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RESOLUCIÓN OIV/OENO 382D/2010
ACTUALIZACIÓN DEL COMPENDIO DE MÉTODOS INTERNACIONALES DE ANÁLISIS DE
LAS BEBIDAS ESPIRITUOSAS DE ORIGEN VITIVINÍCOLA – Determinación de los
compuestos α- dicarbonílicos de bebidas espirituosas de origen vitivinícola por
cromatografía en fase gaseosa tras derivatización con 1,2-diaminobenceno.
LA ASAMBLEA GENERAL
VISTO el artículo 2 apartado 2b iv del acuerdo del 3 de abril de 2001 relativo a la
creación de la Organización Internacional de la Viña y el Vino.
VISTAS las acciones del plan estratégico de la OIV 2009-2012, en particular aquélla
dirigida a reorganizar las publicaciones relativas a los métodos de análisis vitivinícolas.
CONSIDERANDO los trabajos de la Subcomisión de Métodos de Análisis.
VISTO el «Compendio de métodos internacionales de análisis de las bebidas espirituosas
de origen vitivinícola» adoptado en 2009
DECIDE introducir dentro del«Compendio de métodos internacionales de análisis de las
bebidas espirituosas de origen vitivinícola» el método siguiente.
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Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
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DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS α-DICARBONÍLICOS DE BEBIDAS
ESPIRITUOSAS DE ORIGEN VITIVINÍCOLA POR CROMATOGRAFÍA EN FASE
GASEOSA TRAS DERIVATIZACIÓN CON 1,2-DIAMINOBENCENO
Método de tipo IV
1. Introducción
Los principales compuestos α-dicarbonílicos de los aguardientes de vino (Figura 1) son:
glioxal, metilglioxal, diacetilo y pentano-2,3-diona.
Glioxal: OCH−CHO (etanodial)
Metilglioxal: CH3−CO−CHO (2-oxopropanal)
Diacetilo: CH3−CO−CO−CH3 (butano-2,3-diona)
Pentano-2,3-diona: CH3−CH2−CO−CO−CH3
Hexano-2,3-diona: CH3−CH2−CH2−CO−CO−CH3
Figura 1. Los principales compuestos α-dicarbonílicos de los aguardientes de vino, (la
hexano-2,3-diona no está naturalmente presente pero se utiliza como patrón interno).
Los compuestos dicarbonílicos son importantes debido a su impacto sensorial.
2. Ámbito de aplicación
Este método se aplica a las bebidas espirituosas de origen vitivinícola para contenidos de
compuestos carbonilados comprendidos entre 0,05 mg/l y 20 mg/l.
3. Principio
El método se basa en la formación de derivados de tipo quinoxalina a partir de compuestos αdicarbonílicos con el 1,2-diaminobenceno (figura 2).
R
NH2
O C
N
R
N
R
+
NH2
O C
R
1,2-Diaminobenceno Dicarbonilo
Quinoxalina
Figura 2. Formación de los derivados.
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La reacción se produce en la bebida espirituosa diluida 1:4, a pH 8 y tras una duración de
reacción de 3 h a 60 °C. El análisis de los derivados se efectúa tras su extracción con
diclorometano por cromatografía en fase gaseosa, con una detección por espectrometría de
masas (GC-MS) o mediante un detector específico de los compuestos nitrogenados.
4. Reactivos y productos
4.1 Compuestos dicarbonílicos
4.1.1 Glioxal (n° CAS 107-22-3) en solución al 40 %
4.1.2 Metilglioxal (n° CAS 78-98-8) en solución al 40 %
4.1.3 Diacetilo (n° CAS 431-03-8) de pureza > 99 %
4.1.4 Pentano-2,3-diona (n° CAS 600-14-6) de pureza > 97 %
4.1.5 Hexano-2,3-diona (n° CAS 3848-24-6) de pureza > 90 %
4.2 1,2-Diaminobenceno (n° CAS 95-54-5) en polvo, de pureza > 97 %
4.3 Agua para HPLC (según la norma EN ISO 3696)
4.4 Etanol (n° CAS 64-17-5) puro para HPLC
4.5 Hidróxido de sodio (n° CAS 1310-73-2) en solución 0,1 M.
4.6 Ácido sulfúrico (n° CAS 7664-93-9) en solución 0,2 M
4.7 Diclorometano (n° CAS 75-09-2).
4.8 Sulfato de sodio anhidro (n° CAS 7757-82-6).
4.9 Solución hidroalcohólica al 50 % vol.
Mezclar 50 ml de etanol puro para HPLC (4.4) con 50 ml de agua (4.3)
4.10 Solución de patrón interno hexano-2,3-diona a 2,0 g/1
Colocar 40 mg de hexano-2,3-diona (4.2) en un vial de 30 ml, diluir en 20 ml de
solución hidroalcohólica al 50 % vol (4.9) y agitar hasta que se disuelva
completamente.
