INFORME TECNICO FINAL DEL PROYECTO Título: Métodos alternativos para el control de la garrapata (Boophilus microplus) en el trópico mexicano (clave 31-2007-0552) Responsable: Roger Iván Rodríguez Vivas. RFC: ROVR660622-1E2 Institución: Universidad Zootecnia Autónoma de Yucatán. Facultad de Medicina Veterinaria y Colaboradores: Rocio Borgez Argaez, CICY Zeferino García Vázquez, INIFAP Alberto Rosado Aguilar, UADY Armando Aguilar Caballero, UADY Martha Elena Méndez González, CICY Edelmira Galindo Velasco, UAC Fecha de Inicio: 1/02/08 (DÍA / MES / AÑO) (DÍA / MES / AÑO) Fecha de Termino: 30/11/09 Período que abarca el presente informe: Fuente(s) de Financiamiento: FUNDACIÓN PRODUCE YUCATÁN, A.C.--------------------------------$ 190,000 1 2. INFORME FINANCIERO: Asignado Radicado Saldo Ejercido $190,000 $ $ 3. INFORME FÍSICO (SEÑALAR EL GRADO DE AVANCE EN EL CUMPLIMIENTO DE CADA UNO DE LOS OBJETIVOS Y METAS PLANTEADAS EN EL PROTOCOLO). Se logró el 100% de los objetivos y metas planteadas. A continuación se describen: Objetivo y Meta % de cumplimiento Objetivo: Evaluar in vitro la actividad ixodicida de 15 extractos 100% de especies vegetales contra garrapatas Boophilus microplus en las fases de larvas y adultas. Meta: Identificar plantas con poder ixodicida 100% Objetivo: Evaluar el efecto entomopatógeno de tres cepas del 100% hongo M. anisopliae para el control de larvas y garrapatas adultas de B. microplus. Meta: Identificar la cepa de M. anisopliae con mejor eficacia 100% para controlar fases de larvas y adultas de B. microplus. Objetivo: Determinar la naturaleza de la fracción activa 100% ixodicida de dos extractos de especies vegetales (se planeó el inició de esta actividad en el segundo semestre y finalizará en el tercer semestre en la segunda fase del proyecto). Meta: Conocer la naturaleza de la fracción activa ixodicida de 100% dos extractos de especies vegetales 4. ACTIVIDADES REALIZADAS DURANTE LA FASE 1 DEL PROYECTO (DETALLADAS): (De Mayo a Febrero) 4.1. Evaluación in vitro de plantas con poder ixodicida. De Febrero a Abril de 2008 se realizaron 5 salidas de campo y se colectaron 500 garrapatas adultas de B. microplus y fueron incubadas obteniéndose 2 1,000,000 larvas aproximadamente. Las larvas fueron utilizadas para realizar 50 bioensayos con diferentes disolventes con el propósito de seleccionar el mejor (en disolución del extracto, inocuidad en larvas y seguridad para el técnico) para las pruebas definitivas. A partir de este estudio se seleccionó al Tween 20. Esta es una propuesta innovadora, siendo esta la primera vez que se utiliza para la disolución de extractos de plantas en bioensayos con garrapatas B. microplus. A su vez se estandarizó la técnica de bioensayo a utilizar. De Abril a Julio se realizaron 10 salidas de campo y se colectaron 1200 garrapatas adultas que fueron incubadas obteniéndose 2,500000 larvas aproximadamente. También se colectaron 15 plantas con ayuda de etnobotánicos para la identificación de la especie. De cada planta se colectó 2000 g aproximadamente y se llevaron al Centro de investigaciones Científicas de Yucatán. Posteriormente se procedió a separar las estructuras de cada planta (hoja, tallo y raíz), se secaron en estufas a 40 ºC por tres días y se molieron en un molino mecánico. Una vez molidas se sometieron en frascos con metanol por 48 hrs y se procedió a la concentración de 45 extractos. Ya obtenidos los extractos de las 15 plantas, se realizaron 450 bioensayos contra larvas de garrapatas B, microplus a concentración del 10 %. De las 15 plantas evaluadas se obtuvieron 9 plantas con eficacia >80%. Con base en los resultados de eficacia con hoja, fueron seleccionadas las tres plantas con mayor eficacia (Petiveria alliacea, Havardia albicans y Caesalpinha gaumeri), las cuales fueron evaluadas nuevamente mediante bioensayos (120 bioensayos más) a diferentes concentraciones contra garrapatas B. microplus en las fases de larvas (20%, 10%, 5% y 2.5%) y adultas (20% y 10%). Para ello se tuvieron que realizar 5 salidas más a campo para colectar 600 garrapatas adultas que fueron incubadas obteniéndose 1,500,000 larvas aproximadamente. A su vez también se realizaron mas colectas de Petiveria alliacea, ya que no se contaba con suficiente material vegetal para llevar a cabo los estudios in vivo con bovinos infestados con garrapatas B. microplus (programados para el segundo año del proyecto). Del 30 de Junio al 30 de Agosto de 2008 el M. en C. Alberto Rosado Aguilar asistió a seis módulos de capacitación y actualización en la ciencia de animales