transgenesis y clonacion en reproducción porcina

TRANSGENESIS Y CLONACION EN REPRODUCCIÓN PORCINA
ANGELA MILENA CORTES TORO
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES U.D.C.A
FACUTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
VICE-RECTORIA DE INVESTIGACIONES
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
BOGOTÁ
2008
TRANSGENESIS Y CLONACION EN REPRODUCCIÓN PORCINA
ANGELA MILENA CORTES TORO
Trabajo de grado
Requerido para optar al titulo de
Médicos Veterinarios Zootecnistas
Director: Doctor David Pineda. MV. Patólogo Genital. Docente de
reproducción U.D.C.A.
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES U.D.C.A
FACUTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
VICE-RECTORIA DE INVESTIGACIONES
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
BOGOTÁ
2008
2
Nota de aceptación
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
______________________________
Firma del director
_____________________________
Firma del codirector
_____________________________
Firma del jurado
_____________________________
Firma del jurado
Bogotá, mayo 2008
3
CONTENIDO
pág.
INTRODUCCION
8
1. OBJETIVOS
10
1.1 OBJETIVO GENERAL
10
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
10
2. MARCO TEORICO
11
2.1 FISIOLOGÍA DE LA FECUNDACIÓN PORCINA
11
2.1.1 El ovocito
11
2.1.2 El espermatozoide
17
2.1.3 El oviducto
20
2.1.4 Desarrollo embrionario preimplantacional
22
2.2 PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES PORCINOS
25
2.2.1 Fecundación in Vitro
25
2.2.2 Maduración in vitro
30
2.2.3 Cultivo de Embriones
33
2.3 TRANSGENESIS Y CLONACION
39
2.3.1 Transgénesis en animales
39
2.3.2 Clonación
55
3. METODOLOGIA
76
4. IMPACTO ESPERADO
77
5. CONCLUSIONES
78
BIBLIOGRAFIA
80
4
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1. Animales transgénicos
40
Tabla 2. Mamíferos transgénicos.
41
Tabla 3. Producción de mamíferos transgénicos en diferentes especies.
52
Tabla 4. Trasplantes de órganos de animales a humanos.
53
Tabla 5. Principales Tipos de Celulares Utilizados en las Técnicas de
Clonación
58
Tabla 6. Factores que Afectan las Tasas de Gestación en La Partición de
Embriones
61
Tabla 7. Cronología de la clonación mediante transferencia Nuclear y
Separación de blastómeros
63
Tabla 8. Principales ventajas de la partición o división de Embriones
68
Tabla 9. Comparación entre la clonación por separación de Blastómeros y la
transferencia nuclear
69
5
RESUMEN
Esta monografía se basa en la recopilación de información de biotecnologías en
la reproducción animal como es la transgénesis y la clonación en porcicultura para
el mejoramiento genético de esta especie.
Desde el principio de los tiempos, el hombre ha intentado modificar las
características de los animales domésticos intentando incrementar tecnologías
que mejoren condiciones de los animales de compañía, de producción, de trabajo,
mediante la selección de los más aptos y el cruzamiento de ejemplares que
presentan mejores características: mayor producción de carne y leche o más
fuerza y resistencia tanto a enfermedades, medio ambiente y consanguinidad.
El enorme avance de la investigación biotecnológica en los últimos años ha
favorecido el desarrollo de técnicas que permiten introducir, eliminar o modificar de
forma específica un gen, o determinados tipos genes, en el genoma de un
organismo para producir seres vivos (animales, plantas y microorganismos) con
nuevas y mejores características. Este tipo de técnicas se denominas ingeniería
genética y los seres vivos que así se obtienen son los llamados organismos
modificados genéticamente. La ingeniería genética incluye un conjunto de
métodos que permiten aislar y fraccionar el DNA, y ensamblar los fragmentos
obtenidos con otras moléculas de DNA.
Por tal motivo, la clonación como la transgénesis representan una de las
tecnologías de gran interés mundial en la actualidad, debido a su aplicabilidad
tanto en los animales como en los seres humanos.
El sector porcino caracterizado por un alto nivel tecnológico de alta competitividad
en el mercado ha impulsado un gran proceso de modernización del sector,
optimizando todos los recursos y factores que intervienen en la producción
porcina. Estas importantes transformaciones en los sistemas de producción
intensiva, hacen a la industria porcina sea muy receptiva al uso de las nuevas
tecnologías de la reproducción, de modo que se puedan reducir costos y se
incremente la eficacia en la producción.
En un futuro se podría llegar a diseñar genéticamente, gracias a la tecnología
transgénica, las características productivas del animal, de modo que se contara
con cerdos con un crecimiento más rápido, menor cantidad de grasa en la canal,
mejores índices de conversión o mayor resistencia a enfermedades.
6
Por lo tanto, el interés que despierta la tecnología de la reproducción, tanto en el
área de la medicina como en la industria porcina, aumenta el afán por el desarrollo
de nuevos adelantos así como la puesta en marcha de las existentes. Uno de los
avances tecnológicos que más rápidamente se han desarrollado en esta década
ha sido la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos.
El objetivo del trabajo se basa en revisar literatura en las diferentes biotecnologías
de la reproducción animal haciendo un enfoque en la clonación y transgénesis en
el área de porcicultura.
7
INTRODUCCION
En los últimos años, la biotecnología de la reproducción en los animales
domésticos ha experimentado un gran crecimiento, aportando nuevas técnicas
que han repercutido en el desarrollo de innovadoras vías de investigación en el
campo de la medicina humana, así como de la industria animal. La biotecnología
de la reproducción incluye un conjunto muy diverso de técnicas, entre las que se
encuentran: inseminación artificial (IA), transferencia de embriones,
crioconservación de gametos y embriones, citometría de flujo para el sexaje de
espermatozoides, producción in vitro de embriones (PIV), transferencia nuclear y
microinyección de construcciones de ADN (Transgénesis y Clonación). Algunas de
estas tecnologías, como es el caso de la IA, están ampliamente implantadas en
porcino; sin embargo, el desarrollo de nuevas tecnologías de la reproducción en
porcinos está todavía retrasado respecto al bovino, a pesar del tremendo progreso
que ha experimentado en estos últimos años (Niemann y Rath, 2001).
Debido a las semejanzas fisiológicas que comparte con los humanos, el cerdo se
considera la especie de elección como potencial donante xenógrafo y como
productor de proteínas de interés farmacéutico secretadas por la leche de
animales transgénicos, obtenidos mediante microinyección de ADN en el
pronúcleo del zigoto. Además, recientemente se ha conseguido clonar con éxito
cerdos producidos por transferencia del núcleo de células somáticas de animales
adultos al citoplasma de ovocitos maduros (Polejaeva et al., 2000). Debido a que
las técnicas de producción de cerdos clonados y transgénicos requieren ovocitos
maduros y zigotos, respectivamente, existe un creciente interés en la producción
de ovocitos maduros y embriones porcinos a gran escala, mediante técnicas de
maduración y fecundación in vitro (MIV/FIV), con el fin de ser empleados en el
campo de la investigación básica y biomédica.
Por ende, desde sus primeros inicios el hombre ha seleccionado plantas y
domesticado animales mediante el cruzamiento selectivo de individuos con el fin
de transferir los caracteres deseados. La principal limitante de este proceso radica
en la incompatibilidad sexual observada cuando los organismos son muy
divergentes genéticamente, lo que impide esta transferencia entre especies. La
ingeniería genética permite romper esta barrera posibilitando la incorporación de
genes desde otras especies que de otra forma sería imposible con los métodos de
mejoramiento tradicional. De esta forma los organismos genéticamente
modificados o más comúnmente denominados transgénicos son organismos vivos
8
(plantas, animales o bacterias) manipulados genéticamente mediante la inserción
de un gen que habitualmente no formaba parte de su repertorio genético. La
finalidad de esto es proporcionar a la planta o animal nuevas características
productivas y hacerlos más eficientes y competitivos (Clark, 2002).
A pesar de que actualmente es de baja eficiencia, muestra que constituye una
alternativa en la solución de los problemas reproductivos. En la medida en que se
tenga mayor comprensión de sus deficiencias, en un futuro muy cercano permitirá
seleccionar y reproducir animales de interés económico y ecológico a gran escala.
Actualmente se requieren grandes cantidades de material biológico de alta calidad
para obtener resultados positivos lo que incrementa el costo de la técnica (Singla y
col 1997)
Por otra parte, el sector porcino, caracterizado por un alto nivel tecnológico,
supone un porcentaje muy importante de la actividad agraria europea. Este
mercado tan competitivo ha impulsado un gran proceso de modernización del
sector, optimizando todos los recursos y factores que intervienen en la producción
porcina. Estas importantes transformaciones en los sistemas de producción
intensiva, hacen a la industria porcina muy receptiva al uso de las nuevas
tecnologías de la reproducción, de modo que se puedan reducir costos y se
incremente la eficacia en la producción. En un futuro se podría llegar a diseñar
genéticamente, gracias a la tecnología transgénica, las características productivas
del animal, de modo que se contara con cerdos con un crecimiento más rápido,
menor cantidad de grasa en la canal, mejores índices de conversión o mayor
resistencia a enfermedades.
Por lo tanto, el interés que despierta la tecnología de la reproducción, tanto en el
área de la medicina como en la industria porcina, aumenta el afán por el desarrollo
de nuevas tecnologías así como la puesta en marcha de las existentes. Uno de los
avances tecnológicos que más rápidamente se han desarrollado en esta década
ha sido la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos, la transgénesis y la
clonación. Se han puesto a punto los procedimientos necesarios para la
producción a gran escala de embriones: obtención de ovocitos recogidos de
matadero, maduración (MIV) y fecundación (FIV) en el laboratorio. Además, del
desarrollo de la ingeniería genética en la utilización de diferentes especies además
de los cerdos en pro del desarrollo de alternativas terapéuticas para el ser humano
utilizando como mediadores a los animales a través de la transgénesis y la
clonación.
9
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Realizar una revisión de literatura actualizada sobre la importancia de la clonación,
transgenesis y desarrollo embrionario in Vitro en la reproducción porcina.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Determinar los factores que afectan la calidad de los ovocitos y su importancia
en la producción in Vitro de embriones porcinos para así establecer los
procesos de fecundación in Vitro, así como determinar los factores y efectos de
este mismo en la viabilidad del ovocito y del espermatozoide.
 Identificar las técnicas de clonación de embriones utilizadas en porcicultura para
reproducir animales genéticamente idénticos.
 Conocer las ventajas y desventajas de las técnicas de clonación, para
determinar la viabilidad del donador y determinar con esto su valor genético,
además de, determinar la importancia de los xenotrasplantes como alternativa
en la producción de órganos para transplantes en humanos.
 Reconocer la importancia de los animales transgénicos en salud publica como
en reproducción porcina y su aporte a la generación de modelos para el estudio
de enfermedades que afectan a los humanos.
10
2. MARCO TEORICO
2.1 FISIOLOGÍA DE LA FECUNDACIÓN PORCINA
El diseño de un sistema de producción con uso de biotecnologías en áreas de
producción in vitro de embriones, transgénesis y clonación precisa de un
conocimiento previo de los sucesos que acontecen en el proceso de fecundación
in vivo y de las condiciones ambientales a las que van a estar sometidos los
gametos masculino y femenino dentro del aparato reproductor de la hembra en las
diferentes fases de dicho proceso. Como apuntó Yanagimachi (1988): “la madre
naturaleza ha hecho su trabajo durante millones de años, mientras que nosotros
hemos comenzado a imitarla hace muy poco; por lo tanto, hay muchas cosas que
aún debemos aprender de ella”.
2.1.1 El ovocito
 Ovogénesis. Durante el desarrollo fetal, las células germinales primordiales del
ovario van a sufrir un proceso de diferenciación. Primero se transforman en
ovogonias por sucesivas divisiones mitóticas, las cuales dan lugar a los ovocitos
primarios al iniciarse la primera división meiótica.
La meiosis es un tipo de división celular exclusiva de las células germinales
(ovogonias y espermatogonias) y su objetivo es doble: la reducción a un número
haploide de cromosomas y la recombinación de la información genética (Polanski
y Kubiak, 1999). Antes de sufrir la meiosis, las células germinales replican su ADN
y contienen en ese momento 4 copias de ADN y un número 2n de cromosomas,
como cualquier célula diploide; mientras que entre las dos divisiones meióticas la
replicación de ADN queda suprimido, lo que asegura que los gametos resultantes
sean haploides. La meiosis consiste en dos divisiones: en la primera, las dos
células hijas pasan a tener 1n cromosomas y 2 copias de ADN; y en la segunda,
las 2 células resultantes contienen 1n cromosomas y 1copia de ADN. Así, con la
meiosis se obtienen 4 células hijas haploides y genéticamente diferentes, en el
caso del macho; mientras que en la hembra sólo da lugar a una célula, pues las
dos divisiones meióticas son asimétricas, y en cada una se forman una célula
grande y otra pequeña abortiva (corpúsculo polar). De este modo, se minimiza la
pérdida de productos almacenados en el ovocito, necesarios para el posterior
desarrollo embrionario temprano.
En las hembras, toda la población de ovocitos entra en meiosis sincrónicamente
en la vida fetal. La primera división meiótica progresa hasta que el ovocito alcanza
el estadio de diploide difuso de la profase I (estado dictiato), donde se produce la
11
primera detención de la meiosis, justo antes o poco después del nacimiento. A
partir de este momento, el ovocito comienza a ser rodeado por células
pregranulosas, las cuales forman una membrana basal alrededor de ellas,
quedando formado el compartimento folicular. La primera parada de la meiosis se
mantiene hasta momentos antes de la ovulación o de la atresia folicular (Tsafriri et
al., 1983), y es importante para asegurar que el ovocito disponga de tiempo
suficiente para crecer antes de la fecundación, de modo que sea capaz de
mantener el proceso de la embriogénesis.
Esta interrupción se mantiene mediante un sistema de control múltiple en el que
están implicados el adenosil monofosfato cíclico (AMPc) (Schultz, 1991; Mattioli,
1994; Dekel, 1999), la hipoxantina (Stromstedt y Byskov, 1999; Dekel, 1999) y el
factor inhibidor de la maduración del ovocito (Dekel, 1999), entre otros factores
(Thibault et al., 1987), y cuya finalidad es mantener inactivo al factor promotor de
la maduración (MPF). Se ha comprobado que el MPF es un regulador universal
(desde las levaduras hasta el hombre) de la transición de la fase G2 a metafase
tanto en la mitosis como en la meiosis, por lo que se ha propuesto llamarle factor
promotor de la metafase, manteniendo las mismas siglas. El MPF (Dekel, 1996)
está constituido por una proteinkinasa (p34cdc2) y una ciclina. Aunque no está
muy claro el mecanismo por el que el AMPc regula la detención meiótica, parece
ser que su acción en el ovocito viene mediada por la proteinkinasa A que, a través
de una cascada de reacciones bioquímicas no conocidas, previene la
defosforilación de la proteinkinasa p34cdc2, manteniendo al MPF en un estado
inactivo (Dekel, 1999)
En este estadio, los ovocitos se caracterizan por tener un núcleo prominente,
denominado vesícula germinal (VG) (Franchi et al., 1962), y por estar rodeados
por una capa de células epiteliales (foliculares), lisas no proliferativas, conocidas
como células pregranulosas, que ejercen un efecto inhibidor sobre la meiosis y el
crecimiento folicular. En el momento del nacimiento, la mayoría de los ovocitos
han alcanzado este estadio y se encuentran formando los folículos primordiales,
siendo la única fuente de gametos femeninos en el animal sexualmente maduro.
 Crecimiento del folículo y del ovocito. El ovocito y el folículo sufren un periodo
de crecimiento, que se caracteriza por ser una fase de intensa síntesis proteica y
de almacenamiento de macromoléculas (Moor el al., 1990). El folículo primordial
se transforma en folículo primario, donde el ovocito está rodeado por una capa
unilaminar de células granulosas cuboides, derivadas de las pregranulosas. En el
folículo primario se produce un aumento del volumen del ovocito, sin división
celular del mismo, y una hiperplasia e hipertrofia de las células de la granulosa,
dando lugar al folículo secundario (un folículo preantral multilaminar). En el ratón
se ha identificado un factor de diferenciación del crecimiento, conocido como GDF9, necesario en el inicio del crecimiento folicular al estimular la multiplicación de
las células de la granulosa, y que solamente se expresa en el ovocito (Stromstedt
12
y Byskov, 1999; Dong et al., 1996). El crecimiento folicular va acompañado de la
formación de una capa de células de la teca vascularizada alrededor de la
membrana basal.
Al alcanzar las células de la granulosa un número elevado, y en respuesta a la
FSH, se forma la cavidad antral repleta de fluido folicular (Canipari, 1994). Tras la
formación del antro, las células de la granulosa se diferencian en dos
subpoblaciones: por una parte, las células de la granulosa que revisten la pared
del folículo y forman un epitelio estratificado en contacto con la lámina basal; y por
otra, las células del cumulus oophorus que forman varias capas de células
cilíndricas alrededor del ovocito (Canipari, 1994). Cuando el folículo ha formado la
cavidad antral, pasa a llamarse folículo terciario, antral o de Graaf, y alcanza un
diámetro aproximado de 2,2 mm (Motlik et al., 1984).
El crecimiento del ovocito va unido a un aumento en el número de orgánulos
citoplasmáticas, como mitocondrias, aparato de Golgi y ribosomas, y a la
formación de los gránulos corticales a partir del complejo de Golgi (Stromstedt y
Byskov, 1999). Toda esta maquinaria celular, indicativa de una elevada actividad
metabólica, permite la síntesis y almacenamiento de ARN, proteínas y enzimas y,
en las últimas etapas del crecimiento, el desarrollo de la red de microtúbulos y
filamentos. También durante la fase de crecimiento se forma la zona pelúcida
(ZP), una cubierta extracelular glicoproteica que rodea a los ovocitos mamíferos.
La capa de células del cúmulus más próxima a la ZP se conoce con el nombre de
corona radiata.
En esta etapa de crecimiento se van a establecer unas comunicaciones entre el
ovocito y las células del cúmulus, mediante unos procesos citoplasmáticos de las
células de la corona radiata que cruzan la ZP y conectan con el oolema, conocidos
como uniones tipo gap (Gilula et al., 1978). Las células de la granulosa también se
interconectan mediante uniones tipo gap (Albertini y Anderson, 1974). Este
entramado de uniones intercelulares posibilita el intercambio de moléculas entre el
ovocito, las células de la granulosa y la circulación sanguínea, con una finalidad
nutritiva y reguladora, constituyendo el proceso de “cooperación metabólica”
(Canipari, 1994). Las células somáticas proporcionan nucleósidos, aminoácidos y
fosfolípidos, además de mantener un balance iónico y una estabilidad en el ARNm
en los ovocitos (Hunter, 2000). Esta cooperación es bidireccional, de modo que los
ovocitos porcinos secretan un factor de expansión del cúmulus (Nagyova et al.,
1997), además de un(os) factor(es) soluble(s) que regula(n) la esteroidogénesis de
las células del cúmulus (Coskun et al., 1995), suprime(n) la luteinización y
promueve(n) la proliferación de células de la granulosa en cultivo (Brankin et al.,
1999). No se han identificado estos factores solubles, aunque entre los candidatos
estarían varios factores de crecimiento, incluido el GDF-9.
13
Los folículos dominantes serán seleccionados de entre los folículos antrales para
continuar su crecimiento (Stromstedt y Byskov, 1999). La selección de los folículos
que producirán ovocitos maduros listos para ovular en cada ciclo estral está
determinada por la expresión de receptores para la hormona luteinizante (LH) y la
hormona folículo estimulante (FSH) en sus células de la granulosa (Espey, 1999).
Por ejemplo, en los folículos antrales pequeños, cuyas células de la granulosa no
poseen receptores para la LH, la reanudación de la meiosis inducida por esta
gonadotropina no se podrá producir; por lo tanto, los folículos seleccionados
deberán disponer de estos receptores. Los receptores para la FSH, sólo presentes
en la hembra en las células de la granulosa, aumentan de número en la fase de
crecimiento (Stromstedt y Byskov, 1999). Al actuar sobre las células de la
granulosa, la FSH va a desencadenar la expresión de una batería de genes que
codifican factores de crecimiento, enzimas y proteínas involucradas en la
esteroidogénesis y péptidos que regulan la liberación de gonadotropinas; los
cuales se van a sintetizar y acumular en el fluido folicular (Stromstedt y Byskov,
1999). Además las células de la teca, estimuladas por la LH, van a sintetizar
andrógenos que, posteriormente, serán transformados en estradiol por las células
de la granulosa (Stromstedt y Byskov, 1999). Los folículos dominantes tienen un
mayor número de receptores para la FSH y son más sensibles a ella que el resto
de folículos antrales, por lo que van producir grandes cantidades de estradiol e
inhibina. El estradiol y la inhibina van a regular negativamente la secreción de FSH
y, al disminuir su concentración, los folículos menos sensibles a la FSH
degeneran, sufriendo el proceso de atresia (Stromstedt y Byskov, 1999).
Justo después del pico preovulatorio de LH, los folículos seleccionados comienzan
una rápida expansión como resultado de la acumulación de fluido folicular en el
antro. Las altas concentraciones de gonadotropinas en el fluido folicular cambian
el patrón de síntesis de esteroides de las células de la granulosa y la teca (Espey,
1999), y preparan al ovocito para la reanudación de la meiosis y la maduración.
 Maduración del ovocito. La maduración del ovocito, dividida en maduración
nuclear y citoplasmática, hace referencia a todos los cambios nucleares,
citoplasmáticos y de membrana que sufre el ovocito, con el fin de prepararse para
ser fecundado con éxito y desarrollarse posteriormente.
El estímulo que desencadena el inicio de la maduración del ovocito es el aumento
preovulatorio en los niveles de gonadotropinas, en especial de LH. Además de la
reanudación de la meiosis, el pico de la LH desencadena otras transformaciones
dentro del folículo, como alteraciones en la esteroidogénesis folicular y cambios en
el complejo cúmulus-ovocito (COCs) (Moor et al., 1990; Motlik et al., 1986). La
respuesta inmediata de las células de la granulosa a la interacción con la LH es la
activación de la adenilato ciclasa y la generación de AMPc.
14
Por tanto, la reanudación de la meiosis viene precedida por un aumento en el
AMPc; lo que parece estar en contradicción con su actuación en el manteniendo
del bloqueo meiótico en el ovocito. La explicación es que el AMPc desempeña un
papel doble en la regulación de la meiosis. Los niveles basales de AMPc
producidos por las células somáticas en los folículos antrales pequeños son
transferidos de manera continua al ovocito, a través de las uniones tipo gap, para
mantenerlo en la parada meiótica, pues el ovocito no es capaz de producir AMPc a
los niveles necesarios. Sin embargo, a partir de la formación de receptores para la
LH en las células del cúmulus y granulosa del grupo de folículos dominantes,
éstos pueden responder al pico preovulatorio de la LH produciendo grandes
cantidades de AMPc. Las elevadas concentraciones de AMPc en los folículos
dominantes median en la acción de la LH sobre la conexina 43, una proteína que
forma parte de las uniones tipo gap ováricas. Mediante reacciones de fosforilación/
defosforilación, se producen cambios en la conformación de la conexina 43 que
inducen una inmediata reducción de las comunicaciones intercelulares en dichos
folículos y, por tanto, en la cooperación metabólica entre sus células (Gilula et al.,
1978; Séller y Schultz, 1980). Este fenómeno, conocido como expansión o
mucificación del cúmulus (Eppig, 1979), se produce 16 horas después del pico de
gonadotropinas. Bajo esas condiciones, el flujo de AMPc desde las células del
cúmulus hacia el ovocito desciende por debajo del umbral requerido para inhibir la
activación del factor promotor de la maduración (o de la metafase) (MPF) y el
ovocito reanuda la meiosis (Dekel, 1999). Esto explica porqué se produce una
reanudación espontánea de la meiosis al extraer los ovocitos de los folículos y
cultivarlos in vitro, incluso en ausencia de hormonas, como consecuencia del
rápido deterioro de la integridad morfológica de las células foliculares (Moor y
Crosby, 1987) que conlleva una disminución en el flujo de AMPc hacia el ovocito
(Motlik et al., 1986).
