Trabajo Práctico nº 1 - Universidad Nacional de La Plata

Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata
Bioquímica III – 2009
Trabajo Práctico nº 1
Introducción al trabajo de laboratorio
Objetivos:
Familiarizarse con la Bioseguridad en el Laboratorio, niveles de bioseguridad, el uso de pipetas automáticas, trabajo
en condiciones de esterilidad, etc.
Familiarizarse con el planeamiento de experimentos, preparación de materiales, etc.
Introducción
La preocupación por eliminar los riesgos y proteger al personal docente, administrativo y estudiantes, ha llevado a
que las condiciones de trabajo recaen sobre todos y cada uno de los usuarios de los laboratorios. La bioseguridad
es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y conductas que disminuyen el riesgo del
trabajador en cuanto a su salud, de adquirir infecciones en el medio laboral. El conocimiento y la aplicación
adecuada de estas normas como la utilización de guardapolvo, guantes, barbijo, entre otros; así como la importancia
de estas normas antes, durante y después de cada practica es un deber de cada estudiante en el laboratorio donde
se este desenvolviendo. Estas normas son la base de un buen control de calidad del producto o trabajo que se este
llevando a cabo.
Niveles de bioseguridad en microbiología.
El Instituto Argentino de Normalización (IRAM), tal cual se aclara en el prefacio de todas sus normas, es una
asociación civil sin fines de lucro cuyas finalidades específicas, en su carácter de Organismo Argentino de
Normalización, son establecer normas técnicas, sin limitaciones en los ámbitos que abarquen, además de propender
al conocimiento y la aplicación de la normalización como base de la calidad, promoviendo las actividades de
certificación de productos y de sistemas de la calidad en las empresas para brindar seguridad al consumidor. Sus
normas son el resultado del consenso técnico entre los diversos sectores e instituciones involucrados que participan
a través de representantes en los distintos organismos de estudio de la Institución
En la elaboración de la Norma IRAM 80059 participaron importantes instituciones vinculadas a su temática. La
mencionada norma se basa en la concepción según la cual, para establecer el nivel de bioseguridad necesario en el
trabajo microbiológico, debe tenerse en cuenta no sólo el grupo de riesgo intrínseco al microorganismo manipulado
sino también el tipo de operación que se ejecuta (multiplicadora o no del mismo).
En muchos trabajos se observa que cuando se intentan establecer los niveles de bioseguridad necesarios, se suele
hacer una correlación directa con el grupo de riesgo a que pertenece el microorganismo, según la conocida
clasificación de la OMS.
En la norma que se comenta, se tiene en cuenta que el grado de riesgo que corre el operador y el medio circundante
varía para un mismo organismo de acuerdo al tipo de tareas que se ejecutan.
Esto constituye un aporte que permitirá clarificar numerosas situaciones que hasta ahora eran motivo de discusión.
Los microorganismos se clasifican según cuatro grupos de riesgo individual y comunitario, a saber:



Grupo de nivel de riesgo 1. (Riesgo individual y comunitario escaso o nulo). Grupo de riesgo constituido por
microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en humanos o en animales.
Grupo de nivel de riesgo 2. (Riesgo individual moderado, riesgo comunitario bajo). Grupo de riesgo
constituido por agentes patógenos que pueden provocar enfermedades en humanos o en animales, pero
que tiene pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal del laboratorio, la comunidad,
los animales o el ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección, pero aplicando
medidas eficaces de tratamiento y prevención, el riesgo de propagación es limitado.
Grupo de nivel de riesgo 3. (Riesgo individual elevado, riesgo comunitario moderado). Grupo de riesgo
constituido por agentes patógenos que pueden provocar enfermedades graves en humanos o en animales,
con bajo riesgo de propagarse en la comunidad. Se aplicará al diagnóstico, investigación y producción en el
cual se trabaja con agentes que pueden causar una enfermedad grave o potencialmente letal,
1
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
principalmente como resultado de la exposición a aerosoles. Puede disponerse o no de medidas eficaces
de tratamiento y de prevención.
