PRÁCTICA I − Microscopio óptico: descripción y manejo Objetivo

PRÁCTICA I − Microscopio óptico: descripción y manejo
Objetivo
Comprender el funcionamento del microscopio óptico y visualizar preparaciones de agua de charca.
Introducción
La célula es la unidad morfológica y funcional del ser vivo. Su observación es muy limitada, debido al
pequeño tamaño (10 m) y al hecho de ser traslúcida.
Para la observación se han utilizado muchos instrumentos ópticos que aumentan el poder resolutivo.
Poder resoultivo: es la capacidad que tiene un instrumento para dar imágenes distintas de dos puntos que se
encuentran muy cerca uno del otro.
Limite de resolución: es la distancia mínima que tiene que existir entre dos puntos para ser identificados
como independentes.
Microscopio Óptico Simple (MOS): o lupa, sólo tiene un sistema óptico que aumenta unas 10 veces.
El Microscopio Óptico Compuesto (MOC): está constituido por:
• Sistema óptico:
• Sistema ocular: 2 oculares con la misma ampliación que pueden estar separados en algunos microscopios
para mejor adaptación.
• Sistema objetivo (se llama asi pues es el que está más próximo al objeto). Está normalmente constituido por
cuatro objetivos.
• Sistema de iluminación:
• Fuente de luz en el pie
• Diafragma para regular la intensidad
• Condensador
• Sistema Mecánico (soporte de las piezas):
• Pie: base de sustentación
• Brazo: en forma de L. Contiene el sistema de tornillo:
• Tornillo de enfoque macrométrico, para un primer enfoque
• Tornillo de enfoque micrométrico, para ajustes y exploración de la profundidad de campo.
• Platina: Pinza y tornillos de desplazamiento (horizontal y vertical)
• Revolver: es donde se encuentra ubicado uno de los sistemas ópticos: el objetivo. Por ser giratorio se puede
cambiar fácilmente el objetivo
• Tubo ocular: contiene la ocular que va a aumentar el objeto unas 10 veces.
Para utilizarse se deben seguir las siguientes normas:
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• Se mira la preparación ampliada por los dos oculares y con los ojos abiertos
• Se pone una de las manos (suele ser la izquierda) en los tornillos de enfoque
• Se pone la otra mano (la derecha) en el tornillo de desplazamiento
En cualquier preparación están presentes siempre dos elementos:
• Portaobjetos por encima del cual se pone el objeto a observar
• Cubreobjetos con el cual se cubre el objeto
Procedimiento:
1− Con una pipeta Pasteur se ponde una gota de agua sobre un pieza larga de vidrio, que se denomina
portaobjetos (forma rectangular)
2− Se cubre la gota, con un material también de vidrio, pero de espesor muy pequeño y demás dimensiones
también más pequeñas respecto al portaobjetos. Este es el cubreobjetos (forma cuadrangular).
3− Se observa la preparación con el objectivo de A4 y después se aumenta (A10 y A40)
4− Se hace el registro oportuno de lo que se observe
PRÁCTICA II − Obtención y observación de extensiones citológicas
Objetivo
Observar el tejido sanguíneo por medio de una extensión citológica.
Introducción
Para visualizar células o extensiones citológicas hay que obtener, en primer lugar, el material donde están
contenidas dichas células. Así, la procedencia de una muestra pueden ser los exudados o punciones por
aspiración. Los exudados son de dos tipo: secrecciones (vaginal, esputo, mama) o un raspado de una lesión o
de una superficie. La punción aspiración suele ser obtenida a partir de cavidades o de tumores sólidos.
Pero estos elementos no pueden ser observados directamente, necesitan de una preparación a priori, o sea,
tienen que ser procesadas.
Procesamiento General
• Extensión: En el portaobjetos se extiende el material a observar (después de homogenizar si es
preciso).
• Fijación: Se hace dejando la preparación secar al aire, o bien utilizando laca.
• Tinción: Se hace a través del método de Papa Nicolau (como por ejemplo con las células de un
raspado de mucosa vaginal, en que las células vivas se tiñen en azul y las muertas en rosa) o a través
del método Panóptico (método que se divide en cinco pasos. Primero se sujeta la preparación a una
diluición metilica, después la ponemos en una solución de xanteno, en seguida en una solución de
tiazina y por último la pasamos por agua. Se deja la preparación en cada solución durandte cinco
segundos con movimientos ligeros. Al final se deja secar al aire).
