empresa beneficiada laboratorio de biotecnologia

NUMERO DE PROYECTO
000000000209992
EMPRESA BENEFICIADA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA APLICADA S
DE RL DE CV
TÍTULO DEL PROYECTO
ESCALAMIENTO Y VALIDACIÓN DE UNA VACUNA
BIOLÓGICA CONTRA GARRAPATA
IMAGEN DEL PRODUCTO O SERVICIO
PROBAR LA EFICIENCIA DE LA VACUNA BIOLÓGICA EN
VIVO
OBJETIVO DEL PROYECTO
Con base en las actividades propuestas en el proyecto: “3ra FASE:
Escalamiento y validación de una vacunas biológicas de garrapata del
ganado” se llevaron a cabo todas las actividades. A continuación se describen
dichas actividades por etapas:
1. Escalamiento de la producción de plantas conteniendo los genes que
codifican para la proteína del cemento Boophilusmicroplus y del factor
estimulante de colonias de granulocitos de bovino.
Durante esta etapa se propusieron diferentes actividades, las cuales
se desarrollaron en forma y en tiempo, con ello se logró cumplir con el
objetivo de dicha etapa, el escalamiento de la producción de plantas
las cuales se probarían como una vacuna biológica de garrapata del
ganado. Las actividades consistieron en:
1. Preparación de medios de cultivo
PRINCIPALES ACTIVIDADES
REALIZADAS
2. Inducción y proliferación de callos embriogénicos de zanahoria.
3. Regeneración de plantas.
4. Pase a suelo de plantas de zanahoria
bajo condiciones de
invernadero
5. Establecimiento y proliferación cultivos de callos embriogénicos de
zanahoria durante todo el año para que, durante este periodo se
cuenten con plantas.
2. Transferencia de genes de que codifican para la proteína del cemento
Boophilusmicroplus
y
del
factor
estimulante
de
colonias
de
granulocitos de bovinoa a callos embriogénicos a través de
biobalística (producción escalonada).
Durante esta etapa
se logró transformar nuevamente callos
embriogénicos de zanahoria, a través del sistema de biobalística.
Cabe señalar que se llevó a cabo la transformación en dos fechas a lo
largo del año. Se lograron establecer cultivos de callos transformados,
de los cuales una parte se llevó a regeneración y otra a mantenimiento
para contar con material biológico en cualquier momento del año. Las
actividades propuestas se cumplieron en su totalidad tanto en forma,
en cuanto a tiempo se efectuaron tres bombardeos, uno más del
propuesto y las fechas variaron en el mes ya que la primera se efectuó
en el mes de febrero, un mes antes y las otras dos en marzo y en
septiembre. En cuanto a la selección se realizó con el basta como
agente selectivo lográndose la sobrevivencia del 70 % de los callos
bombardeados y la regeneración de las plantas.
1. Realizar bombardeos periódicos
2. Preparación
de
medios
de
cultivo
para
la
selección
y
mantenimiento de callos.
3. Identificación de plantas conteniendo los genes que codifican para la
proteína del cemento Boophilusmicroplus y del factor estimulante de
colonias de granulocitos de bovino.
Durante esta etapa se verificó la presencia de los genes en las plantas
regeneradas en
medios de selección,por PCR con las siguientes
especificaciones:
94°C por 30 s
40°C por 2 min
30 ciclos
72°C por 30 s
72°C por 7 min
Se tomó una muestra al azar de plantas y se verificó la presencia de
los genes, dichas plantas se pasaron a condiciones de suelo para su
desarrollo. Las actividades llevadas a cabo en tiempo y forma fueron:
1.
Se tomó una muestra representativa de cada lote de plantas
regeneradas y se analizaron por PCR. No pudimos conseguir los
anticuerpos a tiempo y por ello no se realizaron experimentos de
western blot.
2.
Se tomaron muestras y se liofilizaron, y otras se almacenaron a 80° C.
3.
Las plantas que fueron analizadas y que salieron positivas se
pasaron a suelo. (Anexo 1)
4. Pruebas Inmunológicas
Se
realizaron
pruebas
inmunológicas
con
tejido
de
plantas
identificadas como positivas por PCR en ovinos. Se les administró por
vía oral aproximadamente 50 µg de antígeno un total de tres veces
con intervalos de 2 semanas y después se infestaron con 1850
larvas/bovino de garrapata (Rhipicephalus (B.) microplus). Los
parámetros biológicos a evaluar fueron:
Porcentaje de disminución del número de garrapatas (% D.G.).
Porcentaje de disminución de la repleción (% D. R.).
Porcentaje de disminución de la oviposición (% D. O.).
Porcentaje de disminución de la fertilidad (% D. F.).
Porcentaje de eficacia (% E).
BREVE DESCRIPCION DEL
PROYECTO
Los ectoparásitos chupadores de sangre tales como mosquitos y garrapatas,
son eficientes transmisores de enfermedades. Muchas garrapatas causan
también un daño considerable en la piel del animal, provocando pérdidas
cuantiosas a la industria de la piel. Las técnicas convencionales para controlar
las poblaciones de garrapatas consisten en el uso de acaricidas. Esta
estrategia tiene la enorme desventaja de que induce el desarrollo de
garrapatas resistentes al compuesto químico, lo cual requiere el uso de
nuevos compuestos. Además, estos compuestos tienen poco efecto residual
por lo que tienen que ser aplicados frecuentemente. Todo esto, sin mencionar
los daños a la salud humana y al medio ambiente que causan los
garrapaticidas, ha hecho difícil la lucha contra esta plaga. Como una
alternativa se ha tratado de criar animales resistentes a las garrapatas pero los
resultados hasta ahora no son muy alentadores. Debido a los intensos
programas de erradicación que se han llevado a cabo en muchos países a
causa de las pérdidas económicas que este parasito causa, en la actualidad
existen zonas libres de esta plaga. Sin embargo los problemas persisten. Por
ejemplo, en Brasil las pérdidas económicas ocasionadas por la infestación por
garrapatas han sido estimadas en más de 1000 millones de dólares anuales;
en Australia se estima que la pérdidas son de 100 a 150 millones de dólares al
año y en Cuba, sólo por el concepto de enfermedad hemoparasitarias
transmitida por las garrapatas, se ha ocasionado la perdida de alrededor de
100,000 cabezas en la última década. En México se han identificado 77
especies de garrapatas que causan problemas similares en el ganado bovino
con pérdidas económicas considerables: Daños a las pieles de 5 a 10%,
disminución en la producción de carne aproximadamente en 15%, lo que
corresponde a una pérdida anual de 25 a 60 kg de peso vivo en los animales
infestados, disminución en la producción de leche entre 15 a 20%, transmisión
de enfermedades como Anaplasmosis y Babesiosis, etc. Sin duda, la mejor
estrategia sería vacunar a los animales contra garrapatas, sin embargo, las
vacunas disponibles a nivel nacional e internacional para prevenir brotes de
hemoparásitos se basan en el uso de organismos vivos atenuados (tipo
babesias) o heterólogos (tipo anaplasma). El procedimiento de preparación de
estas vacunas es complejo y su eficacia desafortunadamente ha sido muy
baja sin mencionar el hecho de que estas vacunas no son de amplio espectro
y por lo tanto sólo funcionan contra los garrapatas para las cuales fueron
desarrolladas y quizá alguna que otra más. Otro problema lo representan los
efectos secundarios. Por lo tanto existe una gran necesidad del desarrollo de
una vacuna efectiva para combatir enfermedades transmitidas por
ectoparásitos. Una alternativa para el desarrollo de vacunas es el uso de
proteína recombinantes. Se han probado diferentes antígenos recombinantes
aislados de garrapatas como candidatos vacunales con éxitos variables
utilizando proteínas como las longistatinas (tipo de serinproteasas),
subolesinas, varias glucoproteínas, diversas proteínas superficiales de
membrana, proteínas relacionadas con el fibrinógeno y finalmente la proteína
cementante o de cemento. Las garrapatas son parásitos hematófagos que se
unen a un hospedero por medio de un cono de cemento que se origina de sus
glándulas salivales. El cemento que forma el cono es una secreción lechosa
que se inyecta en la piel del hospedero y lo constituyen muchas proteínas y
carbohidratos. El cemento se extiende en el sitio de la mordedura sobre la piel
y al endurecerse causa que el órgano bucal permanezca firmemente anclado
durante el período de alimentación el cual dura por lo regular de 4-8 días. En
este proyecto nos proponemos generar plantas de zanahoria conteniendo los
genes que codifican para la proteína formadora de cemento y para una
proteína inmunomoduladora (factor estimulante de colonias de granulocitos)
que va a reforzar el sistema inmune bovino. En la presente etapa (Fase III/III)
se realizará el escalamiento y validación de la vacuna biológica contra
garrapata para corroborar su efectividad. En la etapa anterior fueron
regeneradas las plantas a partir de los callos embriogénicos seleccionados y
se realizaron los análisis correspondientes para verificar la presencia de los
genes en las plantas regeneradas.
 La regeneración de plantas y pase a suelo de las mismas bajo
condiciones de invernadero.