Grupo de nivel de riesgo 4. (Riesgo individual y comunitario elevado). Grupo de riesgo constituido por
agentes patógenos que pueden provocar enfermedades graves en las personas o en los animales, con alto
riesgo de propagarse en la comunidad. No suele disponerse de medidas eficaces de tratamiento y
prevención.
A su vez los tipos de actividades u operaciones que se pueden realizar con los microorganismos se definen como:



A: Actividad que no multiplica ni disemina el microorganismo
B: Actividad que multiplica y/o disemina el microorganismo.
C: Trabajo con animales potencialmente infectados.
De la interrelación entre las dos clasificaciones anteriores se establece, para un listado de microorganismos, el nivel
de
bioseguridad
necesario
entre
los
siguientes
cuatro
posibles:
Nivel de bioseguridad 1: Debe contemplar lo siguiente:
1. El trabajo es generalmente realizado sobre mesadas abiertas y se usan técnicas microbiológicas
adecuadas.
2. No se requiere equipamiento de contención ni diseño especial de infraestructura.
3. El personal de laboratorio debe tener capacitación continua y supervisión de un profesional habilitado.
4. El personal debe usar indumentaria de protección adecuada.
Nivel de bioseguridad 2: Debe contemplar lo siguiente:
1. El personal de laboratorio debe tener entrenamiento específico para manipular agentes patógenos y estar
supervisado por un profesional habilitado.
2. El acceso al laboratorio debe estar restringido al personal autorizado.
3. Se deben tomar precauciones extremas con elementos corto punzantes.
4. Las operaciones generadoras de aerosoles potencialmente infecciosos deben ser realizadas con
equipamiento y/o procedimientos de contención física.
5. El personal debe usar indumentaria de protección adecuada.
6.
Nivel de bioseguridad 3: (Laboratorios de contención).
Se debe aplicar al diagnóstico, investigación y producción cuando se trabaja con agentes que puedan causar una
enfermedad grave o potencialmente letal, principalmente como resultado de la exposición a aerosoles.
Debe contemplar lo siguiente:
1. La capacitación debe ser específica.
2. Todos los procesos que involucran manipulación de este nivel de material infeccioso deben ser realizados
en cabinas de seguridad biológica.
3. El personal debe usar indumentaria de protección adecuada y disponer de vestuario "doble" con ducha.
4. El laboratorio debe tener diseño e instalaciones adecuadas para la contención.
5. Es necesario el tratamiento de los efluentes líquidos.
6. Se debe usar filtración absoluta HEPA del aire extraído y presión negativa en el laboratorio.
Nivel de bioseguridad 4: (Laboratorio de máxima contención)
Debe contemplar lo siguiente:
1. El acceso al laboratorio debe ser estrictamente controlado (ingreso y egreso documentados) y debe estar
aislado del resto de las instalaciones.
2. Dentro de las áreas todas las actividades deben estar confinadas a gabinetes de seguridad biológica Clase
3 o gabinetes de seguridad biológica Clase 2 con traje presurizado para el operador.
3. Se debe realizar el tratamiento "in situ" de los efluentes.
4. Se debe usar filtración absoluta doble HEPA del aire extraído, y aplicar presión negativa en el laboratorio.
Cada
nivel
de
bioseguridad
incluye
las
medidas
del
nivel
anterior.
La norma aclara que en el caso que durante una investigación microbiológica se produzca evidencia de la
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presencia de un microorganismo que requiera un nivel de bioseguridad superior al del ámbito donde se
efectúa el trabajo, toda manipulación posterior con dicho microorganismo se realizará únicamente en un
ámbito de nivel de bioseguridad correspondiente o se procederá a su destrucción de acuerdo con las
reglamentaciones legales vigentes.
LAS NORMAS GENERALES SON:
 El acceso al laboratorio estará limitado solo al personal autorizado.
 El personal que trabaje en el laboratorio debe cumplir a cabalidad las normas de bioseguridad.
 Toda área debe estar marcada con la respectiva señal de riesgo biológico y su nivel de contención.
