Análisis de dos QTL epistáticos en el cromosoma 12

ANÁLISIS DE DOS QTL EPISTÁTICOS EN EL CROMOSOMA 12 PORCINO PARA EL
CARÁCTER TAMAÑO DE CAMADA
Fernández-Rodríguez, A.1, Rodríguez, M.C., Noguera, J.L., Balcells, I., Óvilo, C. y
Fernández, A.I.
1
Dpto.Mejora Genética Animal, INIA, 28040 Madrid. E-mail: [email protected]
INTRODUCCIÓN
Varios estudios de detección de QTL para los caracteres número de lechones nacidos
totales (NT) y nacidos vivos (NV) han mostrado resultados significativos en regiones
cromosómicas de SSC 7, 12, 14, 17 y SSC 7, 11, 16 y 18, respectivamente (Tribout et al.,
2008). Además, varios genes candidato relacionados con este tipo de caracteres han sido
analizados hasta el momento, como son el receptor de estrógenos 1 (ESR1) y la proteína de
unión al retinol (RBP4), en los que se han detectado polimorfismos asociados con el
carácter NV (Tribout et al., 2008).
En un estudio llevado a cabo en un cruce experimental tipo F2 Ibérico x Meishan, se ha
mostrado la complejidad de estos caracteres detectando varios QTL y múltiples
interacciones epistáticas entre ellos en los cromosomas porcinos 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13,
14, 15 y 18 (Noguera et al., 2009). Entre los resultados más relevantes, se han detectado
dos QTL epistáticos en el cromosoma 12 para NV y NT. El objetivo de este trabajo ha sido
confirmar estos dos QTL epistáticos mediante la incorporación de nuevos marcadores y
analizar dos genes previamente seleccionados como candidatos posicionales y biológicos
(SLC9A3R1 y NOS2a) (Fernández et al., 2007).
MATERIAL Y MÉTODOS
El material animal utilizado en este trabajo corresponde al mismo cruce experimental F2
Ibérico x Meishan (Rodríguez et al., 2006). El registro de caracteres reproductivos se realizó
en 255 cerdas de la F2, obteniendo un total de 865 partos con registros para NV y 881 para
NT, datos recopilados durante cuatro partos sucesivos. En el quinto parto las cerdas fueron
sacrificadas a los 30 días de gestación y se tomaron muestras de tejido ovárico.
Se genotiparon 12 marcadores en todo el cruce: 7 microsatélites (SW2490, SW2494,
SW1307, SW874, SW1956, S0106 y SWR1021) usados previamente por Noguera y col.
(2009), 3 nuevos microsatélites (SWR1802, S0090 y SW1962), y dos marcadores PCRRFLP (GH (Hha I) y FASN (Msp I)) (Rodríguez et al., 2006). El mapa de ligamiento se
construyó utilizando el programa CRI-MAP versión 2.4 (Green et al., 1990).
La caracterización de los genes SLC9A3R1 y NOS2a se ha abordado a partir de ARNm. Las
muestras de ovario almacenadas a -80ºC se procesaron con el kit RiboPure TM para la
extracción de ARN total. La síntesis de ADNc se llevó a cabo mediante retrotranscripción
inversa (SuperscriptTM II Reverse Transcriptase). Se caracterizaron 1970 pb del ADNc
SLC9A3R1 porcino y 3948pb del NOS2a, incluyendo las regiones 3´ y 5´ UTR, y se realizó
una búsqueda de polimorfismos mediante secuenciación.
Análisis estadísticos: Se realizó un análisis de detección de QTL para los caracteres NV y
NT, incluyendo como efectos fijos el año-estación, el ordinal de parto, el efecto poligénico
aleatorio y el efecto ambiental permanente, además de los efectos aditivo y dominante del
QTL. Para analizar la epistasia se incluyeron los efectos de la interacción. Los umbrales de
significación cromosómicos se calcularon al 0.1, 1 y 5%. El estudio de asociación de ambos
genes candidato con los caracteres de prolificidad se realizó mediante un modelo animal
estándar y un test de asociación asistida por marcadores (MAAT). En ambos se incluyó el
efecto de sustitución alélica de cada SNP, y los efectos fijos anteriormente nombrados.
Además, en el MAAT se incluyeron los efectos aditivo y dominante del QTL. Por último se
testó la interacción entre los polimorfismos de mayor significación. Todos los análisis
estadísticos se llevaron a cabo con el programa QxPak v.3 (Pérez-Enciso y Misztal, 2004).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El mapa de ligamiento obtenido resultó: FASN- 0.9 - SW2490 - 10.4 - SW2494 - 29.4 - GH 3.4 - SW1307 - 16.7 - SW874 - 8.5 - SWR1802 - 3.1 - S0090 - 2.0 - SW1956 - 5.0 - SW1962
- 8.8 - S0106 - 15.5 - SWR1021, concordante con mapas públicos disponibles.