Se indujeron y proliferaron
callos embriogénicos de zanahoria
transformados durante el año y se logró
RESULTADOS DEL PROYECTO
regenerar plantas de
zanahoria periódicamente.

Se realizar bombardeos constantes durante el año.

Se contó con callo con los genes de interés durante todo el año.

Se identificaron los genes de interés en las plantas regeneradas por
PCR bajo las mismas condiciones ya descritas.
IMPACTOS DEL PROYECTO
Se cumplieron todos los objetivos comprometidos en su totalidad, sin embargo
las pruebas inmunológicas arrojaron datos negativos. No se observó una
disminución del número de garrapatas. Esto pudo deberse a varios factores:
Hay que considerar que es la primera vez en México y muy probablemente en
el mundo, que se prueba una vacuna de este tipo y no teníamos ninguna
información sobre dosis, frecuencia, etc
Los resultados no fueron los esperados. Pensamos que quizá la dosis de
antígeno no fue suficiente, quizá la ruta de administración no fue la adecuada,
quizá hizo falta un adyuvante, quizá se necesitan más refuerzos, etc. Son
muchos factores lo que hay que considerar. Sin embargo, la Empresa tiene
planeado continuar con este proyecto a pesar de estos resultados negativos.
Pensamos que es cuestión de afinar varios detalles y se volverán a realizar las
pruebas.