de laboratorio impartidos por expertos del Laboratorio de Ensayos Biológicos (LEBi) y de la Asociación Centroamericana, del Caribe y Mexicana de la Ciencia de los Animales de Laboratorio (ACCMAL) en la Universidad de Costa Rica. El primer módulo cursado y aprobado se título: Introducción a la ciencia de animales de experimentación. En este módulo se conoció a las especies animales, razas y líneas que son utilizados para pruebas experimentales con fármacos o productos naturales. El segundo módulo cursado y aprobado se título: Biología de los animales de laboratorio. En este modulo se aprendió y reforzó conocimientos sobre anatomía y fisiología de los animales utilizados para experimentación con fármacos o productos naturales. El tercer módulo cursado y aprobado se título: Manejo de animales de laboratorio. En este módulo se aprendió y práctico las diferentes técnicas de manejo y mantenimiento de animales en bioterios. El cuarto módulo cursado y aprobado se título: Vías de administración de muestras. En este módulo se aprendió y practicó las diferentes técnicas utilizadas para la administración de fármacos y 3 productos naturales por vía intravenosa, intramuscular, oral, subcutánea, intradérmica y tópica en animales de laboratorio. El quinto módulo cursado y aprobado se tituló: Técnicas especiales, donde se conoció y practicó las diferentes técnicas toxicológicas (irritabilidad dérmica, toxicidad oral aguda, sensibilidad, inhalación, irritabilidad ocular y toxicidad dérmica) utilizadas por la EPA (Environmetal Protection Agency) de Estados Unidos para evaluar fármacos y productos naturales en animales de laboratorio. El sexto modulo se titula: Proyecto de investigación con biomodelos. En este módulo se realizó un protocolo para evaluar la toxicidad de las plantas a utilizar en la fase in vivo de la tesis de doctorado. Además durante estos meses de estancia en la Universidad de Costa Rica se realizó un trabajo de toxicidad con las 9 plantas que tuvieron eficacia >80% contra larvas de B. microplus teniendo como objetivo evaluar la toxicidad en animales de laboratorio de extractos metanólicos de las hojas Petiveria alliacea, hojas de Havardia albicans, Caesalpinha gaumeri y Capraria biflora; tallos de Solanum tridinamum y Solanum eriantum; corteza de Bursera simarouba y Cassearia corymbosa; y la raíz de Ocimum micrantum. En este periodo se realizaron 32 bioensayos de toxicidad (Cuadro 1) utilizando las técnicas toxicológicas según la EPA (Environmental Protection Agency) de Estados Unidos. Doce bioensayos de irritabilidad dérmica, 10 de toxicidad oral aguda, 7 irritabilidad ocular y 3 de toxicidad dérmica. Para la realización de los bioensayos se requirieron de 117 animales de laboratorio (albinos) que fueron: 30 conejos, 72 ratas y 15 ratones de la raza Nueva Zelanda y las Líneas Wistar y Swiss respectivamente. A todos los animales diariamente se les proveía agua, alimento y se procuraba mantener limpias las jaulas y el área donde estaban los animales. Una vez realizados los bioensayos se procedía todos los días a la observación de los animales y se anotaba los datos en una bitácora. El periodo de observación dependió de la técnica utilizada e iba de 3 hasta 14 días. Posterior a la observación los animales eran sacrificados (excepto los conejos) por métodos de eutanasia como la decapitación, sobredosis de barbitúricos y dislocación cervical. A Los animales eutanasiados que se utilizaron para toxicidad oral aguda y toxicidad dérmica se les practicó la necropsia y se inspeccionaron los órganos para detectar alguna anomalía o algún signo de toxicidad. De Agosto del 2008 hasta Noviembre de 2009 se determinó la naturaleza de la fracción activa ixodicida de la planta que presentó mayor eficacia (Petiveria alliacea). En esta parte fitoquímica, se realizaron particiones con hexano, acetato de etilo y metanol para determinar si los compuestos con actividad ixodicida eran de baja, media o alta polaridad. Una vez determinado que la actividad ixodicida es conferida por los compuestos no polares del extracto hexánico, se procedió a analizar la muestra hexánica en el cromatógrafo de gases y se obtuvo el perfil cromatográfico del extracto. Posteriormente se procedió a fraccionar el extracto hexánico filtrándolo en una columna de tonsil con el objetivo de eliminar la clorofila presente en el extracto y obtener fracciones menos complejas. La columna tonsil se corrió con el sistema hexano-acetona (relación 100:0 hasta 0:100) con un volumen de 200 ml para cada fracción. Además durante estos meses