Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli

Guía Práctica 2
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
Enfermedad: Bacteriosis común del frijol
Manejo de la bacteria
en el laboratorio
Guillermo Castellanos, Experto en Investigación–2
Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación
Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto
Fitopatología de Frijol
Contenido
Generalidades
Procedimientos
A. Recolección y transporte de las muestras
B. Preparación del medio de cultivo YCDA
C. Aislamiento de Xap y Xpf
D. Incremento de la bacteria
E. Inoculación de las plantas
1. Producción del inóculo
2. Inoculación de plantas en el invernadero
3. Inoculación en el campo
F. Conservación de la bacteria para almacenamiento
1. Liofilización
2. Conservación como suspensión en solución
de peptona-sucrosa, en papel filtro a –20 °C
G. Recuperación de la bacteria almacenada
1. Liofilizada y conservada en ampolletas
2. Conservada a –20 °C en papel filtro de
suspensión en peptona-sucrosa
2-2
2-3
2-3
2-6
2-7
2-10
2-10
2-10
2-11
2-13
2-13
2-13
2-20
2-22
2-22
2-23
Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
Generalidades
La bacteriosis común es causada por Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli (Xap) (Smith) Dye y por
Xanthomonas phaseoli var. fuscans (Xpf) (Burkholder) Starr
& Burkholder, dos bacterias que inducen síntomas idénticos
en hojas, tallos y vainas del frijol común. Su temperatura
óptima de desarrollo está entre 28 y 30 °C. El crecimiento de
estas dos bacterias patógenas en un medio de cultivo
presenta características diferentes: Xpf produce un pigmento
de color café después de 24 horas en el medio de cultivo
YCDA, mientras que Xap no produce esos pigmentos.
La infección por bacteriosis común en las hojas y las vainas
del frijol se manifiesta del modo siguiente:
Foto 1
•
En las hojas, los síntomas iniciales son puntos acuosos
que aparecen, generalmente, en su envés; estos puntos
aumentan de tamaño y forman una lesión grande, como
se aprecia en la Foto 1.
•
En las vainas, los síntomas son manchas húmedas
pequeñas que, cuando crecen y se juntan, cubren gran
parte de la vaina, la deforman e infectan las semillas que
están en su interior.
Las áreas afectadas se muestran flácidas y se rodean de un
borde de color amarillo que, después de cierto tiempo, se
torna de color café y llega a cubrir un área grande de la hoja
o de la vaina. La enfermedad se transmite a la planta a partir
de semillas infectadas.
2-2
Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
Enfermedad: Bacteriosis común del frijol
Procedimientos
A. Recolección y transporte de las
muestras
Para poder aislar la bacteria, es necesario obtener
material vegetal (hojas o vainas de frijol) que presente
los síntomas típicos de la enfermedad.
Materiales
–
–
–
Toallas de papel
Bolsas de papel
Rótulos para identificar el material
•
Toallas de papel. La muestra de tejido de frijol
infectado (de vainas, hojas o tallos) que se colectó
se envuelve en una toalla de papel que sirve,
además, para absorber su humedad. Si no hay
toallas, pueden usarse materiales similares como
servilletas, papel higiénico, pañuelos faciales y, en
último caso, papel periódico.
2-3
Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
•
Bolsas de papel. Las muestras de tejido infectado
envueltas en algún papel absorbente se colocan en
bolsas o sobres de papel. No se deben usar bolsas
plásticas porque no son porosas y contribuyen,
por ello, a la acumulación de humedad en su
interior; esta humedad favorece el crecimiento de
microorganismos saprofitos, los cuales dificultarán
el aislamiento del patógeno que se hace partiendo
de tejidos de frijol.
•
Rótulos para marcar las muestras. Es muy
importante identificar claramente la muestra con la
siguiente información: variedad (o genotipo) de frijol,
tamaño y color de sus granos, lugar donde se toma
la muestra (localidad, provincia, departamento,
país), fecha de recolección de la muestra, nombre
del recolector y, en lo posible, latitud y longitud
(aproximadas) del lugar en que se hizo la
recolección. El rótulo debe quedar bien adherido en
cada muestra.