La maduración nuclear comienza tras la reanudación de la meiosis. El paso de VG
a metafase II (MII) conlleva: la disolución de la membrana nuclear conocida como
“rotura de la vesícula germinal”, la formación del huso meiótico y la condensación
de la cromatina en cromosomas homólogos que se alinean en el huso, alcanzando
entonces el estadio de metafase I; para continuar con la segregación de los dos
grupos de cromosomas homólogos, dando lugar a la extrusión del primer
corpúsculo polar (CP) y al paso del ovocito al estadio de MII. La maduración
nuclear finaliza cuando el ovocito completa la primera división meiótica con la
formación del primer CP, alcanzando el estadio de MII, unas 36-40 horas después
del pico de LH (Hunter, 1988), tras lo cual se produce la segunda detención de la
meiosis.
El MPF en forma activa es necesario para la rotura de la VG, la condensación de
la cromatina, y su actividad alcanza un pico en metafase I y II, para decrecer en
anafase I y II (KiKuchi et al., 1995), lo que indica que su inactivación también es
necesaria para esta progresión. Por otra parte, la reorganización de los
15
microtúbulos y la apropiada orientación del huso durante la MI parece estar
mediada por las MAP kinasas (MAPK), cuya actividad también está inhibida de
algún modo por el AMPc y aumenta con la reanudación de la meiosis. A diferencia
del MPF, la actividad de las MAPK permanece elevada en los estadios de
anafase.
La maduración citoplasmática, en cambio, es un término más amplio que abarca
una serie de acontecimientos no directamente relacionados con la progresión de la
meiosis pero que preparan al ovocito para la fecundación y el desarrollo
embrionario posteriores (Abeydeera, 2002).
En el citoplasma del ovocito se produce una redistribución de las mitocondrias y
de los gránulos corticales (GC) (Thibault et al., 1987; Cran, 1985). Tras la rotura
de la VG, las mitocondrias migran para situarse en una posición perinuclear
durante la maduración (Thibault et al., 1987; Cran, 1985), siendo este movimiento
mitocondrial necesario para la progresión de la maduración (Moor et al., 1990).
Los GC son un tipo especial de lisosomas primarios, formados a partir del
complejo de Golgi y del retículo endoplásmico, compuestos por glicoproteínas y
enzimas hidrolíticas. Los GC migran hacia la periferia del ovocito, aumentan de
número al final del periodo de maduración (Cran, 1985) y se sitúan debajo de la
membrana plasmática formando una monocapa (Crang y Cheng, 1986);
circunstancia que será fundamental para el bloqueo de la poliespermia.
Además, la maduración citoplasmática implica una reprogramación de la síntesis
proteica. Parte del ARNm que había sido almacenado durante la fase de
crecimiento comienza a transcribirse, sintetizándose nuevas proteínas que serán
esenciales en la progresión de la meiosis, la regulación de la penetración
espermática y la descondensación de la cabeza del espermatozoide (Moor et al.,
1990). Entre estas proteínas, el factor de crecimiento del pronúcleo masculino, que
será esencial para la formación del pronúcleo masculino tras la penetración del
espermatozoide.
 Ovulación. El pico preovulatorio de LH, inducido por el estradiol producido por
los folículos preovulatorios, desencadena finalmente la ovulación (Stromstedt y
Byskov, 1999). La LH también estimula la luteinización de las células de la pared
de los folículos ovulados, es decir su transformación de productoras de estrógenos
a productoras de progesterona, que será la principal hormona esteroidea
producida por el cuerpo lúteo tras la ovulación (Geisert, 1999).
En la especie porcina, la ovulación suele tener lugar 30-40 horas después del
inicio del estro, tomando el pico preovulatorio de LH como día 0 del ciclo estral, y
dura de 1 a 3 horas (Geisert, 1999). Sin embargo, según otros autores (Du Mesnil
Du Buisson, et al., 1970) el comienzo de la ovulación es posterior (38-42 h),
debido a que tanto el inicio como la duración de la ovulación pueden variar
16
ampliamente (Flowers y Esbenshade, 1993). Los folículos preovulatorios tienen un
tamaño de 7 a 11 mm de diámetro y, momentos antes de la ovulación, sus tensas
paredes se vuelven pendulantes y flácidas como consecuencia de una
disminución de la presión intrafolicular y los complejos cúmulus-ovocito (COCs) se
desligan de la pared folicular (Hunter, 1967; Hunter, 1988).
El número de ovocitos liberados durante la ovulación es variable, oscilando entre
10 y 24 (Geisert, 1999); y se encuentran en estadio de MII con el primer CP
separado y rodeados por las células del cúmulus y por líquido folicular viscoso.
2.1.2 El espermatozoide. En los mamíferos, el espermatozoide es la única
célula diseñada para abandonar el organismo y así poder completar su función
biológica de unión al ovocito maduro durante la fecundación, formando el zigoto.
Muchos de sus rasgos físicos y bioquímicos han evolucionado de modo que se
asegure el paso a través del tracto reproductivo masculino y femenino, la
protección del ADN de la cabeza espermática durante este tránsito, la penetración
de las envolturas del ovocito, y la fusión con la membrana plasmática del ovocito.
Las especiales características presentes en el espermatozoide incluyen: un
genoma haploide, un contenido de ADN nuclear altamente condensado y
transcripcionalmente inactivo, proteínas nucleares específicas (protaminas en
sustitución de las histonas) relacionadas con la compactación de este material
genético, un compartimento acrosomal con enzimas hidrolíticas localizado en la
parte anterior de la cabeza espermática y de vital importancia en la fecundación,
un axonema equipado para proporcionar movilidad con características
estructurales no vistas en los flagelos de otras células eucariotas o procariotas, y
una membrana plasmática que presenta una polaridad extrema en la distribución
de sus proteínas y lípidos (Millette, 1999).
De este modo, el espermatozoide queda estructurado en cabeza y cola. La
cabeza, que en el caso del cerdo es de forma oval, contiene el acrosoma y el
núcleo; mientras que la cola, dividida en cuello, pieza intermedia y pieza principal,
contiene el axonema y una funda de mitocondrias localizada en la porción
intermedia rodeando al axonema (Robl y Fissore, 1999).
 Espermatogénesis. La espermatogénesis es el proceso de transformación
gradual desde célula germinal hasta espermatozoide y consta de tres fases:
proliferación, división reductora (o meiosis) y diferenciación (o espermiógenesis).
La espermatogénesis tiene lugar en los túbulos seminíferos de los testículos, cuyo
epitelio consta de dos tipos de células: las células germinales y las células
somáticas o de Sertoli (Hess, 1999). A diferencia de los ovocitos, los
espermatozoides son producidos a partir de la pubertad y durante el resto de la
vida, en la mayoría de los machos (Robl y Fissore, 1999).
17
En la fase de proliferación, las células germinales masculinas se transforman en
espermatogonias por sucesivas divisiones mitóticas. En la fase de meiosis, las
espermatogonias sufren dos divisiones meióticas que, como se explicó en el
apartado son simétricas y dan lugar a 4 células hijas haploides y genéticamente
diferentes, dos de ellas portadoras del cromosoma sexual X y las otras dos del Y,
llamadas espermátidas. Finalmente, las espermátidas sufren una fase prolongada
de diferenciación, conocida como espermiogénesis, en la que experimentan un
conjunto de modificaciones que les llevan a convertirse en una célula altamente
especializada, el espermatozoide.
Durante esta metamorfosis celular, los principales cambios estructurales que sufre
la espermátida son: elongación del núcleo y condensación de la cromatina,
formación del acrosoma a partir del aparato de Golgi, formación de una larga cola
que contiene el axonema (formado a partir del complejo centriolar) y mitocondrias
en su región intermedia, y pérdida del contenido citoplasmático no necesario
(Hess, 1999; Oko y Clermont, 1999). Una vez completado el proceso, los
espermatozoides son liberados a la luz del túbulo seminífero (Robl y Fissore,
1999).
 Maduración final del espermatozoide
- Epidídimo. Los espermatozoides abandonan el testículo y pasan a través del
epidídimo hasta el conducto deferente. Los espermatozoides testiculares, aunque
ya transformados en células altamente especializadas, no son todavía capaces de
fecundar, sino que aún deben experimentar una maduración final, que va a tener
lugar durante su transporte a través del epidídimo. A lo largo de su trayecto por el
epidídimo, se producen una serie de transformaciones en el espermatozoide que
le otorgan la capacidad de interaccionar con los gametos femeninos y fecundarlos
(Yanagimachi: 1988, 1994). Este proceso se conoce como “maduración
epididimaria”.
Uno de los principales cambios que experimenta el espermatozoide es el
desarrollo de la capacidad de movimiento progresivo; ya que al abandonar el
testículo, los espermatozoides presentan una movilidad nula o muy débil, debido,
en parte, a una falta de maduración de su membrana plasmática (Yanagimachi,
1994). Durante la maduración epididimaria, los lípidos de la membrana de los
espermatozoides sufren diferentes alteraciones físicas y químicas (Wolf et al.,
1988), y se producen cambios en el patrón de distribución de las proteínas
intramembranosas (glicoproteínas) (Suzuki, 1990). Asimismo, se altera la
distribución de los antígenos de la membrana acrosomal externa (Phillips et al.,
1991), que podría preparar al espermatozoide para la posterior fusión entre la
membrana acrosomal externa y la plasmática que tendrá lugar durante la reacción
acrosómica. (Yanagimachi, 1994).
18
El epidídimo presenta una elevado nivel de síntesis de colesterol, que es
transferido a la membrana espermática (Suzuki, 1990); por lo que se ha sugerido
que el colesterol sea una de las moléculas claves en la alteración de las
características de la mebrana plasmática de los espermatozoides durante su
maduración (Parks y Hammerstedt, 1985). La estabilización de la membrana por el
colesterol puede ser beneficiosa para el transporte de los espermatozoides a
través de los diferentes, y a menudo hostiles, microambientes dentro del tracto
femenino antes de alcanzar al ovocito (Yanagimachi, 1994). Algunos
espermatozoides alcanzan su capacidad fecundante mucho antes (o en una
región más proximal del epidídimo) que otros; aunque es en la cola del epidídimo,
el principal reservorio de espermatozoides, donde la gran mayoría de ellos
adquiere su completa capacidad fecundante (Yanagimachi, 1994). En el cerdo, el
transporte de los espermatozoides por el epidídimo dura 10 días, pudiendo
permanecer de 4 a 7 días almacenados en la cola del epidídimo antes de ser
eyaculados (Geisert, 1999).
- Eyaculación. Durante la eyaculación, los espermatozoides entran en contacto
con las secreciones de las glándulas accesorias del aparato genital masculino,
que constituyen el plasma seminal. El semen eliminado por la uretra consiste, por
tanto, en una suspensión de espermatozoides en plasma seminal.
En este proceso, los espermatozoides entran en contacto con unos factores
decapacitantes presentes en el plasma seminal. Estos factores, conocidos como
factores de decapacitación o estabilizadores del acrosoma, se presentan en el
espermatozoide en forma de glicoproteínas de superficie. Los factores
estabilizadores del acrosoma evitan la capacitación prematura de los
espermatozoides, de modo que éstos no adquieran la capacidad fecundante final
mientras migran por el tracto genital femenino, antes de haber llegado al lugar
donde se llevará a cabo la fecundación (Töpfer-Petersen et al., 1995).
La eyaculación del verraco se produce en tres fases o fracciones: una fracción
preespermática, clara y constituida por plasma seminal libre o pobre en
espermatozoides; seguida por una fracción rica o espermática, de apariencia
cremosa debido a su elevada concentración espermática; y una fracción pobre o
postespermática, de color blanquecino o transparente, compuesta por plasma
seminal y una baja concentración de espermatozoides.
Durante la eyaculación, sobretodo al final, se secretan unos corpúsculos
gelatinosos o “tapioca” procedentes de las glándulas de Cowper, que van a formar
un tapón para sellar el cérvix de la hembra, evitando en la monta natural el reflujo
del voluminoso eyaculado del verraco (200-300 ml, aproximadamente) (Geisert,
1999).
19
2.1.3 El oviducto. El oviducto de los mamíferos proporciona el microambiente
necesario para la captura, transporte y maduración de los ovocitos ovulados; el
transporte, almacenamiento y capacitación de los espermatozoides; la
fecundación y finalmente, las primeras divisiones del embrión (Hunter, 1988). Este
microambiente apropiado se debe tanto a las características especiales de la
superficie celular del oviducto como al fluido oviductal.
 Anatomía e histología del oviducto. El oviducto se divide anatómicamente en
tres segmentos principales: el infundíbulo, la ampolla y el istmo. El infundíbulo
termina en unas fimbrias que conectan con el ovario para facilitar la captura del
ovocito en el momento de la ovulación y está abierto hacia la cavidad peritoneal
por el ostium tubárico. El istmo conecta con el útero a través de la unión útero
tubárica (UUT) (Beck y Boots, 1974).
La arquitectura histológica del oviducto es muy sencilla, con una mucosa no
glandular (endosálpinx), cubierta por un epitelio pseudoestratificado de
revestimiento compuesto por células ciliadas y no ciliadas (o secretoras); dos
capas de músculo liso, una externa longitudinal y una interna circular (miosálpinx);
y una cubierta serosa (mesosálpinx) que se continúa con la serosa peritoneal
(Rodríguez-Martínez et al., 1985).
El espesor de las capas mucosa y muscular no es homogéneo a lo largo del
oviducto. Mientras que el grosor de la capa muscular interna disminuye hacia la
zona del ostium, los pliegues longitudinales de la capa mucosa adquieren mayor
complejidad, formando incluso pliegues secundarios y terciarios. También varía la
proporción de células ciliadas y secretoras a lo largo del oviducto, siendo en las
fimbrias y el infundíbulo más abundantes las células ciliadas, y disminuyendo a la
vez que se incrementan las células secretoras hacia el istmo (Hafez, 1972; Leese,
1983). Esta especial distribución determina la presencia de compartimentos en la
superficie del oviducto con características específicas, que proporcionan el
ambiente ideal para soportar los procesos reproductivos que van a tener lugar
(Boatman, 1997).
 Fluido oviductal. El fluido oviductal (FO) está constituido principalmente por una
mezcla compleja de sustancias derivadas del plasma sanguíneo, a través de
trasudación selectiva, y de proteínas oviductales específicas (Beier, 1974; Harper,
1988; Leese, 1988). El FO está compuesto por proteínas, enzimas, aminoácidos,
compuestos energéticos, hormonas y electrolitos (Romar, 2001). La composición
del FO varía en las distintas fases del ciclo ovárico. Estas variaciones están
controladas por las hormonas ováricas esteroides (Cox y Leese, 1997). También
se observan variaciones en las características fisicoquímicas del FO, tales como el
volumen, pH, osmolaridad, etc. Además, la composición y características del FO
no son homogéneas en todo el oviducto, sino que varían según la región,
constituyendo diferentes microambientes (Biggers y Borland, 1976).
20
 Transporte del ovocito. En el momento de la ovulación, el extremo fimbriado del
oviducto abraza al ovario, capturando el contenido de los folículos ovulados, es
decir, los ovocitos rodeados por un espeso agrupamiento de células del cúmulus
(Hunter, 1989) y con una pequeña cantidad de fluido folicular viscoso. Los ovocitos
se disponen en la ampolla oviductal, donde se forman agregados entre los COCs,
de ahí son transportados hacia el lugar de la fecundación, en la unión ampular
ístmica, proceso que dura unos 30-45 minutos (Hunter, 1989).
En el transporte de los ovocitos intervienen las ondas de contracción peristáltica
del miosálpinx, el continuo batido hacia el útero de los cilios que revisten la
ampolla y los movimientos del mesosálpinx (Hunter, 1989). Durante el transporte
de los ovocitos, parece que se produce una maduración final del ovocito
secundario debido al cambio de microambiente que experimenta al pasar del
folículo al oviducto (Hunter, 1989).
En el oviducto los ovocitos se denudan, es decir, pierden el revestimiento de
células del cúmulus mediante la propia acción mecánica y por la acción enzimática
de la hialuronidasa de las cabezas de los espermatozoides (Harper, 1988). Los
ovocitos permanecen en el lugar de la fecundación durante 24-48 horas y aquéllos
que han sido fecundados pasan al útero en estadio de embriones de 4 células
(Harper, 1989), mientras que los no fecundados degeneran en el útero por
reblandecimiento y degeneración de la zona pelúcida.
 Transporte del espermatozoide. El transporte de los espermatozoides a través
del tracto genital femenino se divide en tres etapas: 1ª) un rápido transporte
transuterino inmediatamente después de la deposición del semen, 2ª) la
colonización de un reservorio de espermatozoides en la UUT y en el inicio del
istmo (Hunter, 1995), y 3ª) una lenta liberación de espermatozoides desde el
reservorio hacia el lugar de la fecundación, en la unión ampular ístmica, en
relación con la ovulación (Barrat y Cooke, 1991).
De los miles de millones de espermatozoides depositados en la cerda durante la
cubrición o IA, sólo de cien a doscientos mil colonizan el reservorio de la UUT en
1-2 horas (Hunter, 1984). En él, los espermatozoides contactan con los cilios por
su región apical (Rodríguez-Martínez et al., 1990; Mburu et al., 1997),
permaneciendo la mayoría de ellos viables (Mburu et al., 1997). La detención de
los espermatozoides en el reservorio se ve favorecida por la presencia de una
gran cantidad de secreciones mucosas muy viscosas (Rodríguez-Martínez et al.,
1998a), ricas en mucopolisacáridos y glicoproteínas específicas, unido a la
reducción de la luz del oviducto en la UUT y el istmo provocada por el edema de la
lámina propia (Hunter, 1984). Además, parece que existe una unión selectiva de
espermatozoides al epitelio (Mburu et al., 1997), teniendo mayor afinidad aquéllos
no capacitados (Fazelli et al., 1999). Mientras los espermatozoides permanecen
21
en el reservorio, se produce una disminución de su metabolismo, y por tanto de su
movilidad, debido a las especiales condiciones físico- químicas que se dan en este
lugar (Smith, 1998).
Las funciones que va a desempeñar el reservorio espermático son las de: prevenir
la poliespermia, gracias a la retención de espermatozoides que evita que un
número elevado llegue a la zona de fecundación; y modular la capacitación
espermática, mediante un mecanismo de retraso (Smith, 1998). Queda por
determinar si el retraso de la capacitación es debido a las secreciones
intraluminales y/o a la unión de los espermatozoides a la membrana apical de las
células epiteliales del istmo (Murray y Smith, 1997).
2.1.4 Desarrollo embrionario preimplantacional
 Vínculos materno – embrionario. Durante los primeros estadios de la gestación,
las interacciones maternas embrionarias en porcino tienen una gran importancia,
ya que en esta especie, como en otros ungulados domésticos, el periodo
preimplantacional es bastante prolongado. La importancia de esta estrecha
relación entre el desarrollo embrionario y el ambiente uterino queda patente en la
sincronía necesaria entre el estadio del embrión y del útero en las transferencia de
embriones.
 Periodo pre–eclosion
 División embrionaria. La fecundación tiene lugar en el oviducto, en la unión
ampular ístmica. La primera división se produce de 17 a 19 horas tras la ovulación
(Hunter, 1974). Los embriones se mantienen en el estadio de 2 células sólo de 6 a
8 horas; sin embargo el estadio de 4 células se prolonga durante 20-24 horas
(Flint, 1981), por lo que la mayoría de los embriones entran en el útero en este
estadio (Harper, 1988; Davis, 1985). Según Hunter (1974), los embriones y los
ovocitos no fecundados pasan al útero 46- 48 horas tras la ovulación, aunque esta
entrada se puede prolongar hasta 3 días después de la ovulación.
Tras ese periodo de 2 días en el que los embriones son retenidos en el oviducto,
las concentraciones crecientes de progesterona van a causar la dilatación del
oviducto y, como resultado, el paso de los embriones hacia el útero (Dziuk, 1985).
La retención de los embriones en el oviducto permite que el ambiente uterino sufra
una serie de modificaciones, tales como el paso de granulocitos
polimorfonucleares a través del epitelio uterino durante el estro (Stroband et al.,
1986). El oviducto secreta sustancias que podrían modificar la composición de la
ZP (Hedrick et al., 1987), y además afectar a la tasa de división (Fukui et al., 1988)
o a la viabilidad embrionaria (Gandolfi y Moor, 1987). Asimismo, el ambiente
22
oviductal también provoca una demora en la digestión enzimática de la ZP de los
embriones e influencia su función de barrera selectiva (Broemann et al., 1988).
El útero va a ser el compartimento en el que se desarrollarán los embriones
porcinos desde el estadio de 4 células hasta el nacimiento (Stroband y Van der
Lende, 1990). La pared uterina está constituida por la serosa, el miometrio y el
endometrio; y este último está formado por una túnica propia y dos tejidos
epiteliales: el epitelio luminal y las glándulas, que reposan sobre la túnica propia
(Stroband y Van der Lende, 1990). El útero no es un simple saco en el que los
embriones flotan más o menos libres, sino que su pared está plegada de tal modo
que los pliegues opuestos se entrelazan y la luz uterina queda reducida a un
espacio angosto. Las células epiteliales del útero sufren cambios en su altura a lo
largo del ciclo estral (Sidler et al., 1986), al igual que también se ven modificados
los pliegues de la pared (Sidler et al., 1986). Por otra parte, es posible que los
embriones también cambien su propio microambiente uterino al liberar hacia el
útero esteroides, que se encuentran a altas concentraciones en los embriones
tempranos, los cuales actuarían sobre la permeabilidad vascular local y la
liberación de proteínas endometriales; ya que la síntesis y secreción de proteínas
uterinas está modulada por el estrógeno y la progesterona (Simmen et al., 1988).
El concepto de que los embriones no están flotando en un ancho lumen uterino,
sino que se encuentran en un espacio limitado entre los pliegues de la pared da
más credibilidad a las consideraciones sobre el potencial de los embriones
jóvenes de cambiar su propio microambiente uterino.
El epitelio y endotelio endometrial funcionan como una barrera de intercambio
selectivo entre la circulación sanguínea y la luz uterina (McRae, 1988). Además, el
fluido uterino de los mamíferos, incluido el cerdo, parece ser que contiene factores
estimulantes e inhibidores de la síntesis de ADN embrionaria (Flint, 1981). En un
estudio realizado en ovino, en el que se transfirieron asincrónicamente embriones,
aquéllos que estaban retrasados en relación con el útero se desarrollaron más
rápido, mientras que los que estaban adelantados respecto al estadio uterino lo
hicieron más lentamente (Wilmut et al., 1985), lo que indica la importancia del
ambiente uterino. Parece ser que el ambiente uterino cambiante va a influir en el
desarrollo embrionario y la viabilidad de los embriones.
El estadio de mórula de 8-16 células se alcanza alrededor del día 4, tomando el
momento de la ovulación como día 0 (Stroband y Van der Lende, 1990). Durante
el proceso de división, las organelas citoplasmáticas son escasas y están
concentradas alrededor del núcleo, mientras que las inclusiones de vitelo llenan
las zonas periféricas del citoplasma. Las mitocondrias, que son globulares durante
los primeros estadios de división, se elongan en el estadio de mórula, lo que
sugiere un incremento en su actividad metabólica. Los nucleolos se observan a
partir de las 8 células y su desarrollo se acompaña de un incremento en el número
de ribosomas. Todo ello indica la activación del genoma embrionario, es decir, el
23
punto a partir del cual el genoma embrionario comienza a ser
transcripcionalmente activo y pasa a ser el que controla el desarrollo del embrión
(Exley y Carol, 1999); y corresponde en el cerdo al inicio de la síntesis de ARN en
el estadio de 4 células (Freitag et al., 1988). Antes de esta activación genómica, el
desarrollo embrionario está controlado por proteínas y ARN maternos, sintetizados
y almacenados en forma inactiva por el ovocito (Exley y Carol, 1999). El bloqueo
en el estadio de 4 célula, que supone un obstáculo para el cultivo in vitro,
corresponde al momento de la activación del genoma embrionario, y es análogo al
que sufren los embriones ovinos en 8-16 células o los bovinos en 8 células.
