Estequiometría del crecimiento y formación de producto Para

Estequiometría del crecimiento y formación de producto
Para un balance de materia con reacción, se debe conocer la estequiometría de
la reacción. Cuando existe crecimiento celular, las células son el producto de
reacción y deben, por tanto, estar representadas en la ecuación de reacción.
Ahora se mostrará cómo se formulan las ecuaciones de la reacción de
crecimiento y de síntesis del producto. La estequiometría metabólica posee
muchas aplicaciones en bioprocesos: al igual que en los balances de materia y
energía, puede utilizarse para comparar rendimientos de producto teóricos y
experimentales, comprobar la consistencia de los datos de fermentación
experimentales y formular medios de nutrición.
Estequiometría del crecimiento y balances elementales
A pesar de su complejidad y de que existen miles de reacciones intracelulares,
el crecimiento de las células obedece a la ley de conservación de la materia.
Todos los átomos de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y otros
elementos consumidos durante el crecimiento se incorporan a las nuevas
células o se expulsan como productos. Centrando nuestra atención en aquellos
compuestos consumidos o producidos en cantidades significativas, si los
únicos productos extracelulares formados son CO2 y H20, el crecimiento
aerobio de las células puede describirse mediante la siguiente ecuación:
(1)
En la ecuación (1),
es la fórmula química que representa el
sustrato (por ejemplo, para la glucosa, w = 6, x = 12, y = 6 y z =
0).
es la fórmula química de la fuente de nitrógeno y CH O N
es la «fórmula» química de la biomasa seca, a, b, c, d y e son los
coeficientes estequiométricos. La ecuación (1) se escribe tomando como
referencia un mol de sustrato, de manera que se consumen a moles de O2 y se
forman dmoles de CO2 por cada mol de sustrato consumido, etc. Como se
muestra en la Figura 1, la ecuación representa un punto de vista macroscópico
del metabolismo ya que ignora la estructura detallada del sistema y considera
únicamente aquellos componentes que presentan un intercambio neto con el
ambiente que les rodea. A pesar de su simplicidad, la aproximación
macroscópica resulta ser una herramienta muy útil en el análisis
termodinámico. La ecuación (1) no incluye gran cantidad de compuestos
como el ATP y el ADNH que integran el metabolismo y que sufren cambios
cíclicos en las células, pero que no sufren cambios netos con el ambiente.
Podrían también incluirse compuestos tales como las vitaminas y minerales
tomados durante el metabolismo, aunque estos factores de crecimiento se
consumen generalmente en tan pequeñas cantidades que su contribución a la
estequiometría y a la energía de la reacción es despreciable.
Figura 1: Conversión del sustrato, oxígeno y nitrógeno para el crecimiento
celular.
Ecuaciones de balance.
En la ecuación (1), la biomasa se representa por la fórmula CH O N . No
existe objeción alguna a que exista una fórmula molecular para describir las
células, aunque ésta no se aplique normalmente en biología. La fórmula
muestra simplemente la composición de la biomasa. Los microorganismos
como la Escherichia coli contienen una gran variedad de elementos aunque el
90-95% de la biomasa está constituida por cuatro elementos mayoritarios: C,
H, O y N. Las fórmulas de biomasa seca, tienen como base de referencia un
átomo de C; la cantidad total de biomasa formada durante el crecimiento
puede calcularse mediante el coeficiente estequiométrico c de la ecuación (1).
Las bacterias tienden a tener contenidos de nitrógeno ligeramente mayores
(11-14%) que los hongos (6.3-9.0%). Para determinadas especies, la
composición celular depende también de las condiciones de cultivo y del
sustrato utilizado: de ahí que se encuentran diferentes fórmulas para un mismo
organismo. Sin embargo, cabe destacar que los resultados son muy similares
para células y condiciones muy diferentes. Por ello, cuando no se dispone de
la composición puede utilizarse como fórmula general CH1.8O0.5N0.2,. El «peso
molecular» medio de la biomasa basado en los contenidos de C, H, O y N es
por lo tanto 24.6, aunque existe normalmente un 5-10% de ceniza residual que
no se incluye en la fórmula.
