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MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE PCR
PARA EL DIAGNOSTICO DE
LEPTOSPIROSIS EN MUESTRAS DE
SANGRE y ORINA
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº69
MANUEL J CÉSPEDES ZAMBRANO
RAFAEL TAPIA LIMONCHI
DANA GONZÁLEZ QUISPE
LOURDES BALDA JUÁREZ
CARLOS PERALTA
PATRICIA CONDORI
JORGE ALDAZABAL SOTO
FREDY MUNAYCO
2007
VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE PCR PARA EL DIAGNOSTICO DE LEPTOSPIROSIS EN MUESTRAS
SANGRE y ORINA
DE
FORMATO PARA INFORME TÉCNICO FINAL INS
PRIMERA PÁGINA*
I.
Título del estudio.
VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE PCR PARA EL DIAGNOSTICO DE LEPTOSPIROSIS
EN MUESTRAS DE SANGRE y ORINA
II. Autores, indicando su filiación institucional.
Manuel J Céspedes Zambrano - CNSP
Rafael Tapia Limonchi - CNSP
Dana González Quispe- CNSP
Lourdes Balda Juárez - CNSP
Carlos Peralta – LRR Madre de Dios
Patricia Condori – Hospital Santa Rosa.
Jorge Aldazabal Soto – DISA Madre de Dios.
Fredy Munayco - Red Cañete-Yauyos
III. Autor corresponsal (Dirección, teléfono, correo electrónico).
Correspondencia: Manuel Céspedes Zambrano. Instituto Nacional de Salud. Av.
Defensores del Morro 2268, Lima 09, Perú. Apartado Postal 471. Telf.51(1)251 6151,
Fax51(1) 251 6151 Anexo : 429 ó 541
*CONTENIDO*
VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE PCR PARA EL DIAGNOSTICO DE LEPTOSPIROSIS EN MUESTRAS
SANGRE y ORINA
DE
IV. Resumen
Introducción: El “gold standar” para el diagnóstico de Leptospirosis es la prueba basada
en la respuesta serológica, el método utilizado es la aglutinación microscópica (MAT) que
detecta títulos de anticuerpos de los pacientes infectados en un periodo de 6-10 días
después de iniciada la enfermedad. En la prueba de MAT es necesario contar con una
segunda muestra para poder evaluar la evolución de títulos de anticuerpos del paciente.
Se han reportado el uso de la técnica de ELISA para casos tempranos de infección
obteniendo resultados satisfactorios en el diagnóstico de esta enfermedad. El diagnóstico
de Leptospiras también se podría realizar por observación microscópica en campo oscuro
o por aislamiento en cultivo, sin embargo la viabilidad de las Leptospiras es mínima y el
tiempo que demora en crecer la bacteria podría tardar entre 2-3 meses y su porcentaje de
aislamiento es muy bajo de 1-10%. Objetivo: Estandarizar y validar una prueba de PCR
para el diagnostico rápido de Leptospirosis humana a partir de muestras de sangre y orina.
Material y Métodos: Se optimizo la prueba tomando en cuenta los factores que afectan la
prueba. En segundo lugar, se estandarizo en el laboratorio con muestras de ADN de
Leptospiras de diferentes especies con las cuales se evaluo la sensibilidad del método,
seguidamente se evaluo la especificidad de la prueba con muestras de ADN de otros
patógenos. En tercer lugar se determino en el campo el valor de la prueba a través de la
determinación de su sensibilidad, especificidad en muestras de pacientes con sospecha
clínica de leptospirosis. El gold standard será el cultivo y/o la prueba de ELISA y
microaglutinación (MAT). Resultados: El PCR estandarizo amplifico los 25 serovares de
leptospiras que están agrupado en 6 especies: L. biflexa, L. borgepetersenii, L. interrogans,
L. kischneri, L. santarosai, L. weili. De las muestras de ADN de otras bacterias ninguno
amplifico usando estos primers. La sensibilidad y especificidad del método fue 100% in
vitro. En la validación de campo de 57 confirmados por serologia el PCR amplifico en 47
pacientes muestras de sangre y orina. Asimismo en la primera muestra el MAT solo detecto
anticuerpos solo en 35 de 47 PCR positivos. Por lo tanto nosotros concluimos que el PCR
estandarizado es mucho más sensible que las pruebas serológicas en los primeros días de
enfermedad y es poco sensible cuando la carga de bacteria baja en sangre.
VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE PCR PARA EL DIAGNOSTICO DE LEPTOSPIROSIS EN MUESTRAS
SANGRE y ORINA
1.
DE
INTRODUCCION
La Leptospirosis es una enfermedad zoonótica que puede ser causada por diversos serovares
de Leptospira interrogans, es una enfermedad asociada con la actividad de las personas, sobre
todo cuando el hombre está en contacto directo o indirecto con orina de animales infectados(13). La Leptospirosis es una enfermedad febril, aguda, sistémica de distribución universal cuya
incidencia está relacionada con la localización geográfica y la ocupación de las personas. La
Leptospira interrogans es una especie antigénicamente compleja que incluye diversos grupos
genéticos, comprende más de 200 variedades antigénicas aisladas de unas 160 especies de
mamíferos(1-3).
La Leptospirosis es una enfermedad ampliamente distribuida en el país, no conociéndose la
proporción de casos febriles sin diagnóstico que pueden ser atribuidas a esta enfermedad,
pues no es considerada usualmente como una enfermedad de notificación, el diagnóstico
diferencial y las técnicas de diagnóstico no están ampliamente disponibles(4-8). Las pruebas
de diagnostico para estas enfermedades zoonóticas están normalmente basadas en la
respuesta inmunitaria y mucha de ellas no son muy sensibles dentro de los primeros 6 días de
enfermedad y muchas veces no es muy oportuno para el inicio de tratamiento(7).
En la actualidad la biología molecular está permitiendo realizar investigaciones
a nivel
molecular de los patógenos infecciosos que están afectando la salud humana como la
Leptospirosis. Las técnicas moleculares son altamente sensibles y específicas permitiendo un
diagnóstico temprano y oportuno de la enfermedad. Una de estas técnicas es la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR),
es una técnica que permite incrementar el número de
amplificaciones de secuencias de ADN específicos de Leptospiras a partir de un ADN molde.
Posterior al PCR se usa tambien la hibridación haciendo que la prueba sea más sensible y
específica(9-19). En la actualidad el PCR está siendo usado para el diagnóstico de otras
enfermedades infecciosas como Tuberculosis, Sífilis, Enfermedad de Lyme, entre otros.
La prueba de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido usada exitosamente para
diferentes patógenos. También fue probada su utilidad para detectar ADN de Leptospiras en
muestras de sangre, Liquido cefaloraquideo y orina encontrando una buena concordancia con
las pruebas serológicas y el cultivo(9-19).
VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE PCR PARA EL DIAGNOSTICO DE LEPTOSPIROSIS EN MUESTRAS
SANGRE y ORINA
DE
Posteriormente para aumentar la sensibilidad de esta prueba se uso secuencias dentro del
genoma de esta bacteria como el gen ribosomal (16S, 23S) para detectar DNA de esta bacteria
en muestras para poder aumentar la sensibilidad de la prueba se han utilizado sondas
marcadas que permitieron dar una mayor sensibilidad a la prueba.(16, 17, 20)
En nuestro país también se han desarrollado trabajos desde 1953, en el Instituto Nacional de
Salud se iniciaron estudios epidemiológicos de Leptospirosis en ratas de desagües, gatos,
perros y cerdos sacrificados en el camal del Callao, así como al personal del Mercado Central.
A partir de 1962, se intensificaron estos trabajos, principalmente fuera de Lima, efectuándose
estudios en Tumbes, Ancash, Cajamarca, Arequipa, Amazonas, San Martín, Huánuco,
Ayacucho, Loreto y
Madre de Dios
y se concluyó que era una enfermedad ocupacional
presentándose esporádicamente y que es producida principalmente por Leptospiras del
serogrupo Icterohaemorrhagiae, aislándose numerosas cepas de Leptospiras, tanto del hombre
como de los animales domésticos y silvestres, algunos de los cuales resultaron ser serovares
nuevos(21-26). Los estudios que se realizaron anteriormente en nuestro país nos permitieron
conocer las variedades de serovares en las distintas regiones. Estos estudios se realizaron en
diferentes zonas del país.