también se estuvo determinando la naturaleza de la fracción activa ixodicida de la planta Havardia albicans, la cual quedó como 4 la segunda de mayor eficacia contra garrapatas adultas de B. microplus. Petiveria alliacea, en esta parte fitoquímica, se realizaron particiones con hexano, acetato de etilo y metanol para determinar si los compuestos con actividad ixodicida eran de baja, media o alta polaridad. Una vez realizadas las particiones se llevaron a cabo los bioensayos a una única concentración (10%) para obtener el porcentaje de mortalidad larval de en los extractos hexánicos, de acetato de etilo y metanólicos. Se obtuvo el perfil cromatográfico del extracto. Las fracciones serán evaluadas contra larvas de B. microplus en el segundo año del proyecto (Fase 2). 4.2. Evaluación in vitro del hongo M. anisopliae para el control de garrapatas B. microplus. Se usaron tres cepas (Ma34, Ma14 y Ma2) del hongo M. anisopliae que fueron aisladas de: suelo Michoacano la M34 y Ma14 de suelo del estado de Colima, la Ma2 de Diatraea sacharalis del estado de Colima. Estas cepas fueron reproducidas en condiciones de laboratorio y almacenadas en refrigeración hasta su uso. Las cepas fueron diluidas con una solución de Tween 80 para dejarlas en una concentración final deseada. Para la evaluación de cada cepa del hongo M. anisopliae se obtuvo 50 garrapatas adultas hembras repletas de B. microplus de un rancho previamente diagnosticado como resistente al efecto de los piretroides, organofosforados y amitraz. Las garrapatas que se estudiaron pesaban de 200 a 220 mg. Para la evaluación de las cepas del hongo sobre larvas de B. microplus, se pegaron en cinta maskin-tape (aproximadamente 100 larvas), y posteriormente se inocularon durante un minuto en los diferentes tratamientos y ser depositadas en cajas de petri individuales que con anterioridad se prepararon con papel filtro y se humedecieron, una vez puestas las larvas se procedió a sellar las cajas de petri con cinta y se incubaron a 28 °C y 90 % de humedad y cada 48 hrs se observó la mortalidad de las larvas y la presencia de micelios. Para esta prueba se realizaron tres repeticiones por cada concentración del hongo y su control. Se calculó el porcentaje de mortalidad se dividió el número de garrapatas adultas y larvas muertas entre el número de garrapatas adultas y larvas totales estudiadas, y el resultado se multiplicó por 100. Se determinó la significancia estadística de la eficacia de cada cepa para el control de B. microplus se usó el programa estadístico de varianza One-Way ANOVA de StatGraphic Plus. Para determinar las concentraciones letales se utilizó el programa de análisis Probit mediante el programa Polo plus el cual permite conocer de manera cuantitativa el comportamiento de la muestra evaluada mediante diferentes concentraciones del hongo M. anisopliae. 5 Plan de trabajo para el próximo año del proyecto (Fase 2): Realizar la purificación de los compuestos activos de P. alliacesa y H. albicans y probarlos contra garrapatas adultas de B. microplus. Evaluar los extractos de P. alliacea in vivo contra animales infestados con garrapatas adultas de B. microplus. Evaluar el efecto entomopatógeno del hongo M. anisopliae para el control de B. microplus en la fase parásita (en bovinos) y no parásita (en pasto). 5. RESULTADOS Y PRODUCTOS RELEVANTES DE ACCIONES DEL PROYECTO ALCANZADOS HASTA LA FASE 1: 5.1. Evaluación in vitro de plantas con poder ixodicida. De las 15 plantas evaluadas se obtuvieron 9 plantas con eficacia >80% y fueron las hojas (95.7±2.9 %) y tallo (99.2±0.5 %) de Petiveria alliacea; hoja (87.9±8.6 %) y corteza (98.8±1.0%) de Diospyros anisandra; las hojas de Havardia albicans (93.0±12.0), Caesalpinha gaumeri (90.1±4.8 %) y Capraria biflora (86.6±9.9 %), tallos de Solanum tridinamum (98.0±1.7 %) y Solanum eriantum (97.8±1.8 %), corteza de Bursera simarouba (99.1±0.7 %) y Cassearia corymbosa (99.5±0.5 %); y la raíz de Ocimum micrantun (87.0±3.2 %). Con base en los resultados de eficacia con hoja, fueron seleccionadas las tres plantas con mayor eficacia (Petiveria alliacea, Havardia albicans y Caesalpinha gaumeri), las cuales fueron evaluadas nuevamente mediante bioensayos a diferentes concentraciones contra garrapatas B. microplus en las fases de larvas (20%, 10%, 5% y 2.5%) y adultas (20% y 10%) obteniéndose que P. alliacea fue la planta que presentó mayor eficacia en adultas (mortalidad (87%), inhibición de la oviposición (91%) e inhibición de la eclosión larval (16%). En la estancia en la Universidad de Costa Rica se