 Formación del Blastocisto. A partir del estadio de mórula compactada, los
blastómeros internos se diferenciarán en la masa celular interna, que a su vez
dará lugar al futuro embrión verdadero; mientras que los blastómeros externos se
transformarán en el trofoblasto, que será el origen de parte de los anejos
embrionarios y que participará especialmente en la formación de la placenta
(Johnson, 1981).
Durante el proceso de compactación, los blastómeros exteriores forman una capa
de células polarizadas en estrecho contacto (Dulcibella, 1977). Más tarde se
forman entre estas células vecinas unos complejos de unión, que incluyen uniones
herméticas y desmosomas, y a partir de aquí el trofoblasto queda formado
(Borland, 1977; McLaren y Smith, 1977). Las células del trofoblasto tienen
permeabilidad selectiva, lo cual va a favorecer el transporte de sodio y agua que
contribuirá a la formación del blastocele (Borland, 1977); momento a partir del cual
el embrión alcanza el estadio de blastocisto.
Los blastómeros internos, sin embargo, se diferenciarán más tarde.
En el cerdo las primeras señales de compactación se observan en el día 4, en el
estadio de 8 células (Hunter, 1974), la diferenciación entre las células o
blastómeros interiores y exteriores comienza a partir de las 12-16 células en
adelante y los primeros complejos de unión aparecen en el estadio de mórula
compactada alrededor del día 5 (Barends et al., 1989). El estadio de blastocisto se
alcanza en el día 5-6 y el número de células en el momento de la formación del
blastocele es normalmente de 16-32 (Papaioannou y Ebert, 1988).
Durante la formación del blastocele, las células del trofoblasto están bien
desarrolladas y polarizadas, contienen un número creciente de mitocondrias y
algunas hebras de retículo endoplásmico y aparato de Golgi, y presentan
numerosas microvellosidades orientadas hacia la luz uterina; mientras que las
células de la masa celular interna presentan formas desiguales, no muestran
polaridad y sus organelas apenas están desarrolladas. Sin embargo, ambos tipos
celulares contienen grandes glóbulos de vitelo y algunas gotas lipídicas en este
estadio.
24
Antes de la eclosión, los blastocistos sufren un fenómeno de expansión, de modo
que ocupan por completo el espacio perivitelino. La media de células en los
blastocistos porcinos expandidos es de 65-120. La proporción de células que
constituyen la masa celular interna en este estadio es como máximo del 25% del
total de células del embrión (Papaioannou y Ebert, 1988).
 Eclosión y periodo post – eclosión. Hasta el momento de la eclosión, la ZP
desempeña una importante función en la regulación osmótica (Bronson y
McLaren, 1970), la contención de los blastómeros en el embrión (Modlinski, 1970)
y la mejora de la supervivencia del ovocito y el embrión en el oviducto y en el útero
(Dumont y Brummett, 1985). La rotura de la ZP en los embriones porcinos se
produce en el día 6-7, y este proceso parece ser independiente del número de
células del blastocisto, al menos en estudios realizados in vitro (Niemann et al.,
1983). No se conocen con exactitud los factores que causan la lisis de la ZP, pero
podrían estar involucrados fenómenos mecánicos, enzimas embrionarias o
factores uterinos. En el momento de la eclosión, los blastocistos porcinos
contienen prostaglandina E (Stone et al., 1986), que podría estar implicada en la
regulación del transporte de agua. Este efecto mecánico del agua, como ocurre en
los embriones bovinos (Betteridge y Flechon, 1988), podría colaborar en la rotura
de la ZP, previa a la eclosión del blastocisto.
Tras la eclosión, los blastocistos porcinos permanecen en la luz del útero hasta el
día 13 (Dantzer, 1985), lo que constituye un periodo preimplantacional muy largo
si se le compara con el de los humanos o los animales de laboratorio. El diámetro
de los blastocistos recién eclosionados es de 0.2 mm aproximadamente.
Entre la eclosión y la implantación, el desarrollo embrionario es peor soportado por
los sistemas in vitro que en estadios más tempranos. Por ejemplo, la elongación y
expansión de los blastocistos eclosionados, al ser dependiente de factores
uterinos, no tiene lugar in vitro. Hay, por lo tanto, una palpable evidencia de la
interrelación entre los embriones y el útero durante este periodo posterior a la
eclosión. Pero no nos vamos a extender más en este estadio, pues el desarrollo
embrionario in vitro se da por concluido tras la eclosión de los blastocistos.
2.2 PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES PORCINOS
2.2.1 Fecundación in Vitro. La fecundación in vitro (FIV) se ha definido como la
unión o cocultivo de espermatozoides capacitados y ovocitos maduros de forma
que la penetración espermática ocurra fuera del tracto genital femenino (Martínez
et al., 1989). La producción in vitro de embriones (PIV) es un proceso más amplio
que comprende: la obtención y maduración in vitro (MIV) de los ovocitos, la
capacitación in vitro de los espermatozoides, el cocultivo de ambos gametos o
25
FIV, y el cultivo in vitro de los embriones resultantes (CE) hasta alcanzar el estadio
de blastocisto.
En 1974, Motlik y Fulka (1974) consiguieron fecundar in vivo ovocitos porcinos que
habían sido madurados in vitro y, cuatro años más tarde, Iritani et al. (1978)
lograron la primera MIV-FIV en porcino, utilizando espermatozoides incubados en
tractos reproductivos aislados de hembras. Nagai et al. (1984) fueron los primeros
en capacitar in vitro espermatozoides porcinos con éxito. Un año después, Cheng
(1985) obtuvo el nacimiento de crías a partir de ovocitos porcinos madurados in
vivo y fecundados in vitro y, finalmente, Mattioli et al. (1989) lograron producir
lechones a partir de ovocitos MIV y FIV.
La posibilidad de predecir la capacidad fecundante de un eyaculado mediante los
análisis in vitro es un problema que hasta la fecha no ha sido resuelto
adecuadamente (Hammerstedt, 1996). Algunos autores proponen como causa de
la inconsistencia de los resultados conseguidos, la evaluación de un número
relativamente reducido de células, la gran influencia de la subjetividad del
observador y la alta variabilidad que presentan muchos análisis seminales
(Graham y cols., 1980; Evenson y cols., 1994; Saacke y cols., 1994). Además, el
número de espermatozoides aplicados en cada inseminación es un factor muy
importante a la hora de evaluar la fertilidad y su relación con los parámetros de
calidad seminal (Saacke, 1984; Saacke y cols., 1988; Fearon y Wegener, 2000).

Factores que afectan la capacidad espermática y /o fecundación in vitro
 Procedencia de los espermatozoides. En muchos laboratorios, el semen
eyaculado no congelado es la principal fuente de espermatozoides utilizada como
rutina en los estudios de FIV porcina (Abeydeera, 2002). El semen refrigerado, es
decir, semen fresco eyaculado diluido en medio de conservación y mantenido a
15-16ºC, también ha sido empleado para la FIV porcina por diversos autores
(Grupen et al., 1997; Grupen y Nottle, 2000). El empleo de semen refrigerado
permite la utilización de verracos no alojados en las proximidades del laboratorio
donde se va a realizar la fecundación in vitro, sin necesidad de que el semen
tenga que ser congelado.
Al utilizar semen congelado procedente de un sólo eyaculado a lo largo de un
mismo experimento se elimina la variabilidad entre eyaculados (Abeydeera y Day,
1997a; Wang et al., 1991). Sin embargo, se ha demostrado que al emplear semen
congelado para la FIV, el proceso de capacitación y de pérdida espontánea del
acrosoma se acelera en los espermatozoides congelados-descongelados (Wang
et al., 1995); y que tras la descongelación, los espermatozoides sufren un rápido
descenso de la movilidad (Nagai et al., 1988). Además, el protocolo de FIV que
26
funciona bien para el semen congelado de un macho, puede no dar buenos
resultados con otros verracos, por lo que para cada lote determinado de semen
congelado se ha de ajustar el protocolo de FIV.
Al evaluar el porcentaje de espermatozoides móviles tras la descongelación y
dilución final, observaron que el de los espermatozoides de epidídimo congelados
(72%) era similar al de los eyaculados frescos (76%) y mejor que el de los
eyaculados congelados (40%); observando menor variabilidad entre verracos en el
caso de los espermatozoides epididimales. Así mismo, las tasas de división
embrionaria fueron mejores al utilizar espermatozoides de epidídimo (60%) que
eyaculados (15% con frescos y 16% con congelados).
 Preincubación espermática. La composición del medio en el que se preincuba
a los espermatozoides afecta a los parámetros de la fecundación (Nagai et al.,
1984; Funahashi y Day, 1993). En ausencia de PFF (Nagai et al., 1984), se vio
que la preincubación estimulaba la capacitación e incrementaba las tasas de
penetración y poliespermia. Al añadir PFF durante la preincubación, Funahashi y
Day (1993) observaron que se estimulaba la capacitación y la pérdida espontánea
del acrosoma, de modo que durante la FIV se reducía la proporción de
espermatozoides capacitados y la incidencia de poliespermia. La preincubación
durante 90 minutos en medio TCM199m con 0,4% de BSA enriquecido con 0,1% y
1% de PFF reducía significativamente los niveles de poliespermia (36% y 32%,
respectivamente), comparado con la no adición (77%), manteniendo las mismas
tasas de penetración. Pero al aumentar la concentración de PFF a un 10%, la
proporción de ovocitos penetrados se reducía hasta el 37% debido a un marcado
incremento de reacciones acrosómicas espontáneas durante la preincubación
(Funahashi y Day, 1993b). Sin embargo, la sustitución en el medio de
preincubación de la BSA por 10% de FCS bloqueaba el efecto beneficioso del PFF
sobre la poliespermia. Según Cran y Cheng (1986), la presencia de FCS durante
la FIV reduce la disponibilidad de calcio en el medio, de modo que la reacción
cortical no puede ser inducida.
 Concentración espermática. La concentración de espermatozoides presentes
durante el cocultivo con los ovocitos afecta a la penetración y la poliespermia
(Abeydeera y Day, 1997a); ya que a mayor concentración de semen, se va a
capacitar un mayor número de espermatozoides. Sin embargo, la reducción de la
concentración espermática suele venir acompañada de unas bajas tasas de
penetración. Los protocolos de FIV deben diseñarse de modo que durante el
cocultivo, los ovocitos estén expuestos a un número adecuado de
espermatozoides capacitados, manteniendo así un equilibrio entre la penetración y
la poliespermia; ya que si el número es inferior, la tasa de penetración se verá
reducida, mientras que si es demasiado elevado, se incrementará la poliespermia.
27
En este diseño también se han de tener en cuenta las variaciones en la calidad del
semen, debidas tanto a diferencias individuales entre los verracos como a los
daños causados por los procesos de congelación del semen (Nagai, 1996), así
como diferencias en la composición del medio de FIV (Kidson et al., 2001;
Martínez-Madrid et al., 2001; Funahashi y Nagai, 2001), pues todo ello puede
modificar el patrón de capacitación; por lo que la concentración espermática va a
tener que ser ajustada para cada situación concreta.
 Tiempo de cocultivo de los ovocitos en el semen. Al igual que ocurre con la
concentración espermática, una vez se ha alcanzado el nivel máximo de
penetración, la extensión de la duración del cocultivo sólo va a dar lugar a un
incremento en la tasa de poliespermia (Abeydeera, 2001); por lo que se
recomienda que el tiempo de cocultivo no exceda de aquél en el que la mayoría de
ovocitos han sido penetrados.
En un trabajo realizado por Abeydeera y Day (1997a), se evaluaron varios tiempos
de cocultivo (3, 6, 9 y 12 h), comprobándose que la prolongación del cocultivo por
encima de las 6 h no incrementaba la tasa de penetración (81% a las 6h vs 81% y
88% a las 9 y 12 h), pero sí la poliespermia (39% vs 59% y 70%,
respectivamente). La coincubación por un periodo de 3 h dio una tasa de
poliespermia muy adecuada (14%), pero se acompañó de una penetración
excesivamente baja (31%).
La duración óptima del cocultivo de los ovocitos con el semen va a depender de
las condiciones a las que sean sometidos los espermatozoides. Por ejemplo, los
tratamientos de lavado, centrifugación o selección previos a la FIV (Matás et al.,
2002), así como las diferencias en la composición del medio de fecundación
(Funahashi y Nagai, 2001), pueden dar lugar a variaciones en el estado de
capacitación de los espermatozoides que, según Funahashi y Nagai (2001),
podrían influir en el tiempo que precisan éstos para penetrar al ovocito. De modo
que el tiempo óptimo de cocultivo va a depender de las características de cada
estudio.
 Sistema de cocultivo de espermatozoides-ovocitos. En un reciente trabajo,
Grupen y Nottle (2000) propusieron una sencilla modificación en el sistema de
cocultivo de los gametos durante la FIV, con la que lograron mayores tasas de
penetración (80% vs 57%) y un incremento en el desarrollo hasta blastocisto (30%
vs 8%), comparado con el sistema convencional. El protocolo de cocultivo
convencional (control) consistía en la incubación de los ovocitos con los
espermatozoides a una concentración constante de 0.5-1x105 spz/ml durante 5 h.
En el sistema modificado, los ovocitos fueron expuestos a la misma concentración
de espermatozoides que en el control durante 10 min y, a continuación, se
transfirieron junto con los espermatozoides unidos a su superficie a una segunda
28
gota con medio de FIV libre de espermatozoides, donde se incubaron durante 5 h
más.
A mayor tiempo de exposición de los ovocitos con los espermatozoides a la
concentración total, sería de esperar un incremento en la tasa de penetración; sin
embargo, en este experimento ocurre lo contrario. Una posible explicación
apuntada por Abeydeera (2002) es que, como en el sistema modificado los
espermatozoides muertos o dañados se quedan en la primera gota, las especies
reactivas del oxígeno generadas por su degradación, que dañarían a los ovocitos
y los espermatozoides viables a lo largo de las 5 h de incubación, no les van a
afectar.
 Medios de fecundación in vitro. En la FIV de ovocitos porcinos se han empleado
diferentes medios de fecundación, según el equipo de trabajo y/o el propósito del
estudio; siendo los más utilizados el medio TCM-199 (Tissue Culture Medium;
Yoshida et al., 1990; Funahashi et al., 1994a; Nagai y Moor, 1990; Funahashi y
Day, 1993b), el medio BO (Brackett and Oliphant Médium; Wang et al., 1995;
Kikuchi et al., 1993; Nagai et al., 1988), la solución KRBm (Krebs Ringer
Bicarbonato modificada) (Naito et al., 1988), el medio TBM modificado
(Trisbuffered Médium; Abeydeera y Day, 1997a, 1997b) y el medio TALP
modificado (Tyrode-albumin-lactate-piruvate Medium; Rath et al., 1999). Es difícil
establecer una comparación entre los medios de fecundación según los resultados
obtenidos en diversos trabajos, pues los protocolos empleados por cada equipo
nunca son exactamente iguales. Asimismo, las variaciones en la composición de
los medios afectan a más de un componente, por lo que las diferencias en los
resultados no pueden ser atribuidas a un solo factor.
Comparado con los medios TCM199, BO o la solución KRBm, el medio TBMm
(Abeydeera y Day, 1997a) contiene una mayor concentración de Ca2+ (7.5 mM) y
no presenta iones bicarbonato, entre otras diferencias. En dos estudios diferentes,
la misma concentración de Ca2+ añadida al medio BO (Mori et al., 1996) o al
TBMm (Abeydeera y Day, 1997b) tuvo un comportamiento diferente sobre la
penetración y poliespermia. Al utilizar el medio BO (Mori et al., 1996), la mayor
tasa de penetración se alcanzó con 1,125 y 2,25 mM de CaCl2, aumentando
también la poliespermia en el segundo caso; mientras que al elevar la
concentración de CaCl2 a 4,5 mM, se redujo tanto la tasa de penetración como la
de poliespermia. Sin embargo, al emplear el medio TBMm (Abeydeera y Day,
1997b), el porcentaje de penetración y de poliespermia aumentó a la vez que se
incrementó la concentración de CaCl2, siendo máximas para 7,5 y 10 mM de
CaCl2. Además de la diferente composición en calcio y bicarbonato entre el medio
BO y el TBMm, otros factores diferenciales en cada uno de los trabajos fueron el
pH del medio de FIV (7,6 vs 7,2-7,3), el tiempo de cocultivo de ovocitos y
espermatozoides (4 vs 12 h), la concentración espermática (5x104 vs 1x106
spz/ml) y la fuente de espermatozoides (fresco vs congelado). Estas diferencias en
29
la metodología han podido contribuir en las variaciones obtenidas en los
resultados. Esto es sólo un ejemplo de la gran variabilidad que existe en los
protocolos de FIV empleados por cada equipo y para cada estudio, que hace muy
difícil su comparación.
Por otra parte, Rath et al. (1999) estudiaron el efecto de dos medios modificados
respecto al TALP, que se diferenciaban en que el primero contenía CaCl2 como
fuente de calcio, mientras que el segundo presentaba lactato cálcico; en que el
contenido de NaH2PO4 en el segundo era un 24% superior que en el primero; y
en el empleo de dos antibióticos diferentes: kanamicina y amikacina. Con el
segundo medio modificado se obtuvo una tasa de división mayor (43% vs 18%), y
se sugirió que la presencia de una mayor concentración de fosfato junto con la
disponibilidad de calcio podían ser los responsables de la mejora.
Lo descrito anteriormente hace suponer, en relación con el medio de FIV
empleado, que la fecundación de los ovocitos porcinos va a depender no sólo de
cada uno de los componentes que constituyen el medio en cuestión, sino también
de la interrelación entre ellos.
2.2.2 Maduración in vitro. El proceso de maduración del ovocito se suele dividir
en maduración nuclear y citoplasmática. El ovocito maduro a nivel nuclear puede
ser claramente identificado como aquél que reanuda la meiosis y alcanza el
estadio de MII; mientras que la maduración citoplasmática, término que abarca
una serie de acontecimientos no directamente relacionados con la progresión de la
meiosis pero que van a preparar al ovocito para la fecundación y el desarrollo
embrionario posteriores (Abeydeera, 2002), se ha de estimar de un modo
indirecto.
El ovocito que no ha completado su maduración citoplasmática no es capaz de
reaccionar de manera correcta con la cromatina del espermatozoide penetrado e
inducir los cambios moleculares necesarios para la formación del PNM, pues este
proceso está controlado por el factor de crecimiento del pronúcleo masculino, que
se sintetiza durante la fase final de la maduración del ovocito. El GSH, sintetizado
también durante la maduración del ovocito, es un factor citoplasmático necesario
para la descondensación de la cromatina espermática y, por tanto, para la
formación del PNM (Perreault et al., 1988; Yoshida, 1993).
Esto explica la estrecha relación que existe en el porcino entre la maduración
citoplasmática y la formación del PNM (Moor et al., 1990); y por esta razón, tanto
el porcentaje de formación de PNM como el contenido intracelular de GSH de los
ovocitos (Day et al., 2000) pueden ser tomados como indicadores de la
maduración citoplasmática del ovocito. Asimismo, se ha demostrado una alta
correlación entre el contenido de GSH del ovocito al final de la MIV y la incidencia
de formación de PNM tras la FIV (Funahashi et al., 1994). Al mismo tiempo, el
30
GSH está involucrado en la protección del ovocito contra el fenómeno de
apoptosis, inducido por la presión oxidativa generada bajo las condiciones de
cultivo in vitro (Tatemoto et al., 2000).
El fallo en la maduración citoplasmática de los ovocitos MIV puede deberse a
deficiencias inherentes a los propios ovocitos y/o condiciones subóptimas de
cultivo (Abeydeera, 2002). Para resolverlo es preciso realizar una buena selección
y manipulación de los ovocitos, así como mejorar el sistema de MIV.
 Factores que afectan a la calidad de los ovocitos
 Condiciones de transporte de los ovarios al laboratorio. La duración y
temperatura del transporte de los ovarios desde que son recogidos en el matadero
hasta que se comienzan a procesar en el laboratorio puede influir en la calidad de
los ovocitos. Walters y Graves (1998) compararon el efecto de varias temperaturas
(5, 16, 25, 30 y 37ºC) y tiempos (2, 6, 10, 14 y 26 h) de transporte en la posterior
maduración de ovocitos porcinos. Al incrementarse el tiempo de transporte se
redujo la maduración de los ovocitos, en todas las temperaturas valoradas. Los
transportes de más de 5 h de duración o a temperaturas inferiores a 25ºC
comprometieron seriamente la maduración de los ovocitos.
 Presencia de cuerpos lúteos y folículos quísticos en el ovario. Ocampo et al.
(1993) han apuntado que la presencia de cuerpos lúteos en los ovarios afecta a la
calidad de los ovocitos recuperados, por lo que es conveniente no utilizar ovarios
con cuerpos lúteos en los protocolos de PIV de embriones porcinos. Así mismo, es
recomendable desechar aquellos ovarios que presentan folículos quísticos.
 Tamaño del folículo. El tamaño del folículo determina la capacidad de desarrollo
del ovocito. Los ovarios porcinos contienen folículos antrales con una amplia gama
de diámetros, que se clasifican como pequeños (menores de 3 mm), medianos
(entre 3-7 mm) y grandes (de más de 7 mm). Los ovocitos utilizados en la
producción de embriones de cerdo se suelen recuperar de folículos de tamaño
medio.
Yoon et al. (2000) utilizaron ovocitos porcinos aislados de folículos de mayor (de 3
a 8 mm) y menor (<3 mm) diámetro y determinaron que los ovocitos de folículos
más grandes daban mejores tasas de maduración nuclear, formación de PNM y
desarrollo hasta estadio de blastocisto, que los procedentes de folículos más
pequeños. Por lo que se deduce que sólo los ovocitos que han alcanzado un
grado adecuado de desarrollo pueden responder al estímulo de maduración,
experimentando los cambios morfológicos y funcionales necesarios para alcanzar
una total capacidad de desarrollo. Y al ser el compartimento folicular el que
sostiene el crecimiento del ovocito, el desarrollo del ovocito va a estar supeditado
al estadio de desarrollo del folículo en el que se encuentra.
31
 Método de recuperación de los ovocitos. Aunque la recuperación de ovocitos
por disección de los folículos es más laboriosa que por aspiración, asegura la
recuperación de ovocitos exclusivamente de folículos no atrésicos (Ding et al.,
1992a). Cuando se compararon los estadios de vesícula germinal en ovocitos
obtenidos de ovarios de matadero y recuperados tanto por punción de los folículos
seleccionados como por aspiración folicular, se observó que los ovocitos
recuperados por punción se encontraban detenidos en el estadio de VG1 en
mayor proporción que los aspirados (Ebihara et al., 1993). Esto sugiere que con el
método de aspiración también se recuperan ovocitos de folículos cuyas células
foliculares no son adecuadas para mantener el arresto meiótico en VG1,
permitiendo al ovocito reanudar la meiosis.
En nuestro laboratorio, hemos observado que la aspiración de folículos con jeringa
de 10 ml conectada a aguja de 18G provoca una denudación mecánica de las
células del cúmulus que rodean al ovocito, cuya presencia va a ser fundamental
en el proceso de maduración del ovocito.