Durante el año de 1997, el Instituto Nacional de Salud reportó 11 casos positivos, en el año
1998, debido a problemas climáticos como el fenómeno del Niño, el laboratorio de Leptospiras
reportó 98 casos positivos, en 1999 reportó 93 positivos, en el 2000 reportó 105 positivos.
Con el objetivo de conocer la incidencia de la enfermedad en febriles en un brote en Madre de
Dios, personal del Instituto Nacional de Salud y la Dirección de Salud de Madre de Dios
intervinieron para hacer el estudio en los poblados que se encuentran a lo largo del río Madre
de Dios, encontrando un 36.6% de positividad para Leptospirosis en humanos. Asimismo se
hizo un muestreo al animal doméstico más cercano al hombre, el perro, encontrando en estos
animales una positividad de 66.6% para Leptospirosis. (6)
En un estudio de seroprevalencia que se realizó el año 2000 por la DISA San Martín y el INS
buscando anticuerpos pasados en personas que se dedican al cultivo de arroz en cuatro
provincias, se encontró una positividad de 25.2% considerando estos resultados como alto.
Con la finalidad de conocer la prevalencia de la enfermedad en los distintos departamentos del
país, en el mes de octubre del 2001 el Instituto Nacional de Salud con la participación de la
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SANGRE y ORINA
DE
DISA Ucayali realizó un estudio en humanos y animales encontrado una positividad de la
enfermedad en 31%.(4)
Con estos datos obtenidos en los diferentes departamentos del país, se vio que la
Leptospirosis es una de las causas más frecuentes de fiebre en las diferentes regiones del
país(27)
Asimismo en el INS se han estandarizado diferentes metodologías para él diagnóstico
serológico de la Leptospirosis en especial por el método de ELISA para lo cual se uso
diferentes preparaciones antigénicas, encontrando valores de sensibilidad y especificidad, que
varia entre 85 a 95%(7)
El presente es un proyecto de investigación aplicado a salud que consiste en aplicar métodos
de diagnóstico utilizando Técnicas de Biología Molecular modernas y altamente específicas, a
fin de realizar un diagnóstico rápido y oportuno en las diferentes zonas de nuestro país de
muestras biológicas usando primer que corresponde a los nucleótidos 38 a 57 y 348 a 368 de
la estructura primaria del gen rrs (16S) de Leptospira.
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SANGRE y ORINA
DE
V. Objetivos.
Validación de la prueba de PCR para el diagnóstico temprano de Leptospirosis.
Objetivos Específicos:

Estandarización de la prueba de PCR en el laboratorio.

Validación de la prueba de PCR a partir de muestras de sangre y orina
provenientes de zonas endémicas de Leptospirosis
VI. Materiales y métodos.
Población de estudio: El estudio tuvo dos etapas la primera de estandarización de la
prueba en laboratorio y la otra de validación en el campo.
Estandarización in vitro:
A. Selección de cepa de Leptospira interrogans
Las cepas usadas para la estandarización in vitro fueron de la especies de leptospiras
patógenas y no patógenas. Las cepas fueron reactivadas mediante su cultivo en medio
EMJH, por 5 días a 30ºC. Posteriormente se realizará pruebas para evaluar la pureza de
los cultivos con técnicas establecidas.
B. Extracción de ADN genómico
Las cepas de Leptospira después de incubadas fueron centrifugadas a 2000g durante 10
minutos. El sedimento fue resuspendido en buffer TE/sodio (50mM Tris, 50 mM EDTA, 100
mM NaCl, pH 8,0). Luego se adicionará 30 ul de SDS al 10% y 3ul de proteinasa K,
dejando incubar a temperatura de 37ºC durante una hora. La suspensión de las células
lisadas se trataron con fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1) y los ácidos nucleicos
serán precipitados con dos volúmenes de etanol frío y luego resuspendidos en agua
tridestilada estéril.
C. Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR):
Se realizo la optimización de todos los parámetros del PCR como Primer, Cloruro de
Magnesio, DNTPS, Taq polimerasa, buffer y ADN.
Para la optimización del PCR se trabajo con 25 muestras de ADN de leptospiras patógenas
y no patógenas para evaluar la sensibilidad mezclada con muestras de sangre.
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SANGRE y ORINA
DE
Para los estudios de especificidad de la prueba de PCR se probaron con 3 muestras de
ADN de los siguientes patógenos (Brucella, Salmonella, Treponema, Borrelia, Rickettsias y
Plasmodium).
Validación en el campo:
Para la validación en campo se trabajo con aquellos pacientes sospechosos con
Leptospirosis que acudan a los establecimientos de salud de las Dirección de Salud de
Madre de Dios (Hospital Santa Rosa, Iberia y C.S. Jorge Chávez, Nuevo Milenio, Laberinto)
y adicionalmente se capto muestras de pacientes febriles con sospecha de leptospirosis los
cuales fueron posterior a un brote al sur de Lima en San Vicente de Cañete.
Los criterios de inclusión usados fueron:
Criterios de inclusión:

Todo paciente febril con tiempo de enfermedad menor de 10 días, con temperatura
oral mayor o igual a 38oC con malestar general, cefalea repentina y asociado a uno
o mas signos y síntomas como escalofrío, mareo, mialgia, artralgia, tos, disnea,
diarrea, náuseas o vómitos, hemorragia conjuntival,
fenómenos hemorrágicos,
ictericia y oliguria

Residente en el área un mínimo de 2 meses.

Edad mayor de 5 y  65 años de edad.
Criterios de exclusión:

Pacientes con sintomatología sugerente de leptospirosis que antes de empezar
con el estudio se le confirma otra patología.

Personas que no deseen participar en el estudio
Procedimientos:
Muestra biológicas para las pruebas:
Paciente: Se tomo a aquellos pacientes sospechosos con Leptospirosis y que cumpla
la definición de caso.
A. Obtención de Sangre para el cultivo y PCR: Se tomo una cantidad de 5ml con
tubo al vació con anticoagulante como EDTA.
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SANGRE y ORINA
DE
B. Obtención de Suero para serologia: La toma de la muestra sangre total se realizo
simultáneamente con la toma de sangre anticoagulada entre 1-10 días de iniciado los
síntomas y otra muestra se tomo a los 7-21 días posterior a tomado la primera muestra.
C. Obtención de muestra de orina para PCR:
La toma de la muestra de orina se realizo simultáneamente de tomado la muestra de
sangre, esta se centrifugo y el sedimento se guardo
en congelación hasta la
realización del PCR.
VII. Resultados y Discusión (incluye tablas y gráficos).
Métodos para la Estandarización del PCR en laboratorio:
Estandarización del PCR:
Para el PCR se usaron al final un primer ribosomal correspondiente al gene rrs Lep A:
5´GGCGGCGCGTCTTAAACATG3´ and Lep B: 5´TTCCCCCCATTGAGCAAGATT 3´.
Las condiciones del mix se estandarizaron en 100 pmol de cada primer, 1.5mM MgCl2
(Perkin Elmer) 1X PCR Buffer II (Perkin Elmer) 200uM dNTPs and 1 U of AmpliTaq
Gold DNA polymerase (Perkin Elmer) in a final volumen of 50uL. Las condiciones se
ciclaje fueron: Denaturación inicial de 95°C for 5 min, 95°C por 30 segundos, 59°C por
1 minuto, 72°C por 30 segundos, este ciclo se repitió 30 veces terminado se hizo una
extensión final 72°C for 7 minutos en un thermocycler Amplitron II (Thermolyne)
Sensibilidad y especificidad in vitro:
Los primers usado durante la estandarización del PCR amplificaron los 25 serovares de
leptospiras que están agrupado en 6 especies, estos serovares son usados en el MAT.
Tabla 1: Numero de Serovares usados por especie en la estandarización del PCR.
Especie
Numero de serovares
Resultados de PCR.