realizó un trabajo de toxicidad con las 9 plantas que tuvieron eficacia >80% contra larvas de B. microplus teniendo como objetivo evaluar la toxicidad en animales de laboratorio de extractos metanólicos de las hojas y tallo de Petiveria alliacea, hojas de Havardia albicans, Caesalpinha gaumeri y Capraria biflora; tallos de Solanum tridinamum y Solanum eriantum; corteza de Bursera simarouba y Cassearia corymbosa; y la raíz de Ocimum micrantum. Como resultado de las pruebas toxicológicas se obtuvo que ninguno de los extractos evaluados en los animales de laboratorio utilizando diferentes vías de administración presentó toxicidad relevante, es decir, los extractos pueden ser utilizados de forma oral o tópica en los animales sin verse afectados en su estado de salud (Cuadro 1). 6 Cuadro 1. Relación de técnicas, dosis, tipo de animal y toxicidad de 9 plantas (12 extractos metanólicos) en animales de laboratorio. Planta Parte TWEEN 20 RO 7 – PA Irritabilidad dérmica Toxicidad oral aguda Ratas y conejos Ratas 10% Ratón 1 dosis Irritabilidad ocular Toxicidad dérmica Conejos Ratas (0) Tallo 400 mg/ ml (0) Hoja 500 mg/ ml (0) 5000 mg/ kg (0) Tallo 500 mg/ ml (0) 5000 mg/ kg (0) Hoja 500 mg/ ml (0) 5000 mg/ kg (0) Raíz 500 mg/ ml (0) 5000 mg/ kg (0) RN 6- ST Tallo 300 mg/ ml (1) 5000 mg/ kg (0) RF 7- OM Raíz 300 mg/ ml (0) RF 7- BS Corteza 300 mg/ ml (1) 2000 mg/ kg (0) RJ 7- CC Corteza 350 mg/ ml (0) 5000 mg/ kg (0) RO 7- HA Hoja 500 mg/ ml (1) 5000 mg/ kg (0) 1000 mg/ ml (1) 5000 mg/ kg (0) CG Hoja 500 mg/ ml (1) 5000 mg/ kg (0) 1000 mg/ ml (0) 5000 mg/ kg (0) RF 8- CB Hoja 500 mg/ ml (0) 5000 mg/ kg (0) 1000 mg/ ml (0) Total animales 9 conejos y 27 ratas 15 15 21 30 117 Total de ensayos 12 5 5 7 3 32 RN 6- SE 1000 mg/ ml (0) 1000 mg/ ml (0) 5000 mg/ kg (0) 1000 mg/ ml (0) 1000 mg/ ml (1) En la determinación de la naturaleza de la fracción activa ixodicida de la planta que presentó mayor eficacia (Petiveria alliacea), la planta fue particionada con hexano, acetato de etilo y metanol para determinar si los compuestos con actividad ixodicida eran de baja, media o alta polaridad. Una vez realizadas las particiones se llevaron a cabo los bioensayos a una única concentración (10%) obteniéndose un porcentaje de mortalidad larval de 93.63%, 6.44% y 5.21% en los extractos hexánicos, metanólicos y de acetato de etilo, respectivamente. Una vez determinado que la actividad ixodicida es conferida por los compuestos no polares del extracto hexánico, se procedió a analizar la muestra hexánica en el cromatógrafo de gases y se obtuvo el perfil cromatográfico del extracto. Al fraccionar el extracto hexánico se obtuvieron 9 fracciones finales de Petiveria alliacea, que fueron evaluadas contra larvas de B. microplus, obteniéndose los siguientes resultados (Cuadro 2). 7 Cuadro 1. Eficacia de nueve fracciones del tallo de la planta P. alliacea contra larvas de B. microplus. F1 39.6% F2 20.2% F3 09.1% F4 10.1% F5 50.0% F6 23.8% F7 16.7% F8 41.8% F9 26.8% F: Fracción Como se puede observar en el cuadro 1 las fracciones de la planta P. alliacea presentan una baja eficacia contra larvas de B. microplus, por lo cual se necesita evaluar mas colectas de esta planta para seleccionar el material con mayor eficacia y poder llevar a cabo los estudios in vivo con animales infestados con garrapatas adultas de B. microplus. Adicionalmente se inició la determinación de la naturaleza de la fracción activa ixodicida de la planta Havardia albicans, la cual quedó como la segunda de mayor eficacia contra garrapatas adultas de B. microplus. En esta parte fitoquímica, se realizaron particiones con hexano, acetato de etilo y metanol para determinar si los compuestos con actividad ixodicida eran de baja, media o alta polaridad. Una vez realizadas las particiones se llevaron a cabo los bioensayos a una única concentración (10%) obteniéndose un porcentaje de mortalidad larval de 45.93%, 60.26% y 85.23% en los extractos hexánicos, de acetato de etilo y metanólicos respectivamente. Una vez determinado que la actividad ixodicida es conferida por los compuestos polares del extracto metanólico, se procedió a analizar la muestra metanólica en el cromatógrafo de gases y se obtuvo el perfil cromatográfico del extracto. Posteriormente se procedió a fraccionar el extracto metanólico filtrándolo en una columna de Sephadex. La columna Sephadex se corrió con el sistema metanol 100 con un volumen de 10 ml para cada fracción, obteniéndose 34 fracciones. Estas fracciones se aplicaron en una placa cromatográfica de placa fina y se luyeron utilizando el sistema cloroformo-metanol-agua 7:3:0.5. En la placa se observó que había fracciones muy similares, por lo cual se agruparon obteniéndose 9 fracciones finales. Una vez obtenidas las 9 fracciones se procedió a concentrarlas para eliminar el disolvente y se corrieron nuevamente en otra placa con el mismo sistema con el propósito de observar cuantos compuestos posee cada fracción. Estas 9 fracciones serán evaluadas contra larvas de B. microplus en el segundo año del proyecto (Fase 2). 