 Sistema de maduración in vitro de los ovocitos: condiciones de cultivo y medios
de maduración. Las condiciones físicas específicas del ambiente en el que se
maduran los ovocitos (osmolaridad, pH y composición iónica del medio;
temperatura y tensión de CO2 y O2 el incubador; volumen de cultivo; y tiempo de
incubación), así como la mayor o menor definición del medio de maduración
utilizado (suero, células somáticas, etc.) van a influir en la maduración de los
ovocitos (Holm y Callesen, 1998).
 Condiciones de cultivo. La duración del cultivo durante la MIV de los ovocitos
porcinos oscila desde 36 horas (Yoshida et al., 1993b) hasta 48 h (Naito et al.,
1988), pasando por 40 h (Funahashi y Day, 1993c) y 44 h (Wang et al., 1997a).
Según Ka et al. (1997) un cultivo de 36 h es suficiente para completar los procesos
de maduración nuclear y citoplasmática, mientras que Yamauchi et al. (1996)
apuntan que el periodo óptimo de cultivo es de 42-44 h.
La temperatura de incubación más utilizada, tanto en la MIV, la FIV y el CE es de
38,5ºC ó 39ºC. En un reciente estudio, Abeydeera et al. (2001) analizaron el efecto
de dos temperaturas, 35 y 39ºC, y de dos duraciones de cultivo, 44 y 68 h, durante
la MIV de ovocitos porcinos sobre la maduración nuclear, la fecundación y el
desarrollo embrionario posterior. El cultivo a 35ºC durante 44 h redujo
significativamente la tasa de maduración nuclear (12% vs 79%), comparado con la
incubación a 39ºC durante el mismo tiempo. La extensión del cultivo a 35ºC hasta
68 h aumentó la tasa de maduración nuclear a 58%, mientras que en el caso del
cultivo a 39ºC, se incrementó la activación espontánea de los ovocitos. Respecto
al desarrollo embrionario hasta blastocisto, el tratamiento que dio mejor resultado
fue el cultivo a 39ºC durante 44 h (31%), comparado con el cultivo a 35ºC (13%) y
32
a 39ºC (3%) durante 68 h. Aunque se confirmó que la temperatura y el tiempo
óptimos de cultivo durante la MIV son 39ºC y 44h, respecto a 35ºC y 68h, la
extensión del tiempo de incubación a una menor temperatura permitió alcanzar
tasas aceptables de desarrollo embrionario.
La atmósfera de cultivo empleada como rutina en los protocolos de PIV de
embriones porcinos es de 5% de CO2 y 95% de humedad. La utilización de
incubadores con baja tensión de oxígeno (5-7%), no es frecuente en porcino.
 Medios de maduración. Para la maduración in vitro de ovocitos porcinos se han
empleado distintos medios de cultivo, según el grupo de trabajo o el propósito del
estudio. Los medios se pueden clasificar en sencillos o complejos, dependiendo
de la cantidad de productos incluidos en su composición. Ejemplos de medios
sencillos ampliamente utilizados en la MIV de ovocitos porcinos son el medio
Whitten (Funahashi et al., 1994b), el medio KRB (Krebs Ringer Bicarbonato) (Naito
et al., 1988), y el medio NCSU23 (North Carolina State University) (Abeydeera et
al., 1998b, 1998c), que se suelen preparar en el propio laboratorio. Entre los
medios complejos más utilizados están el TCM199 (Tissue Culture Medium 199)
(Zheng y Sirard, 1992) y el Waymouth (Yoshida et al., 1993b), que debido al
elevado número de componentes, se suelen adquirir en preparados comerciales.
A su vez, los medios de cultivo se dividen en definidos o indefinidos, conforme al
tipo de suplementos que contengan. La tendencia actual es, en la medida de lo
posible, la eliminación de suplementos no definidos, pues contienen factores
desconocidos que dificultan la identificación de los mecanismos involucrados en la
regulación de los procesos en estudio (Abeydeera, 2002). Además, en el caso de
suplementos como el PFF, el FCS o las células somáticas, entre otros, se ha
observado mucha variabilidad entre lotes y entre laboratorios, que impide la
estandarización de los protocolos y la repetibilidad de los experimentos.
Pero la presencia de determinados suplementos no definidos en los medios, como
el PFF (Yoshida et al., 1990, 1992) o el cocultivo con células somáticas
(Abeydeera et al., 1998b), ha mejorado de forma notable los rendimientos de la
técnica, que compensan las desventajas de su utilización. En la actualidad se
están tratando de identificar y purificar los factores activos, presentes en los
suplementos no definidos, responsables de estos efectos beneficiosos.
2.2.3 Cultivo de Embriones. En los primeros estudios sobre cultivo in vitro (CE)
de embriones porcinos, no se logró sobrepasar el estadio de 4 células a partir de
embriones de una célula obtenidos in vivo (Davis, 1985). Este bloqueo en 4
células coincide con la transición del control genético de la madre al embrión
(Jarrell et al., 1991). Además, el estadio de 4 células se prolonga durante 24 h in
vivo, y es la fase en la que se produce el paso de los embriones porcinos del
oviducto al útero (Davis, 1985).
Posteriormente se consiguió superar el bloqueo en 4 células gracias al uso de
33
Oviductos de ratón en cultivo (Kriser et al., 1989), al cocultivo con células
epiteliales (Archibong et al., 1989) o al enriquecimiento con fluido oviductal
(Archibong et al., 1989) durante el CE. En cambio, el cultivo in vitro de embriones
recogidos de hembras donantes a partir del estadio de 4 células hasta blastocisto
si se podía llevar a cabo en un medio de cultivo simple basado en el medio KrebsRinger bicarbonato (Davis, 1985), sin necesidad de cocultivo.
En estudios más recientes, más del 70% de los embriones porcinos obtenidos in
vivo y cultivados in vitro se han desarrollado hasta el estadio de blastocisto en
diferentes medios: medio Whitten’s modificado (Beckmann y Day, 1993), medio
NCSU23 (North Carolina State University 23; Petters y Wells, 1993), medio Iowa
State University (Youngs et al., 1993) y medio BECM-3 (Beltsville Embryo Culture
3; Dobrinsky et al., 1996). Sin embargo, al comparar la eficacia de estos medios
para soportar el desarrollo embrionario de embriones MIV-FIV se encontró un
amplio rango (desde 5% a 30%) en la proporción de blastocistos obtenida con
cada uno de ellos (Abeydeera et al., 1999a).
Por otra parte, la transferencia embrionaria de zigotos MIV-FIV al oviducto de
hembras receptoras y su posterior recogida, por lavado retrógrado, 5 días más
tarde dio lugar a blastocistos con un número de células notablemente más elevado
(106-136 vs 10- 21) que los controles cultivados in vitro (Funahashi et al., 1994d).
Asimismo, al cultivar in vitro e in vivo embriones de 1-2 células obtenidos in vivo,
los blastocistos desarrollados in vivo también presentaban un mayor número de
células (55 vs 25) que los cultivados in vitro (Machaty et al., 1998).
Según Bavister (1995), el ambiente de cultivo utilizado para el desarrollo de los
embriones preimplantacionales, incluso en ausencia de efectos visibles, puede
afectar profundamente a los procesos que acontezcan tras la implantación.
Asimismo, el cultivo in vitro afecta a la expresión génica de los embriones, tanto en
estadios tempranos como avanzados del desarrollo, aunque su efectos se
observen a largo plazo (Duranthon y Renard, 2002). Incluso siendo compatible con
el desarrollo a blastocisto, las modificaciones en la concentración salina del medio
de cultivo pueden provocar importantes alteraciones en la expresión de
determinados genes (Ho et al., 1994). Del mismo modo, la adición al medio de
cultivo de aminoácidos (Ho et al., 1995), factores de crecimiento (Babalola y
Schultz, 1995) o suero (Wrenzycki et al., 1999) puede afectar a la transcripción
génica maternal y embrionaria. En general, el desarrollo de los embriones en
cultivo es más lento que in vivo, dando lugar a blastocistos con un menor número
de células unido a una progresiva pérdida de viabilidad y a un metabolismo
reducido (McKiernan y Bavister, 1994).
Según lo expuesto hasta este momento, se podría afirmar que el limitado
desarrollo hasta blastocisto de los embriones porcinos MIV-FIV-CE y su menor
calidad, comparada con los obtenidos in vivo, no se debe a un fallo puntual en el
sistema de PIV de embriones, sino a la combinación de una maduración
34
citoplasmatica inadecuada o incompleta, una elevada poliespermia, una
formulación inadecuada de los medios de cultivos y unas condiciones de cultivo
embrionario subóptimas.

Condiciones del cultivo de embriones
 Tensión de oxígeno. Las condiciones convencionales de incubación de los
embriones durante el CE son las mismas que las empleadas para la MIV y la FIV,
es decir, 5% de CO2 en atmósfera saturada de humedad a una temperatura de
38,5-39ºC.
Sin embargo, Berthelot y Terqui (1996) afirmaron que el desarrollo de embriones
porcinos obtenidos in vivo y cultivados en NCSU23 modificado (sin glucosa pero
enriquecido con lactato, piruvato, vitaminas y mayores niveles de glutamina,
NaHCO3 y BSA) a baja tensión de O2 era óptimo. En contraste con estos
resultados, Machaty et al., (1998) no observaron mejora en el desarrollo hasta
blastocisto al comparar el cultivo de embriones obtenidos in vivo en NCSU23 bajo
tensión reducida (5%) de O2 o en condiciones convencionales (20% O2). No
obstante, estos trabajos no son comparables, al haber diferencias en el medio de
cultivo empleado.
Recientemente, Machaty et al. (2001) han observado un incremento en el
desarrollo a blastocisto y en el número de células al cultivar mórulas MIV/FIV bajo
tensión reducida (5%) de O2. La explicación propuesta para esta mejora es que la
inhibición parcial de la fosforilación oxidativa a partir del estadio de mórula tiene
efectos beneficiosos sobre el desarrollo y el número de células de los blastocistos.
Fischer y Bavister (1993) indicaron que el nivel de O2 en la cavidad uterina era
menor que en el oviducto. Esta menor tensión de oxígeno podría ser en parte
responsable del cambio en la vía de producción de ATP (adenosil trifosfato) de
fosforilación oxidativa a glicólisis en el momento de la compactación/blastulación.
Como en condiciones in vivo, los embriones porcinos alcanzan los cuernos
uterinos antes del estadio de mórula compacta (Davis, 1985), podríamos pensar
que una reducción en la fosforilación oxidativa en beneficio de la glicólisis sería
positiva en el estadio de peri-compactación.
Se ha propuesto el establecimiento de un CE secuencial: en atmósfera
convencional (20% O2) hasta el estadio de mórula y a partir de ahí bajo tensión
reducida (5%) de O2.
 Relación: embriones/volumen de medio. Se ha demostrado que el cultivo de
embriones en volúmenes reducidos de medio o en grupos incrementa
significativamente el desarrollo a blastocisto, así como el número de células de los
blastocistos en varias especies: ratón (Paria y Dey, 1990), mujer (Lane y Gardner,
1992), vaca (Palma et al., 1992) y oveja (Gardner et al., 1994). Además, el cultivo
35
de embriones en volúmenes reducidos aumenta la viabilidad del embrión tras la
transferencia embrionaria (Lane y Gardner, 1992). Asimismo, la disminución de la
relación volumen de cultivo/embrión estimula el desarrollo de la masa celular
interna de los blastocistos sin afectar el número de células del trofoblasto, en
embriones de ratón (Gardner et al., 1997) y vaca (Ahern y Gardner, 1998). Sin
embargo en un estudio reciente realizado sobre embriones humanos (Rijnders y
Jansen, 1999), no se observó ninguna mejora en el desarrollo embrionario al
cultivar en grupo o al reducir el volumen de cultivo.
En el porcino, los estudios en los que se valoró el efecto del volumen de cultivo
sobre el desarrollo de los embriones se realizaron hace más de dos décadas. En
el más reciente, de 1982 (Menino y Wright, 1982), se comparó el efecto de dos
sistemas de cultivo: en microgota de 50 µL en placas de Petri de cristal y en 4 ml
en tubos Falcon de plástico, con unos 28-29 embriones por placa o tubo, sobre el
desarrollo de embriones de 1 célula obtenidos in vivo; alcanzándose un mayor
índice de divisiones completadas en cultivo con el sistema de 4 ml de medio,
aunque sin apreciarse diferencias significativas en el porcentaje de mórulas y de
blastocistos entre los dos sistemas. Mientras que en dos estudios previos (Pope y
Day, 1977; Davis y Day, 1978), el desarrollo embrionario de embriones de 1 célula
obtenidos in vivo fue superior en los cultivados en microgotas frente al cultivo en
tubos.
Una de las hipótesis propuestas para el efecto beneficioso del cultivo en grupo y/o
en pequeño volumen de medio es la producción de factores autocrinos y/o
paracrinos por parte del embrión en cultivo (Paria y Dey, 1990; O’Neill, 1998), que
estimularían el desarrollo del propio embrión que los genera y el de los embriones
vecinos. Según esto, el cultivo en volúmenes grandes daría lugar a la dilución de
los factores beneficiosos producidos por el embrión, de tal modo que la
concentración presente en el medio de cultivo no sería suficiente para ejercer el
efecto (Gardner, 1994).
Entre los posibles factores autocrinos y/o paracrinos implicados se han descrito los
siguientes: factores con propiedades mitogénicas o de diferenciación, como los
factores de crecimiento PDGF (Platelet-derived Growth Factor) (Thibordeaux et al.,
1995) e IGF II (Insulin-like Growth Factor II) (O’Neill, 1997); y factores antiapoptóticos o de supervivencia, como el TGFβ (Transforming Growth Factor β)
(Brison y Schultz, 1997) y el PAF (Platelet-activating Factor) (O’Neill, 1998), los
cuales actuarían reduciendo los niveles de apoptosis dentro de la masa celular
interna del embrión (Colon y Raff, 1999).
Paria y Dey (1990) sugirieron que el efecto de estos factores de crecimiento o de
supervivencia producidos por el embrión de ratón empezaba a ser operativo a
partir del estadio de 8 células o mórula, momento en el que comienzan a
detectarse en la superficie del embrión receptores para el factor de crecimiento
epidérmico (EGF); mientras que, recientemente, O’Neill (1998) ha propuesto que
36
los factores de supervivencia autocrinos sólo son requeridos por el embrión de
ratón antes o durante el estadio de 2 células.
Otra de las hipótesis, ofrecida por Bavister (1995), es que el incremento en el
número de embriones por unidad de volumen podría resultar beneficioso debido,
simplemente, a un agotamiento por parte de los propios embriones de sustancias
embriotóxicas o inhibidoras en el medio, o por una disminución en la pérdida de
compuestos endógenos importantes, como aminoácidos, entre otras posibilidades.
Según este autor, el efecto del tamaño de la gota de cultivo sobre el desarrollo
embrionario va a depender, entre otros factores, de la composición del medio de
cultivo y de las condiciones físicas empleadas.
Para apoyar esta hipótesis, Bavister comparó dos trabajos en los que se estudió el
efecto del número de embriones por unidad de volumen, en embriones de
hámster. En uno de ellos (Schini y Bavister, 1988), al aumentar el número de
embriones por microlitro de medio de 0,24 a 35 se incrementó ampliamente el
porcentaje de embriones de 2 células que se dividieron al menos una vez (de 1%
a 34%). El medio de cultivo empleado contenía glucosa y fosfato, que bloquean el
desarrollo de los embriones de hámster en cultivo; lo cual hace pensar que la
mejora se debió, en parte, a un consumo de estos compuestos por los embriones,
que redujo su concentración en el medio. En cambio, en el otro trabajo descrito
(McKiernan y Bavister, 1994) se empleó un medio sin glucosa ni fosfato, no
encontrándose diferencias en el desarrollo a mórula y a blastocisto al cultivar 2, 4
u 8 embriones por gota de medio.
 Medios de cultivo de embriones. Como hemos visto, el desarrollo hasta el
estadio de blastocisto de embriones obtenidos in vivo se logró con éxito (>70%) en
varios medios de cultivo. Sin embargo, al comparar la eficacia de estos medios
sobre el CE de embriones MIV-FIV, se observó un amplio rango de resultados
(Abeydeera et al., 1999a). El medio con el que se obtuvo el mejor desarrollo
embrionario fue el NSCU23 (30% de blastocistos) seguido por el medio Iowa State
University (14%) y el BECM-3 (12%), siendo el medio Whitten el que dio peores
resultados (5%). Se puede afirmar que, hasta la fecha, el NCSU23 es el medio de
elección para el cultivo de embriones MIV-FIV, mientras que para el cultivo de
embriones obtenidos in vivo también son adecuados los otros 3 medios citados.
De todos modos, la capacidad de los embriones de desarrollarse en un medio de
cultivo determinado no indica necesariamente que este medio le proporcione un
ambiente beneficioso o deseable; sino que podría reflejar simplemente su
capacidad para tolerar las condiciones artificiales, quizás a expensas de su
viabilidad (Bavister, 1995). Por lo tanto, el diseño del medio de cultivo es crucial
para el posterior desarrollo embrionario pre- y postimplantacional. En la actualidad
hay dos tendencias a la hora de formular los medios de cultivo: una tendencia más
pragmática, cuyo principal objetivo es la producción de embriones viables, que
puede emplear medios de cultivo no definidos para este fin; y otra tendencia, cuya
37
meta es el conocimiento de los requerimientos básicos de los embriones en
cultivo, para lo cual es fundamental el empleo de medios cuya composición esté
totalmente definida (Bavister, 1995).
 Morfología y calidad de los embriones producidos in Vitro. A pesar de los
notables avances en la PIV de embriones porcinos, la morfología de los embriones
PIV, incluidos los blastocistos, difiere de la de los embriones obtenidos in vivo
(Wang et al., 1999a). Asimismo, el número de células que constituyen los
blastocistos PIV es menor que la de los obtenidos in vivo (Papaioannou y Ebert,
1988).
Wang et al. (1999a) evaluaron la morfología y los filamentos de actina de
embriones producidos in vitro e in vivo, y comprobaron que in vivo los blastocistos
presentaban una masa celular interna más prominente y que los blastómeros de
los embriones tempranos tenían un aspecto más definido que los de los
producidos in vitro. Asimismo, sugirieron que las divisiones anómalas y el bajo
número de células en los blastocistos, que aparecen en los embriones PIV, se
podía deber a las alteraciones observadas en la distribución de los filamentos de
actina en el citoplasma, ya que éstos están involucrados en el proceso de división
celular.
 Valoración de la capacidad de desarrollo embrionario. El parámetro por el que
se valora la capacidad de desarrollo de los embriones MIVFIV- CE en la mayoría
de laboratorios es el desarrollo hasta el estadio de blastocisto. Por otra parte, un
mayor número de células en el blastocisto se considera un signo de calidad
embrionaria, ya que, como hemos visto, el número de células de los blastocistos
obtenidos in vivo suele superar al de los embriones PIV. También se ha empleado
el parámetro del porcentaje de blastocistos eclosionados en cultivo como indicador
de la calidad embrionaria, aunque este hecho no está comprobado.
Sin embargo, hemos visto que el sistema de producción in vitro ocasiona
alteraciones en el embrión, que pueden llegar a ser compatibles con el desarrollo
a blastocisto (Duranthon y Renard, 2002). Por lo tanto, la prueba definitiva que va
a medir la viabilidad embrionaria es el establecimiento de gestaciones y el
nacimiento de crías vivas tras la transferencia de los embriones a una hembra
receptora. Actualmente, el éxito alcanzado en las transferencias de embriones PIV
según diferentes autores ha sido muy variable, y como mucho sólo el 20% ó 30%
de los embriones sobrevive tras la transferencia (Abeydeera, 2002).
Desgraciadamente, la transferencia de embriones tiene un costo elevado, tanto en
tiempo como económico, que no hacen posible su ejecución de manera rutinaria.
La división embrionaria a las 48 h es un parámetro bastante subjetivo, debido a la
dificultad de distinguir entre un embrión dividido correctamente y otro fragmentado
38
o dividido partenogenéticamente, sólo mediante criterios morfológicos. En un
estudio en el que se analizaron las alteraciones en la división se observó que, de
los embriones producidos in vitro, sólo el 73% de los embriones de 2 células, el
26% de 3 células, el 49% de 4 células y el 26% de 5 a 8 células eran
morfológicamente normales (con un núcleo por blastómera), presentando el resto
una división citoplasmática y nuclear asincrónica, que dio lugar a embriones
fragmentados o con blastómeras bionucleadas; mientras que en los embriones
obtenidos in vivo no se observó ninguna alteración en la división (Wang et al.,
1999a).
2.3 TRANSGENESIS Y CLONACION
2.3.1 Transgénesis en animales. Desde sus primeros inicios el hombre ha
seleccionado plantas y domesticado animales mediante el cruzamiento selectivo
de individuos con el fin de transferir los caracteres deseados. La principal limitante
de este proceso radica en la incompatibilidad sexual observada cuando los
organismos son muy divergentes genéticamente, lo que impide esta transferencia
entre especies. La ingeniería genética permite romper esta barrera posibilitando la
incorporación de genes desde otras especies que de otra forma sería imposible
con los métodos de mejoramiento tradicional. De esta forma los organismos
genéticamente modificados o más comúnmente denominados transgénicos son
organismos vivos (plantas, animales o bacterias) manipulados genéticamente
mediante la inserción de un gen que habitualmente no formaba parte de su
repertorio genético. La finalidad de esto es proporcionar a la planta o animal
nuevas características productivas y hacerlos más eficientes y competitivos (Clark,
2002).
El gen a ser introducido consiste básicamente de una construcción de ADN que
contiene una región promotora y la región codificante para la proteína de interés,
los que se insertan en el genoma en forma artificial mediante alguna de las
técnicas disponibles como se detalla más adelante. Esta región de ADN es
denominada comúnmente transgen y puede provenir de otro animal de la misma
especie o desde una bacteria o planta. El lugar del animal donde se expresa el
transgen está dirigido por la región promotora o las regiones reguladoras de la
región promotora. Así por ejemplo, si se utiliza el promotor del gen de la ßLactoglobulina se podría dirigir la expresión y secreción de una proteína
recombinante exclusivamente en la leche del animal.
Hasta muy recientemente, la tecnología para generar animales de granja
modificados genéticamente involucraba la microinyección pronuclear, en la cual
pequeñas cantidades del ADN de interés (transgen) eran inyectadas en el
pronúcleo de un embrión al estado de dos células. Aunque ampliamente aceptada
y utilizada en forma rutinaria en muchos laboratorios, ha habido muy poco
progreso para mejorar su eficiencia, la que se mantiene en el orden 0.1-5%,
39
dependiendo de la especie considerada (Wall y col., 1997). Al mismo tiempo que
la microinyección pronuclear se estaba desarrollando, en animales de granja, las
células madre embrionarias (ES cells) estaban siendo desarrolladas y utilizadas
para experimentos de recombinación homóloga en el ratón. Esta tecnología ha
sido tremendamente eficiente para explotar la capacidad de las células en
contribuir a la línea germinal y realizar recombinación homóloga con ADN
exógeno, permitiendo la introducción de cambios precisos en el genoma del
animal (para revisión ver Hooper, 1992). Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de
muchos laboratorios, no se han descrito aún células madre embrionarias en otras
especies distintas al ratón (Stice, 1998), lo que ha frenado muchas aplicaciones
potenciales de esta tecnología en animales de granja. Esta situación se revirtió
recientemente después del nacimiento de Dolly, el primer animal obtenido por
transferencia nuclear de una célula adulta (Wilmut y col., 1997). Sin embargo
Polly, la primera oveja transgénica obtenida por transferencia nuclear (Schnieke y
col., 1997), y George y Charlie, los primeros terneros transgénicos obtenidos de la
misma forma (Cibelli y col., 1998), son los que han marcado el curso de las
investigaciones en este campo y conducirán el camino en el futuro. Hoy en día, la
transferencia nuclear se ha convertido en una alternativa real a la microinyección
pronuclear debido a que permite un acortamiento del tiempo entre la obtención de
un animal transgénico fundador y el establecimiento de un rebaño transgénico.
