Los Marcadores Moleculares y su aplicación en la agricultura

Los Marcadores
Moleculares y su
aplicación en la
agricultura moderna
Dr. Luis Wong Vega
Instituto de Innovación en Biotecnología
e Industria (IIBI)

La biotecnología posee un impacto
potencial significativo en la tarea de
alimentar al planeta....

“ ...To advance agricultural research into new
technologies, including biotechnology...the use
of tried and tested new technologies including
biotechnology should be accomplished in a safe
manner and adapted to local conditions to help
improve agricultural productivity in developing
countries.
http://www.fao.org/worldfoodsummit/english
/documents.htm
¿De qué manera puede ayudar la
biotecnología a las personas
afectadas por el hambre y la
desnutrición?
-Mejorando el rendimiento
-Provocando menores costos de producción
-Generando resistencia a enfermedades y a la
sequía
- Creando mayor valor nutricional
- Garantizando calidad e inocuidad
en los alimentos

Las modernas biotécnicas aplicadas a la
agricultura están teniendo un fuerte impacto en la
investigación y en la producción agrícola
modernas, afectando también a fenómenos
diversos como la comercialización, aspectos de
salud pública y patentes y derechos de marca,
entre otros...
APLICACIONES BÁSICAS DE LA
BIOTECNOLOGÍA
1.
2.
3.
4.
5.
productividad y estabilidad
en áreas marginales
degradadas
eficiencia en el uso del agua
manejo integrado de plagas y
reducción del uso de
plaguicidas
resistencia de los cultivos a
las enfermedades
calidad nutricional

Las técnicas de los llamados
“Marcadores Moleculares” van cobrando
cada vez más un impacto significativo
sobre diversos aspectos de las ciencias
agropecuarias modernas...

Desde la prehistoria, el
hombre ha seleccionado
y mejorado especies
vegetales, animales y
microbianas basándose
en el fenotipo.

Las mejoras
genéticas eran
posible gracias a la
variabilidad genética,
a la heredabilidad del
carácter que se
quería aislar, a la
eficacia e intensidad
de la selección
aplicada, y al tiempo
necesario para
realizar un ciclo de
selección.

Sin embargo, con estos métodos quedan
muchos aspectos desconocidos, como
son el número y efecto de los genes
implicados en la expresión de un
carácter, la localización de estos genes,
y su función fisiológica.

Por otra parte, la taxonomía siempre ha
estudiado características morfológicas,
lo cual requiere observaciones muy
exhaustivas de los organismos en
diferentes estadios de desarrollo

Los criterios utilizados en la selección
clásica carecen muy a menudo de
definición y objetividad y, en cualquier
caso, son marcadores ambiguos debido
a las influencias ambientales.

Afortunadamente la
aparición de los
marcadores
moleculares está
ayudando a eliminar
tanto los
inconvenientes de una
selección basada en el
análisis exclusivo del
fenotipo, como la
identificación de
especies y variedades
de una forma más
rigurosa y repetitiva.

Los marcadores moleculares son
biomoléculas que se pueden
relacionar con un rasgo genético.

Las biomoléculas que pueden ser
marcadores moleculares son las
proteínas (antígenos e isoenzimas) y
el DNA (genes conocidos o fragmentos
de secuencia y función desconocida).

Cuando varios marcadores moleculares se
asocian inequívocamente con un rasgo
genético, se dice que forman un QTL (loci
de rasgos cuantitativos o cuantificables).
Un marcador molecular monomórfico es
invariable en todos los organismos estudiados,
pero cuando presenta diferencias en el peso
molecular, actividad enzimática, estructura, o
sitios de restricción, se dice que es polimórfico.
 A veces el grado de variación es tal que se
denominan hipervariable.


Los primeros marcadores desarrollados
a finales de los 70 se basaron en la
identificación de proteínas e isoenzimas
por electroforesis en geles de almidón o
poliacrilamida.

Con ellos se abrió el
conocimiento de la
estructura y
heterogeneidad
genética entre
diferentes especies,
variedades, y
poblaciones de
distinto origen
geográfico.

Pero esta técnica tenía una limitación muy
importante: no era capaz de detectar
suficiente polimorfismo entre variedades o
especies próximas debido a que las proteínas
son el resultado de la expresión génica, que
puede ser distinta de unos tejidos a otros, de
una etapa de desarrollo a otra, de un medio
ambiente a otro, y de una época del año a
otra.

Los avances de la tecnología del
DNA recombinante han permitido
el desarrollo de los marcadores
moleculares basados en el DNA,
consiguiendo estabilidad en la
identificación de especies y
variedades.

Los cromosomas, localizados en el núcleo de
las células vegetales y animales, contienen las
unidades de información que son transferidas
de una generación a otra. Cada cromosoma
contiene una larga y única molécula de ADN,
además de proteínas que actúan en el
empaquetamiento de esta molécula.

