ARN mensajero

Facultad de Medicina
TEMA
Genética – 1er Curso
0-3
EXPRESIÓN GÉNICA:
TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN
9
9
9
9
ARN mensajero.
La transcripción en eucariotas.
Ribosomas.
La traducción.
ARN mensajero
Apartados
Síntesis y procesamiento
Corte y empalme
“Capping”
Poliadenilación
Estabilidad
ARN mensajero
Síntesis y procesamiento
ƒ En eucariotas, el ARNm producido por la ARN polimerasa II
actúa como un molde para la síntesis de proteína durante la
traducción
ƒ El ARNm se sintetiza como un precursor, pre-ARNm, en el
que se han transcrito tanto los exones como los intrones del
gen. Antes de la síntesis de proteína, el pre-ARNm sufre un
procesamiento para producir un ARN maduro:
- “Splicing” Æ eliminación de intrones
- “capping” Æ adición de un nt modificado en 5’ (caperuza)
- poliadenilación Æ adición de una cola de hasta 250 adeninas
ƒ En el núcleo existe una población de moléculas de diferente
longitud y diferentes estados de procesamiento: ARN nuclear
heterogéneo (hnRNA)
ARN mensajero
Corte y empalme
ARN mensajero
Corte y empalme
• genes eucariotas (y ARNm)
están caracterizados por intrones
y exones
• exón – parte codificante
• intrón – parte no codificante
• ARNm son procesados por el
espliceosoma,
un
híbrido
de
proteína/ARN ensamblados
• muchos exones corresponden a
dominios de proteínas, una porción
auto-plegable de una proteína con
su propia actividad
ARN mensajero
“Capping”
y
Poliadenilación
• El ARNm es procesado por distintos métodos antes de ser
traducido a proteína:
- caperuza 5’ Gppp, ayuda a la unión al ribosoma, protege de la
degradación
- cola 3’ poli(A) de 30-200 nucleótidos adenina
ARN mensajero
“Capping”
y
Poliadenilación
ARN mensajero
Estabilidad
ƒ El ARNm tiene una vida media muy corta en las células. Esto
es debido a que las células regulan los niveles de proteínas
en el citoplasma principalmente cambiando el ritmo de la
transcripción génica. Así pues, estos cambios se reflejan en
la cantidad de ARNm asequible para la síntesis de proteínas
ƒ En células bacterianas la vida media de un ARNm son unos
pocos minutos
ƒ En células eucariotas, suele ser como mucho 6 horas
ARN mensajero (I)
Objetivos
Síntesis y
procesamiento
El ARN mensajero (ARNm) actúa como un molde para la síntesis de
proteínas Se sintetiza en el núcleo por transcripción de los genes que
codifican proteínas mediante la ARN polimerasa II. Primero se
transcribe como precursor (preARNm), el cual contiene las secuencias
intrónicas no codificantes que son posteriormente eliminadas por
“splicing”. Al extremo 5’ se le añade una caperuza y al 3’ una cola poli-A.
Corte y empalme
Este proceso (“splicing”) consiste en la eliminación de los intrones
en el ARNm precursor. Las secuencias GT y AG están en los finales
de los intrones y son parte de secuencias señal de “splicing” más
grandes. En el intrón existe otra señal llamada “branch site”. El
proceso conlleva el corte del extremo 5’ del intrón y su unión al
“branch site” formando un lazo con cola. El intrón se libera al
cortar su extremo 5’ y los exones quedan juntos y se unen. El
proceso está catalizado por snRNPs: U1 se une al sitio 5’ de
splicing; U2 a la secuencia “branch”; U5 y U4/6 forman un
complejo con U1 y U2 llamado espliceosoma que mantiene el ARNm
en la posición correcta para el splicing y aporta la actividad
enzimática requerida para cortar el intrón y unir los exones.
ARN mensajero (y II)
Objetivos
“Capping”
Los ARNm euxariotas son modificados en el extremo 5’ mediante la adición de
un nucleótido modificado, 7-metilguanosina, en una unión inusual 5’ Æ 5’
trifosfato al primer nucleótido del ARNm. Esta modificación protege al ARNm
de la degradación por 5’ exonucleasas.
Poliadenilación
Estabilidad
La mayoría de los ARNm de eucariotas son modificados en el extremo
3’ por adición de una cola poli A (poliadenilación). El ARNm precursor
es cortado alrededor de 20 bases aguas abajo de la secuencia señal de
poliadenilación, 5’-AAUAAA-3’, y la polimerasa poli A añade un grupo
de adeninas. También protege de las exonucleasas.