Recomendaciones
–
–
Indicar en el rótulo si la recolección se hizo en
el campo de un agricultor o en una estación
experimental.
Cuando no haya suficientes rótulos para todas
las muestras, marcar las bolsas con un código y
registrar la información completa en una libreta de
campo.
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Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
Enfermedad: Bacteriosis común del frijol
–
No recolectar material vegetal húmedo; si está en
esas condiciones, secarlo con toallas de papel antes
de ser transportado. Una vez en el laboratorio, y si
no se procesa inmediatamente, dejarlo sobre toallas
de papel al aire libre para que termine de secarse.
Pasos del proceso
• Paso 1
Tomar muestras de hojas o vainas que presenten
los síntomas de la bacteriosis común (ver
A. Recolección y…).
• Paso 2
Envolver la muestra en una toalla de papel, colocarla
en una bolsa o sobre de papel y adherir a ésta el
rótulo que corresponda (ver A. Recolección y…).
• Paso 3
Enviar las muestras, tan pronto como sea posible, al
sitio o laboratorio donde se hará el aislamiento de la
bacteria. Tener en cuenta dos recomendaciones:
–
–
Nunca envíe las muestras dentro de bolsas
plásticas o envueltas en papel aluminio (ver
antes).
No recolecte material vegetal húmedo; si está
húmedo, secarlo con toallas de papel antes de
transportarlo (ver antes).
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Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
B. Preparación del medio de cultivo YCDA
Las siglas YCDA indican los componentes del medio:
yeast (levadura), ‘calcium carbonate’ (carbonato de
calcio), dextrosa y agar.
Materiales
–
–
–
–
–
–
–
Extracto de levadura (‘yeast extract’)
Dextrosa
Agar
Carbonato de calcio (CaCO3)
Agua destilada
Frascos erlenmeyer de 1000 ml
Cajas petri
10
10
15
2
1000
2
g
g
g
g
ml
Preparación
–
–
–
Se pesan los ingredientes, se colocan en un
recipiente grande, que puede ser un vaso de
precipitado, y se les agrega el agua; esta solución
se envasa en dos frascos erlenmeyer (500 ml en
cada uno).
Los frascos erlenmeyer con el medio de cultivo
YCDA se esterilizan en el autoclave. Esta máquina,
con una presión de 20 libras y una temperatura de
121 °C, realiza el proceso total de esterilización en
40 minutos.
El medio esterilizado se deja enfriar hasta que pueda
manipularse y se vierte luego en cajas petri, a razón
de 20 ml por caja.
2-6
Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
Enfermedad: Bacteriosis común del frijol
C. Aislamiento de Xap y Xpf
Materiales
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Material vegetal enfermo (muestra)
Tijeras
Pipeta pasteur
Pinza
Varilla de vidrio u otro instrumento que sirva para
macerar
Cajas petri pequeñas o tubos limpios (de plástico o
vidrio) para macerar las muestras
Agua destilada estéril
Hipoclorito de sodio al 2.5%
Medio de cultivo YCDA
Asa microbiológica
(Foto 2)
Foto 2
Nota: Todos los procedimientos se deben ejecutar dentro
de la cámara de flujo laminar; además, deben cumplirse
todas las condiciones de asepsia y esterilidad que se
exigen en un laboratorio. En otras palabras, se aplican
siempre las buenas prácticas microbiológicas (BPM).
Pasos del proceso
• Paso 1
Limpiar las tijeras con algodón impregnado en
alcohol 70% y cortar luego varios trozos pequeños de
la muestra. Sumergir los trozos durante 3 minutos en
hipoclorito de sodio al 2.5% (Foto 3).
2-7
Foto 3
Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
• Paso 2
Retirar el exceso de hipoclorito de sodio, y lavar la
muestra con agua destilada estéril utilizando una
pipeta pasteur estéril (Foto 4).