5.2. Evaluación in vitro del hongo M. anisopliae para el control de garrapatas B. microplus. En la figura 1 se presenta el porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x108 conidias/ml. Se observa que las garrapatas tratadas con la cepa Ma34 presentaron 100% de mortalidad a partir del día 11 postinfección, mientras que las cepas Ma14 y Ma2 lo alcanzaron hasta el día 13 y 20 postinfección respectivamente. 8 Porcentaje de mortalidad 100 100 90 90 80 80 65 60 65 Ma14 55 Ma34 45 40 Ma2 20 15 5 0 1 4 5 6 7 20 8 11 12 13 Dias posinfeccion 14 15 18 19 Figura 1. Porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x108 conidias/ml. En la figura 2 se presenta el porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x107 conidias/ml. Se puede observar que a partir del día cinco se presentó las primeras mortalidades de garrapatas adultas tratadas con la cepa Ma14, alcanzando 100% al día 20; sin embargo, las garrapatas tratadas con la cepa Ma34 presentaron mortalidades a partir del día ocho y teniendo 100% de mortalidad al día 13 . Las garrapatas tratadas con la cepa Ma2 presentaron mortalidad más tardía que en la dilución anterior y finalizó con un 70% de mortalidad a los 20 días. Pocentaje de mortalidad 100 90 85 80 75 70 70 60 50 45 40 Ma14 35 25 20 10 0 1 4 5 6 7 8 Ma34 5 11 12 13 20 Días posinfección 10 15 14 15 Ma2 18 19 Figura 2. Porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x107 conidias/ml. En la figura 3 se presenta el porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x106 conidias/ml, se puede observar que las cepas Ma34 y Ma14 tuvieron un 9 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 85 90 80 70 65 55 45 40 15 10 5 1 4 5 6 7 8 11 12 13 Días pos-infección 20 25 Ma14 Ma34 25 Ma2 14 15 18 19 20 Figura 3. Porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x106 conidias/ml. En la figura 4 se presenta el porcentaje de mortalidad de larvas B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x108 conidias/ml. Se observó que las larvas tratadas con la cepa Ma34 presentaron una elevada mortalidad a partir del día seis postinfección, alcanzando un 57% de mortalidad al día 20, mientras que las larvas tratadas con la cepa Ma14 empezaron el mismo día que la Ma34 hasta alcanzar un 62% de mortalidad al día 20 postinfección. Al igual que las anteriores la cepa Ma2 presento mortalidad al día 6 postinfección; sin embargo, sólo alcanzó un 20% mortalidad al día 20 postinfección. 100 90 Porcentaje de mortalidad Porcentaje de mortalidad comportamiento más lento en cuanto a la mortalidad; sin embargo, la cepa Ma34 alcanza 100% de mortalidad al día 18 mientras que la cepa Ma14 finaliza con 65% de mortalidad; la cepa Ma2 tuvo un comportamiento paulatino alcanzando 80% de mortalidad al día 20. 80 70 61 60 56 50 44 40 21 14 20 10 0 0 0 2 4 9 5 1 6 22 7 52 Ma 34 Ma14 Ma2 47 32 30 62 57 31 23 9 24 17 14 11 20 2 8 10 12 14 Dias posinfeccion 16 18 20 10 Figura 4. Porcentaje de mortalidad de larvas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x108 conidias/ml. En la figura 5 se presenta el porcentaje de mortalidad de larvas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x107 conidias/ml. Se observa que las larvas tratadas con las cepas Ma34 y Ma14 presentaron mortalidad a partir de día seis postinfección, alcanzando un 52% y 61% de mortalidad al día 20 respectivamente, mientras que las larvas tratadas con la cepa Ma2 empezaron a morir a partir del día ocho demorando hasta alcanzar un 19% de mortalidad al día 20 postinfección. Porcentaje de mortalidad 100 90 80 70 60 57 50 50 40 32 30 25 20 10 0 38 0 0 2 4 13 10 14 14 0 1 1 4 8 Ma 34 Ma14 Ma2 32 25 17 6 46 42 61 52 10 12 14 Días posinfección 14 11 9 16 18 19 20 Figura 5. Porcentaje de mortalidad de larvas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x107 conidias/ml. En la figura 6 se presenta el porcentaje de mortalidad de larvas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x106 conidias/ml. Se observa que las larvas tratadas con las cepas Ma34 y Ma14 empezaron a presentar mortalidad a partir del día seis postinfección, llegando a 34% y 45% de mortalidad al día 20, mientras que las larvas tratadas con la cepa Ma2 empezaron a morir a partir del día ocho alcanzando únicamente un 26% de mortalidad final del estudio. 