Las tecnologías de análisis molecular de la
variabilidad del ADN y sus productos de
expresión, permiten determinar puntos de
referencia en los cromosomas,
técnicamente denominados “marcadores
moleculares”.
Las técnicas de biología
molecular, basadas en el
análisis de ácidos nucleicos
(PCR, microsatélites, AFLP,
etc.), permiten la
incorporación de nuevas
alternativas para acelerar los
procesos de selección.
 De esta forma, es posible
explorar aspectos teóricos y
prácticos relacionados con la
genética de plantas,
mejoramiento y análisis de
germoplasma.


La PCR (reacción
en cadena de la
polimerasa),
descrita en 1988, es
una de las técnicas
esenciales para la
preparación de
huellas dactilares, si
bien no vale para
elaborar marcadores
por sí sola.

La reacción básica de la PCR comienza con la
desnaturalización del DNA molde para separar las
cadenas, continúa con el alineamiento de un par de
oligonucleótidos con su DNA molde, y termina con la
polimerización para sintetizar un nuevo DNA entre los
dos oligonucleótidos. De aquí se vuelve a la
desnaturalización para comenzar un nuevo ciclo.

Hoy en día todo el proceso esta completamente
automatizado en un aparato llamado
Termociclador, y existe una batería de enzimas y
condiciones que permiten polimerizar hasta 35
kpb sin errores, aunque las condiciones normales
amplifican sin problemas fragmentos de 3 a 6 kpb
de longitud.
El número de técnicas de marcadores
moleculares descritas en la literatura científica
es cada vez más numeroso, por lo que vamos a
reunirlas en 3 categorías:
 RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los
fragmentos de restricción),
 MAAP (Múltiples perfiles arbitrarios de
amplificación) y
 STS (Sitios de secuencia etiquetada).

RFLP


RFLP (Polimorfismo en el
tamaño de los
fragmentos de
restricción).
Esta técnica, desarrollada
a finales de los 70, se
basa en la detección de
fragmentos de DNA de
distinto peso molecular
(por digestión con la
misma enzima de
restricción) en diferentes
organismos

Los fragmentos más
fáciles de analizar son los
“pequeños”, derivados de
la digestión del genoma
de las mitocondrias o los
cloroplastos, puesto que
delecciones, sustituciones
o mutaciones pueden
alterar significativamente
el patrón de bandas
identificable por
electroforesis en geles de
agarosa, donde migran de
acuerdo con su peso
molecular


En cambio, para moléculas de DNA de mayor
tamaño, como el DNA cromosómico, el patrón
de bandas es tan complejo que es necesario
utilizar sondas específicas para visualizar sólo
ciertos fragmentos mediante la técnica de
Southern Blot.
Las sondas de DNA para esta técnica suelen
corresponder a genes previamente conocidos,
aunque a veces se usan DNA preparados a
partir de amplificaciones inespecíficas.

Aunque la RFLP evalúa sólo un tipo de
polimorfismo en cada ensayo, el resultado es
muy preciso. Los primeros mapas genómicos
basados en la distribución física de los genes
en vez de la frecuencia de entrecruzamiento se
hicieron utilizando esta técnica.

Cuando se emplea la PCR en lugar
de sondas radiactivas para
visualizar los polimorfismos, se le
denomina PCR-RFLP
Técnicas MAAP
MAAP
 Término genérico acuñado en 1994
con el que se designan las técnicas
que emplean oligonucleótidos
arbitrarios para generar huellas
dactilares complejas. Entre estas
técnicas caben destacar...



RAPD (DNA polimórfico
amplificado al azar): Es
una de las técnicas más
versátiles desde que se
desarrolló en el año 1990.
Se usa una colección de
decanucleótidos para
amplificar por PCR áreas
específicas distribuídas al
azar por el genoma.
Su pequeñez y la baja
temperatura de
alineamiento (36°C)
aseguran que se unen a
infinidad de secuencias en
el genoma para conseguir
amplificar muchos
fragmentos de DNA.

Estos fragmentos se pueden
separar en geles de agarosa para
obtener perfiles electroforéticos
que variarán según el polimorfismo
de los distintos individuos o grupos
de individuos, y proporcionarán
una huella dactilar característica.

Es una técnica muy
cómoda, rápida,
requiere poco DNA
que además no
necesita estar muy
puro, no presupone
conocimientos previos
sobre la secuencia, y
se pueden distinguir
rápida y
simultáneamente
muchos organismos.

Sus inconvenientes
son que los
fragmentos
amplificados no
suelen corresponder
a DNA ligado a algún
carácter, sino
redundante, y que no
da información sobre
el número de copias
que el DNA genómico
contiene de la
secuencia
amplificada.