Foto 4
Foto 5
• Paso 3
Macerar la muestra en una caja petri pequeña
(Foto 5) o en un tubo. Agregar luego 10 gotas de
agua destilada estéril para obtener una suspensión
de tejido macerado.
• Paso 4
Tomar con el asa microbiológica la suspensión del
macerado (Foto 6) y hacer con ella un rayado sobre
el medio de cultivo YCDA de una caja petri (Foto 7).
Repetir el paso en otras cajas e incubarlas luego a
28 °C.
Foto 6
Foto 7
2-8
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Enfermedad: Bacteriosis común del frijol
• Paso 5
Después de 36 horas de incubación, la bacteria
habrá crecido sobre el medio. Del cultivo resultante
tomar una colonia aislada, cuyas condiciones en el
entorno del medio observado con el estereoscopio
(Foto 8) indiquen que corresponde a la bacteria
(colonia ‘sugestiva’ de la bacteria), y con ella hacer
un nuevo rayado en otra caja petri, como se indica
en la Figura 1. Si hay cultivos contaminantes, su
morfología es diferente de la del cultivo de esta
bacteria y se nota a la vista. Proceder de igual
manera con las colonias obtenidas de otros cultivos
de la muestra de tejido infectado. De este modo se
purifica una colonia que, una vez seleccionada, se
incrementará más adelante.
Foto 8
Técnica para el rayado de bacteria
Para aislar bacterias de una muestra de tejido
vegetal o para incrementar un cultivo de bacterias,
seguir el patrón de rayas indicado en la Figura 1. El
rayado se hace con un asa microbiológica estéril.
Esta metodología permite la obtención de colonias
aisladas y facilita la diferenciación entre las bacterias
contaminantes y la bacteria de interés.
Figura 1
2-9
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Manejo de Patógenos del Frijol
D. Incremento de la bacteria
Foto 9
Estas bacterias se incrementan partiendo de colonias
que tengan entre 24 y 48 horas de crecimiento. Una
colonia se transfiere a medio de cultivo YCDA haciendo
en él un rayado con material de la colonia seleccionada
mediante un asa microbiológica estéril (Foto 9). El
rayado de bacteria se incuba luego a 28 °C durante
24 a 48 horas. Se harán incrementos en cuantas cajas
sean necesarias para la cantidad de plantas que se
inocularán, ya sea en el campo o en el invernadero
(ver cantidades sugeridas en E., 3. Inoculación en…).
E. Inoculación de las plantas
1. Producción del inóculo
Foto 10
Para este proceso se necesitan varios incrementos
de la bacteria de 48 horas de crecimiento (en sus cajas
petri).
Pasos del proceso
• Paso 1
Obtener una suspensión del inóculo en las cajas en
que están los incrementos agregando de 3 a 5 ml de
agua destilada a cada una (Foto 10). Raspar luego
con un triángulo estéril de vidrio la superficie de los
incrementos para desprender del medio las colonias
de la bacteria (Foto 11).
Foto 11
2 - 10
Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
Enfermedad: Bacteriosis común del frijol
• Paso 2
Colectar la suspensión de todas las cajas del paso
anterior en un solo recipiente esterilizado.
Posteriormente medir la concentración de
bacterias de esta suspensión en un
espectrofotómetro. Ajustar la lectura de la
suspensión en 0.5 unidades de absorbancia a una
longitud de onda de 620 nm. Esto equivale a una
concentración aproximada de 5 x 108 ufc/ml.
(ufc = unidades formadoras de colonias)
• Paso 3
Tomar la suspensión del inóculo ajustada a la
concentración de 5 x 108 ufc/ml (ver paso anterior) y
diluirla 10 veces para obtener finalmente una
concentración de 5 x 107 ufc/ml, que es la
concentración de bacteria recomendada para hacer
inoculaciones controladas. Ejemplo de dilución:
diluir 100 ml de suspensión en 900 ml de agua.