CwHxOyNz + a02 + bHg OhNi
cCH O N + dCO2 + eH2O (1)
La ecuación (1) no es completa a menos que se conozcan los coeficientes
estequiométricos a, b, c, d y e. Una vez obtenida la fórmula de la biomasa,
estos coeficientes pueden calcularse mediante los procedimientos normales de
las ecuaciones de balances; es decir, mediante balances elementales y
resolución simultánea de ecuaciones.
Balance de C:w = c + d(2)
Balance de H:x + bg = c + 2e(3)
Balance de O:y+ 2a + bh = c +2d+e(4)
Balance de N:z + bi = c (5)
Obsérvese que existen cinco coeficientes desconocidos (a, b, c, d y e) pero
sólo cuatro ecuaciones de balances. Esto significa que se necesita alguna
información adicional pararesolver el sistema. Generalmente esta información
se obtiene experimentalmente. Un parámetro muy útil, medible de forma
experimental, es el cociente de respiración (RQ);
(6)
Cuando se dispone de un valor experimental de RQ, las ecuaciones (2) a (6)
pueden ya resolverse y así determinar los coeficientes estequiométricos. Los
resultados son, sin embargo, muy sensibles a pequeños errores en el valor
de RQ, el cual debe medirse con gran exactitud. Cuando la ecuación (1) está
completa, las cantidades de sustrato, nitrógeno y oxígeno necesarias para la
producción de biomasa pueden determinarse directamente.
Balances de electrones
Aunque los balances elementales son útiles, la presencia de agua en la
ecuación (1) causa algunos problemas en la aplicación práctica. Teniendo en
cuenta que generalmente el agua se encuentra en gran exceso y que cambios
en la concentración de agua son difíciles de medir o verificar
experimentalmente, los balances de H y O pueden presentar dificultades. En
su lugar, un principio muy útil es la conservación de potencia reductora o
electrones disponibles, la cual puede utilizarse para calcular relaciones
cuantitativas entre sustratos y productos. Un balance de electrones muestra
cómo se distribuyen en la reacción los electrones disponibles del sustrato.
Los electrones disponibles se refieren al número de electrones disponibles
para transferir al oxígeno en la combustión de una sustancia a CO2, H2O y
compuestos que contengan nitrógeno. El número de electrones disponibles
encontrados en los materiales orgánicos se calcula a partir de la valencia de
sus elementos: 4 para C, 1 para H, -2 para O, 5 para P y 6 para S. El número
de electrones disponibles para N depende del estado de referencia: -3 si la
referencia es amoníaco, 0 para nitrógeno molecular N2 y 5 para nitratos. El
estado de referencia para el crecimiento celular se elige generalmente que sea
el mismo que la fuente de nitrógeno del medio. En la siguiente discusión se
supone por conveniencia que se utiliza amoníaco como fuente de nitrógeno,
aunque el cambio es muy sencillo si se emplean otras fuentes de nitrógeno.
El grado de reducción se define como el número de equivalentes de
electrones disponibles en aquella cantidad de materia que contenga 1 átomo de
carbono. Por lo tanto, para el sustrato CwHxOyNz, el número de electrones
disponible es (4w+x-2y-3z). Él grado de reducción del sustrato
es, por lo
tanto. (4w+x-2y-3z)/w. El grado de reducción para el CO2, H2O y NH3 es
cero.
Los electrones disponibles para transferir al oxígeno se conservan durante el
metabolismo. En una ecuación de crecimiento correctamente ajustada, el número
de electrones disponibles se conserva en virtud del hecho de que las cantidades
de cada elemento químico también se conservan. Aplicando este principio a la
ecuación (1) y utilizando amoníaco como fuente de nitrógeno, el balance de
electrones disponibles es:
donde
y
son los grados de reducción del sustrato y de la biomasa,
respectivamente. Obsérvese que el balance de electrones disponibles no es
independiente de la serie completa de balances elementales; si la ecuación
estequiométrica se ajusta en función de cada elemento que contenga H y O, el
balance se satisface implícitamente.
