofina Becker Dystrophin DRP CMD Merosin Spectrin Emery Dreyfuss Emerin Emerin, Control Emery Dreyfuss Emerina, Control EDMD Emerina, Control EDMD -DISTROGLICANO Control Antibody: clon VIA4 (glycosylated epytope) INMUNOHISTOQUÍMICA DIFICULTADES DE INTERPRETACIÓN Y SOLUCIONES • Interacción de varias proteínas (distrofina-sarcoglicanos; disferlina-otras) • Pueden obtenerse falsos resultados si se usa un único anticuerpo • La ausencia de una proteína puede dar lugar a la sobreexpresión de otras (distrofina y dystrophin-related protein) • Las proteínas nucleares se expresan en cualquier tipo de célula (emerina, lamina A/C) PRINCIPIOS PARA EL MANEJO DE LAS MUESTRAS • LA MUESTRA DEBE SERVIR PARA TODOS LOS ESTUDIOS • CUALQUIER MUESTRA DEBE PODER RETOMARSE EN EL FUTURO (Bancos de tejidos y ADN)