2. Inoculación de plantas en el invernadero
• Paso 1
Insertar en un tapón de corcho (o de material blando
similar) cinco agujas por el extremo del ojo, de
manera que sobresalga del corcho 1.5 cm de cada
punta; con estas puntas de aguja se perforará el tejido
foliar para inocularlo. Tomar una caja petri y colocarle
un círculo de espuma plástica de igual tamaño
(Foto 12). Elegir en el invernadero plantas de 17 días
de edad que presenten el primer trifolio expandido
(ya desarrollado) en un 70%, aproximadamente.
2 - 11
Foto 12
Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
• Paso 2
Verter un volumen de la suspensión de inóculo
(Paso 3 anterior) en la espuma de la caja, de tal
manera que la espuma quede totalmente
impregnada, sin que la suspensión se derrame por
los bordes en el momento de la inoculación. Colocar
el trifolio (o un folíolo) elegido sobre la espuma.
Perforar con las agujas del corcho el trifolio y
presionarlas hasta el fondo de la caja para que, al
retirarlas, la bacteria entre en contacto con las
heridas de los folíolos e inicie la infección (Foto 13).
Foto 13
Las plantas inoculadas permanecen en el
invernadero a temperatura ambiente (temperaturas
diurnas entre 25 y 30 °C) hasta cuando sean
evaluadas.
• Paso 3
Evaluar las plantas a los 15 días después de su
inoculación (Foto 14), según la escala estándar del
CIAT, cuyas categorías van del 1 al 9 y se distribuyen
así:
de 1 a 3: planta resistente
de 4 a 6: planta de reacción intermedia
de 7 a 9: planta susceptible
Foto 14
2 - 12
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Enfermedad: Bacteriosis común del frijol
3. Inoculación en el campo
Se necesitan alrededor de 50 cajas petri (bien
incrementadas con la bacteria) por hectárea de cultivo
que se quiera inocular. Seguir los pasos siguientes:
–
–
Obtener una suspensión de la bacteria de las
cajas petri como se indicó antes y ajustar su
concentración (ver E., 1. Producción del…,
Paso 3) en un volumen final de 12 litros para una
bomba (aspersora) de motor.
Aplicar alrededor de 10 a 12 bombas por hectárea
de acuerdo con la edad del cultivo; se recomienda
inocular a los 25 días después de la siembra y
una semana después de esta inoculación (en la
floración).
F. Conservación de la bacteria para
almacenamiento
Para conservar estas bacterias se emplean dos
métodos: la liofilización y el papel de filtro impregnado
con una suspensión de la bacteria en solución de
peptona-sucrosa.
1. Liofilización
Es un método confiable para conservar los
microorganismos que se almacenan.
2 - 13
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Manejo de Patógenos del Frijol
Materiales
–
–
–
–
–
–
–
Liofilizador con dos tipos de soporte: gradilla y árbol.
Ampolletas para liofilizar de ‘cristal neutro’
(‘neutral glass’) de 0.5 ml
Pipetas pasteur largas
Tijeras y algodón
Cultivos de las bacterias en medio de cultivo YCDA
Peptona al 10%
Sucrosa (o dextrosa) al 20%
Nota: Las cepas de bacteria que serán liofilizadas deben
haberse incrementado 48 horas antes de este proceso
(ver D. Incremento de…).
Pasos del proceso
• Paso 1
Escribir o marcar en papel filtro la identificación de
los aislamientos que se van a liofilizar. La
identificación incluye el nombre de la bacteria (Xap o
Xpf), el número del aislamiento (código empleado
por cada laboratorio) y la fecha en que se almacena
la bacteria. Esta información se escribe con letra
pequeña en áreas reducidas del papel filtro (1 a
2 cm2).
2 - 14
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Enfermedad: Bacteriosis común del frijol
• Paso 2
Cortar, con una tijera estéril, los trozos de papel filtro
con la identificación de la bacteria e introducir uno
en cada ampolleta hasta el fondo.
