PRÁCTICAS DE GENÓMICA E INGENIERÍA GENÉTICA BLOQUE I

Practica 1
4º de Grado de Biología
Genómica e Ingeniería Genética
PRÁCTICAS DE GENÓMICA
E INGENIERÍA GENÉTICA
BLOQUE I
1
Practica 1
4º de Grado de Biología
Genómica e Ingeniería Genética
PRÁCTICAS DE GENÓMICA
E INGENIERÍA GENÉTICA
BLOQUE I
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ü Elexamenpuedecontenercuestionesreferenteaestasprácticas.
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Practica 1
4º de Grado de Biología
Genómica e Ingeniería Genética
I. DETECCIÓN DE VARIANTES POLIMÓRFICAS.
MEDIANTE PCR
MARCO TEÓRICO
Los genomas presentan regiones altamente variables entre los individuos de una
especie, llamadas secuencias polimórficas o polimorfismos. Estos cambios pueden
deberse a variaciones en el contenido de la secuencia de nucleótidos o pueden deberse a
inserciones, o deleciones. En el caso de polimorfismos que generan un cambio
significativo en número de nucleótidos se puede usar directamente la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) para detectarlos. Para polimorfismos que produzcan un cambio
en la secuencia de nucleótidos (pero no en su número) puede usarse una técnica que
combina PCR y enzimas de restricción llamada (PCR-RFLP) que hemos estudiado en
clase.
En nuestro genoma existe una secuencia polimórfica llamada Alu TPA-25. Esta
secuencia polimórfica se encuentra en el cromosoma 8 y se sitúa en el intrón del gen
que codifica el activador tisular del plasminógeno (TPA). Se conocen dos formas de
esta secuencia, y una de ellas presenta una inserción de una secuencia de 300 pb
llamada Alu. Las regiones Alu forman parte de las regiones repetitivas del genoma, se
derivan de elementos móviles llamados retrotransposones y son responsables de muchas
de las regiones polimórficas del genoma humano.
En esta práctica amplificaremos esta región polimórfica mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos (también llamados
oligonucleótidos o primers) que flanquean la secuencia. En caso de presentar la
secuencia Alu insertada, se obtendrá por PCR un fragmento de 400 pb. Si no se tiene
dicha secuencia el tamaño del producto amplificado será de 100 pb. De esta forma, si el
individuo es heterozigótico para este carácter, mostrará los dos fragmentos, de 100 y
400 pb y si es homocigo sólo uno de los mismos.
Cebador aguas arriba "5-GTAAGAGTTCCGTAACAGGACAGCT-3"
Cebador aguas abajo "5-CCCCACCCTAGGAGAACTTCTCTTT-3.
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Practica 1
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Genómica e Ingeniería Genética
PROBLEMA 1:
Se ha cometido un crimen en el cual tú eres el principal sospechoso. La policía, ha
obtenido un pelo del agresor en la escena del crimen. Pruebas preliminares han
determinado la información sobre un marcador polimórfico Alu-TPA-25, siendo el
criminal homocigoto para la inserción de la secuencia Alu. Tal y como estás en un
laboratorio de biología molecular: ¿sabrías exculparte del delito?
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Sesión 1
I.
AISLAMIENTO DEL DNA DE LAS CÉLULAS EPITELIALES DE LA
CAVIDAD BUCAL DE LOS CARRILLOS (30 MINUTOS)
1. Poner 10 ml de solución salina (NaCL 0,9%) en tubos 30 ml (aproximadamente 1/3
del tubo), introducirse en la boca todo el volumen y enjuagarse vigorosamente
(raspar los carrillos con la lengua con el fin de que se arrastre células descamadas)
con ella durante 30 seg.
2. Expulsar la solución procedente del lavado bucal en el vaso y verterlo con cuidado
en un tubo de 30 ml. Agitar la solución y tomar 1 ml de esta y pasarla a un tubo
eppendorf de 1.5 ml que será rotulado con nuestro nombre.
3. Centrifugar la solución en una microcentrífuga a 10.000 rpm durante 2 minutos.
4. Eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no despegar el sedimento celular
blanquecino visible en el fondo del tubo.
5. Añadir, 200 µl de la solución de Chelex 10% homogenizada al sedimento celular.
Agítala bien antes de coger la solución de Chelex porque las bolitas caerán al fondo
rápidamente, usa la punta azul (la más gruesa, porque con la amarilla la punta se
obturará). Resuspender el pelet celular con la micropipeta. Asegurarse, mirando a la
luz, que no quedan acúmulos de células.