El ARNm es relativamente inestable comparado con el ARNr y ARNt. Esto
permite a las células regular los niveles de proteínas alterando el ritmo de la
transcripción. Los ARNm procariotas tienen una vida media mucho más corta
que los eucariotas.
Términos
Cadena codificante
(no molde, sentido +)
3’
5’
ADN G C C A T T T C G A A T
C
G
G
T
A
A
A
G
C
T
T
A
3’
5’
Cadena molde
Transcripción
ARN G C C A U U U C G A A U
Transcrito, misma secuencia
que la cadena codificante
Procariotas vs eucariotas
Cadena ADN
codificante
Cadena ADN
codificante (x=cualquier base)
Transcripción en eucariotas
Apartados
Introducción
ARN polimerasa II
ARN polimerasa I
ARN polimerasa III
Transcripción en eucariotas
Introducción
• En eucariotas, los genes están
normalmente “off” hasta que
algo los cambia a “on”
• Los promotores de eucariotas
tienen una secuencia especial
llamada caja TATA:
5’TATA(A/T)A(A/T)3’, a –25
pb, que dirige la unión de un
grupo de proteínas denominadas
factores de transcripción.
• Una vez unidos los factores de
transcripción, se une la ARN
polimerasa
y
comienza
la
transcripción
• La
terminación
ocurre
al
encontrar una señal AAUAAA
Transcripción en eucariotas
ARN polimerasa II
Transcripción en eucariotas
ARN polimerasa II
Transcripción en eucariotas
ARN polimerasa II
Transcripción en eucariotas
ARN polimerasa II
Transcripción en eucariotas
ARN polimerasa II
Transcripción en eucariotas
ARN polimerasa I
ƒ Transcribe ARNr 18S, 28S y 5,8S. El promotor contiene
dos elementos de secuencia esenciales para una eficiente
transcripción:
- el core, que solapa el sitio de inicio de la transcripción
- una secuencia control aguas arriba en torno a –100 pb
Estas secuencias unen ARN polimerasa I y sus factores de
transcripción asociados. El core es esencial para que ocurra
la transcripción y la secuencia control aguas arriba influye
en el nivel de transcripción
ƒ Una señal de terminación de 18 pb a 600 pb después del
final del gen
Transcripción en eucariotas
ARN polimerasa III
ƒ Transcribe un grupo de genes cortos que codifican ARNt y el ARNr
5S.
ƒ Las secuencias promotoras están después del sitio de inicio de la
transcripción dentro de la secuencia codificante del gen (regiones
de control internas, ICR). Están dentro de las 100 bases desde el
sitio de inicio de la transcripción.
ƒ El gen ARNr 5S contiene una secuencia conocida como caja C,
siendo el sitio de unión para los factores de transcripción y la ARN
polimerasa III. Existe otra secuencia importante aguas arriba
conocida como caja A.
ƒ Los genes ARNt tienen dos elementos de secuencias conservadas
importantes, la caja A y B, que constituyen el ICR, actuando
conjuntamente como sitio de unión para los factores de
transcripción y la ARN polimerasa III.
ƒ Una secuencia poli A poco después del final del gen induce la
terminación de la transcripción.
Transcripción en eucariotas
Objetivos
Introducción
ARN
polimerasa II
ARN
polimerasa I
La iniciación es compleja y la terminación no implica estructuras tallo-lazo.
Tres ARN polimerasas (I, II, y III) transcriben diferentes grupos de genes.
Esta enzima transcribe genes que codifican proteínas. Las secuencias del
promotor suelen contener una caja TATA 25 pb aguas arriba del sitio de
inicio de la transcripción, donde se une la enzima. Los factores de
transcripción (TFII A, B, etc.) se unen al ADN alrededor de la caja TATA
en un orden específico y forman una plataforma a la que la ARN
polimerasa II se une. Genes sin caja TATA suelen tener otro elemento
iniciador. Otros elementos promotores como la caja CAT actúan como
sitios de unión para otros factores de transcripción que influyen en el
nivel de transcripción. También influyen elementos distantes
(potenciadores e inhibidores). No se conoce bien el mecanismo de
terminación.
Transcribe ARNr 18S, 28S y 5,8S. El promotor contiene dos elementos
esenciales para la transcripción: el core, que solapa el sitio de inicio de la
transcripción, y una secuencia control aguas arriba en torno a –100 pb. Una
señal de terminación de 18 pb se sitúa a 600 pb después del final del gen.