Además, la transferencia nuclear abrió las puertas a la recombinación homóloga
de animales de granja que había sido restringida sólo al ratón mediante la
tecnología de células madre embrionarias. Esto posibilita la eliminación de genes
endógenos en animales de granja (gene knock out) y/o la inserción de genes
específicos en regiones transcripcionalmente activos del genoma, favoreciendo
altos niveles de expresión de la proteína de interés.
En la tabla 1, se indican algunas especies en las que se han obtenido animales
transgénicos:
Tabla 1. Animales transgénicos
ANIMALES TRANSGÉNICOS
MAMÍFEROS
AVES
PECES
Ratón
Pollo
Salmón
Rata
Codorniz
Trucha
Conejo
Tilapia
Vacuno
Carpa
Cerdo
Pez gato
Oveja
Medaka
Cabra
Dorada
( revisiones por Clark et al., 1987; Chen y Powers, 1990; Bialy, 1991; Sangh, 1994;
Velander et al.,1997)
40
Por su especial importancia, en lo que sigue solamente se hará referencia a la
obtención y utilización de animales transgénicos en especies de mamíferos de
valor económico.
 Mamíferos transgénicos. Como se indicaba anteriormente, las investigaciones
llevadas a cabo a principio de los años ochenta no fueron más que el lanzamiento
de una serie ininterrumpida de avances, tanto en la investigación básica como en
la utilización práctica de los animales transgénicos. En el cuadro adjunto se
incluyen los principales hitos relacionados con la obtención y desarrollo de los
mamíferos transgénicos:
Tabla 2. Mamíferos transgénicos.
MAMÍFEROS TRANSGÉNICOS: ANTECEDENTES Y CRONOLOGÍA
1938: Spemann propone experimento de transferencia nuclear
1949: Hammond mantiene embriones de ratón en cultivo in vitro
1961: Tarkowski obtiene ratones quiméricos agregando embriones
1966: Lin describe la técnica de microinyección de embriones de ratón
1980: Gordon, Ruddle y col. obtienen los primeros ratones transgénicos por
microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón
1981 Gordon y Ruddle obtienen ratones transgénicos por microinyección de
ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón
1981: Evans y Kaufman obtienen células embrionarias totipotentes de ratón
1982: Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante
transgenes de la hormona del crecimiento de la rata
1983 Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante
transgenes de la hormona de crecimiento humana
1983: McGrath y Solter desarrollan una nueva técnica para experimentos de
transferencia nuclear en ratón
1985: Hammer y col. obtienen animales de granja transgénicos (conejos,
ovejas, cerdos) con el transgén de la hormona del crecimiento humano
1987: Thomas y Capecchi obtienen los primeros ratones knockout por
recombinación homóloga
1989 Clark y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano del factor
IX de coagulación de la sangre mediante microinyección de ADN en el
pronúcleo del cigoto
1991 Wright y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano de la 1-antitripsina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de
cigotos
1991 Ebert y col. obtienen cabras transgénicas con el gen AtPH humano
(activador tisular de plasminógeno) mediante microinyección de ADN
en pronúcleo de cigoto
1991 Krimpenfort y col. obtienen vacas transgénicas con el gen humano de
la lactoferrina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de
41
cigotos
1993: Nagy y Rossant obtienen ratones quiméricos por co-cultivo de
embriones
1993: Schedl y col. obtienen ratones transgénicos con cromosomas
artificiales de levaduras
1994: Brinster y col. obtienen ratones transgénicos por transplante de
espermatogonias
1996: Campbell y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de
células embrionarias en cultivo
1997: Wilmut y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de
células diferenciadas fetales y adultas en cultivo
1997: Schnieke y col. obtienen ovejas clónicas transgénicas por transferencia
nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1998: Cibelli y col. obtienen vacas clónicas transgénicas por transferencia
nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1999 Baguisi y col. obtienen cabras transgénicas por transferencia nuclear
1999 Yanagimachi y col. obtienen ratones transgénicos mediante la coinyección de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno
( revisiones por Clark et al., 1987; Chen y Powers, 1990; Bialy, 1991; Sangh, 1994;
Velander et al.,1997)
 Métodos de transformación genética en animales
 Transformación genética mediante el uso de vectores retrovirales. Contrario a
la percepción de muchos, los primeros animales transgénicos fueron producidos
hace ya casi 30 años mediante la microinyección de ADN viral (SV40) en la
cavidad del blastocele de embriones de ratón (Jaenish y Mintz, 1974). Los
próximos intentos involucraron embriones de ratón infectados con el retrovirus
Moloney de la leucemia murina (MoMuLV), lo que resultó en la transmisión estable
hacia la línea germinal (Jaenish, 1976). Esto se logró reemplazando genes que no
son esenciales para el virus por genes heterólogos, aprovechando así la
capacidad de los virus de infectar un amplio espectro de células y con una gran
eficiencia. Una de las grandes desventajas de este método radica en que la
integración del ADN se produce en diferentes etapas del embrión en desarrollo, lo
que implica que el ADN no se integra en todas las células somáticas o en la línea
germinal y por lo tanto no hay transmisión del transgen a la descendencia.
Además, los animales generados por este método tienen a menudo más de un
sitio de integración, lo cual ocurre cuando más de una célula del embrión es
infectada por el virus (Palmiter y Brinster, 1985). Esto implica que las líneas de
ratones transgénicos deben ser cruzadas para segregar los diferentes loci
conteniendo el transgen y poder así aislar líneas con un sitio de inserción único.
Finalmente, los vectores retrovirales poseen una limitada capacidad de ADN
42
foráneo que puede ser acomodado, alrededor de 8 kb, lo cual imposibilita muchos
experimentos especialmente con secuencias genómicas humanas que pueden
superar ampliamente este tamaño.
 Transformación genética mediante microinyección pronuclear. En la década del
80 ocurrió un importante avance en la tecnología de animales transgénicos que
marcó el curso de la investigación en este campo por al menos dos décadas.
Gordon y colaboradores describieron una técnica donde el ADN desnudo fue
inyectado en el pronúcleo de un ovocito de ratón recientemente fertilizado, el que
posteriormente se transfirió a hembras receptoras sincronizadas (Gordon y col.,
1981). Este experimento demostró que era posible usar un plásmido recombinante
como vector para transferir genes foráneos directamente hacia el embrión. El ADN
inyectado de esta forma se integró en el genoma y pudo ser heredado por la
descendencia de los animales transgénicos fundadores. La inyección de
embriones al estado de una célula fue clave para obtener una integración
temprana del transgen, permitiendo al ADN foráneo contribuir en el genoma de
todas las células somáticas y la línea germinal. En ciertos casos la integración del
transgen también ocurrió después de la primera división del zigoto, lo que resultó
en animales fundadores mosaicos. Estos animales mosaicos aún transmiten el
transgen a la descendencia pero lo hacen a una frecuencia menor al 50%.
Desgraciadamente, la eficiencia para generar animales transgénicos utilizando
esta tecnología es baja, particularmente en animales de granja. La eficiencia de la
inyección pronuclear está controlada por una serie de factores como quedara
demostrado por los trabajos de Brinster y colaboradores, quienes entregaron
valiosa información sobre la integración de los transgenes y permitieron establecer
que la concentración y la forma (circular o linear) del ADN eran los factores más
críticos para una eficiente integración (Brinster y col., 1985). No se encontraron
diferencias significativas cuando el pronúcleo femenino o masculino era utilizado
para la inyección, aunque este último es preferido por ser más grande. Por otro
lado, el cruzamiento de ratones híbridos (por ejemplo C57BL x SJL) fue más
exitoso en la producción de animales transgénicos que las líneas cosanguíneas
(C57Bl x C57Bl). El descubrimiento de la inyección de pronúcleos como un nuevo
método para modificar el genoma de los animales revolucionó la forma en que los
investigadores pudieron analizar la expresión de los transgenes y pavimentó el
camino para la generación de los primeros animales transgénicos de granja hace
ya 18 años (Hammer y col., 1985). Desde entonces, la tecnología ha sido
implementada con éxito en la mayoría de los animales domésticos como en
conejos (Buhler y col., 1990), ovejas (Wright y col., 1991), cabras (Ebert y col.,
1991), vacas (Krimpenfort y col., 1991) y cerdos (Wall y col., 1991). Sin embargo,
además de los problemas asociados con la integración de los transgenes hay
ineficiencias asociadas con la recolección, cultivo de los huevos fertilizados y
transferencia de los embriones hacia las hembras receptoras. Otros factores como
el largo período de gestación y el bajo número de animales por generación,
sumado al costo extra de cuidado de los animales, han contribuido a la lenta
43
adopción de estas tecnologías, especialmente en los países menos desarrollados.
Los primeros estudios realizados en animales de granja se enfocaron hacia el uso
de genes que controlan la productividad del animal, por ejemplo genes de la
hormona del crecimiento para incrementar la tasa de crecimiento y la eficiencia de
conversión (Pursel y Rexroad, 1993). Estos estudios mostraron los problemas de
la inyección pronuclear con relación al control de los niveles de expresión del
transgen. Se encontró una gran variación de expresión en las líneas de animales
transgénicos generados, siendo ésta en general muy pobre, especialmente si no
todos los elementos reguladores del transgen eran incluidos en la construcción
genética (plásmido). Esto llevó a que muchos investigadores dedicaran mayores
esfuerzos a entender la forma en que los transgenes se insertan en el genoma del
animal y los factores que afectan la expresión de los mismos. Esto explica por qué
la mayoría de los experimentos dirigidos a alterar la composición de la leche han
sido realizados principalmente en el ratón, aunque existen algunas notables
excepciones tales como la secreción de proteínas de valor terapéutico como el
factor IX de la coagulación en la leche de ovejas (Wright y col., 1991), el activador
de plasminógeno de tejido en la leche de cabras (Ebert y col., 1991) y la lisozima
humana en la leche de bovinos (Krimpenfort y col., 1991). Sin embargo, dada la
baja eficiencia de esta tecnología (Clark y col., 1994), sumado a los costos
involucrados, es que ha habido una búsqueda constante por nuevas alternativas.
Así, la manipulación de las células madre embrionarias de ratón (ES cells)
apareció como una potencial solución para muchos de los problemas encontrados
con la técnica de microinyección pronuclear.
 Transformación genética mediante recombinación homóloga en células madre
embrionarias (ES cells). El aislamiento de células madre embrionarias de ratón,
en 1989, abrió nuevas posibilidades para estudiar la función génica en animales
transgénicos (Thompson y col., 1989). Las células madres embrionarias se
obtienen desde el macizo celular interno de blastocistos y se pueden mantener en
cultivos sin perder su estado indiferenciado gracias a la presencia en el medio de
cultivo de factores inhibitorios de la diferenciación. Estas células pueden ser
manipuladas in vitro vía recombinación homóloga, permitiendo así alterar la
función de genes endógenos. Las células así modificadas pueden ser entonces
reintroducidas en blastocistos receptores contribuyendo eficientemente a la
formación de todos los tejidos en un animal quimérico incluyendo la línea germinal
(Evans y Kaufman, 1981; Martin, 1981). Esta tecnología posibilita modificaciones
genéticas muy finas en el genoma del animal, tal como la introducción de copias
únicas de un gen. La incorporación de una copia única de un gen en un sitio
predeterminado del cromosoma tiene las ventajas de permitir controlar el número
de copias del transgen y se puede controlar la inserción de este en un sitio
favorable (transcripcionalmente activo) para su expresión tejido-específica.
Utilizando esta tecnología ha sido posible anular la función de genes endógenos
del ratón mediante la integración de un marcador de selección, lo que ha permitido
44
la generación de varios cientos de ratones llamados knock out que han servido
como modelos de enfermedades genéticas en humanos y como modelos para
analizar la función de genes endógenos (Melton, 1994; Shastry, 1998; Kolb y col.,
1999; Wallace y col., 2000). Lamentablemente, la generación de animales
modificados genéticamente a través de esta ruta ha sido limitada sólo al ratón,
fundamentalmente por la imposibilidad de aislar células madre embrionarias de
otras especies que conserven la capacidad de totipotencialidad que caracteriza a
estas células (Clark y col., 1992; Niemann y Reichelt, 1993; Cibelli y col., 1998).
Aunque células parecidas a las células madre embrionarias (ES-like cells) han
sido descritas en otras especies (lo que ha contribuido a la formación de vacas y
cerdos quiméricos a partir de ellas), en ningún caso se ha demostrado que puedan
transmitir las modificaciones a su descendencia, lo cual ha impedido el
establecimiento de líneas de animales transgénicos a través de esta ruta
(Niemann y Reichelt, 1993; Cibelli y col., 1998).
 Transformación genética mediada por semen. En 1989 Lavitrano y col.
describieron la producción de ratones transgénicos mediante inseminación
artificial, utilizando semen que había sido incubado con ADN exógeno. Aunque
atractivo por su simplicidad, este procedimiento ha sido muy cuestionado por su
poca reproducibilidad, ya que a pesar de los esfuerzos de los principales
laboratorios del mundo estos experimentos no pudieron ser repetidos en el ratón
(Brinster y col., 1989). Más recientemente, el mismo grupo clama haber producido
cerdos transgénicos con una muy alta eficiencia de 54-60% (Lavitrano y col.,
1997); sin embargo, la integridad del transgen no fue analizada y otros estudios
demuestran que el ADN internalizado por esta ruta sufre re-arreglos y
recombinación con el ADN genómico, lo que dificulta la formación de líneas de
animales transgénicos con niveles de expresión estable (Zoraqi y Spadafora,
1997).
 Transformación genética mediante transformación de células somáticas y
transferencia nuclear (clonación). La transferencia nuclear se describió por
primera vez en 1952 en anfibios y consiste en extraer el material genético de un
ovocito para posteriormente introducirle el material genético de una célula del
animal a clonar. Los trabajos pioneros de Briggs y King (1957) demostraron que
los núcleos de células al estado de blastocisto eran capaces de dirigir el desarrollo
embrionario normal de ovocitos reconstituidos y generar una rana adulta a partir
de estas células. En la década de los ochenta se realizaron exitosamente
transferencias nucleares en la mayoría de los mamíferos como conejos (Stice y
Robl, 1988), cerdos (Prather, y col., 1989), bovinos (Prather y col., 1987) y ovejas
(Willadsen, 1986; Smith y Wilmut, 1989). Estos experimentos se realizaron por
medio de la disociación de blastómeros embrionarios (células embrionarias no
diferenciadas) y su posterior transferencia nuclear. Sin embargo, los intentos por
realizar transferencia nuclear con células más diferenciadas fueron infructuosos, lo
que llevó a pensar que el ADN de células diferenciadas no podía reprogramarse,
45
surgiendo entonces el dogma de que el proceso de diferenciación celular era
irreversible. Este dogma se derrumbó el 27 de febrero de 1997, fecha en que Ian
Wilmut y sus colegas del Instituto Roslin, en Edimburgo, Escocia, explicaron en la
revista Nature cómo habían creado a la oveja Dolly. Dolly fue el resultado de la
fusión de un núcleo procedente de una célula mamaria extraída de una oveja
adulta con un óvulo al que previamente se le había extraído el material genético
(proceso conocido como enucleación). El equipo escocés demostraba así que las
células adultas y especializadas podían ser reprogramadas. La etapa clave de
este proceso fue la coordinación del ciclo celular de la célula receptora y el de la
célula donante de núcleos que se logró mediante la deprivación de suero de estas
últimas (Campbell y col., 1996; Wilmut y col., 1997). La deprivación de suero,
previo a la transferencia nuclear, induce a las células a salir del ciclo de
crecimiento y entrar en un estado de arresto celular o quiescencia (G0/G1 en el
ciclo celular), que se ha propuesto potenciaría el desarrollo embrionario,
permitiendo a los factores en el ooplasma reprogramar el núcleo donante
(Campbell y col., 1996). Siguiendo los hallazgos de Campbell y Wilmut muchos
grupos han reproducido exitosamente estos experimentos (Schnieke y col., 1997;
Wells y col., 1997; Baguisi y col., 1999; Zakhartchenko y col., 1999a; Reggio y col.,
2001), con la excepción de un grupo en Estados Unidos, quienes han
recomendado el uso de células proliferando activamente, esto es, células en G1
en el ciclo celular en vez de deprivadas de suero (Cibelli y col., 1998). Sin
embargo, ninguno de estos estudios comparó directamente la eficiencia de ambos
tratamientos para producir animales clonados y estudios recientes, utilizando
fibroblastos fetales, han demostrado que la inducción del estado de quiescencia
en las células mejora significativamente el desarrollo a la etapa de blastocisto
comparado con células proliferativas, aunque no se evaluó la tasa de éxito de la
transferencia de estos embriones en receptoras sincronizadas (Hill y col., 2000;
Zakhartchenko y col., 1999b).
 Problemas de la transgénesis. La introducción de una nueva información
genética (el transgén) dentro del genoma de un organismo puede presentar
algunos problemas en relación a dónde y cuándo expresar el transgén, tal como
se indica a continuación:
-
Integración múltiple (en tándem o no)
-
Lugar de integración indeterminado (efecto de posición)
-
Metilación y falta de expresión
-
Mosaicismo (germinal y somático)
-
Expresión específica/ectópica
-
Expresión variable
-
Expresión variable dentro de líneas (variegación)
46
En cualquier caso, el ideal sería poder dirigir con total precisión el lugar de
integración del transgén. Así, por ejemplo, en 1999 se obtuvieron en el Roslin
Institute de Edinburgo las ovejas transgénicas “Cupid” y “Diana” a partir de la
clonación de cultivos celulares modificados mediante recombinación homóloga
(“gene targeting”).
- Potenciales usos de la tecnología de transferencia nuclear y recombinación
homologa en producción animal
- Clonación de animales elite. Además de proporcionar una ruta para la
generación de animales transgénicos, la transferencia nuclear podría utilizarse
para realizar la imagen más popular de la clonación, esto es, la producción de
cantidades ilimitadas de animales genéticamente idénticos. La posibilidad de
multiplicar razas de animales seleccionados podría aumentar la eficiencia de la
productividad pecuaria. Sin embargo, la principal ventaja de la clonación no sería
en los programas de selección, sino en la diseminación más rápida del progreso
genético desde rebaños elite hacia los productores. Hasta la fecha esto se ha
venido realizando mediante la inseminación artificial, la cual suministra sólo la
mitad de los genes. Con la clonación, los productores que pudieran pagar este
servicio recibirían embriones que serían clones de las vacas más productivas de
los rebaños elite, con lo que incrementarían la performance de sus rebaños en tan
sólo una generación. En este escenario las empresas venderían embriones
clonados de la misma forma en que hoy comercializan el semen. Estos embriones
tendrían la ventaja de un transporte más fácil de los genotipos entre países,
evitándose los inconvenientes de la cuarentena. Un potencial riesgo de esta
práctica estaría en la posibilidad de pérdida de diversidad genética; sin embargo,
esto se podría evitar restringiendo la venta de un número limitado de clones de
cada genotipo a cada productor. Aunque los rebaños de algunos productores
pudieran consistir sólo de animales clonados, el hecho de que estos fueran clones
de diferentes animales elite incrementaría la diversidad genética en estos predios.
- Conservación genética. Aunque la transferencia nuclear se asocia en la mente
de la gente con una pérdida de la diversidad genética, esta técnica también
proporciona nuevas alternativas para la conservación genética. Con una cada vez
más creciente presión comercial, muchas razas indígenas o criollas adaptadas a
las condiciones locales (a modo de ejemplo la raza Overo Negro en nuestro país)
están siendo reemplazadas por razas comerciales sujetas a sistemas intensivos
de producción. Estas razas locales pueden contener importantes genes que
confieran resistencia a enfermedades y resistencia a las condiciones climáticas
(frío/calor). Hay, por tanto, una urgente necesidad por prevenir su extinción. Los
métodos actuales de conservación consisten en almacenar semen o embriones
congelados, procesos que son largos y costosos. Como consecuencia, el futuro de
sólo unas pocas razas está asegurado. La tecnología de clonación puede
47
proporcionar una forma más simple y efectiva de conservar estas razas, por
cuanto muestras de sangre, biopsias de piel o incluso pelo pueden ser utilizadas
como fuentes de células que podrían ser crecidas brevemente en el laboratorio,
mantenidas y congeladas mediante su almacenamiento en nitrógeno líquido para
ser luego utilizadas en experimentos de transferencia nuclear. El mejor ejemplo
del potencial de esta tecnología lo demuestran los recientes experimentos en
diversas especies en peligro de extinción mediante transferencia nuclear
interespecies (Lanza y col., 2000; Kitiyanant y col., 2001; Loi y col., 2001; Lee y
col., 2003).
- Eliminación de genes (gene knock out). La posibilidad de recombinación
homóloga (gene targeting) en células somáticas previo a la transferencia nuclear
ha captado la atención de las principales compañías biotecnológicas que desean
capitalizar los frutos de esta tecnología (Pollock y col., 1999; Reggio y col., 2001).
La modificación genética que conduce a la pérdida de función de un gen, o más
comúnmente conocida como gene knock out, ha sido utilizada extensivamente en
el ratón para obtener un mayor entendimiento de la función génica y como modelo
para ciertas enfermedades (Shastry, 1998; Kolb y col., 1999; Wallace y col., 2000).
Actualmente existe una gran carencia de órganos para trasplantes humanos que
no es cubierta por las donaciones. El trasplante de órganos de animales hacia
humanos (xenotrasplantes) podría ser la solución. Sin embargo, existen muchas
barreras de rechazo entre especies que limitan su uso. La principal barrera
consiste en el fenómeno de rechazo hiperagudo debido a la presencia de
anticuerpos naturales contra epítopes del disacárido galactosa 1-3 galactosa
presente en las superficies celulares de mamíferos, pero que estarían ausentes en
las superficies celulares de humanos y monos (Gallili y col., 1985). Este es uno de
los principales usos donde la tecnología de recombinación homóloga acoplada con
transferencia nuclear está siendo explotada. La reciente generación de cerdos
transgénicos en los que se eliminó el gen 1-3 galactosiltransferasa y que permitiría
la producción de animales que carecen del epítope responsable del rechazo
hiperagudo, es una clara demostración del poder de esta tecnología (Phelps y col.,
2003).
Otra de las aplicaciones de esta tecnología está en la creación de animales
resistentes a ciertas enfermedades. Las enfermedades ocasionadas por priones
han tenido un enorme impacto económico en algunos países de Europa y la
utilización de productos animales para su uso en humanos es una preocupación
constante. Este es el caso de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) o más
comúnmente conocida como enfermedad de las vacas locas que sería la causa de
una nueva forma de enfermedad de Creuzfeldt Jacob en humanos denominada
vCJD (Hill y col., 1997). Experimentos realizados en ratones (Prusiner y col., 1993)
y más recientemente en ovejas (Denning y col., 2001), demuestran que es factible
eliminar el gen para los priones (PrP) mediante recombinación homóloga y que los
animales producidos son resistentes al Scrapie. Dado que las ovejas y vacas
48
están siendo utilizadas para producir proteínas humanas de uso farmacológico y
que estos animales poseen genes funcionales PrP, sería apropiado producir
poblaciones de animales resistentes a estos priones.
La tecnología de recombinación homóloga ha sido ampliamente utilizada en el
ratón para producir varios modelos de enfermedades humanas. Sin embargo,
debido a las diferencias fisiológicas sería más apropiado disponer de modelos
animales que se asemejen más al humano. Este es el caso del modelo para
fibrosis quística creado en el ratón, donde se eliminó el gen Cftr (Cystic fibrosis
transmembrane responder). Este modelo no presentó las características típicas de
la enfermedad en humanos debido a las diferencias en la fisiología del pulmón del
ratón (Davidson y col., 1995). La eliminación del gen Cftr en la oveja se esperaría
produjera un modelo animal para fibrosis quística más exacto debido a las
similitudes de la fisiología pulmonar entre ovejas y humanos (Harris, 1997).