11 Porcentaje de mortalidad 100 90 80 70 60 Ma 34 50 40 30 35 13 9 13 11 24 20 14 5 0 10 0 35 0 0 2 4 6 16 6 1 8 13 4 10 12 14 Días posinfección 16 35 39 30 21 16 20 18 45 34 26 Ma14 Ma2 20 Figura 6. Porcentaje de mortalidad de larvas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x106 conidias/ml. En el Cuadro 3 se presentan las concentraciones letales (CL) de tres cepas del hongo M. anisopliae que matan al 50%, 90% y 99% de B. microplus en la fase de adulta y larva a los 20 días postinfección. Se observa que las cepas Ma14 y Ma34 fueron eficaces para el control de garrapatas adultas necesitando desde 1x106 hasta 1x107.5 conidias/ml de M. anisopliae para matar al 99% respectivamente. Asimismo, se observó que las cepas Ma14 y Ma34 fueron eficaces para el control de larvas necesitando entre 1x10 6.3 y 1x107.1 conidias/ml de M. anisopliae para matar al 50% respectivamente. Cuadro 3. Concentraciones letales (CL) de conidias/ml de tres cepas del hongo M. anisopliae que matan al 50%, 90% y 99% de garrapatas adultas y larvas de B. microplus (20 días postinfección). Las CL se obtuvieron mediante el análisis Probit. Cepas M. anisopliae Ma2 Ma14 Ma34 - No tuvo eficacia. 50% de mortalidad Adulta Larva 6 < 1x10 1.9x106 <1x106 1.2x107 90% de mortalidad Adulta Larva 6 4.7x10 < 1x106 - 99% de mortalidad Adulta Larva 7 3.5x10 1x106 - En el cuadro 4 se presenta la micosis de garrapatas adultas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a diferentes concentraciones, se puede observar que la cepa Ma34 a la dilución 1x10 7 conidias/ml, fue la que mejor comportamiento presentó alcanzando 100% de micosis al día 20 postinfección, así también, en la dilución 1x106 conidias/ml alcanzó 65% de micosis al día 20; la cepa Ma14 alcanzó 80% y 50% de micosis en las diluciones 1x108 y 1x107 respectivamente; la cepa Ma2 sólo alcanzó 35% y 25% de micosis en las diluciones 1x108 y 1x106 respectivamente. 12 Cuadro 4. Porcentaje de micosis de garrapatas adultas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a diferentes concentraciones Conidias/ml Cepa Ma2 1X108 1X107 1X106 Cepa Ma34 1X108 1X107 1X106 Cepa MA14 1X108 1X107 1X106 Días postinfección 10 días 14 días 20 días % de micosis % de micosis % de micosis 0 10 35 0 0 0 0 20 25 15 5 0 100 95 40 100 100 65 5 5 0 25 40 0 80 50 5 En el Cuadro 5 se presenta el porcentaje de micosis en larvas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a diferentes concentraciones, en la que se observa que la cepa Ma14 fue la que mejor se comportó ya que al final del estudio alcanzó 38%, 28% y 21% de micosis en las diluciones 1x10 8, 1x107 y 1x106 respectivamente; la cepa Ma34 sólo alcanzó 19% y 17% de micosis en las diluciones 1x108 y 1x107 respectivamente. La cepa Ma2 no tuvo efecto sobre las larvas de B. microplus. Cuadro 5. Porcentaje de micosis en larvas de B. microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a diferentes concentraciones Conidias/ml Cepa Ma2 1X108 1X107 1X106 Cepa Ma34 1X108 1X107 1X106 Cepa Ma14 1X108 1X107 1X106 10 días % de micosis 0 0 0 Días postinfección 14 días % de micosis 0 0 0 20 días % de micosis 0 0 0 7 2 0 13 5 0 19 17 3 7 9 6 26 18 16 38 28 21 En el Cuadro 6 se presenta el índice de eficiencia reproductiva en garrapatas adultas de B. microplus tratadas con tres cepas diferentes de M. anisopliae , el cual se evaluó mediante el programa de análisis de varianza y se observa que la única cepa que presentó significancia estadística entre las tres diluciones es la Ma34, ya que el control es diferente a las tres diluciones; la dilución de 1x108 es diferente a la 13 dilución de 1x106 y al control; la dilución 1x107 es igual a la dilución de 1x108 y 1x106, pero es diferente al control: La dilución de 1x10 6 es igual a la dilución de 1x107 pero diferente a la dilución de 1x108 y al control. Cuadro 6. Índice de eficiencia reproductiva en garrapatas adultas de B. microplus tratadas con tres cepas diferentes de M anisopliae. Cepas Ma34 Ma14 Ma2 1x108 0.250c 0.492a 0.553a 1x107 0.433cb 0.497a 0.578a 1x10 6 0.496b 0.452a 0.557a Control 0.562a 0.562a 0.562a E.E 0.022 0.031 0.021 P <0.001 NS NS Literales diferentes entre las tres diluciones por cepa y el control tienen significancia estadística (horizontalmente) E.E= Error Estándar NS= no significativo P= Probabilidad En el Cuadro 7 se presenta el índice de eficiencia