5. Instrumental
5.1 Cromatografía en fase gaseosa con detección por espectrometría de masas (GC-MS) o por
medio de un detector específico de los compuestos nitrogenados.
5.1.1 Columna analítica capilar de polietilen-glicol medianamente polar (C 20M, BP21… )
con las características siguientes (a título de ejemplo) 50 m x 0,32 mm x 0,25 µm.
5.1.2. Sistema de adquisición de datos
5.2 Equipo de medición del pH
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5.3 Agitador magnético
5.4 Balanza de precisión de 0,1 mg.
5.5 Horno capaz de ser ajustado a 60 °C
5.6 Material de vidrio de laboratorio, como por ejemplo: pipetas, viales con tapón de rosca de
30 ml y microjeringas.
6. Preparación de la muestra
Diluya la bebida espirituosa a 1:4 en agua (4.3)
7. Modo operatorio
Colocar 10 ml de bebida espirituosa diluída a 1:4 (6) en un vial de 30 ml (5.6)
Ajustar a pH 8 mediante agitación, con hidróxido de sodio 0,1 M (4.5)
Añadir 5 mg de 1,2-diaminobenceno (4.2)
Añadir 10 µl de hexano-2,3-diona (patrón interno) a 2,0 g/1 (4.10).
Cerrar el vial mediante un tapón de rosca provisto de una junta de teflón
Agitar hasta disolución completa del reactivo (5.3)
Colocar en el horno a 60 °C durante 3 h. (5.5)
Enfríar.
7.1 Análisis
7.1.1 Extracción de las quinoxalinas
- El medio de reacción, preparado en 7, se lleva a pH 2 mediante H2SO4 2M (4.6);
- Extraer dos veces utilizando 5 ml de diclorometano (4.7) mediante agitación magnética
durante 5 minutos;
- Decantarla fase inferior cada vez;
- Mezclar las dos fases de disolvente;
- Secar sobre 1 g aproximadamente de sulfato de sodio anhidro (4.8);
- Decantar.
7.1.2 Análisis cromatográfico (dado a título de ejemplo)
- Detección. Para el análisis por GC-MS se ha acoplado un cromatógrafo en fase gaseosa
Hewlett Packard HP 5890 a una chemstation y un espectrómetro de masas HP 5970 (impacto
electrónico 70eV, 2,7 kV),
Nota: puede utilizarse un detector específico de los compuestos nitrogenados
- Columna. La columna es una BP21 (SGE, 50 m x 0,32 mm x 0,25 µm).
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- Temperaturas. Las temperatura del inyector y del detector son, respectivamente, de 250 °C y
280 C; la del horno se mantiene a 60 °C durante 1min, y seguidamente se programa a razón
de 2 C/min hasta alcanzar los 220 C, y la isoterma final dura 20 min.
- Inyección. El volumen inyectado es de 2 µl y el tiempo de cierre de las válvulas del inyector
(splitless) es de 30 s.
7.1.3 Análisis de las quinoxalinas formadas
- Separación. El cromatograma de los derivatizados con 1,2-diaminobenceno de una bebida
espirituosa según el método de selección de iones (SIM) aparece en la Figura 3.
- Identificación de los picos. La utilización de la GC-MS ha permitido identificar los
compuestos dicarbonílicos derivatizados de un aguardiente de vino utilizando el método de la
corriente iónica total (scan), que permite obtener los espectros de masas de los derivados
quinoxalínicos y compararlos con los memorizados en la biblioteca de espectros; además, se
han comparado los tiempos de retención con los de los compuestos puros tratados del mismo
modo. La tabla 1 muestra los iones principales de los espectros de masas de los compuestos
dicarbonílicos derivatizados obtenidos.
- Dosificación. La determinación cuantitativa de los compuestos dicarbonílicos se efectúa con
el modo SIM, seleccionando iones M / Z = 76, 77, 103, 117, 130, 144, 158 y 171. Los iones
M/Z = 76 y 77 se utilizan para la cuantificación y los otros como caracterizadores, esto es,
glioxal: iones M/Z =103 y 130, metilglioxal: iones M/Z =117 y 144, diacetilo: iones M/Z =
117 y 158, pentano-2,3-diona: iones M/Z = 171 y hexano-2,3-diona: iones M/Z = 158 y 171.
