Clasificación del género Brucella: situación presente(**)

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1982, 1 (1), 301-310.
Clasificación del género Brucella:
situación presente(**)
por
M . J . CORBEL y W . J . BRINLEY MORGAN(**)
El actual sistema de taxonomia relativo al género Brucella se basa en las recomendaciones formuladas por el Subcomité de Taxonomia de Brucella del Comité
Internacional de Nomenclatura Bacteriológica (1963) (1) y completadas, más
tarde, en más recientes informes (1967) (2) y (1971) (3). Se elaboró el sistema
para eliminar los problemas que pudiesen plantearse para identificar las tres
especies de origen : B. melitensis, B. abortus y B. suis, empleando para la tipificación los métodos convencionales, especialmente las necesidades de C 0 ,
la producción de H S , las afinidades tintóreas y las pruebas de aglutinación c o n
los antisueros monoespecíficos. La introducción de otros métodos, por un lado,
para evaluar la sensibilidad a la lisis por los fagos y, por otro lado, para medir
el metabolismo oxidativo c o n substratos seleccionados, resolvió t o d o s estos
problemas, permitiendo elaborar un sistema de identificación de la especie c o m patible con la evidencia epidemiológica.
2
2
Se suele emplear la lisis de los fagos y el metabolismo oxidativo c o m o m é t o dos básicos para identificación a nivel de la especie y los m é t o d o s convencionales para diferenciación de los biotipos.
También se hizo hincapié en los criterios de identificación a nivel del género.
Figuran esos criterios en las recomendaciones formuladas por el S u b c o m i t é
de Taxonomia del género Brucella en el seno del Comité Internacional de Sistemática Bacteriológica
el examen de las propiedades m o r f o l ó g i c a s , culturales, metabólicas y serológicas. Se puede efectuar la c o n f i r m a c i ó n — en el supuesto de g e r m e n atipico
— examinando, por un lado, la c o m p o s i c i ó n de las bases purina-pirimidina del
A . D . N . (5), así c o m o la secuencia de nucleótidos del A . D . N . (5, 6) y exami-
(*) Traducción del Documento original WHO/BRUC/81.370.
(**) Centro colaborador FAO/OMS de consulta e investigación sobre brucelosis, Laboratorio
Veterinario Central, Weybridge, Surrey, Inglaterra.
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n a n d o , por o t r o lado, los esquemas de migración electroforética producidos
por las proteínas solubles en la mezcla de a g u a , f e n o l , ácido acético (7) y el
espectro de adsorción de las franjas a y c del c i t r o c r o m o (8) y , por ú l t i m o , evidenciando antígenos intracelulares idénticos a los de las cepas de Brucella de
referencia (9, 10). La cromatografía en fases gaseosa y líquida de los ésteres
metílicos de los ácidos grasos t a m b i é n es un m é t o d o c o m p l e m e n t a r i o que se
puede utilizar, por tener los ácidos grasos estructurales de las cepas de Brucella un perfil característico de elución (11).
Se emplean la evaluación de la lisis de los f a g o s y el perfil m e t a b ó l i c o oxidativo para identificar las especies, pero t a m b i é n se los emplea — especialmente
la lisis de los fagos — para confirmar el género, por ser específicos de Brucella. Los m é t o d o s convencionales — especialmente el e x a m e n de necesidades de C 0 , las afinidades tintóreas, la p r o d u c c i ó n de H S , la actividad ureasa
y las pruebas de aglutinación con los antisueros monoespecíficos — tienen un
valor suplementario para identificar la especie, empleándoselos t a m b i é n para
diferenciar los biotipos de las especies m a y o r e s , B. abortus, B. melitensis y
B. suis.
2
El género Brucella
2
y sus especies f u e r o n definidos c o m o sigue :
Pequeños cocos inmóviles, Gram negativos, cocobacilos o bastoncillos cortos de bordes rectos o ligeramente convexos y de e x t r e m o s redondeados, de
0,5 - 0 , 7 µ m de ancho por 0,6 - 1 , 5 µ m de largo. Se presentan individualmente,
más escasa vez en pares, en cadenas cortas o en pequeños racimos. No producen cápsulas, esporos ni flagelos. No suelen presentar coloración bipolar.
No son ácidorresistentes, aunque pueden resistir a la decoloración por los ácidos débiles o por los álcalis c o m o en los m é t o d o s de coloración de Macchiavello o de Köster modificada.