6. Calentar la muestra en un termobloque a 95-100º C, durante 10 minutos.
7. Enfriar los tubos en hielo durante 1 minuto. Centrifugar 30 segundos en una
microcentrífuga, con objeto de sedimentar la resina de Chelex, y proteínas.
8. Transferir 100 µl del sobrenadante teniendo cuidado de no tomar nada del sedimento
(que contiene Chelex y proteínas) a un tubo limpio marcado con un nombre que lo
identifique.
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Practica 1
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Genómica e Ingeniería Genética
REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN DEL DNA (PCR).
1. Se nos dará un tubo de PCR de 0.2ml con un volumen de 12 µl que la Mezcla
Maestra (master mix) RedTaq que contiene todo el material necesario para la reacción
con la excepción de nuestro ADN (Taq Polimerasa, Buffer, dNTPs, primers, además de
tampón de carga y colorantes aniónicos).
Tomaremos 8µl de muestra de solución de ADN y lo añadiremos al tubo para completar
los 20µl. No te olvides de marcar el tubo para identificarlo.
2. Tapar bien el tubo e introducirlo en el termociclador automático. Asegúrate que el
termociclador seguirá el programa correcto para realizar la reacción en cadena de la
polimerasa.
Añadir un muestra de control positivo (ADN proveniente del individuo problema) y
negativo a la reacción global.
Ciclos
Proceso y temperatura
tiempo
1
Desnaturalización
2 min
40
1
94 ºC
Desnaturalización 94 ºC
30 seg
Hibridación
55 ºC
30 seg
Elongación
72 ºC
30 seg
Elongación
72 ºC
10 min
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Genómica e Ingeniería Genética
Sesión 2
PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA AL 2%
Preparar el gel de agarosa de forma similar a la descrita anteriormente pero a un
porcentaje del 2% en TAE (2gr de agarosa por cada 100ml de TAE).
Debido a que la manipulación de los genes de agarosa tiene cierto riesgo esta parte
será realizada por el profesor o bajo supervisión directa del mismo.
Se utilizarán 2 gr de agarosa por cada 100 ml de tampón TAE. Se necesitan 50 ml de
gel por cada cubeta pequeña de electroforesis del sistema de Biorad. Una vez pesada
la agarosa, se añade junto con el tampón TAE a una botella termo-resistente. Se
enrosca la botella de forma que no quede completamente cerrada (importante!). Se
calienta en el microondas a máxima potencia hasta que se disuelva la agarosa y la
solución se vuelva totalmente transparente, parando cada 20 segundos para agitar el
contenido.
Δ! Utilizar un protector para coger la botella, quemará!. Al agitar la botella para
disolver la agarosa, la presión hace que la solución pueda salir de la botella de forma
brusca y existe peligro de quemarse (a nosotros o a nuestros compañeros). Al agitar
“apuntar” con la botella hacia el fregadero.
Verter 50ml de gel en un matraz termorresistente dentro de la campana de extracción
de vapores y esperar unos minutos hasta que dejen de salir vapores del mismo. A
continuación se añade 1µl de BrEt (concentración final 0,5 µg/ml) y se agita con
cuidado. Posteriormente se vierte en una bandeja de electroforesis (pequeña Biorad),
se incorpora a la misma un peine adecuado y se deja gelificar (20 minutos
aproximadamente).
Δ!
Usa guantes para la manipulación del BrEt, y de los productos que entren en
contacto directo con él. Recuerda que el BrEt es potencialmente cancerígeno.
1. Centrifugar 30 segundos a máxima velocidad cada uno de los tubos de 1.5ml donde
habíamos incubado la digestión. Añadir 4µl de tampón de carga de electroforesis (x6).
2. Añadir con la micropipeta 5µl de marcador de peso molecular con la micropipeta
en la pista 1 del gel.
3. Añadir con la micropipeta todo el producto de la PCR a la pista 2, el siguiente a la
pista 3 y así sucesivamente (no olvidar anotar el orden de carga de muestras, se
puede usar la plantilla de al final del documento).
4. Orientar los polos de la cubeta de electroforesis negativo arriba, y positivo abajo.
Encender la fuente de alimentación con un voltaje de 100V y empezar la carrera.