L. biflexa
2
Positivo
L. borgepetersenii
4
Positivo
L. interrogans
14
Positivo
L. kischneri
1
Positivo
L. santarosai
3
Positivo
L. weilii
1
Positivo
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SANGRE y ORINA
DE
De las muestras de ADN de otras bacterias ninguno amplifico usando estos primers.
Para este numero de cepas y con estas bacteria podemos se afirma que la sensibilidad
del método es 100% y con una especificidad de 100%.
Evaluación de la Extracción de ADN con muestras de sangre:
Asimismo 8 serovares de Leptospira fueron extraído por 7 métodos para ver cual era el
mejor método de extracción: M1: DNAzol (GIBCO), M2: DNAzol y extracción orgánica,
M3: DNAzol modificado, M4: Esferas de CHELEX 100 (SIGMA), M5: Método
convencional, M6: Método convencional modificado, M7: Boiling (Corney 1993). Solo
amplificaron adecuadamente y se observo una banda con los métodos M3, M4, M5, M6
y M7.
Validación de la prueba en campo
Para determinar la sensibilidad y especificidad, se evaluó un total de 194 muestras de
estas se excluyeron 14 debido a que tenían mas de 10 días de enfermedad y otras no
tenían muestras de sangre anticoagulada para estudios en el PCR. Des estos 153
correspondían a muestras que habían sido captadas en establecimientos de la DISA
Madre de Dios, 27 correspondían a muestras tomadas en San Vicente de Cañete, se
excluyo el estudio en Pucallpa debido a que faltaron recursos para esta zona, pero el
numero de muestras captadas en estas dos zonas era suficiente para un análisis. La
confirmación de caso por serologia se tomaron lo siguientes criterios: muestras
pareadas de serología negativa a positiva, seroconversion de anticuerpos en 2 o mas
títulos, ELISA Ig M positiva y MAT positiva en una muestras y con titulo mayor a 1/400
y cultivo positivo. En un análisis previo, lapido y crudo porque se necesitaba un informe
preliminar se observo que de 44 confirmados por serologia el PCR amplifico el ADN de
leptospiras en 22 pacientes y en 138 casos dados como negativo amplifico 12. Se
había incluido en ello también a pacientes con mas de 10 días de enfermedad en el
nuevo análisis se excluye todas las posibilidades que podrían afectar el análisis. En la
tabla 2 se muestran los resultados.
VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE PCR PARA EL DIAGNOSTICO DE LEPTOSPIROSIS EN MUESTRAS
SANGRE y ORINA
DE
Tabla 2 Resultados de las muestras obtenidas por las diferentes pruebas.
PCR
Pacientes
MAT
ELISA
Cultivo
PCR-
PCR
PCR
total
sangre
orina
suero
(sangre
Elisa y
(180)
mat
y orina)
Positivo
57
56
5
74
41
20
8
47
Negativo
123
124
66
106
139
121
19
133
0
0
109
0
0
39
153
0
No
realizado
Asimismo comparando el PCR con respecto al MAT en la primera muestra de 41 PCR
que resultaron positivos en sangre, en el MAT tuvo positividad en solo en 19 y 22
habían salido negativos. Esto evidencia que en la fase temprana es mucho más
sensible que el MAT en el PCR muestras que resultaron se obtuvo que el PCR
detectaba positividad.
Haciendo la comparación con la positividad obtenida en PCR en muestras de sangre y
orina de 47 PCR positivos en la primera muestra solo el MAT detecto 20 y 27 salieron
negativos, los cuales evidencia que el PCR es mas sensible que las pruebas
serológicas ya que la respuesta inmune es mas tardía como es mencionado por
diversos autores en revisiones previas.
Con respecto a la negatividad obtenida en el PCR se explica porque en la mayoría de
casos se han tomado en pacientes entre 8 y 10 días de enfermedad donde las
leptospiras ya en sangre están en menor proporción que en los primeros seis días y
recién comienzan a circular en orina.
Por lo tanto nosotros concluimos que el PCR estandarizado es mucho más sensible
que las pruebas serológicas en los primeros días de enfermedad y baja su detección
de leptospiras en sangre cuando va bajando su carga a partir del octavo día.
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SANGRE y ORINA
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