Aerobios, que poseen un metabolismo respiratorio. M u c h a s cepas exigen
un suplemento (del 5 al 10 % ) de C 0 para su c r e c i m i e n t o , sobre t o d o para el
primer aislamiento. Quimioorganotróficos, con necesidades nutritivas completas, incluidos m u c h o s ácidos aminados, la t i a m i n a , la n i c o t a m i d a , la biotina
y el magnesio. Algunas cepas exigen suero u otros coloides para su crecimiento
— pero no requieren haemina (factor X) ni nicotamida adenina dinucleótida
(factor V ) . Catalasa positivas y n o r m a l m e n t e oxidasa positivas — aunque B.
neotomae, B. ovis y algunas cepas de B. abortus son oxidasa negativas. No
fermentan los hidratos de carbono en los medios convencionales salvo B. neotomae. Oxidan m u c h o s ácidos aminados y los hidratos de c a r b o n o . Reducen
los nitratos en nitritos, salvo B. ovis. La urea se hidroliza a u n q u e a un grado
variable.
2
La producción de H S varía en f u n c i ó n de las especies y de los biotipos. No
se emplea el citrato c o m o única f u e n t e de c a r b o n o . No existe producción de
indol. La prueba con rojo metil y las reacciones de Voges-Proskauer son negativas. La gelatina no está licuada y los hematíes no están lisados. La leche tornasolada no cambia, o bien se hace alcalina.
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Las temperaturas varían de 20 a 4 0 ° C, siendo el ó p t i m o 37° C. El pH ó p t i m o
está comprendido entre 6,6 y 7,4 y la presión osmótica óptima entre 2 y 6 atmósferas (0,05-0,15 mole NaCl).
Los sistemas de transporte de los electrones incluyen los c i t o c r o m o s a, a ,
b, c y O.
3
La sensibilidad a la lisis producida por los fagos específicos del género varía
según la especie. Los ácidos grasos estructurales p r o d u c e n un perfil de elución característico en cromatografía gas - líquido, así c o m o los ésteres metílicos.
Poseen proteínas de estructura c o m u n e s , solubles en la mezcla de agua, de
ácido acético y de f e n o l que d a n , en electroforesis, resultados específicos del
género. Los principales antígenos de superficie difieren según el carácter liso
o non liso de las cepas, mientras que algunos antígenos intracelulares son c o m u nes para todas las especies.
El contenido de guanina + citosina del A . D . N . varía entre 56 y 58 moles
por ciento (densidad en equilibrio). Las secuencias de los polinucleótidos del
A . D . N . ponen de manifiesto en 9 0 % de homología en los estudios de
hibridación.
Son parásitos intracelulares facultativos que p r o d u c e n enfermedades características en una amplia serie de animales.
ESPECIES TIPO
1. BRUCELLA
MELITENSIS
C 0 independiente. No produce H S o apenas un indicio en medio peptonado.
Crecimiento habitual en presencia de fucsina básica y de tionina. Hidroliza normalmente la urea. Las cepas lisas pueden reaccionar c o n los antisueros monoespecíficos M , A o A y M según los biotipos. No es lisada por los fagos T b , Fi
o W b con D.C.P. (dilución corriente de prueba) o a 1 0 D.C.P. Las cepas lisas
son lisadas por el f a g o B k c o n la D.C.P. y a 104 D.C.P.
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4
2
Oxida la L-alanina, la L-asparagina, el ácido L-glutámico, la D-glucosa y el
i-eritritol. No oxida la L-arabinosa, la D-galactosa, la D-ribosa, la D-xilosa, la
L-arginina, la DL-citrulina, la DL-ornitina o la L-lisina. Suele ser patógena para
ovejas y cabras, aunque puede infectar a los ovinos y al h o m b r e .
Cepas de referencia F . A . O . / O . M . S . (neotipo y biotipos) :
B. melitensis
B. melitensis
B. melitensis
16 M (biotipo 1)
6 3 / 9 (biotipo 2)
Ether (biotipo 3)
NCTC
10094
10508
10509
ATCC
23456
23457
23458
-
304
2. BRUCELLA
ABORTUS
Suele requerir un 5 % de C 0 en s u p l e m e n t o para el c r e c i m i e n t o , especialmente en el primer aislamiento. Hidroliza normalmente la urea y produce moderadas cantidades de H S , aunque algunas cepas pueden no p r o d u c i r l o . Suele
crecer en presencia de fucsina básica y algunos biotipos en presencia de tionina. En c a m b i o , otras serán inhibidos por a m b o s colorantes. Las cepas lisas
pueden tener antígenos de superficie A , M , o A y M que reaccionan, según
el biotipo, con los antisueros monoespecíficos. Los cultivos de gérmenes en
fase lisa — o en fase intermedia — son lisados por los fagos T b , Fi, W b y Bk
c o n la D.C.P. Los cultivos n o lisos s o n lisados p o r el f a g o R / C c o n la D.C.P.