La detección de QTL con estos 12 marcadores reveló la presencia de dos QTL sugestivos
en SSC12 para NV y NT que se tornaron significativos cuando se testó la interacción
epistática (QTL1 a 15cM y QTL2 a 97cM), siendo aditivo x aditivo la interacción más
significativa (p<0.0005 para NV y p<0.0006 para NT). Estos resultados confirman lo
detectado previamente por Noguera et al. (2009) pero con un mayor poder estadístico y
significación debido a la incorporación de 5 nuevos marcadores.
En un trabajo previo se seleccionaron por su posición, el gen SLC9A3R1 (7.4cM) para el
QTL1 y el NOS2a (94.2) para el QTL2, de entre una propuesta inicial de cinco genes
candidato posicionales y biológicos. SLC9A3R1 interviene en la respuesta primaria a
estrógenos (Tracy et al., 2002), mientras que NOS2a codifica para una óxido nítrico sintasa
inducible que está implicada en la regresión de los tejidos reproductivos en mamíferos (Yong
et al., 2004). Mutaciones en ambos genes han sido relacionadas con disminución del
tamaño de camada en ratones (Senolikar et al., 2002; Burnett et al., 2002). Además se ha
descrito una interacción entre las proteínas codificadas por ambos genes necesaria para la
correcta localización celular del NOS2a (Glynne et al., 2002).
En el presente trabajo llevamos a cabo la caracterización completa del ADNc de ambos
genes. Por comparación de secuencias entre 10 individuos de la F2 detectamos un total de 9
polimorfismos en SLC9A3R1 y 14 en NOS2a. Para seleccionar los polimorfismos más
interesantes a genotipar analizamos su importancia biológica. Un total de 6 polimorfismos
fueron genotipados: 3 SNPs (c.662A>G, c.1791A>C, c.2192C>T) y una duplicación
c.3556_3571 dup CTGTATTTACCTGAC en NOS2a y 2 SNPs en SLC9A3R1 (c.839A>G y
c.1359A>G). El SNP c.2192C>T y la duplicación cosegregaron en el cruce.
Los resultados significativos del modelo animal estándar para los dos genes con los
caracteres NV y NT figuran en la Tabla 1. Para NV, los 3 polimorfismos de NOS2a tuvieron
efectos aditivos significativos sobre el carácter, mientras que para SLC9A3R1 sólo el SNP
c.1359A>G mostró efectos significativos. En el caso del carácter NT sólo los SNPs
SLC9A3R1 c.1359A>G y NOS2a c.2192C>T, presentaron efectos significativos.
Con el objetivo de reducir el riesgo de falsos positivos que se produce en cruces F2, debido
al desequilibrio de ligamiento, se llevó a cabo un MAAT en el que se incluyeron los efectos
del QTL y del gen candidato (Tabla 2). Para ello, se ha seleccionado de cada gen el
polimorfismo que mostró mayor significación estadística con el modelo animal estándar:
SLC9A3R1 c.1359A>G y NOS2a c.2192C>T. En primer lugar se incluyó el efecto de los
QTL1 y 2 en el modelo para testar el efecto de los polimorfismos. Los resultados fueron
similares a los del modelo animal, excepto para SLC9A3R1 c.1359A>G donde el efecto
sobre NV no fue significativo (p=0.051). Posteriormente se incluyeron los efectos de los dos
SNPs en el modelo, con el fin de testar cada uno de los QTL para los dos caracteres.
Cuando SLC9A3R1 c.1359A>G fue incluido, el QTL1 para NT desapareció. En el caso del
carácter NV, la significación del QTL1 disminuyó de forma menos acusada, en concordancia
con el resultado anterior. En el caso de NOS2a, cuando se incluyó el efecto del SNP
c.2192C>T en el modelo, la significación del QTL2 para ambos caracteres desapareció
completamente. Dado que ambos QTL son significativos únicamente cuando se contempla
epistasia en el modelo, se analizó la interacción entre ambos SNPs, sin ser ésta
significativa. Estos resultados nos indican que el efecto de la interacción de los dos
polimorfismos no es subyacente al efecto epistático de los QTL.
La duplicación de 15pb del 3´UTR de NOS2a que cosegrega con el SNP c.2192C>T parece
constituir parte de una diana para microRNA, además esta región del gen incluye varios
elementos ricos en AU (AREs), regiones que intervienen en la regulación postranscripcional
mediante la unión de ribonucleoproteínas nucleares. Estas potenciales explicaciones de
causalidad junto con los resultados aportados por el MAAT parecen mostrar a NOS2a
c.3556_3571 dup CTGTATTTACCTGAC como una probable mutación causal, aunque
análisis funcionales de esta mutación serían necesarios para confirmar esta causalidad.
Tabla 1. Resultados significativos del análisis de asociación con el modelo animal estándar.
