Identificación bioquímica de los bacilos Gram

Identificación bioquímica de los
bacilos Gram-negativos
Capítulo 9
Iván Ferrer Rodríguez, PhD
Catedrático
Hoja de Reporte de Desconocidos
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Bacilos gram negativos
Identificación de bacterias:
 Morfología de colonias
 Pruebas bioquímicas en tubos
 Sistema de identificación rápidos
 Sistema de identificación automatizados
 Ensayos de biología molecular
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Pruebas bioquímicas
Utilización de hidratos de carbono:
 Fermentación de lactosa: glucosa + galactosa:

galactoside permeasa – enzima trasportadora

galactosidasa – hidrolisa lactosa
 Se utiliza la glucosa mediante glucólisis (Figura 9.1)
 Bacterias con
galactosidasa solamente son fermentadores lentos.
 El uso de los carbohidratos puede ser mediante oxidación (aeróbicamente) o
fermentación (anaeróbicamente).
 MacConkey
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Pruebas bioquímicas
Prueba de oxidación – fermentación (OF):
 Se usa para diferenciar la familia Enterobacteriaceae (fermentadores) de los
pseudomonads y organismos similares (no fermentadores).
 Contiene 1% de carbohidratos y 0.2% de peptonas.
 Indicador azul de bromotimol (Figura 9.2):
 Verde – medio sin inocular
 Amarillo – medio ácido
 Azul – medio alcalino
 Se inoculan dos tubos:
 Aeróbico
 Anaeróbico – se cubre con aceite mineral
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Pruebas bioquímicas
Tripple Sugar Iron Agar (TSI) & Kliger’s Iron Agar (KIA) – Figura 9.3:
 Útiles en la identificación de patógenos intestinales.
 TSI contiene:







Glucosa 0.1%
Lactosa 1.0%
Sacarosa 1.0%
Sulfato ferroso
Tiosulfato de sodio (H2S)
Peptona
Rojo fenol (pH 7.4) –
indicador amarillo bajo 6.8
 KIA sólo tiene glucosa y lactosa.
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 Inoculación, incubación y lectura de resultados – página 216:
Pruebas bioquímicas
Ortho-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (ONPG):
 Se utiliza para diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa lentos,
de los NO fermentadores.
 Se usan discos con ONPG, estructura similar a lactosa.
 ONPG entra rápidamente al interior de la célula bacteriana, sin la necesidad de
utilizar la -galactósido permeasa.
 Es metabolizado por la
galactosidasa y libera galactosa y o-nitro-fenol
generando un color amarillo.
 Bacterias que producen pigmentos amarillos NO se deben probar.
 Es similar a p-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (PNPG).
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Pruebas bioquímicas
Ortho-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (ONPG):
 Se puede hacer preparando una suspensión de bacterias en salina y añadiendo un
disco comercial o tableta de ONPG.
 Se incuba a 37 °C y se examina a las 6 horas.
 Dado que la
galactosidasa es una encima inducible:
 El gen sólo se expresa si hay lactosa o un sustrato similar
 La bacteria debe obtenerse de un medio que contenga lactosa
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Pruebas bioquímicas
Methyl Red, Voges-Proskauer (MR-VP) (IMViC):
 Se usa para clasificar las Enterobacterias.
 La glucosa en el medio puede ser metabolizada por los microorganismos a
través de distintas vías metabólicas.
 Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido láctico, ácido
acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol).
 Con la adición de un indicador como rojo de metilo (MR) se puede detectar la
presencia de productos ácido (Figura 9.5).
 Glucosa  ácido pirúvico  fermentación ácido-mixta (pH 4.4)
Color rojo con el indicador rojo metilo
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Pruebas bioquímicas
Methyl Red, Voges-Proskauer (MR-VP) (IMViC):
 Mediante la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio (VP) se puede
evidenciar la presencia de productos finales neutros (Figura 9.5).
 Glucosa  ácido pirúvico  acetoina  Diacetyl + KOH +
naftol
Color rojo en presencia de 2-3 Butanediol
 Algunas bacterias son negativas para ambas pruebas.
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Pruebas bioquímicas
Decarboxylation Test:
 Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de las Enterobacterias.
 Se usan comúnmente dos aminoácidos: lisina, ornitina y arginina.
 Cuando los aminoácidos pierden el grupo carboxilo, se convierten en aminas
que incrementan el pH del medio y el indicador (bromocresol púrpura) cambia
a violeta.
 Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o
arginina al 1% y un indicador de pH (bromocresol púrpura).
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Pruebas bioquímicas
Deaminase Test (Figura 9.6):
 Las desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un
ácido carboxílico.
 Se inoculan tubos inclinados conteniendo un medio complejo y fenilalanina.
 Después de la incubación se añade una solución de cloruro férrico al 10%, el
cual reacciona con el acido y se torna oscuro.
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Pruebas bioquímicas
Utilización de citrato (IMViC) (Figura 9.7):
 Se usa para clasificar las Enterobacterias.
 Se basa en la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía
ya que el medio contiene:
 Citrato de sodio única fuente de carbono.
 Fosfato monoamónico única fuente de nitrógeno.
 El azul de bromotimol es el indicador de pH, que cambia a color azul en medio
alcalino.
 El metabolismo del citrato se realiza en aquellas bacterias poseedoras de citrato
permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico.
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Pruebas bioquímicas
DNasa:
 Las DNasas son endonucleasas que
rompen los enlaces fosfodiester del
DNA generando unidades
pequeñas.
 Algunas bacterias producen DNasas
extracelulares:
 Staphylococcus aureus
 Serratia marcescens
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Pruebas bioquímicas
DNasa:
 El medio contiene DNA al 0.2%.
 Se hace un inóculo pesado en línea recta.
 Se incuba a 35 °C y se examina a las 18-24 horas.
 Se añade HCl y se evalúa la formación de un precipitado negro.
 DNA no hidrolizado es insoluble en HCl y se precipita.
 Oligonucleótidos se disuelven en el HCl y se ve un área clara.
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Pruebas bioquímicas
DNasa:
 También se puede utilizar Agar
DNasa, el cual es un medio diferencial .
 Contiene nutrientes, DNA y verde de
metilo como indicador, el cual se une al
DNA cargado negativamente.
 Cuando el DNA se rompe, ya no se une
al verde de metilo y se aparece un halo
claro alrededor del organismo:
 Staphylococcus aureus – negativo
 Serratia marcescens – positivo
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Pruebas bioquímicas
Licuefacción de la gelatina:
 La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados
dentro de las células.
 Las bacterias secretan enzimas extracelulares que hidrolizan los polímeros y
transportan los monómeros al interior de la célula.
 La producción de proteasas, como la gelatinasa, es evaluada incorporando una
proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa.
 La placa se inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada.
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Pruebas bioquímicas
Producción de indol (IMViC):
 Detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano.
 La liberación de indol se debe a la degradación del aminoácido triptófano, un
aminoácido constituyente de muchas peptonas, mediante la enzima triptofanasa.
 Su usa un caldo de triptona, NaCl al 0.5% y el reactivo de Kovacs.
 Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir el reactivo de Kovacs al
medio, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba
será considerada positiva.
 Si da negativo a las 24 horas, se repite a las 48 horas.
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Pruebas bioquímicas
Utilización de malonato:
 Se hace para determinar la
capacidad de utilizar malonato de
sodio como fuente de carbono.
 El caldo de malonato tiene azul de
bromotimol como indicador de pH.
 Las bacterias que usan malonato
también sulfato de amonio como
fuente de N2.
 Positivo por aumento en alcalinidad
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al usar sulfato de amonio, cambia
indicador de verde a azul (Figura 910).
Pruebas bioquímicas
Motilidad:
 La motilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos.
 El movimiento se puede observar en cultivos frescos utilizando un microscopio
de luz compuesto.
 La motilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a las
corrientes en la preparación.
 Se puede hacer en medios de cultivo conteniendo agar al <4%.
 Se inocula el organismo en el centro de forma recta y se incuba a 35 °C (y a
temperatura ambiente) por 18-24 horas.
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 Se examina y se compara con en medio sin inocular.
Pruebas bioquímicas
Reducción de nitrato y nitrito:
 Se detecta una respiración anaerobia en la que usa nitrato como aceptor final de
electrones.
 Los nitratos se reducen a nitritos mediante una reductasa de nitrato y en algunas
bacterias, los nitritos se reducen a productos gaseosos (N2 y N2O) mediante
reductasa de nitrito.
 Se inoculan medios conteniendo nitrato potásico y el nitrito se detecta
añadiendo alfanalfilamina y ácido sulfanílico produciéndose un color rojo.
 Para saber si el nitrato se redujo a gas:
 Tubo Durham.
 Añadir zinc en polvo, color rojo indica presencia de nitrato.
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Pruebas bioquímicas
Oxidasa:
 La prueba de oxidasa determina la presencia del sistema de citocromo oxidasa.
 Es una prueba útil en la identificación de No-fermentadores (Pseudomonas spp.) y
Neisseria spp., los cuales son positivos.
 Permite diferenciar entre las Enterobacterias (negativos) y los No-
fermentadores (positivos).
 Hay varios métodos disponibles, incluyendo la prueba de Kovac (0.5-1% de
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina).
 Se añade una gota a un papel de filtro y se toca la colonia con
un palito de madera o algodón y se frota contra el reactivo.
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Pruebas bioquímicas
Oxidasa:
 El desarrollo de un color lavanda en
10-15 segundos se considera
positivo.
 Oxidasa positivo - Pseudomonas
aeruginosa
 Oxidasa negativo - Escherichia coli
 El reactivo también puede añadirse
directamente sobre la colonia, pero
…
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Pruebas bioquímicas
Ureasa:
 Se usa para determinar la capacidad de un organismo de usar la urea formando
dos moléculas de amoniaco por la acción del enzima ureasa.
 Las bacterias se inoculan en un medio con glucosa-peptona, urea al 2% y rojo
fenol como indicador de pH.
 La enzima hidroliza la urea (H2N-CO-NH2) y origina amonio, el cual genera un
aumento en el pH, el cual puede detectarse con el indicador.
 Es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para
diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo
tardío.
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Pruebas bioquímicas
Lysine Iron Agar (LIA) – asignación
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Pruebas bioquímicas
Sulfide-indole-motility (SIM):
 Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
 Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol
y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo.
 El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de
Erlich, para originar un compuesto de color rojo.
 Las cepas móviles pueden apreciarse por la turbidez que producen alrededor de
la punción.
 Las cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un
precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato, siempre que el
medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
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Pruebas bioquímicas
Motility-Indole-Ornithine Agar (MIO):
 Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae.
 Por su composición, es posible detectar tres reacciones en un mismo tubo:
movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.
 La movilidad se demuestra por un turbidez en el medio o por crecimiento que
se difunde más allá de la línea de inoculación.
 La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio.