Las modificaciones en los animales que pudieran influir rasgos de producción tales
como el crecimiento y la eficiencia de alimentación son uno de los principales
objetivos en el mejoramiento animal. Ratones en donde el gen de la miostatina se
eliminó mediante recombinación homóloga desarrollaron mayor musculatura
esquelética que los controles no modificados (McPherron y col., 1997). Además, el
fenotipo de doble musculatura de algunas razas bovinas, por ejemplo Belgian
Blue, ha sido asociado a modificaciones (mutaciones naturales) del gen de la
miostatina (Grobet y col., 1997). Por lo tanto, la eliminación de este gen en
bovinos, ovejas y cerdos podría producir animales con mayor masa muscular, lo
cual sería de enorme importancia económica. Tal es así que actualmente existe
una empresa biotecnológica en USA (http:// www.prolinia.com) cuyo objetivo es
proporcionar la clonación a los mejoradores de razas registradas, para luego
mediante ingeniería genética proveer a estas razas elite de características
deseables como la mutación para el gen de la miostatina.
Otra característica productiva que se podría mejorar a través de esta tecnología es
la leche. La leche aporta cerca del 30% de las proteínas consumidas en los países
desarrollados. Por esta razón, la lactancia ha sido objeto de diversos estudios en
el campo de genética, fisiología y nutrición. La recombinación homóloga podría ser
utilizada para reemplazar genes de las proteínas de la leche de los animales de
granja con la respectiva contraparte de los genes humanos para utilizarlos como
fuentes de proteínas. Por ejemplo, la seroalbúmina humana es utilizada
ampliamente para el tratamiento de quemaduras y como reemplazo de fluidos
corporales en cirugía. La escala de requerimiento de esta proteína (~ 600
toneladas al año) la hacen un muy buen candidato para su producción a escala
comercial en la leche de vacas transgénicas. Desafortunadamente, la
seroalbúmina bovina es muy similar a la humana, lo que genera problemas para
su purificación. Una solución sería reemplazar el gen bovino con su contraparte
humana, así la proteína bovina sería eliminada sin alterar o comprometer la
49
viabilidad del animal. Otro ejemplo lo constituye la ß-Lactoglobulina que está
presente sólo en la leche de rumiantes y no tiene una función conocida en el
proceso de secreción de leche (Clark y col., 1998). Su presencia confiere algunas
propiedades de elaboración indeseadas y se cree es la responsable de la mayoría
de las alergias a la leche bovina, situación que afecta a una considerable parte de
la población mundial. Por lo tanto, la eliminación de esta proteína podría
proporcionar nuevas propiedades tecnológicas a la leche (Richardson, 1985).
Además, su eliminación no sólo ayudaría con el problema de las alergias, sino que
también, debido a la compensación que se produciría en la concentración de las
otras proteínas de la leche, probablemente incrementaría la concentración de
caseínas, lo que tendría un efecto directo para la industria quesera. De la misma
forma, la sobreexpresión de caseínas en la leche se esperaría que alterara
significativamente las propiedades tecnológicas de la misma como fuera
demostrado recientemente por Brophy y col., (2003) y la expresión de proteasas
podría generar resistencia a enfermedades de gran impacto en el sector lechero
como la mastitis (Kerr y col., 2001).
- Aplicaciones de la transgénesis. La biotecnología incluye “cualquier técnica que
utilice organismos vivos o parte de los organismos para fabricar o modificar
productos, mejorar plantas, animales o desarrollar microorganismos para usos
específicos” (Rodríguez-Villanueva, 1986).
La potencialidad de la biotecnología estriba en producir cantidades ilimitadas de:





Substancias de las que nunca se había dispuesto con anterioridad
Productos que se obtenían en pequeñas cantidades
Abaratamiento de los costes de producción
Mayor seguridad en los productos obtenidos
Nuevas materias primas, más abundantes y menos caras
Dentro de este contexto general, la Biotecnología ha incorporado la transgénesis
animal con los fines que se indican a continuación:




Mejora de caracteres productivos
Resistencia a enfermedades
Modelos animales de enfermedades humanas (por ejemplo, ratones knockout)
Animales transgénicos como biorreactores para la síntesis de proteínas de alto
valor (proteínas terapéuticas): Las “granjas farmacéuticas” o “granjas
moleculares”
 Donación de órganos: Xenotransplantes
- Las granjas farmacéuticas. La Biotecnología ha aplicado estas técnicas
experimentales de transgénesis y ya hoy se están estableciendo las primeras
50
granjas farmacéuticas en las que se crían ovejas, cabras, vacas o cerdos
transgénicos que producen en su leche proteínas terapéuticas humanas (
Velander et al., 1997).
La manipulación genética de un mamífero doméstico transgénico consiste, en
primer lugar, en preparar el fragmento de ADN que contiene el gen humano,
uniéndolo a otro fragmento de ADN correspondiente a un elemento regulador
(promotor) procedente de un gen que promueve la síntesis de una proteína de la
leche (por ejemplo, la -lactoglobulina, la caseína, etc.). De esta manera se
asegura que el gen humano sólo se expresará en las células de las glándulas
mamarias del animal transgénico (oveja, cabra, vaca, cerdo) obtenido tras la
inyección del ADN manipulado en el pronúcleo masculino de un cigoto producido
por fecundación in vitro. Sin embargo, actualmente, la utilización de la técnica de
clonación por transferencia de núcleos de células genéticamente modificadas
resulta más ventajosa. Con esta última técnica, los investigadores del Roslin
Institute de Edinburgo obtuvieron por vez primera en 1997 ovejas transgénicas
procedentes de núcleos de fibroblastos fetales a los que se les había introducido
el gen humano que codifica para el factor IX de coagulación de la sangre
(Schnieke et al., 1997). Los resultados de estos autores demostraron además que
la utilización de la técnica de clonación de los núcleos modificados genéticamente
es mucho más eficaz que la técnica original de microinyección de ADN en los
pronúcleos de los cigotos.
Posteriormente, con estas técnicas se ha conseguido que la leche de las hembras
transgénicas contenga también otras proteínas terapéuticas humanas (-1antitripsina, proteína C, factor VIII de coagulación, antitrombina III, etc.) que
pueden luego ser fácilmente separadas de las restantes proteínas propias del
animal. Además es importante señalar que el animal transgénico no se ve
perjudicado en su desarrollo porque el gen humano sólo se expresa en las células
de las glándulas mamarias debido al regulador específico al que se le ha asociado
y, por tanto, en las restantes células del animal no se sintetiza la proteína humana
al estar silenciado el gen humano. En consecuencia, el animal doméstico ha sido
convertido en un gran biorreactor sin perjuicio aparente para él.
Las primeras granjas farmacéuticas fueron establecidas por compañías
biotecnológicas como Pharmaceutical Proteins Ltd (PPL) en Escocia (1500
ovejas), Genzyme Transgenics en Estados Unidos (1000 cabras), Gene Pharming
Europe en Holanda (vacas), etc. Otros grupos de investigación son partidarios de
la utilización de las granjas de cerdos transgénicos dado su corto tiempo de
gestación (cuatro meses), el intervalo generacional (un año) y el mayor tamaño de
las camadas (10 a 12 lechones), teniendo en cuenta además que una cerda
lactante produce unos 300 litros de leche al año.
51
Las cifras económicas demuestran la importancia futura de las granjas
farmacéuticas: el mercado de proteínas terapéuticas, que actualmente se obtienen
principalmente mediante fermentación o cultivo celulares, se estima en unos 7.600
millones de dólares anuales y se calcula que podrá llegar a ser de 18.500 millones
de dólares el año 2000 (ver Postel-Vinay y Millet, 1997 para una versión
divulgadora de los experimentos de clonación y de animales transgénicos).
Las cifras expresadas parecerían justificar las enormes inversiones que es
necesario hacer para obtener animales transgénicos, tal como se indica en el
cuadro adjunto:
Tabla 3. Producción de mamíferos transgénicos en diferentes especies.
Animales transgénicos
producidos
Meses
Coste en $ Proteína
Especie
para
estimado de producid
%
% embriones
descendencia inyectados y obtener la cada animal a en la
F2
transgénico
leche
transferidos
(por
lactación)
Ratón
17,3
2,6
7,5
$ 121
1g
Conejo
12,8
1,5
17
Porcino
9,2
0,9
38
$ 25.000
Ovino
8,3
0,9
52
$ 60.000
100 Kg
Bovino
3,6
0,7
100
$ 546.000
1.000 Kg
1 Kg
Fuente: A. Sánchez Bonastre, 1999
De la última columna del cuadro anterior se deduce el valor económico de los
rebaños de animales transgénicos. Indicaremos a continuación algunas
realizaciones prácticas:
- Xenotrasplantes. Desde que el Doctor Christian Barnard hiciera su primer
trasplante de corazón, la técnica de trasplante de órganos se ha generalizado en
la práctica médica, habiendo alcanzado altísimos niveles de perfección. Sin
embargo, uno de los retos pendientes es el de la oferta y la demanda:
desgraciadamente muchos pacientes mueren antes de tener acceso al trasplante
deseado. Por ello la posibilidad de recurrir a especies animales como donantes de
52
órganos se planteó hace ya muchos años. De hecho, entre los años 1964 y 1995
se han realizado 32 xenotrasplantes de riñón, corazón, hígado y médula ósea
procedentes mayoritariamente de chimpancé y mandril con un resultado negativo
en todos los casos, tal como se indica en el cuadro adjunto:
Tabla 4. Trasplantes de órganos de animales a humanos.
TRASPLANTES DE ÓRGANOS DE ANIMALES A HUMANOS
Donante
Órgano Supervivencia Número de
Autor
Año
trasplantes
Chimpancé Riñón
Un paciente,
12
Reemtsma
1964
nueve meses
Mono mico Riñón
10 días
1
Reemtsma
1964
Mandril
Riñón
4 días y medio
1
Hitchcok
1964
Mandril
Riñón
Un paciente, dos
6
Starzl
1964
meses
Chimpancé Corazón Extirpado
1
Hardy
1964
Chimpancé Hígado
Un paciente, 14
3
Starzl
1969-74
días
Mono
Corazón Fracasó (sin
1
Yacoub
1975
datos)
Mandril
Corazón Rechazo agudo
1
Barnard
1977
Chimpancé Corazón 4 días
1
Barnard
1977
Mandril
Corazón 3 semanas
1
Bailey
1985
Mandril
Hígado
70 días
1
Starzl
1992
Cerdo
Hígado
34 horas
1
Nakowka
1992
Mandril
Hígado
26 días
1
Starzl
1993
Mandril
Médula El paciente vive,
1
Deeks e
1995
ósea
pero el
Ildstat
trasplante
fracasó
Fuente: Unidad de trasplantes del
Total: 32
Hospital General de Massachussetts,
USA
La utilización de órganos procedentes de monos tenía la lógica de su proximidad
evolutiva con la especie humana, pero la diferencia de tamaños de los órganos
entre las especies suponía un serio inconveniente. Por eso se pensó en el cerdo
como posible donante. Por otro lado, una causa importante del fracaso de los
xenotrasplantes es el rechazo hiperagudo que se produce cuando el organismo
humano reconoce la presencia del órgano de otra especie. De ahí surgió la idea
de utilizar cerdos transgénicos como posibles donantes.
53
Respecto a la utilización de cerdos transgénicos como reservorio de órganos para
posibles trasplantes (xenotrasplantes) de corazón, riñón o hígado a pacientes
humanos hay que ser todavía muy cauto en relación con las expectativas creadas.
El primer paso que se ha dado ha consistido en la obtención de cerdos
transgénicos capaces de expresar el antígeno regulatorio del complemento
humano, evitando así el rechazo hiperagudo (Dr. David J.G. White, en Cambridge,
en 1992). No obstante, quedan por resolver aún numerosos interrogantes, entre
ellos la posibilidad de que se transmitan al hombre infecciones virales de origen
animal (Le Tissier et al. 1997). De ahí la importancia que tendría la posible
utilización de cerdos transgénicos ante la demanda creciente de órganos y las
correspondientes listas de espera. Para una revisión de los xenotrasplantes ver
Lanza et al. (1997) y Cooper et al. (1997).
- Aspectos bioéticos. En un contexto bioético quizá podría ser conveniente hacer
una valoración general sobre lo que significa la introducción de genes humanos en
organismos no humanos. Habría que distinguir dos situaciones diferentes: la
primera, cuando la transferencia del gen humano al organismo no humano se
hace en beneficio del propio hombre, y la segunda cuando la transferencia del gen
humano al organismo no humano se hace exclusivamente en beneficio (o
perjuicio) de este último.
Desde el punto de vista bioético, la situación creada por la obtención de
mamíferos transgénicos portadores de genes humanos para la obtención de
proteínas terapéuticas humanas no es esencialmente nueva ya que, desde los
primeros tiempos de la ingeniería genética molecular, se han introducido genes
humanos en células bacterianas para obtener proteínas humanas (insulina,
hormona de crecimiento, interferón, etc.). Tanto en el caso de las bacterias como
de los animales transgénicos que se convierten en factorías naturales
(biorreactores) de proteínas humanas, la valoración ética es positiva. En este
último caso es importante señalar además que, al quedar restringida la expresión
del gen humano a las células de la glándula mamaria, la fisiología y desarrollo del
animal no se ven alterados y por tanto se evita cualquier daño a éste, quedando
protegidos así los derechos de los animales.
En el segundo caso planteado, cuando la transferencia del transgén humano se
realiza con el único propósito de influir en el desarrollo del animal, la valoración
ética puede ser negativa si se producen anomalías importantes en su fisiología,
como ocurrió en los cerdos que habían incorporado el gen humano de la hormona
del crecimiento. Finalmente, en este contexto ¿podría decirse que algún gen
humano concreto – en definitiva, un trozo de ADN – merecería un tratamiento o
valoración ética diferente al resto? La respuesta lógica sería negativa, so pena de
caer en una sacralización del ADN humano.
¿Cuál es la valoración ética de los xenotrasplantes? En primer lugar, habría que
tener la garantía suficiente de que no hay problemas de transmisión viral. Aún
54
sentada esta premisa, hay que reconocer que a muchas personas les repugna, en
principio, la idea de que alguien pueda llevar un órgano animal. Sin embargo
habría que recordar que desde hace mucho tiempo se realiza la implantación de
válvulas de cerdo a personas con ciertas insuficiencias cardiacas y todo el mundo
ha aceptado esta práctica médica. Por otro lado, la existencia de prótesis de
material inerte (plástico, metales, etc.) podría ser igualmente rechazado y no lo es.
Ciertamente, desde el punto de vista ético parece que no habría razón para
rechazar los xenotrasplantes en la medicina del futuro, siempre que se solucionen
todos los aspectos técnicos – que son muchos – que aún quedan por resolver.
2.3.2 Clonación. Después de la exitosa clonación de ovinos, bovinos y caprinos
numerosos laboratorios intentaron clonar cerdos. A pesar de los esfuerzos, en
esta especie los resultados no fueron buenos inicialmente. Esto motivo que
numerosos grupos hayan continuado con la producción de cerdos transgénicos
por microinyección pronuclear. Así se han generado cerdos con un incremento de
la conversión alimenticia, originados por la introducción de la construcción
compuesta por metalotioneina + hormona del crecimiento (Nottle et al,.1999).
Recientemente también se han obtenido cerdos destinados a aumentar la
asimilación del fósforo y reducir la concentración de este elemento en las heces,
mediante la expresión de la fitasa bacteriana en la glándula salivar de cerdos, esto
tendría beneficios al reducir la polución ambiental. La fitasa es una enzima que
desdobla el ácido fítico liberando el fósforo del mismo (Golovan et al., 2001).
También se ha alterado la leche de los cerdos para incrementar la salud y el
desarrollo de los lechones esto se ha logrado sobreexpresando alfa-globulina
bovina (Wheeler et al 2001). Estas técnicas de modificación genética se realizaron
en estos trabajos basadas en la introducción del DNA foráneo por microinyección
en la cigotas. Esta metodología es altamente ineficiente (1-2% de inserción
estable) y produce un alto grado de mosaiquismo debido a la inserción tardía
durante el desarrollo embrionario temprano.
El primer cerdo producido por clonación de células somáticas fue producido en el
año 2000 (Polejaeva et al) desde esta fecha se han hecho importantes progresos.
Entre ellos la producción del los primeros cerdos por incorporación de genes al
azar (Park et al., 2000; Lai et al., 2001 y 2002). Si bien esta modificación aumenta
la eficiencia en la obtención de animales transgénicos, la integración del transgen
continúa siendo al azar, por lo cual la expresión del mismo es esencialmente
impredecible. Para solucionar este problema se han estado reclonando los
animales con expresión adecuada (Salamone et al., 2004) para tener animales de
producción predecible, pero aun son necesarias futuras mejoras.
La técnica de recombinación homóloga permite la modificación precisa de los
genes existentes, evita los problemas derivados de los efectos posiciónales y de
inactivación por inserción y permite además la inactivación de genes específicos
así como el reemplazo de un gen por otro. La utilización de la técnica de
55
recombinación homóloga permite aplicaciones sumamente atractivas en el campo
de la producción animal (Piedrahita, 2000). En cerdos la transgénesis en sitio
especifico o recombinación homologa ha sido lograda exitosamente (Day et al.,
2002; Lai et al., 2002; Ramsoondar et al., 2003; Sharma et al., 2003).
Los cerdos son fisiológicamente similares a humanos y ha habido intenso interés
en utilizarlo para transplante de órganos, así como, para modelo de
enfermedades. La producción de órganos y tejidos animales humanizados para
ser utilizados en transplante ha despertado también un interés enorme. Esto
implicará la expresión de ciertas proteínas humanas y el silenciamiento de
algunas proteínas de origen animal. Esto puede lograrse creando cerdos por
recombinación homologa mediante el llamado “knockout de la alfa-1,3galactosiltransferasa”. La obtención de productos para transplantes es probable
que se requieran sucesivas modificaciones genéticas.
La expresión de proteínas de valor biológico especialmente de interés
farmacológico usando como biorreactores animales transgénicos, ha demostrado
ser un sistema muy eficiente de producción en numerosas especies. Las
limitaciones han sido el nivel de expresión, modificaciones post-transcripcionales
y el efecto biológico de las proteínas exógenas sobre el animal que las produce.
Una vez que el animal fundador ha sido obtenido también es una limitante llegar
a tener un buen número de animales a escala comercial. En el porcino se ha
seleccionado las vesículas seminales como órgano de expresión de dichas
moléculas. Las ventajas que tienen dichas glándulas incluyen el hecho que el
semen luego de producida la pubertad, es generado constantemente y por lo
tanto también el fluido seminal, además se puede colectar en una forma no
invasiva, no dolorosa y que no requiere gran entrenamiento. Un cerdo
transgénico puede producir por muchos años y ser reemplazado por
reproducción simple en forma no muy costosa. El plasma seminal es una
secreción externa y una vez producida no es reabsorbida, es mas, el exceso de
secreción prostática es eliminada por uretra a través de la orina. Esto permitiría
expresar moléculas con fuerte actividad biológica y estaría ofreciendo ventajas
frente a la glándula mamaria donde ya se ha observado la reabsorción linfática
de proteínas secretadas. Por otro lado ha sido demostrado que en ratones a los
que se le incorporo el transgen de la hormona del crecimiento para ser
expresado en vesículas seminales, no se incrementan los niveles en sangre de
dicha hormona cuando se llega a la pubertad. Incluso cuando se expresan
niveles de 500 ug/ml en el fluido seminal (Sirad et al., 2002). Además los
espermatozoides son muy sensibles a cambios de pH y a las proteasas y el
fluido seminal esta preparado para proteger a los espermatozoides a través de
anti-proteasas, esto es interesante porque probablemente sería posible
aprovechar esta característica para preservar proteínas frágiles. Las proteínas
están en el plasma seminal en forma soluble y no forman micelas como en la
leche donde las proteínas pueden ser atrapadas en las mismas. Los
56
espermatozoides pueden ser centrifugados y el plasma seminal diluido y
purificado usando todo tipo de columnas sin problemas de formación de
coágulos.
Los cerdos son una especie con una eficiencia reproductiva importante, un
macho heterocigoto puede inseminar unas 50 cerdas por mes utilizando
inseminación artificial y cada una de estas puede dar origen a 10 lechones, 5 de
los cuales serán machos y 2-3 transgénicos, originando un grupo de 150
lechones en 5 meses, por lo que al año habría un numero suficiente de machos
para empezar a producir a escala industrial.
A la pregunta ¿cuales serán sus aplicaciones agropecuarias en nuestro sistema
de producción? La respuesta es que nuestra capacidad de imaginación e
innovación es insuficiente. La aplicación más inmediata será la multiplicación de
animales de elite. La utilización de animales clonados facilitara la producción y
difusión de animales transgénicos. Por ejemplo, existe interés en Europa en
reemplazar el gen PrP que torna a los bovinos susceptibles al virus de la vaca
loca por otro que le otorgue mayor resistencia. Numerosas compañías ya han
producidos animales transgénicos y clonados especialmente expresando nuevas
proteínas en leche de valor farmacéutico (Baguisi et al., 1999, Salamone et al.
2005). Hay proyectos que intentan producir cerdos modificados genéticamente
para producir semen de un solo sexo, o utilizar cerdos como modelo para
enfermedades humanas como la arteriosclerosis, etc. (Forsberg, 2005). Todo
esto indica la enorme potencialidad de esta técnica y el futuro desarrollo que
pueda alcanzar en la especie porcina.
- Técnicas de clonación de embriones. Con base en los conceptos de la
clonación descritos anteriormente, se observa que existen tres técnicas que han
sido utilizadas en animales de granja o de laboratorio para producir embriones
genéticamente idénticos. Dos de ellas cabrían en el concepto de la clonación en
un sentido horizontal: la partición o división de embriones por microcirugía, y la
separación y cultivo de blastómeros aislados por métodos enzimáticos o
mecánicos (Agca y col 1998; Rexroad y Powell 1997). La tercera entra en el
concepto de la clonación en un sentido vertical: la transferencia nuclear a partir de
células somáticas de adulto o embrionarias (Campbell y col 1996) o de
blastómeros de embriones (Prather y col 1987; Savoir y col 1997; Tanaka y col
1997) entre otras células (Tabla 5).
57
Tabla 5. Principales Tipos de Celulares Utilizados en las Técnicas de
Clonación.
METODOLOGIA
TIPOS CELULARES
a) Partición de Embriones
 Mórulas
o
blastocitos
tempranos o tardíos (15,38).
 Blastómeros de embriones en
diferentes etapas, desde 2
células
hasta
mórula
cultivándose in Vitro fuera o
dentro de la zona pelúcida
(65,66,67).
 Partenogenotes
(ovocitos
activados químicamente para
dividirse)
para
reagregar
blastómeros. (52,68).
b) Separación y cultivo de
blastómeros aislados
c) Transferencia nuclear
 Como carioplastos (células
donadoras de núcleos).

 Blastómeros obtenidos de
embriones con diferentes
etapas de segmentación
(desde 2 células hasta
blastocitos) (52,69)
 Células somáticas de
embriones (fotroectodermo o
masa celular interna o MCI,
fibroblastos fetales células de
riñón, piel, músculo, gandula
mamaria, y células cúmulo o
espermatogenias de animales
adultos
(3,4,15,39,44,54,70,71,72)
 Ovocitos enucleados
 Cigotos
 Embriones de 2 blastómeros
(19,54,71)
Como
citoplastos
(células
receptoras de núcleos)
- Partición o división de embriones. En la década de los 70 se pensaba que los
embriones en fases tempranas de la segmentación no sobrevivirían después de
una microcirugía. Fue en los años ochenta cuando se demostró que las mórulas y
blastocistos de los animales domésticos eran capaces de desarrollarse después
de una partición y producir nacimientos viables (Rorie y Godke 1987). Actualmente
58
la partición de embriones permite la producción de gemelos idénticos al dividir el
embrión original por métodos microquirúrgicos. Las evidencias experimentales
indican que existe una relación inversa entre el número de secciones que se le
hagan al embrión y el porcentaje de éxito. Las tasas de producción de gemelos
monocigóticos van desde poco mas de 30% en bovinos y ovinos (Edwards y
Beard 1998; Herman y col 1998; Williams y col 1983) siendo hasta casi 70% en
bovinos, con porcentajes de gestación superiores a 60% (14) e incluso, en algunos
casos, equivalentes a 100% (Williams y col 1983).