–
–
–
Preparar luego el tapón de algodón con que
se tapa la ampolleta, de modo que cubra,
más o menos, los dos tercios superiores de la
ampolleta. Extender un trozo de algodón hasta
que tenga unos 5 x 3 cm y enrollarlo sobre una
pinza (o la parte delgada de un asa), presionando
con los dedos hasta formar el tapón sobre ese
extremo del asa (Fotos 15, 16 y 17). Dejar un
poco de algodón sin enrollar en el lado opuesto
del tapón.
Introducir el tapón en la ampolleta y retirar la
pinza (o el asa) suavemente con una mano,
mientras se sostiene el tapón dentro de la
ampolleta con la otra.
Preparar ampolletas adicionales con sus
respectivos tapones para tener más tapones
en caso de que se necesiten. Si un tapón se
desintegra al ser manipulado, es necesario
remplazarlo con uno que esté esterilizado en las
ampolletas adicionales.
Foto 15
Foto 16
• Paso 3
Llevar este material (ampolletas con sus tapones) al
autoclave para esterilizarlo durante 40 minutos.
Foto 17
2 - 15
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Manejo de Patógenos del Frijol
• Paso 4
Preparación de las soluciones de peptona y de
sucrosa
Se toman 10 g de peptona y se disuelven en 100 ml
de agua destilada. Se prepara de igual modo una
solución de sucrosa (o de dextrosa) al 20%,
disolviendo 20 g de este producto en 100 ml de agua
destilada. Las dos soluciones, que se preparan por
separado, se llevan al autoclave. Una vez
esterilizadas, se mezclan partes iguales de cada una
en un recipiente estéril para hacer una solución
homogénea de peptona-sucrosa.
• Paso 5
Con una pipeta pasteur larga, succionar de 2 a 3 ml
de la mezcla peptona-sucrosa (ver Paso 4) y
depositarlo sobre el cultivo de bacteria que ha
crecido durante 48 horas en la caja petri. Obtener
luego un homogenizado de la bacteria en la solución
de peptona-sucrosa haciendo succión y expulsión
sucesivas de esa mezcla con la misma pipeta pasteur.
• Paso 6
Tomar, con la misma pipeta pasteur, unas gotas
(2-3 ml) de esa suspensión de bacteria y depositarlas
en el interior de la ampolleta siguiendo estos pasos:
–
Tomar con una mano la pipeta pasteur y con
la otra la ampolleta con su respectivo tapón
(obtenida en el Paso 3).
2 - 16
Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
Enfermedad: Bacteriosis común del frijol
–
Sujetar la pipeta pasteur con los dedos índice
y pulgar, y con el meñique de la misma mano
retirar cuidadosamente el tapón de algodón de la
ampolleta. Enseguida, verter la suspensión de la
bacteria en el fondo de la ampolleta donde está el
papel filtro con la identificación de la cepa. Tapar
luego la ampolleta introduciendo suavemente
en ella el tapón que ha estado sostenido entre el
meñique y la palma de la mano.
Foto 18
Si el algodón del tapón entra en contacto con otra
superficie o con alguna sustancia, se contamina, por
lo que se debe desechar y remplazar entonces con
uno de los que se habían preparado (ver Paso 2) para
estos casos.
• Paso 7
Cortar, con una tijera flameada, la parte del tapón
que quedó por fuera de la ampolleta (Foto 18).
Introducir finalmente en la ampolleta el resto del
tapón de algodón empleando la punta de la tijera,
hasta dejar 1 cm entre el borde de la ampolleta y el
tapón (Foto 19).
• Paso 8
Colocar las ampolletas en una gradilla. Empujar
luego el tapón de algodón hacia el fondo de cada
una hasta que toque el trocito de papel filtro que
lleva la identificación de la bacteria; para ello se
ultiliza un objeto alargado (como la parte superior de
un asa), el cual se flamea constantemente para evitar
que se contaminen los tapones (Foto 20).