NV
NT
Gen
SNP
p Nominal
a (SE)
d (SE) p Nominal
a (SE)
d (SE)
SLC9A3R1 c.1359A>G
0,042
0,55 (0,22) 0,45 (0,28)
0,031
0,58 (0,23) 0,47 (0,29)
0,022
0,56 (0,24)
c.662A>G
NOS2a c.1791A>C
0,041 - 0,37 (0,18)
c.2192C>T*
0,016 - 0,43 (0,18)
0,018
- 0,42 (0,18)
Tabla 2. Resultados del MAAT con los polimorfismos de mayor significación.
Gen
SNP
Carácter
SLC9A3R1 c.1359A>G
NV
NT
NOS2a c.2192C>T*
NV
NT
QTL
cM P nominal
78
0,056
78
0,047
14
0.016
0
0.044
QTLa (SE)
0,36 (0,19)
0,38 (0,19)
0.45 (0.18)
0.37 (0.19)
SNP
P nominal
a (SE)
d (SE)
0,051
0,53 (0,22) 0,44 (0,28)
0,035
0,57 (0,23) 0,46 (0,29)
0.012
-0.31 (0.18)
0.023
-0.41 (0.18)
* Formando haplotipo con la duplicación de 15pb del NOS2a 3´UTR.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Burnett, T.G., Tash, J.S. & Hunt, J.S., Reprod. 2002. 124:49-57. • Ediger, T.R., Park, S. &
Katzenellenbogen B.S. 2002. Mol Endocrinol 16:1828-1839. • Fernández, A., Fernández,
A.I., Rodríguez, C., Tomas, A., Estellé, J., Noguera, J.L. & Óvilo, C. 2007. ITEA Vol 28, II •
Glynne, P., Darling, K., Picot, J. & Evans, T. 2002. J. of Biol Chem 36:33132-33138. •Green,
P.l., Falls, K. & Crooks, S. 1990. Washington University. • Noguera, J.L., Rodríguez, M.C.,
Varona, L., Tomás, A., Muñoz, G., Ramírez, O., Barragán, C., Arqué, M., Bidanel, J.P.,
Amills, M., Óvilo, C. & Sánchez, A. 2009 (enviado a Genetics). • Pérez-Enciso, M. & Misztal,
I. 2004. Bioinformatics, 20:2792-8. • Rodríguez, M.C., Tomas, A., Alves, E., Ramirez, O.,
Arqué, M., Muñoz, G., Barragán, C., Varona, L., Silió, L., Amills, M. & Noguera, J.L. 2006.
Anim Genet 36, 490-496. • Tao, Y., Fu, Z., Zhang, M., Xia, G., Yang, J. & Xie, H. 2004. Mol
Cell Endocrinol 222:93-103. • Tribout, T., Lannuccelli, N., Druet, T., Gilbert, H., Riquet, J.,
Gueblez, R., Mercat, M.J., Bidanel, J.P., Milan, D. & Le Roy, P. 2008. Genet. Sel. Evol.
40:61-78. • Shenolikar, S., Voltz, J.W., Minkoff, C.M., Wade, J.B. & Weinman, E.J. 2002.
Proc Natl Acad Sci USA 99:11470-5
Agradecimientos: Este trabajo ha sido realizado en el marco del proyecto AGL2004-08368.
Amanda Fernandez-Rodríguez disfruta de una beca INIA.
DETECTION AND ANALYSIS OF TWO EPISTATIC QUANTITATIVE TRAIT LOCI ON
SSC12 AFFECTING LITTER SIZE IN PIGS
ABSTRACT: The aim of the present study was to confirm the previously detected epistatic
QTL on SSC12 for total number of piglets born (TNB) and number of piglets born alive (NBA)
in a Meishan x Iberian F2 intercross. A chromosome scan with 12 markers allowed us to
confirm the two epistatic QTL (QTL1 at 15cM and QTL2 at 97cM). Besides, SLC9A3R1 and
NOS2a were analysed as biological and positional candidate genes underlying these QTL.
Both cDNAs were characterized and 23 polymorphisms were identified in the F2. Five
polymorphisms were tested: two in SLC9A3R1 for QTL1 and four in NOS2a for QTL2. Only
SLC9A3R1c.1359A>G reported significant effects on TNB and NBA, while the three SNPs of
NOS2a showed significant additive effects on both traits. Marker assisted association test
performed with the most significant SNPs (SLC9A3R1 c.1359A>G and NOS2a c.2192C>T)
reported significant results for both SNPs; however the interaction between them was not
significant. Despite of the negative result of the interaction, statistical and biological
evidences show NOS2a c.3556_3571dupCTGTATTTACCTGAC, cosegregating with
c.2192C>T, as a likely causal mutation of the epistatic effect.
Keywords: epistatic effect, litter size, SLC9A3R1, NOS2a