Esta tecnología ha sido
utilizada para la
catalogación de frutos,
selección de variedades,
y diferenciación de líneas
clonales.
También se está
utilizando para el análisis
de las variedades de una
serie de cultivos como el
apio, uva, limón y olivo.

AP-PCR (PCR con oligonucleótidos
arbitrarios): La idea es similar a la
de la RAPD, desarrollándose a la
vez que ésta, aunque se cambia el
diseño de los oligonucleótidos y el
tipo de PCR.

Los oligonucleótidos han de ser largos (no menos de 20
nt), y la PCR consta dos de ciclos de baja astringencia
(poco específicos) que permite la polimerización de una
batería de fragmentos característicos de cada variedad
Esta fase va seguida de ciclos
de alta astringencia para
amplificar (visualizar)
específicamente las bandas
anteriores.
 Los fragmentos amplificados
se pueden migrar en un gel
de agarosa para observar las
grandes diferencias entre
especies, o bien se puede
marcar radiactivamente y
migrar en gel de
poliacrilamida para obtener
resultados mucho más finos y
precisos.


Existe una variación denominada DAF
(Huellas dactilares por amplificación de
DNA) que utiliza oligonucleótidos de 5 a
15 bases, pero las huellas
proporcionadas suelen ser muy
complejas y difíciles de interpretar.

AFLP (Polimorfismo de la longitud de los
fragmentos amplificados): Esta técnica
se desarrolló en 1995 y combina el uso
de enzimas de restricción y
oligonucleótidos para PCR, de manera
que se obtienen marcadores moleculares
muy específicos sin necesidad de conocer
la secuencia con anterioridad

El DNA se corta con dos enzimas de restricción, una
de corte muy frecuente, y otra de corte poco
frecuente. A los fragmentos se les ligan
oligonucleótidos de extremos compatibles con las
enzimas usadas.y se amplifica por PCR. Jugando
con la complementariedad del oligonucleótido con
el sitio de restricción se puede disminuir o
aumentar el número de bandas amplificadas.

Una ventaja especial de
esta técnica es que es
capaz de generar
muchos marcadores
moleculares en una sola
reacción. Por eso el
resultado debe
resolverse en un gel de
poliacrilamida de alta
resolución, puesto que
no se resolverían en
agarosa.
STS

STS (Sitios
etiquetados por la
secuencia) o SSLP
(Polimorfismo de
longitud en las
secuencias
discretas)
Desarrollada a
partir de 1989,
aprovecha las
secuencias
conocidas, únicas
dentro del genoma,
para amplificarlas
por PCR.

Los STS (Sitios de secuencia etiquetada)
son un término general dado a un
marcador que se define por la ubicación
exacta de su cebador y por el orden de
las bases.



El polimorfismo se suele
encontrar fácilmente cuando lo
que se amplifican son intrones
en lugar de exones.
La ventaja principal es la
velocidad con la que se pueden
realizar los análisis una vez que
las parejas de oligonucleótidos
se han establecido claramente.
Por tanto se combinan la
rapidez de la RAPD con la
especificidad de la RFLP

Por la manera en que se determinan los
oligonucleótidos y por la forma de
analizar los polimorfismos, estas
técnicas STS han generado otras
técnicas derivadas, altamente
informativas pero bastante complejas.
Las aplicaciones de los marcadores
moleculares son muy diversas y es
de esperar que cada vez se les
encuentren nuevos usos. Por ahora
se vienen empleando en:
 la diferenciación de individuos,
 la discriminación entre clones,
 los análisis filogenéticos y
taxonómicos,

el mapeo de genomas,
 la cuantificación de
variabilidad génica intra
e interespecífica,
 las mejoras genéticas,
 La detección de
infecciones o propensión
a sufrirlas,
 la localización de
resistencia a
enfermedades, y
 en la dispersión de
especies.


Las Marcadores Moleculares
son una herramienta
fundamental en la
protección nacional ante el
nuevo entorno globalizado,
dado que permiten, para dar
unos ejemplos, cubrir
funciones importantísimas
tales como la detección de
patógenos en bienes de
consumo importados, la
identificación de
Organismos Genéticamente
Modificados introducidos
violando restricciones y
controles,

Igualmente
importante es el
hecho de que los
marcadores
moleculares nos
permiten tipificar
de variedades y
ostensiones
vegetales que se
desarrollan en el
país, registrarlas y
ponerlas bajo
registro para su
protección

La República Dominicana debe
desarrollar sus capacidades científicotécnicas y contar con su propia unidad
de marcadores moleculares, como
salvaguarda de sus intereses nacionales
estratégicos.





En el centro de
Biotecnología vegetal
del IIBI ya se están
haciendo trabajos de
marcadores
moleculares en una
diversidad de
especies:
Mango
Aguacate
Cítricos
Arroz
Muchísimas
Gracias