Observa que cuando se inicia la corriente saldrán burbujas del polo negativo de la
cubeta. El ADN se desplazará del polo negativo al positivo. Dejar correr la
electroforesis hasta que la banda del azul de bromofenol haya migrado los 2/3 del
tamaño del gel.
5. Visualizar en un transiluminador de luz ultravioleta y fotografiar el gel.
Δ! Cuidado con la irradiación UV, es tóxica.
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Practica 1
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Genómica e Ingeniería Genética
II. MAPAS DE RESTRICCIÓN
MARCO TEÓRICO
Las enzimas de restricción son endonucleasas capaces de reconocer secuencias
específicas de ADN y cortarlas.
Estas enzimas se encuentran en muchas especies de bacterias, donde funcionan como
parte de un sistema de restricción y modificación (sistema R/M). Este sistema es
análogo a un sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre su propio
ADN y el ADN exógeno, siendo este último degradado por la enzima de restricción.
El ADN propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que
previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una
metiltransferasa (enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a
bases específicas).
Existen tres tipos de enzimas de restricción. Las enzimas de restricción de tipo II
cortan en una posición específica del ADN dentro de su secuencia de reconocimiento,
denominada sitio de restricción, en él la enzima rompe un enlace fosfodiéster en
una de las hebras de ADN y otro enlace fosfodiéster en la hebra complementaria.
Las secuencias reconocidas son en su gran mayoría palindrómicas (secuencias que se
leen igual en ambas direcciones) y tienen un tamaño de entre 4-12 pb en ADNs. Los
cortes generarán extremos romos (si cada una de las dos hebras del ADN se cortan en al
mismo nivel) o protuberantes (cuando las dos hebras de ADN no se cortan en el mismo
nivel). La existencia de extremos romos o protuberantes tiene importancia en ingeniería
genética a la hora de unir diferentes fragmentos de ADN como estudiaremos en clase.
Sin embargo no tiene una importancia relevante a la hora de confeccionar mapas de
restricción, ya que mediante electroforesis no se pueden diferenciar entre ambos cortes.
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Practica 1
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Genómica e Ingeniería Genética
Nomenclatura: Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que
son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de
donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género
de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa,
y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.
Ejemplo:
Eco RI
E = género Escherichia
co
= especie
R
= cepa RV 13
I
= primera endonucleasa aislada de esta cepa
Aplicaciones de las enzimas de restricción a la identificación de secuencias de
ADN: Mapa de restricción
La especificidad de corte de los enzimas de restricción tiene diversos usos para la
identificación de secuencias de ADN.
La representación de una molécula de ADN donde se indiquen los sitios de
restricción de diferentes enzimas se denomina mapa de restricción y puede servir para
identificar secuencias de ADN una vez resueltas durante la electroforesis en geles de
agarosa.
PROBLEMA 1:
Un paciente se ha infectado de una bacteria patógena que presenta una toxina codificada
por un plásmido. Se necesita saber que tipo de toxina presenta la bacteria para
administrarle al paciente la antitoxina (antitoxina A, B o C). Para tal fin se han aislado
los plásmidos de la bacteria. ¿Cómo podrías saber de que toxina se trata si solo dispones
de los siguientes mapas de restricción (próxima página)?
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Practica 1
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Genómica e Ingeniería Genética
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Practica 1
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PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Sesión 2.
Tomar 500 ng de plásmido extraído de la bacteria aislada del paciente (dado por
el profesor a cada grupo, ¡no se te olvide apuntar el nombre que identifica al paciente!)
y llevarlo a un volumen final de 17 µl con agua estéril.
Añadir 2 µl de Fast Digest Green Buffer (x10), agitar mediante vórtex y añadir 1
µl de enzima FastDisgest (1U/µl).
Cada grupo de alumnos seleccionará una sóla enzima de restricción de las
disponibles (que puede ser Eco RI, Pvu II, HindIII) para digerir el plásmido.
Esta digestión se trata de una nueva formulación de digestión enzimática rápida
(10 minutos frente a 60 minutos) que se combina con tampón de carga, la que encuentre
más apropiada para discriminar entre las diferentes toxinas.
•
Incubar a 37ºC durante 10 minutos a 37ºC (en estufa o termobloque).
•
Preparar un gel de agarosa al 0,8% en tampón de electroforesis (TAE) de forma
similar a la indicada anteriormente en la página 7, aunque utilizando 0.8 gr de
agarosa por cada 100 ml de tampón TAE.