El número de células que tenga el embrión no solo limita el número de segmentos
en que pueda dividirse, sino que también tiene incidencia sobre otros aspectos.
Típicamente se utilizan embriones en etapa de mórula o blastocisto (Baker 1985;
Seidel 1993). Esta estrategia permite utilizar una de las secciones para otros fines
experimentales como la determinación del sexo del embrión, mientras que el resto
se cultiva o congela para después transferirse a hembras receptoras previamente
sincronizadas para mantener la gestación (King y col 1992; Schmidt y col 1992;
Palma y col 1995).
Los embriones en etapa de blastocisto son seccionados de manera que se dividan
en dos partes iguales tanto la masa celular interna (MCI como el trofoectodermo).
Es recomendable emplear soluciones que deshidraten ligeramente al embrión (por
ejemplo, sacarosa 200mM), con lo que se reduce el daño al trofoectodermo
durante su partición. Una vez cortadas, las mórulas compactas y los blastocistos
no necesariamente deben ser introducidos a zonas pelúcidas, teniendo una
sobrevivencia aceptable al ser transferidas en hembras receptoras; aunque
existen informes que indican tasas de supervivencia de 15% en medios embriones
(demi-embriones) sin zona pelúcida y de 35% cuando se transfieren con zona
pelúcida. En este último caso las tasas de gestación van de 55% a 65% en
bovinos (Baker 1985). Willadsen y Godke en 1995, obtuvieron tasas de gestación
de 80% en bisecciones de embriones de ovino indistintamente si tenían zona
pelúcida o no. En la tabla 6 se muestran algunos de los factores principales que
afectan las tasas de éxito con esta técnica.
- Separación y cultivo de blastómeros aislados. En algunas especies, como los
equinos, se ha utilizado la separación de blastómeros de embriones previos a su
implantación para efectuar estudios de diagnóstico de enfermedades genéticas.
En ellos se ha determinado la viabilidad de los embriones analizados después de
su transferencia en hembras receptoras, encontrándose tasas de gestación de
21% (Huhtinen y col 1997).
En humanos la separación y cultivo de blastómeros aislados también han sido
utilizados en estudios de biopsias de embriones en diferentes etapas de
segmentación con la finalidad de dar alternativas a los estudios de diagnóstico
prenatal, evaluando a su vez el desarrollo embrionario in vitro con el propósito de
que se seleccionen los mejores embriones capaces de desarrollarse en
59
blastocistos y congelarlos mientras se evalúan sus blastómeros aislados (Geber y
col 1995; Pierce y col 1997; Geber y Sampaio 1999).
La técnica de separación de los blastómeros implica la remoción de la zona
pelúcida, ya sea por métodos químicos, mecánicos o enzimáticos, para
posteriormente obtener los blastómeros mediante aspiración, extrusión o
disminución de sus interacciones en soluciones libres de Ca2+ y Mg2+ (Savoir y
col 1997; Saito y Niemann 1991; Cheong y col 1993; Reicheit y Niemann 1994).
Los blastómeros de rata aislados en la etapa de dos células, son capaces de
formar embriones completos (Matsumoto y col 1989). En el ratón se han obtenido
gemelos idénticos removiendo la zona pelúcida de embriones de dos células y
cultivándolos separadamente previo a su transferencia (Williams y col 1984). En
otras especies, el éxito del experimento se ha determinado como dependiente de
diversos factores. Así, por ejemplo, en porcinos y ovinos la baja eficiencia en la
obtención de fetos se debe a la baja sobrevivencia in vivo.
En embriones libres de zona pelúcida en fases previas a la compactación
(Williams y col 1984). Esta tasa de nacimientos puede aumentarse si se utilizan
embriones encapsulados en gel de azarosa (Herman y col 1998; Lehn-jensen y col
1983). De manera que algunas estrategias para suplir a la zona pelúcida son el
empleo de capsulas artificiales de azarosa (Willadsen 1979) o de alginato de sodio
(Eaton y col 1990; Adaniya y col 1993), o matrices extracelulares como la
fibronectina y laminina (Saito y niemann 1991; Wilton y Trounson 1989).
EI número de células que forman al embrión separado constituye otro factor
importante en la probabilidad de éxito. Willadsen en 1989, demostró que la tasa de
gestación en ovinos y bovinos se reducía conforme se hacían grupos de células
de números menores. La mayor tasa de gestación que obtuvo este autor fue del
66% al utilizar embriones de dos células o dos grupos de células provenientes de
embriones de hasta ocho células. Cuando utilizó embriones de cuatro células o
pares de células de embriones de ocho células, la tasa de gestación se redujo a
50%. Cuando se utilizaron los blastómeros individuales provenientes de embriones
de ocho células, la tasa de gestación fue de sólo 5%. En todos los casos en los
que se separaron las células embrionarias, el número de células formando el
blastocisto se reducía linealmente con el número de "divisiones" a la que era
sometido el embrión. Un dato importante de este estudio es que cuando se
utilizaron las células individuales de los embriones de ocho células, el desarrollo
de la MCI se veía fuertemente comprometido al extremo de formarse sólo
vesículas sin la presencia de este grupo de células.
60
Tabla 6. Factores que Afectan las Tasas de Gestación en La Partición de
Embriones
FACTORES
Calidad morfológica
CONSIDERACIONES
Mejores de grado 1 a 2 (14)
Fase de segmentación de embriones
Mejores resultado (30) y con mayor
tasa de gestación (16) en blastocito
con mórula
Numero se secciones en las que se Los
medios
embriones
(demidivide el embrión
embriones) sobreviven mejor en el
útero que los 4 embriones (14), los 4
embriones carecen de MCI funcional,
viabilidad reducida (30)
Presencia de zona pelúcida
Resultados controversiales, necesaria
en algunos casos (66) o con escasa
diferencia (16)
Sistema de cultivo de los embriones Mejor en oviducto ligados que in Vitro
partidos
Numero
de
demi-embriones Relación directa entre el numero de
trasferidos a hembras receptoras
demi-embriones trasferidos y la tasa
de gestación
Preservación
Menor probabilidad de supervivencia
de demi-embriones congelados (14,
23)
Sexo
Afectado por la manipulación y el
cultivo de embriones, mayor pérdida
de embriones femeninos (20)
Aparentemente, en los blastómeros aislados se promueve más fácilmente la
apoptosis y se afecta preferentemente a las células de la MCI. Este proceso
contribuye a la incidencia de abortos debido a que la poca cantidad de células de
la MCI reduce la viabilidad fetal (Chan y col 2000).
En monos esta misma técnica ha sido aplicada a partir de embriones de ocho
células, en la que se separan los blastómeros mientras son mantenidos en medio
61
libre de Ca2+ y Mg2+ ,y luego se reagrupan por pares que se introducen en zonas
pelúcidas para que puedan desarrollarse hasta la fase de compactación y así
transferirlos a hembras receptoras. El 8% de los embriones tratados brindaron
crías vivas (Chan y col 2000).
- Transferencia nuclear. Una técnica que incrementa el potencial de desarrollo
de los blastómeros aislados de embriones de ocho células o de etapas mas
tardías de la segmentación es la transferencia nuclear (Willadsen 1989). Esta
técnica permite la producción de individuos genéticamente idénticos originados a
partir de un solo donador de núcleos (Romo 1994). Implica la inserción por
métodos químicos, físicos, biológicos o mecánicos del núcleo de una célula
donadora que puede ser tomada de varios tejidos a la cual se le llama carioplasto,
con un ovocito activado y carente de núcleo, o con un huevo fertilizado al que se le
hayan extraído los pronúcleos (Edwards 1998; Wlladsen 1989; Meng y col 1997;
Bromhall 1975). Contrariamente a lo que pudiera pensarse, el desarrollo de esta
metodología es más bien antiguo, si bien hasta hace poco ha acaparado el interés
no sólo de la comunidad científica, sino del público en general. En la tabla 7 se
muestra una cronología de los eventos más importantes en la obtención de
organismos clonados por transferencia nuclear.
Es importante destacar que tanto el citoplasma que recibirá al núcleo transferido
como el propio núcleo deben tener características fisiológicas específicas para que
se realice con éxito tanto la transferencia nuclear como el desarrollo posterior de la
célula reconstituida y, eventualmente, el desarrollo del nuevo organismo. La célula
que contiene al núcleo que será transferido (carioplasto) debe tener características
particulares que permitan cierto porcentaje de éxito antes de ser colocado en el
espacio perivitelino adyacente a la membrana del ovocito (citoplasto) y se fusione.
Experimentalmente el uso de citocalacina B para bloquear la polimerización de
microfilamentos, y de colchicina para la de los microtúbulos, permiten controlar los
movimientos del citoesqueleto en el carioplasto, provocar una elasticidad de la
membrana plasmática y favorecer así la enucleación mediante el uso de
micropipetas, sin romper la membrana plasmática (Edwards 1998; Prather y col
1987; Cheong y col 1993; McGrath 1983; Prather 1990; Yong 1998).
Si se utiliza un embrión en segmentación como carioplasto, también requerirá de
la micromanipulación para obtener sus blastómeros. Uno de estos últimos se
transfiere dentro del ovocito en metafase II desprovisto previamente de su núcleo,
y se fusiona con él. Mediante este proceso, el ovocito se activa y da inicio a su
desarrollo como un nuevo embrión. En algunas especies la sola transferencia del
carioplasto inicia la activación del ovocito (Edwards 1998; Prather 1990; Bromhall
1975; McLaren 1984).
62
Tabla 7. Cronología de la clonación mediante transferencia Nuclear y
separación de blastómeros
AÑO
1938
1952
1967
1970
1981
1984
1987
1992
1993
1996
1997
1997
2000
EVENTO
Hans Speman divide un cigoto de salamandra con un cabello; mantiene
al núcleo en una de sus mitades que continua su segmentación. Al
retirar la barrera, uno de los nuevos núcleos llega al interior de la mitad
que carecía de él y se segmenta hasta convertirse en otro embrión.
Robert Briggs y Thomas King demuestran que los núcleos de
blastocistos de rana (rana pipiens), son capaces de desarrollar
renacuajos al ser transferidos a ovocitos enucleados.
Di Bernardino observa que los núcleos aislados de embriones en etapa
de gástrula, desarrollan renacuajos anormales.
Se efectúan algunos experimentos parcialmente exitosos con núcleos de
células intestinales de sapos. Estos clones se desarrollan hasta alcanzar
el estado de renacuajos, sin llegar a adulto.
Primer reporte al nacimiento de ratones provenientes de la transferencia
de núcleos de células somáticas en ovocitos enucleados, al intentar
repetir estos experimentos otros investigadores no pudieron lograrlo.
Clonación de ovinos utilizando núcleos de blastómeros de embriones
por fusión con virus Sendai o campo eléctrico con ovocitos enucleados.
Ovejas al término de su desarrollo.
Nacimientos de dos terneros a partir de cigotos reconstituidos con
núcleos de blastómeros de embriones electrofusionados con ovocitos
enucleados.
Cultivo in vivo en oviductos de oveja hasta blastocisto y transferencia a
una vaca receptora hasta que llegaron al término de su desarrollo.
Uso de color ante Hoechst para monitorear el proceso de enucleación
de ovocitos de bovino. Nacimiento de 32 terneros.
Electrofusión de núcleos de ratón a partir de blastómeros de embriones
en estado de 2 ,4 y 8 células con ovocitos, con nacimiento de crías
vivas.
Nacimiento de ovejas vivas partiendo de ovocitos enucleados por
transferencia de núcleos de células epiteliales de embriones de 9 días
de gestación mantenidas en etapa Go.
Nacimiento de “Dolly” utilizando el núcleo de células derivadas de
glándula mamaria de oveja adulta arrestada en la fase G por reducción
de suero en el medio.los núcleos fueron electrofusionados a ovocitos
enucleados. La tasa de éxito es inferior al 1 %.
Nacimiento de “Neti” y “Dite” dos monos Rhesus obtenidos por
electrofusión de núcleos derivados de fertilización in vitro y ovocitos
madurados in vitro, enucleados y activados con cicloheximida. Tasa de
éxito de 3,77%.
Obtención de cerdos clonados mediante electrofusión y microinyección
de núcleos. Tasa de éxito inferiores al 8 %.
63
La primera etapa de esta metodología es la obtención del citoplasma adecuado
para que sirva de aceptor del núcleo. A los ovocitos en metafase II se les retira el
núcleo, en el caso de huevos fertilizados, se les extraen los pronúcleos en
microscopía de contraste de fases. Para confirmar que el material cromosómico
haya sido totalmente extraído, se aplican tinciones de ADN en el citoplasma del
ovocito. El colorante más utilizado para esta etapa es el Hoechst 33258 para
visualizar la ausencia de contenido nuclear en los ovocitos enucleados, bajo luz
ultravioleta durante períodos de menos de diez segundos, sin efectos negativos en
el desarrollo de los embriones reconstituidos (Yong 1998; Stice y col 1993; Le
Bourhis y col 1998).
Respecto a las características del carioplasto, entre mas diferenciada esté la
célula somática, menor será la probabilidad de éxito en la transferencia nuclear.
Para que una célula sea totipotencial requiere que su núcleo sea capaz de
desarrollarse en un nuevo embrión (Solter 1996). Para ello los genes que dan
lugar al desarrollo de un organismo completo deben estar presentes aún cuando
no todos sean expresados (Casas y col 1998). Algunos de los genes que deben
expresar las células totipotentes son el gen Tnap, los factores de transcripción, los
genes Oct 3/4, el proto-oncogen ckit, y la ADN metiltransferasa Mt (Urven y col
1993).
La experiencia con múltiples tipos celulares tanto embrionarios como de tejidos
diferenciados ha demostrado que el uso de núcleos de blastómeros obtenidos de
embriones de dos células es mas eficiente que los de ocho células; asimismo, los
núcleos de blastómeros de las células de la MCI son mas eficientes que los de las
células de la granulosa, por ende, las células embrionarias son mas efectivas que
las células de individuos adultos (Edwards 1998). A su vez, los núcleos de las
células de la MCI son más efectivos que los de las células del trofoectodermo
(McLaren 1984). Cheong et al (1993) encontraron que al utilizar núcleos de
blastómeros de embriones de dos, cuatro y ocho células que se hallaran en la fase
temprana del ciclo celular (fase G 1 de la segunda división), como donadores de
núcleos para ser transferidos, los de dos células daban 78% de blastocistos y 29%
de ratones nacidos vivos a partir de los embriones reconstituidos, mientras que los
de cuatro células daban 71% de blastocistos y 22% de ratones nacidos vivos, y los
de ocho células daban 46% y 17% respectivamente. En resumen, los núcleos
obtenidos de embriones en las fases tempranas de la segmentación tienen la
ventaja sobre los provenientes de células diferenciadas en que los primeros
revierten con facilidad los cambios que sufren previo a su diferenciación; mientras
que los últimos deben revertir los cambios que ya han sufrido durante más de 30
ciclos de divisiones celulares.
Es por ello que una transferencia nuclear eficiente, con un desarrollo a término del
huevo manipulado, dependerá de la reprogramación adecuada del núcleo
donador. Las macromoléculas del tipo del ARN mensajero y las proteínas
64
almacenadas en el ovocito sólo soportan el desarrollo embrionario durante un
tiempo relativamente corto. Entre más corto sea este período, se requerirá menor
tiempo para la reprogramación. Conforme el embrión sufre cambios mayores y
crece, sus células requerirán mayor tiempo y será probable que esta
reprogramación no se lleve a cabo adecuadamente. En algunas especies, la
activación de la transcripción del genoma reintroducido ocurre hasta el estado
previo al blastocisto, por 10 que depende de la transcripción del ARN materno. En
embriones productos de una fertilización normal, este proceso se lleva a cabo a
diferentes tiempos en diferentes especies: a partir del estado de dos células en
ratones y caprinos; de cuatro células en porcinos; y en el paso de ocho a dieciséis
células en embriones de ovinos y bovinos (Prather y col 1987). En la transferencia
nuclear, la compatibilidad entre el citoplasma recipiente y el núcleo donador, es
poco entendida aún y toma parte en la reprogramación del núcleo donado (Solter
1996).
Dentro de los cambios que deben revertir los núcleos de las células de adulto
durante la transferencia nuclear está la metilación del ADN que es esencial para el
desarrollo embrionario. El genoma del ovocito está poco metilado, mientras que en
el embrión comienza a incrementarse esta metilación. Esto ultimo afecta la
expresión de los genes, la inactivación del cromosoma X, la diferenciación celular,
y el imprinting (Kokalj-Vokac 1998). Otros cambios asociados son la activación de
las histonas y modificaciones en otras proteínas nucleares. Si estos cambios no se
revierten, durante el crecimiento ocurrirían modificaciones genéticas de los
núcleos adultos, tales como la mutagénesis somática, los errores mitóticos, las
deleciones y trisomías (Edwards 1998).
Con el propósito de revertir los cambios en las células diferenciadas y así
incrementar las tasas de éxito en la fusión y en el desarrollo de embriones
reconstituidos por medio de la transferencia nuclear, es importante la
sincronización de los ciclos celulares de las células donadoras de núcleos y de los
ovocitos receptores (Meng y col 1997; Solter 1996; Serrano y col 1997). Merchant
en 1996, le llama a este proceso sincronización nucleocitoplásmica.
Como es ampliamente conocido, durante la vida fetal y hasta la pubertad, el
ovocito de los mamíferos se encuentra detenido en la etapa de diploteno de la
profase de la meiosis I y sus cromosomas se condensan poco antes de que ocurra
la ovulación por acción de las gonadotropinas. Este estímulo promueve que el
ovocito reasuma su programa de división formándose el ovocito secundario con su
primer cuerpo polar, eliminando así la mitad de su material genético. En los
mamíferos adultos, el crecimiento del ovocito es continuo y termina en la
ovulación, cuando es depositado en el oviducto en donde madura e inicia su
segunda división meiótica (meiosis II), en la cual se vuelve a detener, solo que
esta vez hace en la metafase II. El ovocito arrestado en metafase II continuará su
división únicamente si es activado por el espermatozoide durante la fertilización,
65
en cuyo caso culminará su segunda división meiótica y formará el segundo cuerpo
polar (Merchant 1997; Loi y col 1998; Wassarman 1999).
Durante la maduración y la activación, el citoplasma del ovocito modifica sus
propiedades en la medida en que la célula es liberada del arresto en la metafase II
y es activada con la fertilización mediante una serie de descargas de calcio que
promueven la reacción cortical. Una vez ocurrida la fertilización, la transcripción
del ARN materno comienza a controlar el desarrollo en las primeras divisiones
mitóticas hasta la activación del genoma embrionario. Cuando se efectúa una
transferencia nuclear, la transcripción del genoma materno del ovocito dirige al
núcleo donado mientras que éste es capaz de asumir el control de las fases
embrionarias tempranas por sí mismo (Edwards 1998).
AI igual que en las células que se dividen, el ciclo celular del ovocito se encuentra
controlado mediante dos factores proteínicos: el factor promotor de la mitosis de la
maduración (MPF) formado por una ciclina y la cinasa dependiente de ciclina, y el
factor citostático (CSF) que es esencialmente el mismo MPF pero asociado a una
proteína que inhibe la acción de la cinasa. Cuando la proteína inhibidora de la
ciclina se degrada, la célula es capaz de sintetizar ADN, si el inhibidor no se
degrada, la célula primeramente es incapaz de entrar a la fase S del ciclo y, en
consecuencia, puede condensar de manera prematura su material genético.
Cuando las concentraciones del MPF se elevan, se inducen algunas alteraciones,
tales como la desintegración o rompimiento de la envoltura nuclear (DEN), la
condensación prematura de los cromosomas (CPC) y la reorganización del
citoesqueleto (Campbell y col 1996; Meng y col 1997).
Para que los eventos ocurran apropiadamente después de la transferencia
nuclear, los niveles de MPF deben descender o ser bajos. De otro modo la
incidencia de daño cromosómico y aneuploidías puede ser alta (Meng y col 1997;
Yong 1998). Si la transferencia nuclear se hace cuando el ovocito tiene bajos
niveles de MPF (siete a diez horas después de su activación), no sólo se
presentarán menos problemas de aneuploidías, sino que además se mantendrá
intacta la envoltura nuclear y los cromosomas no se condensarán
prematuramente, por lo que continuarán su ciclo de replicación-condensación de
manera normal, favoreciendo la sincronización nucleocitoplásmica y con ello el
desarrollo del cigoto así reconstituido (Merchant 1997).
Si se fusionan células en G con células en G, el material genético de estas últimas
sufre una condensación prematura como si estuviera lista a iniciar los movimientos
clásicos de la división celular (mitosis). Si la fusión es entre células en etapa S y
G, la síntesis del material genético se completa y el contenido de cromosomas en
el producto es aberrante, pues no sólo hay más sino que incluso las células hijas
sufren la falta de uno o varios de ellos, mientras que la otra presenta más de un
par de copias de un cromosoma (trisomías) (Serrano y col 1997). Los núcleos
66
donadores que se encuentren en la fase del ciclo G resultan en un mejor
desarrollo que los que están en fases S o G, ya que es más sencillo reprogramar
un genoma que está abierto para sufrir una replicación, además de que los
factores citoplásmicos tienen mayor acceso al genoma cuando las células
donadoras están en dichas fases (Wilmut y col 1997). Los núcleos se inducen a
entrar en un estado de quiescencia (G) cultivando las células donadoras o en
medios con cantidades reducidas de suero. De esta manera se coordinan los
ciclos celulares del carioplasto y citoplasto.
Ahora bien, para la fusión de carioplastos y citoplastos se han utilizado estímulos
eléctricos, virales y químicos. La fusión eléctrica y la fusión viral se han utilizado
en roedores, lepóridos y ovinos. La fusión eléctrica se ha usado además en
bovinos y en monos rhesus (Meng y col 1997; Prather 1990). La fusión inducida
por el virus Sendai tiene el inconveniente de que los núcleos transferidos no
sobreviven o los embriones reconstituidos no logran segmentarse. Las tasas de
éxito en la fusión por virus son de 30% en ovinos, siendo de tan solo 8% en
bovinos (Prather 1990; Bromhall 1975), por que este tipo de estímulo ya no se
utiliza. Una vez efectuada la fusión, los factores presentes en el citoplasma del
ovocito enucleado y activado serán los que reprogramen al núcleo, confiriéndole la
habilidad para regular el desarrollo embrionario hasta que llegue a término
(Edwarsd 1998; McLaren 1984). Este desarrollo embrionario puede llevarse a
cabo in vitro, o in vivo en oviductos de ovino (Wlladsen 1989; Prather 1990).
Todavía existe gran variabilidad de resultados con estas técnicas, con tasas de
éxito en la electrofusión de blastómeros obtenidos a partir de embriones de ocho
células del 90% en ovinos, 74% en bovinos, 84% en lepóridos y 87% en porcinos
(Prather 1990), y tasas de gestación de 0% a 54% (1) o hasta de 78% en bovinos.
En esta última especie, las tasas de segmentación de los embriones reconstituidos
varían según el sexo de los mismos: 73% para embriones hembras, 63% para
embriones machos (Le Bourhis y col 1998).