reproductiva en garrapatas adultas de B. microplus tratadas con tres cepas diferentes de M. anisopliae, el cual se evaluó mediante el programa de análisis de varianza, y se observa que en cuanto a cepas en la dilución de 1x108 la Ma34 es la única que tuvo una significancia estadística ya que fue diferentes a Ma2, Ma14 y el control; en la dilución de 1x10 7 tanto la Ma2 como la Ma34 son eficaces ya que ambas son diferentes una de otra así como también de Ma14 y el control que son iguales y por ultimo en la dilución de 1x106 ninguna cepa resultó ser eficaz ya que todas tuvieron un comportamiento similar. Cuadro 7. Índice de Eficiencia Reproductiva en garrapatas adultas de B. microplus tratadas con tres cepas diferentes de M. anisopliae Conidias/ml 1x108 1x107 1x106 Ma2 0.553ª 0.578ª 0.557a Cepas Ma34 0.250b 0.433b 0.496a Control Ma14 0.492ª 0.498ab 0.453a 0.562ª 0.562ab 0.562ª E.E 0.023 0.024 0.027 P <0.001 <0.001 NS Literales diferentes entre las tres cepas por dilución y el control tienen significancia estadística (horizontalmente) E.E= Error Estándar NS= no significativo P= Probabilidad 14 5.3. Productos. a) Logros obtenidos. Se dispone de un nuevo solvente (Tween 20 al 2%) para evaluar extractos de plantas en bioensayos contra larvas de B. microplus. Se dispone de nueve plantas (no toxicas) con eficacia mayor del 80% para el control de la garrapata B. microplus. Se obtuvieron dos plantas (Petiveria alliacea y Havardia albicans) con potencial ixodicida para ser usadas como alternativa de control contra larvas y adultas de la garrapata B. microplus. Se cuenta con la cepa Ma34 que presentó la mayor eficacia para el control de garrapatas adultas de B. microplus en condiciones in vitro, ya que produjo mayor mortalidad, menor concentración de conidias/ml para producir efectos, menor índice reproductivo y mayor micosis. Se cuenta con la cepa Ma14 que presentó mayor eficacia para el control de larvas de B. microplus en condiciones in vitro, ya que produce mayor mortalidad, menor concentración de conidias/ml para producir efectos y mayor micosis. b) Publicaciones científicas: Como producto de esta fase se publicó un artículo científico: Rosado-Aguilar J.A., Aguilar-Caballero A., Rodríguez-Vivas R.I., Borges-Argaez R., García-Vázquez Z., Méndez-González M., Cáceres-Farfán M., DorantesEuán, A. 2008. Actividad ixodicida de extractos crudos de Diospyros anisandra contra larvas de Riphicephalus (Boophilus) microplus (Acari: ixodidae). Tropical and Subtropical Agroecosystems. 8: 297-301. Se anexa artículo publicado. Rosado-Aguilar J.A., Aguilar-Caballero A., Rodríguez-Vivas R.I,, Borges-Argaez R. García-Vázquez Z., Méndez-González M. Acaricidal effect from plant crudeextracts on Riphicephalus (Boophilus) microplus (Acari: ixodidae) larvae. Veterinary Parasitology. Aceptado, en prensa. Rosado-Aguilar J.A., Aguilar-Caballero A., Rodriguez-Vivas R.I., Borges-Argaez R., Garcia-Vazquez Z., Mendez-Gonzalez M. 2009. Acaricidal activity of extracts from Petiveria alliacea (Phytolaccaceae) against the cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: ixodidae). Tropical and Subtropical Agroecosystems. En prensa. 15 c) Resúmenes y presentaciones. Además como parte del proyecto se hicieron las siguientes publicaciones y presentaciones en congresos nacionales e internacionales: Rosado-Aguilar J.A. Aguilar-Caballero AJ., Rodriguez-Vivas R.I., Borges R., Garcia Z., Mendez M., Dorantes A., Caceres M. 2007. Evaluation of three solvents as vehicle of crude methanolic plant extracts in the larval immersion test using Boophilus microplus ticks. XII Conference of WAAVP. Gent Belgium. August 19-23, 2007. Cáceres-Farfan M., Coello-Victurin E.A., Rosado-Aguilar J.A., MéndezGonzález M., Rodríguez-Vivas R.I., Aguilar-Caballero A., Borges-Argáez R. 2008. Eficacia de residuos metanólico de Havardia albicans (leguminosae) para el control de larvas y adultas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. VI Seminario Internacional de Parasitología Animal 2008. Boca del Río Veracruz, del 3 al 5 de Septiembre. Coello-Victurin E.A, Cáceres Farfan M, Rosado Aguilar J.A, Méndez González M, Rodríguez Vivas R.I., Aguilar Caballero A, Borges Argáez R. 2008. Evaluacion de la actividad ixodicida de Petiveria alliacea (phytolaccacea) contra larvas de garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus. VI Seminario Internacional de Parasitología Animal 2008. Boca del Río Veracruz, del 3 al 5 de Septiembre. Rosado-Aguilar J.A., Aguilar-Caballero A., Rodríguez-Vivas R.I., BorgesArgaez R., García-Vázquez Z., Méndez-González M., Caceres-Farfan M. 2008. Evaluación de la actividad acaricida de extractos de especies vegetales contra larvas de garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus resistentes a ixodicidas. VI Seminario Internacional de Parasitología Animal 2008. Boca del Río Veracruz, del 3 al 5 de Septiembre. Ojeda-Chi, M.M., Rodríguez-Vivas, R.I, Galindo-Velasco, E. 2009. Efecto in Vivo de las Cepas MA14 Y MA34 de Metahrizium anisopliae para el control de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en la fase no parásita. XVII Foro de Investigación. 