2 - 17
Foto 19
Foto 20
Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
La parte superior de la ampolleta, que no contiene
algodón, se sellará después del proceso de
liofilización (Paso 13).
• Paso 9
Una vez organizadas las ampolletas, llevarlas a un
congelador a 0 °C durante 15 minutos. Cuando las
muestras se hayan congelado, se inicia el proceso de
liofilización.
Foto 21
Foto 22
Foto 23
• Paso 10
Colocar la gradilla en la campana del liofilizador y
encenderlo (Foto 21). El aparato hace descender en
su interior la temperatura hasta –55 °C e inicia un
proceso de secamiento de la muestra porque le
extrae el agua mediante una bomba de vacío. Este
proceso tarda de 20 a 22 horas.
• Paso 11
Al día siguiente, apagar el liofilizador y retirar de él la
gradilla con las ampolletas. Preparar luego una
pistola de gas propano y proceder al ‘estiramiento’ de
las ampolletas en la parte opuesta a aquella en que
está la muestra, es decir, hacer un cuello en cada
una ablandando el vidrio con la llama y estirando la
ampolleta por sus extremos (Fotos 22 y 23). El
procedimiento requiere mucha precaución para evitar
quemaduras en las manos por la llama. El objetivo
de este paso es reducir el espacio por donde puede
entrar aire (con humedad) a la muestra, antes de
sellarla completamente.
2 - 18
Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
Enfermedad: Bacteriosis común del frijol
• Paso 12
Una vez estiradas todas las ampolletas, colocarlas en
el árbol del liofilizador insertando el extremo abierto
de cada una en los soportes del árbol. De esta
manera, el extremo que contiene la muestra
quedará más visible (Foto 24). Repetir el proceso de
secamiento en el liofilizador durante 1 hora,
aproximadamente, para eliminar la humedad que
pudo haber entrado a la muestra durante el Paso 11.
• Paso 13
Sin apagar el liofilizador, sellar al vacío las
ampolletas, una por una, empleando la pistola de
gas propano, derritiendo el vidrio con la llama donde
se hizo el cuello o estiramiento (Foto 25). Una vez
selladas, finaliza el proceso de liofilización.
Foto 24
En caso de que se pierda el vacío al estar sellando
una ampolleta, retirar esta parte de la ampolleta,
remplazarla por una nueva y esperar que el vacío
llegue al punto indicado para poder continuar con el
sellado de las otras ampolletas.
La duración de una muestra en almacenamiento,
conservada mediante el proceso de liofilización, no se
ha establecido formalmente; sin embargo, en nuestro
laboratorio se han recuperado muestras liofilizadas
que permanecieron almacenadas durante 30 años.
La liofilización de muestras microbiológicas tiene,
no obstante, una desventaja: para recuperar una
muestra hay que romper toda la ampolleta y, por
2 - 19
Foto 25
Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
consiguiente, es necesario tener varias copias de cada
una de las muestras liofilizadas para poder mantener
adecuadamente una colección.
2. Conservación como suspensión en
solución de peptona-sucrosa, en papel
filtro a –20 oC
La conservación de un patógeno suspendido en
solución de peptona-sucrosa (o peptona-dextrosa) que
se deposita en papel filtro es, después de la liofilización,
uno de los métodos más efectivos para almacenarlo.
Materiales
Foto 26
–
–
–
–
–
–
–
Peptona al 10%
Sucrosa (o dextrosa) al 20%
Cajas petri (con incremento de bacteria)
Pipetas (pasteur)
Pinza
Espátula
Papel filtro
(Foto 26)
Preparación de las soluciones de peptona y
de sucrosa (o dextrosa)
Ver F., 1. Liofilización, Paso 4.
2 - 20
Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
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Pasos del proceso
• Paso 1
Tomar una caja petri que contenga un incremento
de bacteria de 48 horas y agregarle 2 ml de la
solución de peptona-sucrosa (o peptona-dextrosa)
(Foto 27).