ARN
polimerasa III
Transcribe genes cortos que codifican ARNt y ARNr 5S. Las secuencias
promotoras están dentro de la secuencia codificante (regiones de
control internas, ICR). El gen ARNt tiene dos elementos de secuencias
importantes, la caja A y B; la transcripción del gen ARNr 5S requiere la
caja C. Una segunda secuencia llamada caja A es importante. Una
secuencia poli A induce la terminación de la transcripción.
Ribosomas
Apartados
Definición
Función
Composición en procariotas y eucariotas
Anatomía de un ribosoma
Ribosomas
Definición: Complejos grandes de ribonucleoproteínas
responsables de la síntesis proteica en todas las
células.
Ribosomas
Función
Subunidad grande: cataliza la reacción de la
peptidil-transferasa en la síntesis proteica
dirigida por el ARNm: formación del enlace
peptídico entre los aminoácidos.
Subunidad pequeña: descodifica el mensaje
del ARNm, controla la fidelidad de la
interacción codón-anticodón, se encarga de
la translocación del ARNm y ARNt.
Ribosomas
Composición
Procariotas
Subunidad 50S
ARNr 23S
ARNr 5S
35 proteínas
RIBOSOMA 70S
subunidad 30S
RIBOSOMA 80S
subunidad 40S
ARNr 16S
21 proteínas
Eucariotas
Subunidad 60S
ARNr 28S
ARNr 5S
ARNr 5.8S
49 proteínas
ARNr 18S
33 proteínas
Ribosomas
Anatomía
Anatomía de un Ribosoma
• Hay tres lugares en el
ribosoma que unen ARNt
amino-acil:
A = acoge un nuevo ARNt
P = aquí se forma el enlace
peptídico entre aminoácidos
E = sitio de salida para
ARNt “vacíos”
Ribosomas
Objetivos
Definición
Función
Complejos grandes de ribonucleoproteínas responsables de la síntesis
proteica en todas las células. Es decir, se trata de estructuras
macromoleculares compuestas de ARN ribosomal (ARNr) y proteínas. Están en
grandes cantidades en el citoplasma donde traducen el ARNm a proteína
Subunidad grande: cataliza la reacción de la peptidil-transferasa en la síntesis
proteica dirigida por el ARNm: formación del enlace peptídico entre los
aminoácidos. Subunidad pequeña: descodifica el mensaje del ARNm, controla la
fidelidad de la interacción codón-anticodón, se encarga de la translocación del
ARNm y ARNt.
Composición en
procariotas y
eucariotas
Anatomía de
un ribosoma
Las subunidades grandes y pequeñas son de tamaños característicos,
descritos en valores de sedimentación (S). Procariotas: 70S,
subunidades 50S y 30S; contienen ARNr 23S, 16S y 5S. Eucariotas:
80S, subunidades 60S y 40S; contienen ARNr 28S, 18S, 5.8S y 5S.
Hay tres lugares en el ribosoma que unen ARNt amino-acil:A, acoge un
nuevo ARNt; P, donde se forma el enlace peptídico entre aminoácidos; E,
sitio de salida para ARNt “vacíos” (no llevan un aminoácido unido).
ARN transferente
Apartados
Papel en la traducción
Estructura
Unión ARNt - aminoácido
ARN transferente
Papel en la traducción
ƒ ARNt son moléculas pequeñas que actúan como adaptadores
durante la síntesis proteica. Relacionan la secuencia de
nucleótidos del ARNm a la secuencia de aminoácidos del
polipéptido.
ƒ En las células existen ARNt cada uno de los cuales une un
determinado aminoácido.
ƒ Cada ARNt reconoce un codón en el ARNm permitiendo
situar su aminoácido en el lugar correcto de la cadena
polipeptídica en crecimiento, según especifica la secuencia
del ARNm.