2
2
2
Oxida la L-alanina, la L-asparagina, el ácido L-glutámico, la L-arabinosa, la
D-galactosa, la D-glucosa, la D-ribosa, y el i-eritritol. No oxida la D-xilosa, la
L-arginina, la DL-citrulina, la DL-ornitina o la L-lisina.
Suele ser patógena para los bovinos en los que es causa de a b o r t o ; también
puede infectar a otras especies entre las cuales ovejas, cabras, camellos, yaks,
búfalos, caballos, perros y el h o m b r e .
Cepas de referencia F . A . O . / O . M . S . (neotipo y biotipos):
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
abortus
abortus
abortus
abortus
abortus
abortus
abortus
abortus
NCTC
10093
10501
10502
10503
10504
10505
10506
10507
544 (biotipo 1)
8 6 / 8 / 5 9 (biotipo 2)
Tulya (biotipo 3)
292 (biotipo 4)
B3196 (biotipo 5)
870 (biotipo 6)
6 3 / 7 5 (biotipo 7)
C68 (biotipo 9)
Ya no está reconocido B. abortus
ATCC
23448
23449
23450
23451
23452
23453
23454
23455
biotipo 8.
3. BRUCELLA
SUIS
C 0 independiente. Hidroliza la urea rápidamente. Produce grandes cantidades de H S o ninguna según el b i o t i p o . El crecimiento se hace en presencia de
tionina y suele ser inhibida por la fucsina básica, aunque algunas cepas se multiplican en ambos colorantes. Las cepas lisas suelen reaccionar c o n el suero
monoespecífico A , aunque algunas cepas pueden reaccionar en f u n c i ó n del
biotipo con los antisueros monoespecíficos A y M , o bien c o n el antisuero M.
Las cepas lisas no son lisadas por el f a g o T b c o n la D.C.P., pero sí son lisadas
a 1 0 D.C.P. y son lisadas parcialmente por el f a g o Fi y lisadas por los fagos W b
y B k con la D.C.P. Oxida la D-ribosa, la D-glucosa, el i-eritritol, la D-xilosa, la
L-arginina, la DL-citrulina y la DL-ornitina. No suele oxidar la L-alanina ni la
L-asparagina. La oxidación de la L-lisina, del ácido L-glutámico, de la
L-arabinosa y de la D-galactosa varía según el b i o t i p o .
2
2
4
2
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305
-
Normalmente patógena para los cerdos con excepción del biotipo 4 que generalmente es p a t ó g e n o para los renos. También puede infectar a otras especies
entre las cuales las liebres, los roedores, los perros y el h o m b r e .
Cepas de referencia F . A . O . / O . M . S . (neotipo y biotipos) :
B.
B.
B.
ß.
suis
suis
suis
suis
NCTC
10316
10510
10511
11364
1333 (biotipo 1)
T h o m s e n (biotipo 2)
686 (biotipo 3)
40 (biotipo 4)
4 . BRUCELLA
ATCC
23444
23445
23446
23447
NEOTOMAE
C 0 independiente. Produce H S . Hidroliza la urea rápidamente. No se m u l t i plica en presencia de fucsina básica, pero sí se multiplicará en presencia de
tionina (al 1/150.000). Las cepas lisas poseen el antígeno de superficie A que
reacciona en las pruebas c o n los antisueros monoespecíficos. Las cepas lisas
son lisadas parcialmente por el f a g o T b c o n la D.C.P. y t o t a l m e n t e lisadas a
10 D.C.P. También son lisadas por los fagos Fi, W b y B k con la D.C.P. Puede
producir ácido a partir de la G-glucosa, D-galactosa, L-arabinosa, y D-xilosa
en medio p e p t o n a d o . Oxida la L-asparagina, el ácido L-glutámico, la
L-arabinosa, la D-galactosa, la D-glucosa,el i-eritritol y la D-xilosa. No oxida
la L-alanina, la L-arginina, la DL-citrulina, la DL-ornitina ni la L-lisina. La oxidación de la D-ribosa es variable. A p a r e c e en el ratón campesino de las regiones
desérticas del Oeste de Estados Unidos (Neotoma lepida T h o m a s ) . Se desconocen las infecciones naturales en las demás especies.
