TIPAJE HLA DE CLASE I POR MICROLINFOCITOTOXICIDAD

TIPAJE HLA DE CLASE I POR MICROLINFOCITOTOXICIDAD
1.- INTRODUCCIÓN
El método de microlinfocitotoxicidad es el más empleado para la determinación de moléculas de
histocompatibilidad de clase I. Las moléculas de clase II han dejado prácticamente de tiparse por este
método y actualmente se identifican por PCR-SSO o procedimientos similares. La técnica se basa en la
incubación en pocillos de las células problema con una batería de antisueros que contienen anticuerpos
anti moléculas HLA específicas. Los anticuerpos se unirán a las moléculas HLA de la superficie de las
células, en caso de reacción positiva, y activarán el sistema del complemento. El depósito de
complemento sobre la membrana de las células producirá su lisis.
Para determinar si las células están lisadas (reacción positiva) o vivas (reacción negativa) se
añaden dos fluorocromos que se intercalan en el DNA de las células: bromuro de etidio (BE), que penetra
sólo en las células muertas y emite fluorescencia roja, y el naranja de acridina (NA), que penetra en todas
las células y emite fluorescencia verde. Al observar los pocillos con un microscopio de fluorescencia
invertido, se podrá determinar en cada uno de ellos si las células están vivas (FL verde) y por tanto
reacción negativa, o lisadas (FL roja que enmascara a la FL verde) y por tanto reacción positiva.
Las células que se emplean habitualmente en los estudios de histocompatibilidad son los
linfocitos. La razón es que se aíslan fácilmente de sangre periférica, o de bazo y ganglios linfáticos si se
trata de donantes cadáveres, y mantienen su viabilidad varios días in vitro. Los anticuerpos para tipaje
proceden de multíparas y con frecuencia reconocen más de una especificidad HLA, aunque cada vez está
más extendido el uso de anticuerpos monoclonales. Debido al alto polimorfismo alélico, para determinar
el tipaje HLA de un individuo, se suelen utilizar 200 o más antisueros distintos, empleando siempre más
de uno para cada especificidad.
2.- OBJETIVOS
Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:
-
Distinguir células viables y lisadas en un ensayo de citotoxicidad
Identificar los alelos expresados según los patrones de reacción
Reconocer la reactividad cruzada
Establecer un tipaje de clase I
3.- EQUIPAMIENTO Y REACTIVOS
-
Microscopio invertido de fluorescencia
Placas Terasaki
Batería de antisueros anti moléculas HLA de clase I
Control negativo (suero AB diluido en medio de cultivo)
Control positivo (poliespecífico)
Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla.
Pipetas de 2-20l y puntas (alternativamente, Dispensador Hamilton)
Tubos eppendorf
Parafina líquida
-
Complemento
Mezcla Hemoglobina/BE/NA/EDTA
Sangre periférica anticoagulada o células ya aisladas
4.- PROCEDIMIENTO
1.- Aislar infocitos+monocitos de sangre periférica por centrifugación en Lymphoprep (Ficoll-Hypaque,
ver protocolo) y ajustar a 3*106 células/ml.
2.- En una placa Terasaki de 60 pocillos pipetear (*) 6 l de parafina líquida en los pocillos que se van a
usar, según la planilla que facilita el Profesor
3.- Pipetear 3.5 l de cada antisuero en su pocillo respectivo, según la planilla. La punta de la pipeta debe
colocarse a 45 grados y tocar el fondo del pocillo.
4.- Pipetear 4 l de células por pocillo cuidando de que se mezclen con la "gota" de antisuero.
5.- Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
6.- Pipetear 6 l de complemento por pocillo, cerciorándose de que se mezcla con las células y el
antisuero.
7.- Incubar 1 hora a temperatura ambiente o 30 minutos a 37C.
8.- Pipetear 5 l/pocillo de la mezcla BE/NA diluida en hemoglobina/EDTA
9.- Leer al microscopio de fluorescencia a bajo aumento (100x).
(*) Todos lo pipeteos deben hacerse hasta el primer golpe para evitar burbujas.
5.- INTERPRETACIÓN
Muchos de los antisueros que se emplean en histocompatibilidad dan reacciones débiles, de modo
que no lisan a todas las células positivas para la molécula HLA en cuestión. Al leer los pocillos al
microscopio se asigna a cada uno una "puntuación" de acuerdo con el siguiente criterio:
% de células lisadas
en el pocillo
0-10
10-20
20-50
50-80
80-100
Puntuación
1
2
4
6
8
Interpretación
Negativo
Negativo dudoso
Positivo débil
Positivo
Positivo fuerte
En esta práctica se simplificará la lectura asignando a los pocillos la calificación:
POSITIVO (mayoría de células lisadas), NEGATIVO (mayoría de células viables) o DUDOSO.
HLA-A
A
B
HLA-B
E
F
A
B
C
D
HLA-C
C
D
E
F
A
1
AB POL A1
(C-) (C+)
A2
A2 A3
+ 28
1
AB POL B7
(C-) (C+)
B8 B12 B13
+ 59
1
AB POL Cw1 Cw2 Cw2 Cw3
(C-) (C+)
+6
2
A30 A11 A10 A25 A23 A9
+ 31
+ 34
+ 74
+ 66
2
B57 B51 B35 B40 B27 B18
+ 58 + 52
+ 48 + 57
+A3
2
Cw1 Cw6 Cw6 Cw5 Cw4 Cw4
(N) +4
+4
+2
(N)
3
3
3
4
4
4
5
5
5
6
6
6
7
7
7
8
8
8
9
9
9
10
10
10
B
C
D
E
F