Foto 27
• Paso 2
Raspar, con una espátula o con la pipeta, el cultivo
de la bacteria que ha crecido en la caja petri,
para desprender de él colonias de la bacteria y
suspenderlas en la solución agregada (Foto 28).
• Paso 3
Colocar en la suspensión de la bacteria (caja petri
del paso anterior) 20 o más cuadritos de papel filtro
esterilizados de 0.5 cm2 (previamente recortados) e
impregnarlos con esa suspensión (Foto 29).
• Paso 4
Retirar los cuadritos de papel filtro de esa caja petri
con una pinza estéril y colocarlos en una caja petri
estéril que tenga papel filtro en el fondo, para que se
sequen a 24 °C durante 7 días. Transcurrido ese
tiempo, guardarlos en sobres estériles de papel
mantequilla (Foto 30) para almacenarlos a –20 °C,
escribiendo en ellos los datos que identifiquen la
bacteria: nombre del aislamiento, lugar de
procedencia y fecha de almacenamiento (Foto 31).
Foto 28
Foto 29
Foto 30
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Foto 31
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Manejo de Patógenos del Frijol
G. Recuperación de la bacteria almacenada
1. Liofilizada y conservada en ampolletas
Materiales
Foto 32
–
–
–
–
–
–
–
–
Ampolletas con la bacteria liofilizada
Solución de peptona al 10%
Solución de sucrosa (o dextrosa) al 20%
Cajas petri con medio de cultivo YCDA
Pipeta con chupo
Mazo de mortero
Servilleta estéril
Pinza
(Foto 32)
Pasos del proceso
Foto 33
• Paso 1
Romper la ampolleta que contiene la bacteria
golpeándola con un mazo (Foto 33) por el extremo
sellado (la servilleta sirve para amortiguar el golpe).
Retirar con la pinza el algodón de la ampolleta
(Foto 34).
Foto 34
2 - 22
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Enfermedad: Bacteriosis común del frijol
• Paso 2
Depositar con la pipeta cuatro gotas de la solución
de peptona-sucrosa (o peptona-dextrosa). Las
células liofilizadas de la bacteria quedan así
suspendidas en la solución (Foto 35).
• Paso 3
Retirar y sembrar la suspensión de células de la
ampolleta en una caja petri que contenga el medio
de cultivo YCDA (Foto 36). Esparcir la bacteria
haciendo un rayado (ver Figura 1, p. 2-9) con un asa
estéril e incubar a 28 °C. En 48 horas, la bacteria
habrá crecido sobre el medio de cultivo.
Foto 35
2. Conservada a –20 oC en papel filtro de
suspensión en peptona-sucrosa
(o peptona-dextrosa)
La reactivación de una bacteria que ha sido
almacenada conservándola según este protocolo se
logra mejor si se agrega solución de peptona-sucrosa
(peptona-dextrosa) al aislamiento almacenado, porque
la solución le proporciona nutrientes a la bacteria para
que reanude su crecimiento.
Foto 36
2 - 23
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Manejo de Patógenos del Frijol
Pasos del proceso
• Paso 1
Sacar de los sobres de papel mantequilla
(ver F., 2. Conservación como…, Foto 31) de 3 a
5 trocitos de papel filtro que portan la bacteria, y
‘sembrarlos’ en el medio de cultivo YCDA contenido
en una caja petri (Foto 37).
• Paso 2
Depositar una gota de la solución de peptonasucrosa (o peptona-dextrosa) sobre cada trocito de
papel filtro. Hacer luego un rayado de bacteria
(ver Figura 1, p. 2-9) con un asa entre los trocitos de
papel filtro sembrados.
• Paso 3
Incubar las cajas petri del paso anterior a 28 °C.
Después de 2 días, la bacteria habrá reactivado su
crecimiento y estará lista para ser incrementada.
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