Lo que se observa es lo siguiente:
Célula
Color del núcleo
Color del citoplasma
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Neutrófilos
Eosinófilos
Basófilos
Linfócitos
Monócitos
Azul oscuro
Azul
Azul
Violeta
Laxo violeta
Rosado con granulaciones rojo violeta
Con gránulos rojo o rojo anaranjado
Con gránulos púrpura casi negros
Azul celeste
Azul celeste
Además de las células mencionadas en la tabla anterior se van a identificar otras estruturas anucleadas que son
los eritrocitos o glóbulos rojos, que tienen un color rosa pálido o intenso, y también plaquetas que tienen color
violeta pálido o púrpura.
PRÁCTICA III − Obtención y observación de preparaciones histológicas
Objetivo
Observar como se puede ver de distintas maneras las celulas en un tejido. Visualizar un corte histológico.
Introducción
Procesamiento de preparaciones histológicas:
1º Fijación: para presenvar el tejido (guardar para no se estrupiar) y suele ser hecha en formol .
2º Inclusión: Sustancia que es añadida (por ejemplo parafina) que se usa para que se forme un bloque que es
de mas facil corte.
• Antes de la inclusión se debe ir deshidratando (pues la parafina no es soluble en agua) el tejido
poniendolo en soluciones de alcool cada vez más concentradas hasta que se introduce el tejido en
acohol puro.
• Se deja el tejido en parafina una noche.
3º Corte: con un microtomo para que el corte sea muy fino y translucido. El corte se deja cair por encima del
agua y se extiende con una pinza. Para quitar del agua el objeto se introduce el portaobjetos y se por debajo
del objeto hasta que queden juntos.
4º Fijación
5º Colorantes: que son acuosos. Pero como el tejido tiene parafina se introduce el tejido en soluciones
crescientes de agua hasta que llegue a la agua pura y quede rehidratado. Se puede hacer despues la coloración.
Hay muchos tipos de coloraciones, una de las más usadas es la coloración con hematoxilina−eosina (HE) la
cual se discribe en el procedimiento. Otros tipos de tinciones (con técnicas histoquímicas que sirven para ver
sustancias más más específicas) pueden ser la tinción ácido−base. La PAS es una técnica que se aplica
después de hacer una coloración hematoxilina−eosina, en este caso, que tiñee la mucina que es el producto de
la secreción de las glándulas intestinales.
Procedimiento
En este caso se ha hecho la coloración HE:
• Fijación
• Inclusión en parafina
• Confección del bloque
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• Corte
• Coloración/tinción: El citoplasma se tiñe de azul marino y el núcleo de rosa
• Hidratación: (no se hizo en la clase)
• Xilol (2 baños de 15 segundos cada uno)
• Alcoholes decrecientes (5 segundos en cada uno)
• Agua
• Teñir (a partir de este punto se tiene que escurrir en papel de filtro por cada paso)
♦ Hematoxilina (20 segundos con agitación suave) − colorante básico.
♦ Agua
♦ Carbonato de litio Li2CO3 (sumergir brevemente)
♦ Agua
♦ Eosina (5 segundos agitación) − colorante ácido
♦ Deshidratar:
◊ Alcoholes crecientes − etanol 1, 2 y 3 − (30 segundos de agitación)
◊ Xilol (agitar hasta que no llore el porta)
♦ Montar. Se pone pegamento y el cubreobjetos por arriba.
PRÁCTICA IV − Microscopía electrónica: identificación e interpretación
Objetivo
Distinguir y observar varias estructuras celulares en fotografias de ME.
Introducción
El descubrimiento del Microscopio Electrónico fue en 1933, y se atribuye a un investigador
ruso. Se basa en la teoría de que una partícula material presenta un movimento ondulatorio
similar a la luz.
♦ El microscopio electrónico de alto voltaje tiene un poder resolutivo muy elevado
♦ En el microscopio electrónico de transmisión los electrones atraviesan el objeto. Hay un
filamento incandescente que es la fuente de electrones.
♦ El microscopio electrónico de barrido o scanning no da imágenes tridimensionales. Los
electrones atraviesan el objeto y chocan con la superficie, por lo que la imagen aparece
tridimensional.