20-21 de enero de 2009. pp. 85-87. Rosado-Aguilar J.A. Aguilar-Caballero A., Rodríguez-Vivas, R.I., BorgesArgaez R., García Vázquez, Z., Méndez-Gonzáles, M., Cáceres-Farfán, M., 2009. Actividad acaricida de extractos de Petiveria alliacea (Phytolaccaceae) contra la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: ixodidae). XVIII Foro de Investigación. 7-8 de julio de 2009. pp. 38-44. Ojeda-Chi, M.M., Rodríguez-Vivas, R.I, Galindo-Velasco, E., 2009. Evaluación del hongo entomopatógeno Metahrizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes) para el control de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: ixodidae) en condiciones de laboratorio y de campo en el trópico mexicano. XVIII Foro de Investigación. 7-8 de julio de 2009. pp. 159-166. Rosado-Aguilar J.A., Aguilar-Caballero A., Rodríguez-Vivas R.I., BorgesArgaez R., García-Vázquez Z., Méndez-Gonzáles M., Cáceres-Farfán M. 2009. Actividad acaricida de extractos de Petiveria alliacea (Phytolaccaceae) contra la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). VIII Congreso Nacional de Parasitología 16 Veterinaria. 26-28 de Octubre de 2009. Mérida, Yucatán, México. pp. 8791. d) Capítulo de libro. Fue aceptado para su publicación el capítulo: Rosado-Aguilar, J.A., RodríguezVivas, R.I., Borges-Argaez, R., Aguilar-Caballero, A.J., Mendez, M. 2009. Uso de plantas como alternativa de control de garrapatas en Yucatán, México. Estudio de la Diversidad Biológica del Estado de Yucatán. En Prensa. e) Boletín técnico. Se publicó el Boletín técnico: Rodríguez-Vivas, R.I. et al. (2007). Métodos alternativos de control de garrapatas en el ganado bovino. Boletín Técnico. Fundación Produce, Yucatán. Mérida, México. f) Tesis de Maestría y doctorado. Se encuentran en proceso las siguientes tesis: Evaluación del efecto entomopatológico de las cepas Ma34 y Ma2 del hongo Metharizium anisopliae para el control in vivo de Boophilus microplus. FMVZUADY. Maestría en Producción Animal Tropical, Opción Salud Animal. Por MVZ. Melina Ojeda Chi. Uso de extractos de plantas como ixodicidas para el control de la garrapata Boophilus microplus. FMVZ-UADY. Doctorado en Ciencias Agropecuarias. Por el M. en C. José Alberto Rosado Aguilar. g) Entrenamiento de estudiante de doctorado. Se capacitó al estudiante de Doctorado (M.C. José Alberto Rosado Aguilar) en la Universidad de Costa Rica. Esta estancia tuvo como objetivo conocer los diversos métodos y técnicas toxicológicas en fármacos y plantas aplicados en animales de laboratorio. 6. COMENTARIOS GENERALES Y OBSERVACIONES AL DESARROLLO DEL PROYECTO: Se finalizó la fase 1 del proyecto y se solicita el financiamiento de la fase 2 del proyecto que tiene como objetivos: 17 Evaluar el efecto entomopatógeno de una cepa del hongo M. anisopliae para el control de garrapatas adultas de B. microplus a nivel de campo. Evaluar la actividad ixodicida de dos extractos de especies vegetales contra garrapatas Boophilus microplus a nivel de campo. Concluir con la determinación de la naturaleza de la fracción activa ixodicida de dos extractos de especies vegetales. 7. ANEXOS: (incluir una fotografía que ilustre el avance del proyecto) Incluir la información siguiente: Número de productores beneficiados (hasta la presente fecha) Directos: Ninguno Indirectos: Ninguno Potenciales: Ninguno Técnica de inmersión larval para evaluar extractos de 15 plantas contra larvas de B. microplus en el laboratorio de Parasitología del Campus de Ciencias biológicas y Agropecuarias de la UADY. 18 Larvas y adulta de B. microplus afectada con el hongo entomopatógeno M. anisoliae en los bioensayos realizados. 19 8.- NOMBRE Y DOMICILIO DE BENEFICIARIOS DIRECTOS Elaboración: Dr. Roger I. Rodríguez Vivas Nombre y firma del Investigador o Técnico responsable del Proyecto Fecha: 11/12/09 (DÍA / MES / AÑO) Revisado y Aprobado: Dr. José de Jesús Williams Nombre y firma del Jefe de Campo o Director de la Institución/dependencia Fecha: 11/12/2009 (DÍA / MES / AÑO) 20