2
2
4
2
Cepa de referencia t i p o F . A . O . / O . M . S . :
B. neotomae
5K33
NCTC 10084
A T C C 23459
No se reconoce n i n g ú n b i o t i p o .
5. BRUCELLA
OVIS
Requiere un c o m p l e m e n t o de C O ( 5 - 1 0 %) para el crecimiento. No hay producción de H S . No suele hidrolizar la urea, a u n q u e algunas cepas pueden presentar una pequeña actividad a los siete días. Se multiplica en presencia de
fucsina básica y de t i o n i n a . No reduce el nitrato. Los cultivos no presentan
el carácter liso, siempre están en la fase rugosa en el primer aislamiento. No
reacciona con los antisueros monoespecíficos A y M , aunque sí se aglutina
con el antisuero R. Reacciona de m o d o cruzado c o n B. canis y otras Brucella
no lisas. No es lisada por los f a g o s T b , Fi ni B k cualquiera que sea la c o n c e n tración. Es lisada por el f a g o R/C c o n la D.C.P. Oxida la L-alanina, la
L-asparagina y el ácido L-glutámico. No oxida la L-arabinosa, la D-galactosa,
la D-glucosa, la D-ribosa, el i-eritritol, la D-xilosa, la L-arginina, la DL-citrulina,
la DL-ornitina ni la L-lisina. El adonitol es o x i d a d o , lo que es útil para la identificación pues B. ovis y B. neotomae son las únicas especies n o r m a l m e n t e activas en este substrato. Es patógena para ovejas, p r o d u c e epididimitis en los
carneros y aborto en las ovejas.
2
2
2
-
306
-
Se desconocen las infecciones naturales en otras especies.
Cepa de referencia t i p o F . A . O . / O . M . S . :
B. ovis 6 3 / 2 9 0
N C T C 10512
A T C C 25840
N i n g ú n b i o t i p o está identificado.
6.
BRUCELLA
CANIS
C 0 independiente. Hidroliza la urea rápidamente. No p r o d u c e H S . Suele
reducir los nitratos, aunque algunas cepas pueden n o poseer esta propiedad.
Se suele multiplicar en la t i o n i n a , a u n q u e no en la fucsina básica. Los cultivos
siempre están en la fase rugosa o m u c o i d e en el primer aislamiento. No reacciona con los antisueros monoespecíficos para los antígenos A y M , aunque
reacciona c o n el antisuero frente al antígeno R. Reacciona d e m o d o cruzado
serológicamente c o n B. ovis y las demás Brucella no lisas. No es lisado por
los fagos T b , Fi, W b o B k cualquier que sea la c o n c e n t r a c i ó n . Es lisado por el
f a g o R/C c o n la D.C.P. Oxida la D-ribosa, la D-glucosa, la L-arginina, la
DL-citrulina, la DL-ornitina y la L-lisina. N o oxida la L-alanina, la L-asparagina,
el ácido L-glutámico, la L-arabinosa, la D-galactosa o la D-xilosa. La oxidación
del i-eritritol es variable.
2
2
2
Es patógena para los perros, p r o d u c i e n d o epididimoorquitis en el macho,
así c o m o el aborto y la metritis en la h e m b r a . Puede ser transmitida al hombre.
Cepa de referencia t i p o F . A . O . / O . M . S . :
B. canis
RM/6/66
N C T C 10854
A T C C 23365
No se reconoce ningún biotipo.
T I P I F I C A C I Ó N DE L A S B R U C E L L A
Dado el poder infectante para el h o m b r e , los cultivos de Brucella deberían
ser examinados por un personal correctamente e n t r e n a d o , d o t a d o de las instalaciones necesarias para precaver cualquier infección accidental. Se han hecho
recomendaciones especiales acerca de las medidas de precaución que se han
de t o m a r para el manejo de las cepas de Brucella (10).
En la mayoría de los casos, los cultivos de Brucella aisladas en las operaciones de diagnóstico o tras las encuestas pueden ser identificados con facilidad
c o m o miembros del género con base, primero a la evidenciación en el microscopio de frotis coloreados con el colorante de G r a m , y a la morfología de las
colonias en medio de gelosa-dextrosa-suero o cualquier otro medio semejante,
poniendo después en acción la aglutinación c o n el antisuero de las especies
lisas de Brucella si está la misma en la fase de colonias lisas o c o n el antisuero
de una cepa rugosa de Brucella si está la misma en la fase rugosa y, por último,
verificando la lisis por los fagos de Brucella. Se realiza e n t o n c e s con facilidad
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PL = Lisis parcial
L = Lisis
Perros
Ovejas
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+ = QO N>50
- = QO N<50
+ = Q0 N variable
+
BU|SI|--|
(a) Cepas lisas
(b) Dilución corriente de prueba
+
Ratón campesino de
las regiones desérticas
+ +
Roedores, múridos
y cricétidos
+
Cerdos
Renos
Bovinos
Ovejas, cabras
Cerdos
Cerdos, liebres
Huéspedes
preferidos
|o;ui|j8-/
Bruce/la
Oxidación de los substratos
Lisis por los fagos
con la D.C.P.Ib)
CUADRO 1. — Clasificación de las especies dúl género Brucella.