Rendimiento de biomasa
Generalmente, para calcular los coeficientes estequiométricos se utiliza la
ecuación (7) junto con los balances de carbono y nitrógeno, ecuaciones (2) y
(5), y el valor medido de RQ.Sin embargo, un balance de electrones, dos
balances elementales y una cantidad medida son todavía una información
inadecuada para resol ver cinco coeficientes desconocidos, necesitándose
todavía otra cantidad experimental para ello. Conforme las células crecen
existe, como regla general, una relación lineal entre la cantidad de biomasa
producida y la cantidad de sustrato consumido. Esta relación se expresa
cuantitativamente utilizando elrendimiento de biomasa, YXS:
(8)
El rendimiento de biomasa se ve afectado por gran cantidad de factores como
la composición del medio, la naturaleza de las fuentes de carbono y nitrógeno,
el pH y la temperatura. El rendimiento de biomasa es mayor en cultivos
aerobios que en los anaerobios; la elección del aceptor de electrones, es decir,
O2, nitrato o sulfato, puede tener también un efecto significativo.
Cuando YXSes constante durante el crecimiento, su valor determinado
experimentalmente puede utilizarse para calcular el coeficiente
estequiométrico c en la ecuación (1). La ecuación (8) expresada en términos
de la estequiometría de la ecuación (1) es:
(9)
donde MW es el peso molecular y «MW células» significa el peso-fórmula de
la biomasa más cualquier ceniza residual. Sin embargo, antes de aplicar los
valores medidos de Yxs y la ecuación (9) para calculare, debe estarse seguro de
que el sistema de cultivo experimental está correctamente representado por la
ecuación estequiométrica. Por ejemplo, debemos estar seguros de que el
sustrato no se utiliza para sintetizar otros productos extracelulares que no sean
CO2 y H2O. Una complicación de los cultivos reales es que alguna fracción de
sustrato se consume para actividades de mantenimiento tales como el
mantenimiento del potencial de la membrana y del pH interno, la recuperación
de componentes celulares y la movilidad celular. Estas funciones metabólicas
requieren sustrato pero no producen necesariamente biomasa celular, CO2 y
H2O, tal como se describe en la ecuación (1). Es importante tener en cuenta
este mantenimiento, cuando se utiliza información experimental para
completar las ecuaciones estequiométricas. En el Capítulo 11 se discuten con
más detalle las necesidades de mantenimiento y la diferencia entre
rendimientos observados y reales. Por el momento se considerará que los
valores disponibles de rendimiento de biomasa reflejan sólo el consumo de
sustrato para el crecimiento.
Estequiometría del producto
Considérese la formación de un producto extracelular CjHkOlNm durante el
crecimiento. La ecuación (1) puede extenderse para incluir la síntesis del
producto de la siguiente manera:
CwHxOyNz + a02 + bHg OhNi
cCH O N + dCO2 +
eH2O +fCjHkOlNm(10)
Donde f es el coeficiente estequiométrico para el producto. La síntesis del
producto introduce otro coeficiente estequiométrico desconocido a la
ecuación, por lo que se necesitará conocer otra relación más entre coeficientes.
Para ello se utiliza generalmente otro coeficiente de rendimiento determinado
experimentalmente, el rendimiento de producto a partir del sustrato, Yps
(11)
Como se ha mencionado anteriormente en relación al rendimiento de biomasa,
debe asegurarse de que el sistema experimental utilizado para medir
Yps corresponde a la ecuación (10). La ecuación (10) no es válida si la
formación de producto no está directamente relacionada con el crecimiento;
asimismo no puede aplicarse a la producción metabólica secundaria como la
fermentación de la penicilina o en biotransformaciones como la hidroxilación
de esteroides que involucran sólo un pequeño número de enzimas. En estos
casos, para describir el crecimiento y síntesis de producto deben utilizarse
ecuaciones de reacción independientes.