Las fotos/imágenes obtenidas en microscopía electrónica son siempre en blaco y negro, y
producen aumentos significativos de la estruturas que se pretenden observar. En microscopía
electónica no se define una ampliación, sino una escala. Por ejemplo, cada centimetro, puede
corresponder a 0.1 .
Ambos cuadernos de imágenes corresponden a fotografias obtenidas por microscopios
electrónicos de transmisión.
PRÁCTICA VI − Embriología
Introducción
Vimos un vídeo acerca de la fecundación y el desarrollo embrionario fetal en el ser humano.
Observaciones
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En todos los animales, antes de darse el coito, hay una serie de instintos naturales que
conducen a que éste tenga lugar. Además, existen estímulos provocados por unas sustancias
químicas denominadas feromonas.
Durante el coito, normalmente el varón eyacula en la vagina de la mujer, y varios millones de
espermatozoides a continuación intentarán atravesar cuello, útero y trompas. Sin embargo, 40
% de los espematozoides no sirven para fertilizar. Cuando uno de los espermatozoides que se
dispone alrededor de óvulo entra en éste, se une la información genética de la madre y del
padre formando una nueva célula (el cigoto), aquella que va a dar origen a un nuevo
individuo: se ha dado la fecundación.
El cigoto formado va a seguir a lo largo de la trompa de falopio y llega a el endometrio,
donde se implantará. Depues de la implantación, el cigoto sigue su desarrollo formando tres
capas u hojes embrionarias básicas que son las precursoras de todos los diferentes tejidos del
nuevo ser humano.
Empienzan pues a formarse las células nerviosas primarias del córtex cerebral y las células
madre que formarán otros tejidos completamente distintos como son los tejidos epiteliales y
las células precursoras de los vasos sanguíneos.
En la 5ª semana el embrión tiene ya 8 mm y el flota en una membrana. Se empiezan a
diferenciar la nariz y la boca. A la 6ª semana con 15 mm de longitud se observa la formación
de las manos. A la 7ª semana, con 2 cm de longitud se inicia la elongación de las piernas. A la
9ª semana el feto ya tiene 4 cm de longitud y 12 gramas de peso.
El aporte de comida lo realiza la placenta materna donde se hace el paso de nutrientes de la
sangre de la madre hasta la sangre fetal. Sin embargo, el aporte de alimento es siempre
prioritario para la madre. Si hay falta de nutrición es la madre quién va a ser nutrida en primer
lugar.
A las 12 semanas los huesos se encuentran formados. Al 3º mes, los primeros pelos aparecen,
y los ojos, que se empezaron a desarrollar a las seis semanas y que eran inicialmente dos
agujeros pequeños fuera del lugar que conocemos, terminan su formación también a los tres
meses. Los ojos se mantienen cerrados durante 3 meses.
El oído externo inicia su formación a la 5ª semana y el oído interno unos días más tarde (los
primeros sonidos que el embrión empieza por oir son los latidos del corazón, ruidos
gastrointestinales, etc). Se sabe que los estimulos externos influyen en el desarrollo del
cerebro (por ejemplo, se sabe que es capaz de oir música, bien como las voces de la madre y
del padre). Un dato curioso, es que al chupar el dedo, significa que el feto sueña con comida.
En la 8ª semana se visualiza el desarrollo de los órganos sexuales. En el caso de la niña se
encuentran ya formados dos millones de óvulos. Como se sabe, el par de cromosomas número
23 es el que determina si el nuevo ser va a ser una niña o un niño. Si el par de cromosomas es
XY entonces vamos a tener un niño, pero si se tiene XX, el resultado será una niña. En el niño
se forma una hormona en grandes cantidades, la testosterona. Si no se forma testosterona,
entonces la hormona que predomina es el estrógeno y será niña.
Durante el desarrollo en el interior de la madre el embrión esta envuelto en el liquido
amniótico que lo proteye de los choques mecánicos y que sirve también, ya que el bebé bebe
de este liquido, para preparar su aparato digestivo.
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Al final de 9 meses, el nuevo individuo siente la necesidad de salir, y entonces por
contraciones en la madre, el bebé acaba por nacer, y seguir su ciclo biológico normal.
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