ARN transferente
Estructura
La Aminoacil ARNt sintetasa une un aminoácido
determinado a un ARNt específico
brazo TϕC
brazo aceptor
brazo opcional
brazo DHU
brazo anticodón
ARN transferente
Unión ARNt - aminoácido
CH3
S
metionina
CH2
CH2
H2N
ARNtMet
CH
COOH
?
anticodón
U A C
A U G
Codón
de inicio
ARNm
ARN transferente
Unión ARNt - aminoácido
CH3
metionina
CH3
S
S
CH2
CH2
CH2
H2N
CH
ATP
C
AMP +
PPi
CH2
H2N
O
CH
OH
C
O
O
metionina
aminoacil ARNt
sintetasa
ARNtMet
ARNt
cargado
anticodón
Objetivos
U A C
U A C
ARN transferente
Papel en la
traducción
ARNt son pequeñas moléculas que transportan los aminoácidos, en un orden
especificado por la secuencia de un ARNm, para la síntesis de proteínas. Las
células contienen un número de diferentes ARNt cada uno de los cuales une un
aminoácido específico. Cada ARNt también se une a un codón específico en el
ARNm permitiendo situar su aminoácido en la posición correcta.
Estructura
El emparejamiento de bases en el ARNt da lugar a una estructura en hoja de
trébol compuesta de brazos llamados tallo-lazos. Éstos incluyen: brazo
aceptor, punto de unión del aminoácido; brazo anticodón, reconoce los
codones en la secuencia del ARNm; brazo DHU, contiene dihirouracilo; brazo
opcional; y brazo TϕC, contiene pseudouracilo. La representación de la
estructura terciaria sitúa los brazos aceptor y anticodón en los extremos
opuestos de la molécula.
Unión ARNt - aminoácido
La interpretación de la información contenida en el ARNm se lleva a cabo
mediante la unión a cada codón de un determinado ARNt que transporta su
aminoácido específico. La unión específica ARNt – aminoácido la lleva a cabo la
enzima aminoacil ARNt sintetasa.
Traducción
Apartados
Reconocimiento de codones
Traducción
Iniciación
Elongación
Terminación
Modificaciones post-traduccionales
Traducción
Reconocimiento de codones
Hay una correspondencia entre la unión de un aminoácido a un ARNt y
su unión a un determinado codón. Esto asegura que la secuencia de
aminoácidos codificada por el ARNm es traducida fielmente.
El reconocimiento de codones tiene lugar mediante el anticodón del
ARNt por unión codón-anticodón por complementariedad de bases.
4 bases en ADN Æ 64 codones; 3 codones son señales de parada;
quedan 61 codones Æ 20 aminoácidos Æ degeneración del código
genético.
Un ARNt reconoce más de un codón debido a la inestabilidad de la
tercera base del codón (“wooble”) (primera del anticodón), que puede unir
bases alternativas en esa posición (G≡C, G∼U, inosina≡C, inosina∼A,
inosina∼ U).
Consecuencia de “wooble” es que sirve para minimizar el efecto de las
mutaciones.
Traducción
Traducción
ƒ Tres estados: INICIACIÓN, ELONGACIÓN, TERMINACIÓN
- Iniciación Æ unión ribosoma a ARNm
- Elongación Æ adición repetitiva de aminoácidos
- Terminación Æ liberación de la nueva cadena polipeptídica
ƒ Proteínas accesorias asisten al ribosoma en cada uno de los
tres estados
ƒ La energía requerida proviene de la hidrólisis de GTP y ATP.
- GTP Æ movimiento del ribosoma y unión de factores
accesorios.
- ATP Æ cargar los ARNt y eliminar la estructura
secundaria del ARNm.
Hasta el 90% del ATP producido en una bacteria se usa para
la traducción.
Traducción
Iniciación
Etapa 1: La subunidad ribosomal pequeña une IF1, IF3 e
IF2-GTP
Etapa 2: La subunidad pequeña se une
al ARNm y se mueve
al codón de inicio
AUG.
Traducción
Iniciación
Etapa 3: Un ARNt iniciador
cargado con metionina se une al
codón de inicio AUG. Se libera IF3
Etapa 4: Se une la subunidad
ribosomal grande. Se libera IF1
e IF2 y se hidroliza GTP.
•Hay tres posiciones en el ribosoma que
unen ARNt aminoacil
A = acepta un nuevo ARNt
P = el enlace peptídico se forma aquí
E = sitio de salida para ARNt “vacíos”
Traducción
Elongación
complejo aa-tRNA/GTP/EF-Tu
Formación del
enlace peptídico
complejo EF-Tu/GDP
met
ala
Traducción
gly
Elongación
CH3
S
CH2
N-terminus
H2N
CH
Peptidiltransferasa
CH3
CH2
C
N
CH
C
O
H2N
CH
O
O
Formación del
enlace peptídico
H
C
O
O
P site
met
A site
ala
Traducción
gly
Elongación
CH3
S
Formación del
enlace peptídico
CH2
N-terminus
H2N
CH
H
CH3
CH2
C
N
O
P site
CH
C
O
N
CH
C
O
O
A site
Traducción
Terminación
ƒE. coli: factores de liberación, RF1 (UAA, UAG) y RF2 (UAA, UGA)
ƒEucariotas: único factor de liberación, eRF
Traducción
Modificaciones post-traduccionales
Después de la traducción, los polipéptidos nuevos sintetizados
pueden sufrir una serie de modificaciones antes de ser proteínas
funcionales. Se trata fundamentalmente de la unión covalente de
grupos químicos y cortes en la cadena polipeptídica.