Demanda teórica de oxígeno
La demanda de oxígeno es un parámetro importante en el bioprocesado ya que
el oxígeno es a menudo el sustrato limitante en las fermentaciones aerobias.
La demanda de oxígeno está representada por el coeficiente
estequiométrico a en las ecuaciones (1) y (10). Las necesidades de oxígeno
están directamente relacionadas con los electrones disponibles para la
transferencia de oxígeno por lo que la demanda de oxígeno puede derivarse a
partir de un balance de electrones apropiado. Cuando existe síntesis de
producto, como el representado por la ecuación (10), el balance de electrones
es:
(12)
donde
obtiene:
es el grado de reducción del producto. Reordenando la ecuación se
(13)
La ecuación (13) es una ecuación muy útil. Significa que si se conocen los
organismos (
), el sustrato (w y
) y el producto (j y
) involucrados
en el cultivo celular, y el rendimiento de biomasa (c) y de producto (f), la
demanda de oxígeno puede calcularse rápidamente. Por supuesto a puede
también determinarse resolviendo los coeficientesestequiométricos de la
ecuación (10) como se ha descrito. La ecuación (13) permite una evaluación
más rápida y no es necesario conocer las cantidades de NH3 CO2 y H2O
involucradas.
Rendimiento máximo posible
De la ecuación (12) se deduce que el reparto de electrones disponibles en el
sustrato puede escribirse como:
(14)
El primer término de la parte derecha de la ecuación (14) es la fracción de
electrones disponibles transferidos desde el sustrato al oxígeno, el segundo
término es la fracción de electrones disponibles transferidos a la biomasa y el
tercero es la fracción de electrones disponibles transferidos al producto. Esta
relación puede utilizarse para obtener los rendimientos de biomasa y producto
a partir del sustrato.
Si se define
como la fracción de electrones disponibles en el sustrato
transferidos a la biomasa:
(15)
En ausencia de formación de producto, si todos los electrones disponibles se
utilizaran para la síntesis de biomasa
sería igual a la unidad. Bajo estas
condiciones, el valor máximo del coeficiente estequiométrico c es:
(16)
cmax puede convertirse a rendimiento de biomasa con unidades de masa
mediante la ecuación (9). Entonces, incluso si no se conoce la estequiometría
de crecimiento, el límite superior de rendimiento de biomasa puede calcularse
rápidamente a partir de la fórmula molecular del sustrato y del producto. Si no
se conoce la composición de las células,
puede tomarse como 4.2 que es
el valor medio de la fórmula de la biomasa CH1.8O0.5N0.2. Los rendimientos
máximos de biomasa pueden expresarse en términos de masa (Yxs,max) o como
número de átomos de C en la biomasa por átomo de C de sustrato consumido
(cmax/w). Estas cantidades se denominan algunas veces como rendimientos
termodinámicas máximos de biomasa. Los sustratos con alto contenido
energético, indicado por elevados valores de
, producen los mayores
máximos de rendimientos de biomasa. De esta manera puede determinarse el
rendimiento máximo de producto en ausencia de síntesis de biomasa, a partir
de la ecuación (14):
(17)
La ecuación (17) permite calcular rápidamente el límite superior del
rendimiento de producto a partir de la fórmula molecular del sustrato y del
producto.
En conclusión la ecuación de la reacción química para la conversión del sustrato
sin crecimiento es una pobre aproximación de la estequiometría global cuando
existe crecimiento celular. Cuando se calculan los rendimientos y las demandas
de oxígeno para cualquier proceso que incluye crecimiento celular debe utilizarse
la ecuación estequiométrica global incluyendo la biomasa. Por otro lado, la
naturaleza química o el estado de oxidación del sustrato presentan su mayor
influencia sobre el rendimiento de producto o a biomasa a través del número de
electrones disponibles.