•
Una vez gelificado, cargar las muestras en el gel y realizar la electroforesis.
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Lambda DNA Hind III Digest
Practica 1
Product Number D9780
StoragedeTemperature
°Cómica e Ingeniería Genética
4º de Grado
Biología −20
Gen
Product Description
Hind III digested bacteria phage Lambda DNA is
suitable for
size
determination
of double-stranded DNA
APÉNDICE: MARCADORES
DE
PESO
MOLECULAR
using DNA electrophoresis and is provided as a
solution in 10 mM Tris HCl, pH 8.0, with 1 mM EDTA.
Precautions and Disclaim
This product is for R&D us
household, or other uses. P
Safety Data Sheet for infor
and safe handling practice
En la electroforesis de ADN en geles de agarosa se utilizan marcadores de peso
molecular que constan de
un patrón
fragmentos
deDNA
ADN
deIIItamaño
que
Figure
1. Gel de
image
of Lambda
Hind
Digest conocido,
Storage/Stability
sirven como referencia run
para
determinar
el
tamaño
de
muestras
problema
durante
on a 0.75% agarose gel in 1xTBE
Storela
at −20 °C.
electroforesis.
Procedure
Existen muchos marcadores de peso molecular, algunos de diferente rango, nosotros
Typically 1 µg per well (0.1
durante estas prácticas utilizaremos uno de los siguientes:
visualized using ethidium b
recommended agarose ge
this marker. A sample of t
with gel loading buffer (Pro
appropriate loading concen
resolution, the solution ma
5 minutes and quick cooled
Agarose gel electrophores
TBE (Product Number T64
Number T6025) followed b
1 µg/ml ethidium bromide.
background can be reduce
minutes in 1X electrophore
References
Hendrix, R.W., et al., LAMB
Laboratory, N.Y. (1983), p.
D7058 (Sigma)
D9793 (Sigma)
D9780 (Sigma)
X174(NEB)
VIII (Roche)
Sigma brand products are sold through Sigma-Aldrich, Inc.
Sigma-Aldrich, Inc. warrants that its products conform to the information contained in this and other S
Purchaser must determine the suitability of the product(s) for their particular use. Additional terms an
Please see reverse side of the invoice or packing slip.
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Genómica e Ingeniería Genética
REACTIVOS UTILIZADOS EN PRÁCTICAS
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Agarosa (Sigma A5093).
Bromuro de Etidio (sol. 1 mg/ml)
Agua destilada
Patrón de tamaño de ácidos nucleicos.
Tampón de electroforesis: Tris/Acetato/EDTA (TAE). 40mM Tris, 20mM acetic
acid, and 1mM EDTA.
ADN Plásmídico extraído de la bacteria patógena: (PRL, PSI, NEO,
pCDNA4NeoLuc, B-pRL-TK, C-psicheck2-MCS-UTR-BRG1long)
Enzimas de restricción.
Tampón de reacción para enzimas de restricción.
Agua destilada estéril
Bromuro de Etidio (sol. 1 mg/ml).
Tampón de carga (6x): 0,25 % de azul de bromofenol y glicerol.
Solución Salina estéril NaCl 0,9 %.
Chelex (Chelating Ion Exchange Resin) 10 % en Tris, ajustar pH=11. Resina
aniónica que capta iones divalentes.
PCR Master Mix x2 (RedTaq Catalog Number R2523): Contiene Taq
Polimerasa, Buffer x2, dNTPs, loading buffer.
Cebadores con una concentración de 10uM.
MATERIALES
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Microondas.
Cubeta de hielo.
Botella 500ml termoresistente.
Guantes.
Micropipetas de 100-1000, 10-100 y 0,5-10 µl.
Puntas de micropipetas estériles.
Tubos de 30 ml (tapón rosca blanco).
Tubos de microcentrífuga 1,5 ml estériles (para la digestión).
Tubos de 0,2 ml para PCR
Centrífuga tubos 1.5ml.
Sistema de Electroforesis (cubetas, fuente de alimentación y pines).
Botella y matraz termoresitente.
Campana de extracción de gases.
Termobloque de tubos 1.5ml a 95ºC.
Termociclador
Estufa a 37ºC.
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Genómica e Ingeniería Genética
PLANTILLA CARGA DE GELES DE AGAROSA PARA ELECTROFORESIS
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