7.1.4 Características del método
Ciertos elementos de validación interna han sido determinados pero no se trata de una
validación formal según el protocolo para la planificación , la realización y la interpretación
de los estudios de rendimiento de los métodos de análisis (OIV 6/2000)
- Repetibilidad . La repetibilidad del método mediante GC-MS-SIM muestra coeficientes de
variación comprendidos entre 2% y 5% para los cuatro compuestos dicarbonílicos.
- Tasa de recuperación. Las cantidades adicionadas a un aguardiente de vino se han
recuperado con una tasa de recuperación superior al 94 %.
- Linealidad. Se han obtenido correlaciones lineales en rangos de concentración
comprendidos entre 0,05 y 20 mg/l.
- Límite de detección. El límite de detección de la mayoría de los productos dicarbonílicos
derivatizados es de 0,05 mg/l.
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Tabla 1. Espectros de masas (ión m/z (intensidad del ión molecular respecto a la del pico de
base) de los derivados de compuestos dicarbonílicos por 1,2-diaminobenceno
Compuesto
dicarbonilado
Derivado
Espectro de masas (principales
iones y abundancia)
Glioxal
Quinoxalina
130 (100), 103 (56.2), 76 (46.8), 50
(20.2), 75 (10.4), 131 (9.4)
Metilglioxal
2-Metilquinoxalina
144 (100), 117 (77.8), 76 (40.5), 77
(23.3),50 (21.9), 75 (11.3), 145
(10.3)
Diacetilo
2,3-Dimetilquinoxalina
117 (100), 158 (75.6), 76 (32.3), 77
(23.1), 50 (18.3), 75 (10.4)
Pentano-2,3-diona
2-Etil-3-metilquinoxalina
171 (100), 172 (98), 130 (34.1), 75
(33.3), 77 (21), 50 (19.4), 144 (19),
143 (14.1), 103 (14)
Hexano-2,3-diona
2,3-Dietilquinoxalina
158 (100), 171 (20.1), 76 (13.7), 77
(12.8), 159 (11.4), 157 (10.8), 50
(8.1) 106
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Abundance
5
Colonne polaire
3200
3000
1
2800
2600
2400
2200
2
2000
1800
1600
3
1400
1200
1000
800
600
4
400
52.00
54.00
56.00
58.00
60.00
62.00
64.00
66.00
68.00
Time-->
Figura 3. Cromatograma en fase gaseosa del extracto de los compuestos dicarbonílicos
derivados por 1,2-diaminobenceno de un aguardiente de vino, detectados por espectrometría
de masas seleccionando los iones m/z =76, 77, 103, 117, 130, 131, 144, 158, 160 y 171.
Columna BP21, 50m -X 0,32mm 0,25 µm. Temperatura de horno 60 °C durante 1 min, y
seguidamente programación a 2 °C/min hasta 220 °C. Temperatura del inyector: 250 °C.
1. glioxal; 2. metilglioxal; 3. diacetilo; 4. pentano-2,3-diona; 5. hexano-2,3-diona (patrón
interno); 6. fenilglioxal (no estudiado en este método).
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Bibliografía
Bartowski E.J.y Henschke P.A. The buttery attribute of wine – diacetyl – desirability spoilage
and beyond. Int. j.food microbial. 96 : 235-252 (2004).
Bednarski W, Jedrychowski L, Hammond E y Nikolov L, A method for determination of dicarbonyl compounds. J Dairy Sci 72:2474-2477 (1989).
Leppannen O, Ronkainen P, Koivisto T y Denslow J, A semiautomatic method for the gas
chromatographic determination of vicinal diketones in alcoholic beverages. J Inst Brew
85:278- 281 (1979).
Martineau B, Acree TE y Henick-Kling T, Effect of wine type on the detection threshold for
diacetyl. Food Res Int 28:139-143 (1995).
Moree-Testa P y Saint-Jalm Y, Determination of -dicarbonyl compounds in cigarette smoke.
J Chromatogr 217:197-208 (1981).
de Revel G Pripis-Nicolau L. Barbe J.-C; y Bertrand A, The detection of α-dicarbonyl
compounds in wine:by ,formation of quinoxaline derivatives. J Sci. Food Agric.80:102-108
(2000).
de Revel G y Bertrand A, Dicarbonyl compounds and their reduction products in wine.
Identi®cation of wine aldehydes. Proc 7th Weurman Flavour Research Symp, Zeist, June, pp
353-361 (1994).
de Revel G y Bertrand A, A method for the detection of carbonyl compounds in wine: glyoxal
and methylglyoxal. J Sci. Food Agric 61:267-272 (1993).
Voulgaropoulos A, Soilis T y Andricopoulos N, Fluorimetric determination of diacetyl in
wines after condensation with 3,4-diaminoanisole. Am J Enol Vitic 42:73-75 (1991).
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