307
2
Producción
de H S
tionina
básica
Tucsina
+
3 . .
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i
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(d) El crecimiento se hará en presencia de tionina al 1/150.000 P/V.
(a) Concentración = 1/50.000 (peso/volumen).
(b) ( + ) = la mayor parte de las cepas son positivas; ( - ) = la mayor parte de las cepas son negativas.
(c) Para más segura diferenciación de los biotipos 3 y 6, se emplea la tionina a 1/25.000 P/V; el tipo 3 es positivo, el tipo 6 es
negativo.
I
B. canis
1 1 1 1 1
B. ovis
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B. neotomae
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B. suis
2
Exigencia
en C0
cr
B. melìtensis
Biotipo
Aglutinación
con los antisueros
monoespecíficos
<
B. abortus
Especies
13
Crecimiento en medios que contienen '
CUADRO 2. — Clasificación de los biotipos de Brucella.
308
-
309
-
la siguiente etapa de identificación a nivel de la especie o del biotipo utilizando
las pruebas convencionales. Estos m é t o d o s s o n sencillos y se los puede realizar en cualquier laboratorio d o t a d o del equipo necesario para la bacteriología
general y que disponga de las indispensables instalaciones de seguridad. Por
el contrario, no convienen las pruebas del m e t a b o l i s m o oxidativo para la identificación de los cultivos de rutina. Efectivamente, requieren un instrumental
costoso y un personal especialmente f o r m a d o ; s o n , además, poco fiables, y
exigen tiempo así c o m o la interpretación de u n especialista. Es preferible que
se deje su realización para los laboratorios de consulta q u e tienen la experiencia de estos m é t o d o s . Se han descrito ( 6 , 7 ) m é t o d o s más sencillos para la
determinación semicuantitativa de la actividad metabólica oxidativa que emplea
una cromatografía en capa f i n a . Estas técnicas s o n más seguras y de más fácil
realización que las técnicas m a n o m é t r i c a s y t a n sólo requieren un aparato sencillo. Sin embargo, no siempre proporcionan resultados t o t a l m e n t e c o n c o r d a n tes con los que se o b t u v i e r o n c o n los m é t o d o s m a n o m é t r i c o s , pues, a diferencia de esta técnica, están influidas por la degradación no oxidativa de los substratos. No obstante, suele bastar el cuadro general del empleo del substrato,
evidenciado por cromatografía en capa f i n a , para identificar la especie.
Las pruebas metabólicas oxidativas son valiosas para identificar los cultivos
atípicos, por ejemplo, lo q u e es menos f r e c u e n t e , la cepa lisa, resistente a los
fagos, o más c o m ú n m e n t e , las variantes no lisas de una especie n o r m a l m e n t e
lisa. Se pueden identificar ahora las especies invariablemente no lisas, B. ovis
y B. canis, mediante la tipificación c o n los fagos y las pruebas convencionales.
Se recomienda que los centros nacionales de brucelosis examinen detenidamente los cultivos aislados en su propio país c o n la prueba del f a g o y los m é t o dos habituales de e x a m e n . Los q u e difieren de los biotipos establecidos y los
que fueron aislados de huéspedes inhabituales deberían ser conservados por
liofilización tan pronto c o m o se realice el aislamiento. Cuando se aisle cierto
número de cultivos similares y parezca que el t i p o reviste cierta importancia
epidemiológica o un interés inhabitual, se debería contactar u n centro de c o n sulta F . A . O . / O . M . S . , ateniéndose a la normativa para el transporte de cultivos fuera de las fronteras nacionales. Los cultivos deberían ir a c o m p a ñ a d o s
de datos completos sobre los resultados de la tipificación preliminar, el origen
y los antecedentes.
En los Cuadros 1 y 2 figuran las características diferenciales de las especies
y de los biotipos del género Brucella.
BIBLIOGRAFÍA
1. STABLEFORTH A . W . y JONES L . M . -
int. Bull. bact. Nomencl.,
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