ADICION...
pequeños grupos.
- metilación
- Fosforilación Æ regula la actividad enzimática
- acetilación
- hidroxilación
grandes grupos
- glicosilación (lípidos y oligosacáridos)
CORTE... (es muy común)
- recorte en el final de las proteínas
- eliminación de secuencias señal internas o N-terminales
- rotura de poliproteínas en péptidos más pequeños
ESQUEMA-RESUMEN
de la transcripción y
traducción en
eucariotas
Traducción y translocación están acopladas en eucariotas
Traducción (I)
Objetivos
Reconocimiento
de codones
Es similar en procariotas y eucariotas y se da en tres pasos: INICIACIÓN,
ELONGACIÓN Y TERMINACIÓN. Cada estado involucra un grupo de proteínas
accesorias. La energía proviene por hidrólisis de ATP y GTP.
Traducción
Iniciación
La complementariedad de bases entre un codón en el ARNm y el
anticodón del ARNt asegura que los aminoácidos se sitúan en el orden
correcto durante la síntesis proteica. El código genético es degenerado;
la mayoría de aminoácidos son codificados por más de un codón. Cada
ARNt puede reconocer más de un codón especificando su aminoácido
porque la base 5’ en el anticodón puede unir bases alternativas 3’ del
codón. Esta posición se conoce como “inestable”.
La traducción comienza con la unión de subunidades ribosómicas pequeñas al
ARNm a la secuencia Shine-Dalgarno en procariotas y a la caperuza 5’ en
eucariotas. La subunidad migra aguas abajo hacia el codón de inicio AUG y el
ARNt iniciador metionina (ARNtimet) se une para formar el complejo de
iniciación. IF1, 2 y 3 son factores de iniciación bacterianos. IF1 e IF3 evitan la
unión de la subunidad grande ribosomal antes de que se complete la iniciación.
IF3 lleva el ARNtimet al complejo de iniciación. En eucariotas, participan al menos
9 factores de iniciación. eIF1 y eIF2 tienen papeles similares a IF1 e IF2. Varios
factores deshacen la estructura secundaria del ARNm.
Traducción (y II)
Objetivos
Elongación
Terminación
Después de la iniciación la subunidad grande ribosomal se une al complejo de
iniciación formando los sitios A y P. El sitio P es ocupado por ARNtmet. Un
segundo ARNt cargado entra al sitio A y la peptidiltransferasa forma un enlace
peptídico entre los dos aminoácidos. La ARNt deaciclasa rompe la unión entre
metionina y su ARNt dejando un dipéptido unido al segundo ARNt. En
procariotas, un factor de elongación, EF-Tu, está asociado con la entrada del
ARNt al sitio A. GTP se hidroliza y se libera EF-Tu asociado a GDP. EF-Ts
regenera EF-Tu. En eucariotas, eEF1 tiene un papel similar a EF-Tu. Después de
la formación del enlace peptídico el ribosoma se mueve al siguiente codón, el
dipéptido unido al segundo ARNt se mueve al sitio P expulsando el ARNt
iniciador. Un tercer ARNt cargado entra en el sitio A y se repite el ciclo de
elongación.
La traducción termina cuando un codón de terminación entra al sitio A.
Factores de liberación entran al sitio A y causan la liberación del polipéptido.
En E. coli, RF 1, 2 y 3 producen la terminación. En eucariotas, una única
proteína esta involucrada, eRF. Después de la terminación, el ribosoma se
disocia y el ARNm se libera.
Modificaciones
post-traduccionales
Después de la traducción, los polipéptidos pueden ser modificados
por la adición de grupos químicos a las cadenas de aminoácidos y a
los extremos N y C terminales o por proteólisis. Estas
modificaciones pueden ser necesarias para la completa
funcionalidad de las proteínas.