Existe un informe interesante en bovinos que describe la transferencia nuclear
utilizando ovocitos de vacas Holstein (Bos taurus) con núcleos de células aisladas
de embriones Brangus (5/8 Angus, Bos taurus y 3/8 Brahman, Bos indicus).En otra
etapa del estudio, utilizaron blastómeros de embriones de ocho a dieciséis células
de ovino que se fusionaron con ovocitos enucleados de caprino, desarrollándose
hasta el estado de ocho células al ser cultivados in vivo en oviducto de ovino. Lo
anterior demuestra que es factible obtener un clon a partir de dos células
provenientes de diferentes especies animales y cultivarlo in vivo en el aparato
reproductor de una especie no homóloga (Willadsen 1989).
- Ventajas y desventajas de las técnicas de clonación. La clonación a partir de
células de animales adultos tiene algunas ventajas y desventajas dependiendo de
67
la técnica que se trate (Cuadros 4 y 5), aunque en general todas tendrían la
ventaja de que al conocerse las características del donador permitirían seleccionar
a los individuos con alto valor biológico o productivo si las características
seleccionadas dependen solo de factores genéticos, lo que no es tan probable por
el efecto de las condiciones ambientales, de manera que se desconoce hasta qué
grado es un clon realmente idéntico a su donador (Lisker y Tapia 1997).
Tabla 8. Principales ventajas de la partición o división de Embriones
 Solo se obtienen de uno a cuatro embriones monocigóticos, y solo la mitad
de ellos llegan al término en su desarrollo (21,73).
 Los demi-embriones obtenidos con esta técnica no resisten la
criopreservación.
 Reducción de las tasas de gestación posteriores a la transferencia en
hembras receptoras (21).
 Dificultad de separar con exactitud dos mitades que sean exactamente
iguales entre sí, por lo que los individuos monocigóticos no son 100%
idénticos (30).
Una de las consideraciones que deben hacerse cuando se planea la clonación por
transferencia de núcleos tornados de células de adultos, es que éstos reflejan la
edad biológica del donador. Esto último parece ser trivial, sin embargo tiene
importancia si se analiza lo ocurrido con las regiones terminales de los
cromosomas. En estas regiones se encuentra ADN de secuencia altamente
repetida y en forma general, por tripletes o tétradas de nucleótidos repetidos,
dichas secuencias se conocen como microsatélites. Experimentalmente se ha
determinado que el número de repeticiones que debe tener es importante para la
función celular. Durante el envejecimiento, cada vez que la célula se divide el
número de estas repeticiones se hacen menores y permiten que se desarrollen
enfermedades propias de la edad adulta aún en organismos "jóvenes" (Marshall
2000).
Sin embargo, Lanza et al. (2000), observaron que en bovinos clonados por
transferencia nuclear a partir de células somáticas envejecidas in vitro, ocurría un
aumento en la duración de la vida replicativa de la célula así como en la longitud
de sus teloneros. Así mismo, las células somáticas que han estado expuestas a
carcinógenos químicos y radiaciones durante períodos prolongados, en este
sentido, es posible que hayan acumulado mutaciones que pueden manifestarse
durante la gestación, como malformaciones congénitas o predisposiciones a
diversas enfermedades en los recién nacidos (Lisker y tapia 1997).
68
Tabla 9. Comparación entre la clonación por separación de Blastómeros y la
transferencia nuclear
SEPARACION DE BLASTOMEROS
TRANSFERENCIA NUCLEAR
VENTAJAS
 Obtención de individuos 100%
 Obtención de copias genómicas
idénticos genéticamente entre
de individuos superiores.
sí.
 Facilidad de obtención de
blastómeros aislados.
 No
requiere
métodos
especializados para obtener los
carioplastos, citoplastos o la
fusión entre ellos.
 En
la
separación
y
la
reagregación de blastómeros,
los blastocitos obtenidos de
quíntuples y séptuples pueden
utilizarse
para
establecer
células totipotenciales.
DESVENTAJAS
 Necesita determinarse el medio
 Los clones no son 100%
óptimo para el desarrollo
idénticos genéticamente debido
embrionario in vitro para cada
a la participación del ADN
especie utilizada.
mitocondrial Puede requerir de la utilización
 Los clones muestran diversos
de zonas pelúcidas o de
grados de alteración.
sustitutos de ellas.
 Requiere de metodología
y
equipos
sofisticados
para
 Bajas tasas de éxito en crías
nacidas que se reducen al
obtención
de
cariplastos,
utilizar embriones en fases
citoplastos y su fusión.
avanzadas de la segmentación.
 Requiere de una adecuada
 Tasas de aborto elevadas
sincronización nucleoplásmica.
después de transferir embriones
 Bajas tasa de éxito en crías
clonados
en
hembras
nacidas.
receptoras.
Con la clonación queda todavía un buen número de problemas a resolver, como
son la eficiencia de la técnica de transferencia nuclear, que actualmente es muy
baja y demasiado costosa para aplicarla comercialmente de manera rutinaria, ya
69
que aún en el estudio mas conocido de esta técnica se obtuvo una eficiencia de
0.36% (Wilmut y col 1997). Considerando que el patrón de desarrollo de los
cigotos es muy diverso, la adaptación de las técnicas a otras especies precisa aún
de una extensa investigación para cada una de ellas (Merchant 1997).
- Aplicaciones de la clonación de embriones. En el ámbito científico, la clonación
ha abierto un nuevo campo de experimentación para abordar problemas
fundamentales sobre los mecanismos que controlan la diferenciación celular en el
inicio del desarrollo (Merchant 1997). También es útil en los estudios de fisiología,
embriología, genética y crianza animal (Herman y col 1998; Williams y col 1984).
Los individuos genéticamente idénticos pueden ser de sumo valor para los
experimentos controlados en los que se evalúen los efectos ambientales, tales
como nutrición, instalaciones y medicamentos. La transferencia de genomas
idénticos en diferentes tipos de citoplastos permitiría evaluar las interacciones
entre citoplasma y núcleo (Williams y col 1983; Prather 1990).
Los clones transgénicos y los derivados de células primordiales pueden ser
incluidos en la investigación de terapias celulares o genéticas, principalmente si se
trabaja con primates no humanos, ya que esto último salvaría la distancia
existente entre las especies de roedores comúnmente utilizadas en los
laboratorios para desarrollo y prueba de fármacos de uso en humanos. En enero
de 2001, el grupo de Gerald Schatten dio a conocer el nacimiento de un simio que
tiene insertado el gene de la proteína verde fluorescente (GFP), de tal suerte que
sus células pueden ser utilizadas con relativa facilidad para estudios encaminados
a determinar los efectos nocivos de fármacos que puedan ser semejantes a los
obtenidos en humanos, por lo que los estudios de fases terminales pueden ser
mas rápidos y con un modelo mas cercano evolutivamente, en lugar del riesgo que
implica hacer la extrapolación del modelo de roedor o conejo, comúnmente usado
en la investigación farmacológica.
Asimismo, los clones con fechas distintas de nacimiento (considerando que de un
mismo grupo de clones unos sean transferidos directamente y otros sean
congelados para transferirlos con posterioridad) tienen aplicación en el análisis
fenotípico de los individuos clonados antes de que sean propagados y en la
transferencia seriada de células totipotentes para dirigir la edad celular mas allá de
las expectativas de vida (Mclaren 1984). Además, los clones implantados en una
misma hembra subrogada podrían probar los efectos epigenéticos que incluyan el
ambiente materno (Chan y col 2000).
- Clonación de embriones por generación múltiple. La última meta de los
proyectos de clonación de embriones es producir gran número o un número
ilimitado de individuos idénticos a partir de un individuo original. Lo anterior ha sido
llevado a cabo a través de la clonación por generación múltiple también conocido
70
como reclonación, que utiliza embriones clonados por transferencia nuclear como
donadores de núcleos para producir la próxima generación de embriones
idénticos. De manera que si el primer ciclo de transferencia nuclear produce 10
embriones clonados viables, el siguiente ciclo posiblemente resultaría en 100
embriones clonados en la segunda generación (Singla y col 1997; Stice y col
1993).
A este respecto, desde la década de los 80, se han reportado resultados exitosos
en los procedimientos de reclonación, pudiéndose obtener seis generaciones de
embriones (Willadsen 1989) y terneros de tercera generación a partir de
embriones en diferentes estados de segmentación, obtenidos por transferencia
nuclear. Asimismo, la multiplicación en serie de embriones mediante la clonación
ha incrementado el número de progenie producida de un embrión donador
determinado. Mediante ciclos repetidos de transferencia nuclear, se han obtenido
gestaciones de clones de tercera generación y se han producido embriones en
etapa de blastocisto de clones de quinta generación. Los límites de la clonación en
serie aún no han sido definidos. Las tasas de gestación de los embriones en
estado de mórula o blastocisto producidos por clonación en serie no difieren de las
tasas de gestación de los clones derivados de embriones frescos (Singla y col
1997; Stice y col 1993).
Se ha visto que los blastómeros provenientes de embriones clonados por
transferencia nuclear en etapas mas tempranas de la segmentación, tienen
mayores probabilidades de fusionarse a los citoplastos que los provenientes de
embriones clonados en etapas mas tardías de la segmentación, y que esto va
relacionado con el tamaño del blastómero que se va a transferir. Las tasas de
éxito en la reclonación difieren con relación en el tiempo de cultivo y el número
generacional del clon; por ejemplo, cuatro días de cultivo in vivo en oviductos de
ovino da lugar a tasas de fusión de 68% en embriones reconstituidos de bovino,
respecto del 57% obtenidos tras cinco días de cultivo in vivo. Sin embargo, los
clones de cinco días de cultivo pueden producir 4.5 generaciones de clones,
mientras que los de cuatro días solo 3.6. La tasa de éxito en la fusión se reduce de
una generación a otra, ya que de una línea clonada se han obtenido 11 clones en
la primera generación, 16 en la segunda, 20 en la tercera y solo 7 clones en la
cuarta generación (Stice y col 1993).
Yong y Yuqiang (1998), lograron obtener crías de caprino de la primera a la sexta
generaciones, de las cuales tres pares fueron gemelos monocigóticos, tres series
fueron de triples monocigóticos, dos series de cuádruples monocigóticos, tres
series de quíntuples y una serie de heptaples monocigóticos.
Los abortos y las tasas de gestación pueden diferir entre reclines y la primera
generación de embriones clonados por transferencia nuclear. Willadsen (1989),
informa que la segunda o posteriores generaciones de bovinos y ovinos, tienen
71
tasas de gestación mas bajas que la primera generación de embriones clonados, y
que las tasas de aborto se incrementan a partir de la segunda generación.
Con el estudio profundo y el adecuado control de las deficiencias actuales de la
clonación, en un futuro la clonación en serie permitirá a su vez, la clonación de
animales transgénicos que contengan genes selectos. De ahí se deduce que la
clonación ofrece una enorme oportunidad para la ganancia genética, el incremento
en la eficiencia de la producción de alimentos de origen animal y los programas de
investigación (Singla y col 1997).
- Aspectos comerciales de la clonación de embriones. Cuando la clonación se
aplica a los embriones de alto valor, la habilidad para producir varios nacimientos
por cada embrión ofrece suficiente ventaja económica para recuperar los costos
involucrados, sobre todo si se utilizan procedimientos de sexado de embriones, de
manera que los nacimientos de individuos clonados sean de sexo predeterminado.
Esto pondría un limite en el número de embriones de sexo masculino transferidos,
lo cual reduciría el número de transferencias requeridas o permitiría obtener una
población de pie de cría efectiva con el mismo número total de transferencias
(Nicholas 1983). Sin embargo, la eficiencia con la que se cuenta actualmente aún
no permite una producción de embriones en masa a un costo accesible para la
producción de animales comerciales (Singla y col 1997). Es necesario que se
incrementen significativamente las tasas de éxito para que el mercado de los
embriones clonados pueda hacerse realidad. Actualmente en el mundo existe un
laboratorio que ofrece la clonación de embriones por transferencia nuclear, a la
cual los ganaderos pueden enviar sus embriones para recibir clones por 100
dólares cada uno (Romo 1994).
Otra limitante es que los pesos de los individuos clonados al nacimiento son
anormales. Estos procedimientos dan lugar a una mayor incidencia de distocias,
aunque posterior al nacimiento las tasas de crecimiento no se afectan por este
procedimiento. No se conoce explicación biológica sobre este aspecto (Singla y
col 1997). Es necesario incrementar la eficiencia de este procedimiento para
eliminar el problema de gigantismo fetal que se ha encontrado en algunos
becerros producidos por transferencia nuclear (Roma 1994). En ovinos no se ha
observado alteración en los pesos al nacimiento de los individuos clonados, pero
sí un alargamiento en la duración de la gestación que es influenciado por el
genotipo fetal (Wilmut y col 1997).
Es clara la necesidad de investigación básica, utilizando especies de las que se
tenga un conocimiento adecuado para los fines de la investigación. Este tipo de
estrategias, por su accesibilidad y bajo costo, podrían ser llevadas a cabo en
animales de laboratorio, explorando mas la técnica en los ámbitos celular y
molecular, de manera que la solución a los problemas de las tasas de gestación y
pesos al nacimiento podría obtenerse de los experimentos a partir de estas
especies (Singla y col 1997).
72
- Aplicación de la clonación en la conservación de especies. La reciente
demostración de la capacidad para clonar mamíferos adultos, ha propiciado una
variedad de nuevas ideas de investigación para los interesados en las especies en
peligro de extinción.
La clonación tiene el potencial de minimizar la pérdida de recursos genéticos, al
igual que rescatar la pérdida de material genético; por lo que permitiría expandir el
número de tasas incluidos en los programas de supervivencia de especies, porque
haría posible la criopreservación de embriones clonados; aunque habría que
pensar con cuidado, en las especies animales que podrían ser utilizadas como las
receptoras de los embriones de especies en peligro de extinción que vayan a ser
clonados, y considerando: que los tipos de placentación son diferentes para cada
especie; que la transferencia embrionaria interespecífica sólo funciona en las
especies en las que es posible crear híbridos; que hay especies silvestres que no
se reproducen en cautiverio, y también que el comportamiento materno de las
hembras receptoras hacia las crías nacidas a partir de embriones clonados de
especies no homólogas a ellas, podría afectar la supervivencia de los clones,
etcétera (Ryder 1997).
El grupo Lanza et al. (2000) efectuaron la primera clonación de una especie en
peligro de extinción: un gaur asiático a quien llamaron «Noé», obtenido por la
transferencia de núcleos utilizando células de piel (fibroblastos) de gaur macho y
ovocito enucleado de vaca doméstica, y cuyo embrión reconstituido fue transferido
en una vaca doméstica. Actualmente esperan el nacimiento del gaur clonado y
señalan que están en planes de ser clonadas especies tales como el antílope
bongo, el tigre de Sumatra y el panda gigante. Asimismo, se cuenta con células
preservadas de una especie ya extinta, la cabra bucardo de montaña, de España,
en la que se esta pensando aplicar la clonación.
 Consideraciones éticas de la clonación. Hasta ahora se ha hablado sobre
algunas consideraciones que deben ser cuidadosamente estudiadas con respecto
ala clonación de animales, tanto para el abasto como para la conservación de
especies en peligro de extinción; queda solamente mencionar las probables
consecuencias que esta técnica tendría si fuera aplicada a los seres humanos.
En 1984 McLaren consideraba que la transferencia nuclear podría ser aplicada en
los seres humanos; señalaba que para las parejas que tuvieran el riesgo de
transmitir defectos genéticos a su progenie, si se recuperaran varios ovocitos de
una mujer, se enuclearan y se les transfiriera un núcleo de la MCI de alguno de
sus propios embriones; unos cuantos podrían ser congelados mientras que los
remanentes genéticamente idénticos podrían ser evaluados para defectos
genéticos por análisis cromosómico, análisis de ADN 0 por métodos bioquímicos.
73
De esta forma se aseguraría a la pareja que cualquier embrión transferido al útero
materno del stock que fuera congelado, estaría libre de defectos genéticos.
A este respecto existen opiniones tanto en favor como en contra. Por ejemplo, en
1997 el Consejo Bioético de Estados Unidos de América (Nacional Bioethics
Advisory Comisión 1997), señaló la preocupación existente acerca del posible
daño físico provocado por la manipulación del ovocito, núcleo y embriones, así
como del daño psicológico en cuanto al sentido de la individualidad y la autonomía
personal de los individuos clonados. Mencionan la preocupación ética sobre la
degradación de la calidad de la familia y el parentesco en el caso de que los
padres quisieran tener un control excesivo sobre las características de sus hijos.
Lisker y Tapia (1997) opinan que la clonación de embriones humanos tendría
utilidad en la investigación siempre y cuando los embriones no fueran implantados
en el útero de mujeres, y que tuviera la finalidad de incrementar el conocimiento
en biología celular y los mecanismos de expresión genética, ya que no deben
ponerse obstáculos al avance en la investigación científica. Aunque hacen
hincapié en la importancia de discutir y resolver todos los problemas éticos y
legales que plantea la clonación de nuestra especie.
A finales del 2000 las autoridades inglesas aceptaron la aplicación de la clonación
por transferencia nuclear en humanos, pero con una temporalidad finita de solo 2
semanas y con una idea de aplicación exclusiva para la obtención de tejidos que
puedan ser utilizados para transplante. Una alternativa en este sentido es la
estrategia definida por los trabajos de Onishi et al. (2000), y de Polajaeva et al.
(2000) en los cuales se obtuvieron cerdos clonados por transferencia nuclear y
cuya similitud en cuanto a tamaño de órganos y capacidades de aspecto
inmunológico son muy similares a la de los humanos.
Hottois (1998) considera que se le está dando mayor prioridad alas reacciones
simbólicas de la clonación que al análisis de sus técnicas. Opina que no hay razón
para enjuiciar la clonación, ya que desde el punto de vista de una pareja con
problemas de esterilidad total, 0 que hayan perdido a un hijo, 0 de una pareja en la
que ambos cargan genes letales, la clonación no implicaría la reproducción en
masa de clones sino de tan solo uno 0 quizás dos, y que ello no afectaría la
autonomía de los clones. Además, recuerda que la identidad biológica entre los
clones, y entre ellos y su donador no sería total, ya que existen diferencias ligadas
al ADN mitocondrial (que permanece en los ovocitos receptores) y alas la
selección natural, son reintegrados al juego con lo que eventualmente pueden
obtenerse individuos en cuyos embarazos se manifiesten nuevamente estos
genes letales.
Por otro lado, Bryan (1998) trata de aproximar el que sería el sentir de los
humanos como individuos clonados con el de los gemelos monocigóticos que
nacen de manera natural. Explica que en virtud de que aún cuando estos últimos
74
son idénticos genéticamente, siempre hay uno que nace primero que el otro y que,
por 10 tanto los medios uterino y extrauterino influyen para producir no solo
apariencias sino también personalidades diferentes en cada uno. En el aspecto
psicológico, señala como ventaja que los gemelos monocigóticos tienen facilidad
para relacionarse y comprenderse mutuamente dada su identidad biológica; pero
como desventajas, que tienen mayores riesgos de nacer prematuramente 0 de
tener altas tasas de muerte perinatal.
Por último, Edwards y Beard (1998) señalan que la bisección 0 separación de
embriones y la transferencia nuclear actualmente aplicadas en animales, podrían
considerarse para su aplicación en humanos en la próxima década
75
3. METODOLOGIA
 Revisión de literatura.
 Revisión de antecedentes investigativos o de trabajos realizados sobre el tema
en nuestro país.
 Revisión de antecedentes investigativos internacionales, así como de
organismos de referencia.
 Consulta a través de revistas de investigación o publicaciones científicas del
tema.
 Consulta en bases de datos y bibliotecas internacionales acerca de temas o
información relacionada.
 Envió de e-mails a investigadores internacionales que han trabajado sobre el
tema, para así realizar una recopilación de información importante.
 Elaboración de un proyecto de investigación tipo monografía en donde se
plasme toda la información obtenida y se realice una descripción clara y
precisa de la fecundación, producción y del desarrollo embrionario como el de
la transferencia de embriones en reproducción y producción porcina que esta
siendo implementada a nivel experimental en el continente Europeo.
76
4. IMPACTO ESPERADO
Esta monografía aportara elementos básicos e indispensables como base para el
desarrollo e implementación de nuevos trabajos investigativos, así como, ser una
fuente de información para los sistemas de producción porcina en donde se
pretende dar a conocer la existencia de nuevas biotecnologías reproductivas y
productivas viables que pueden llegar a ser una solución a los problemas de tipo
genético y reproductivos que están presentando hoy en día nuestros sistemas
Porcícolas en el país.
77
7. CONCLUSIONES
La combinación de las tecnologías anteriormente nombradas (producción in Vitro
de embriones, transgénesis y clonación) hacen posible actualmente realizar
modificaciones genéticas muy precisas en el genoma del animal y han contribuido
a incrementar la eficiencia del proceso de generación de animales transgénicos
como clonados de granja. Aunque en una primera etapa las modificaciones
genéticas afectarán solamente a genes simples, a medida que la tecnología
avance y se haga más eficiente es posible vislumbrar un mayor rango de
modificaciones que irán desde cambios en unos pocos pares de bases hasta la
reingeniería de grandes segmentos cromosómicos. Muchas aplicaciones
requerirán de modificaciones genéticas múltiples, lo que puede significar un
problema para los animales de granja dado su largo período generacional. Por lo
tanto, el real desafío será desarrollar células que mantengan su capacidad de
totipotencialidad para transferencia nuclear después de múltiples eventos de
recombinación homóloga.
Esto permitirá realizar más de una modificación genética en el animal y acortará el
tiempo necesario para establecer estos cambios al estado de homocigosis.
Aunque por el momento muchas de las aplicaciones de esta tecnología están
orientadas principalmente a la industria farmacéutica, es posible vislumbrar que
rasgos tan complejos de manipular como una mayor eficiencia en la conversión de
alimentos y la resistencia a enfermedades, entre otras, serán más fácilmente
abordadas gracias a esta tecnología.
Por lo tanto, el interés que despierta la tecnología de la reproducción, tanto en el
área de la medicina como en la industria porcina, aumenta el afán por el desarrollo
de nuevas tecnologías así como la puesta en marcha de las existentes. Sin
embargo, aunque la clonacion, transgenesis y la producción in Vitro de embriones
a partir de ovocitos madurados, fecundados y cultivados in Vitro es hoy una
realidad, el rendimiento de estas técnicas es todavía inapropiado para obtener los
beneficios anteriormente mencionados pero al iniciar con los primeros peldaños a
nivel investigativo de estos temas, podemos dar comienzo a una secuencia de
investigaciones experimentales a nivel nacional que pueden aportar grandes
hallazgos y resultados para la medicina veterinaria, la medicina humana, además
de contar con las garantías de obtener siempre el propósito que busca el
productor, un sistema optimo, que le brinde los mejores resultados en cuanto
producción y productividad, sin afectar la rentabilidad, sostenibilidad y
sustentabilidad del sistema.
Es claro y evidente que el uso de biotecnologías y sobre todo estos dos tipos de
técnicas en la producción porcina son prácticamente unos términos nuevos, en
78
comparación con la implementación de técnicas como la IA, la cual se ha usado
desde hace muchos años, debemos tener en cuenta que la implementación de
nuevas tecnologías, empiezan y parten de una idea, y es así como surgió la de IA,
ahora el gran salto que esta dando en estos tiempos la ingeniería genética nos da
pinceladas del futuro; de un futuro que podemos tomar en las manos en busca de
nuevas repuestas y soluciones a las nuevas problemáticas mundiales que nos
afectan a todos; es claro que la implementación de estas biotecnologías
representan altos costos de producción, pero a medida de las investigaciones y de
los resultados que estas aporten van a dar respuesta y luz a su uso masivo y
mundial por ser alternativas productivas y mundiales y a su vez a optimizar el
rendimiento y rentabilidad de los sistemas productivos porcinos, es ahora donde
debemos aportar nuestro grano de arena a la investigación, para que en futuro
podamos cosechar los frutos de nuestros esfuerzos.
79
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