 Al ingresar al laboratorio se debe tener en cuenta el debido porte del guardapolvo de manga larga,
abotonado y limpio, así mismo una vez se ingrese se debe colocar los abrigos libros y demás objetos,
en sitios adecuados para evitar un posible accidente y NUNCA sobre los bancos o mesones.
 Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesión de laboratorio para evitar la
contaminación por corrientes de aire.
 Al inicio y término de una práctica se debe limpiar la superficie de trabajo con una solución
desinfectante.
 El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado, durante el trabajo o el término del mismo.
 Lávese las manos a la hora de entrar y al término de cada sesión de trabajo, secándolos con toallas de
papel.
 El personal con cabello largo deber recogerlo para trabajar dentro del laboratorio. Así como usar todos
los implementos necesarios para la protección según el nivel de riesgo biológico.
 Durante la práctica no se deben guardar ni consumir alimentos y bebidas dentro del laboratorio.
 No se debe aplicar máscara de pestañas, porque deteriora los oculares del microscopio.
 Se debe colocar un calzado adecuado para las practicas en el laboratorio, así como mantener las uñas
cortas, limpias y sin esmalte.
 Hable en tono bajo y evite al máximo el movimiento dentro del laboratorio.
 Emplee los equipos según las instrucciones o los procedimientos operativos estandarizados, al igual
que emplee los protocolos correspondientes a la practica.
 El trasporte de materiales o de muestras entre los laboratorios se realizara de manera tal que en caso
de caídas no se produzca salpicadura.
 Todo personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto con materiales potencialmente
infecciosos sin la debida protección.
 Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente el supervisor de laboratorio.
 Se usaran mascaras faciales si existe el riesgo de salpicaduras o aerosoles.
 Apagar los instrumentos eléctricos antes de manipular las conexiones.
Uso de las pipetas automáticas
Las pipetas automáticas son instrumentos delicados y costosos, que deben cuidarse dado que de ellos depende
gran parte de nuestro trabajo. Dichas pipetas son muy precisas si se las utiliza correctamente. Existen varios tipos
de pipetas y cada marca provee un juego para diferentes rangos de volúmenes. Cada pipeta está rotulada en el
émbolo y posee un color distintivo, para su funcionamiento la mayoría tiene características análogas. A continuación
se ejemplifican dos tipos de pipetas.
Ante la menor duda, consulte antes de usar. Es preferible preguntar lo mismo veinte veces antes que romper
una pipeta.
Juego de pipetas tipo A
Una pipeta rotulada P-20 mide entre 2 l y 20 l.
Una pipeta rotulada P-200 mide entre 20 l y 200 l.
Una pipeta rotulada P-1000 mide entre 200 l y 1.000 l ó 0,2 y 1,0 ml.
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Juego de pipetas tipo B
Una pipeta de botón rojo mide con precisión entre 1 l y 5 l.
Una pipeta de botón verde mide con precisión entre 5 l y 50 l.
Una pipeta de botón marrón mide con precisión entre 50 l y 250 l.
Una pipeta de botón azul mide con precisión entre 200 l y 1.000 l ó 0,2 y 1,0 ml.
Para poder tomar líquido con estas pipetas, deben tener en su extremos las puntas plásticas
descartables (tips), amarillas para P-20 y P-200, y azules para P-1000.
Antes de utilizar la pipeta asegúrese conocer cómo fijar el volúmen. La P-20 mide hasta la
décima de microlitro. En la P-20 los dos números superiores indican el volumen en microlitros,
en tanto que el número inferior es la cantidad fraccional La P-200 y P-1000 miden hasta el microlitro por lo tanto,
el número superior de la P-200 nunca debe superar el 2.
Por ejemplo:
En una p20 equivalen
a 3,8ul
En una p200
equivalen a 38ul
En una p1000
equivalen a 380ul
Recuerde que las micropipetas tienen dos topes, antes de tomar un volumen solamente debe bajar hasta el primero,
y cuando baje el volumen hágalo hasta el primer tope, en caso de que aun quede solución en el tips puede bajar
hasta el segundo tope.
“NUNCA”
1- Nunca forzar la pipeta por encima del volumen indicado por su nombre. No mide más de lo establecido y
descalibrará o romperá la pipeta.
2- Nunca utilice la pipeta para medir un volumen menor a la décima parte de su nombre. No es precisa.
3- Nunca utilice una pipeta sin su punta (tips) amarilla o azul.
4- Nunca utilice la pipeta con soluciones ácidas concentradas. Los vapores pueden oxidar las partes metálicas
interiores de la pipeta.
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Preparación de material
Tips amarillos y azules:
Los tips deben tomarse con la ayuda de una pinza o guante desde la bolsa y ubicarse con la punta hacia abajo en
las cajas respectivas. Una vez que las cajas se han llenado, la misma debe envolverse con papel y rotularse
adecuadamente, indicando fecha, cantidad de veces a autoclavarse, nombre de la persona.
Eppendorf:
Los tubos de 0.5 ml y 1.5 ml deben colocarse en frascos de vidrio perfectamente lavados, como en el caso de los
tips, el material debe tomarse con guantes para evitar la contaminación con restos celulares y/o cualquier tipo de
microorganismo presentes en las manos. Una vez que los frascos están llenos se debe tapar el mismo mediante el
uso de un papel aluminio y luego de un papel. La presencia del papel aluminio, evita el desprendimiento de fibras del
papel que pueden interferir con las reacciones a realizarse posteriormente.
Soluciones:
La preparación de soluciones debe realizarse en el lugar adecuado según las especificaciones de los reactivos a
utilizarse (uso de campanas, flujo, mechero, según su posterior uso).
Soluciones a preparar
Solución P1: glucosa 50 mM, EDTA 10 mM ,Tris.HCl 25 mM, pH 8,0.
Solución P2: 0,2 N de NaOH y 1% de SDS (preparada en el momento mediante la mezcla de cantidades iguales de
solución 0,4 N de NaOH y 2 % de SDS.
Solución P3: Solución Acetato de Potasio- Acido Acético pH 4,8. (Concentración final 5M Acetato, 3M Potasio).
BIBLIOGRAFIA
 http://www.mografias.com/trabajos13/manubio.shtml
 http://capra.iespana.es/capra/bioseguradad/bioseguridad.html
 http://www.qb.fcen.uba.ar/microinumo/higieneyseguridad.htm
 Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico panamericana, 110 - 111.
 Norma IRAM 80059. Publicación del Instituto Argentino de Normalización. Buenos Aires. 1º de setiembre
de 2000.
 Dáttilo, Beatriz. Bioseguridad. Boletín IRAM. Instituto Argentino de Normalización. Año 6. Nº 50. 19. Agosto
de 2000.
 Manual de bioseguridad en el laboratorio. Segunda edición. OMS. Ginebra. 1-4. 1994.
 Manual de bioseguridad en el laboratorio. Segunda edición. OMS. Ginebra. 85-89. 1994.
 Desarrollo y fortalecimiento de los Sistemas Locales de Salud. Temas de discusión. OPS/OMS. USA.. 125134. 1993.
 Doval, Hernán; Micucci, Horacio; Stein, Enrique. Salud: Crisis del sistema. Propuestas desde la medicina
social. Editorial Ágora. Bs. As. 110-111. 1992.
 Munitis, María Constanza y Micucci, Horacio Alejandro. Sugerencias para una legislación especial para
pequeños generadores de residuos de establecimientos de salud. Acta Bioquím. Clín. Latinoam., Vol.
XXXIV, Nº2, 212. 2000.
 Ambrosio, Ana María; Riera, Laura; Calderón, Gladis y Micucci, Horacio Alejandro. Procedimientos de
seguridad en el manejo de material biológico. INEVH - FBA. Acta Bioquím. Clín. Latinoam., Suplemento Nº
1, 61-64, 2001.
 Norma IRAM 80059. Publicación del Instituto Argentino de Normalización. Buenos Aires. 9-23. 1º de
setiembre de 2000.
 Para repasar cómo debe utilizar una pipeta automática le recomendamos visitar el siguiente sitio Web
http://www.fhcrc.org/education/hutchlab/lessons/use.html#
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