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La fermentación de glucosa baja el pH y cambia el indicador a amarillo.
La acidez provee condiciones óptimas para la actividad de la enzima.
La ornitina decarboxilasa decarboxila la ornitina presente.
Se alcaliniza el medio y cambia el púrpura de bromocresol a color púrpura.
Sistemas de identificación manuales
Los sistemas de identificación comerciales e basan en:
 Reacciones basadas en pH
 Reacciones enzimáticas
 Utilización de carbono
 Detección de crecimiento bacteriano
 Detección de ácidos grasos volátiles y no-volátiles por cromatografía
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Sistemas de identificación manuales
 Normalmente se incluye una
computadora o libros con códigos
numéricos basados en el perfil
metabólico de los microorganismo.
 API (Analytical Profile Index) para
identificar Enterobacterias en el
mercado desde 1970.
 API 20E
 20 cápsulas liofilizadas en una tirilla
con sustratos basados en pH.
 Se prepara una suspensión de
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bacterias, se inocula, se incuba 1824 horas y se lee.
 Se genera un código de 7 dígitos.
 Requiere oxidasa, no incluida.
 Pruebas extras: nitrato y motilidad.
Sistemas de identificación manuales
ID Tri-Panel
 Paneles para la identificación de organismos Gram-negativos y Gram-positivos
usando pruebas bioquímicas.
 Se pueden probar hasta tres organismos en un panel.
 El panel contiene 104 microtubos con sustratos congelados y agentes
antimicrobianos para determinar susceptibilidad.
 Se utiliza un sistema computarizado para leer y analizar el panel.
 Se utilizan reacciones adicionales: catalasa y oxidasa.
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Sistemas de identificación manuales
ID Tri-Panel
 Paneles para la identificación de organismos Gram-negativos y Gram-positivos
usando pruebas bioquímicas.
 Se pueden probar hasta tres organismos en un panel.
 El panel contiene 104 microtubos con sustratos congelados y agentes
antimicrobianos para determinar susceptibilidad.
 Se utiliza un sistema computarizado para leer y analizar el panel.
 Se utilizan reacciones adicionales: catalasa y oxidasa.
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Sistemas de identificación manuales
Otros:
 Crystal E/NF (Becton Dickinson)
 RapID NS Plus (Remel)
 Microbact (Oxoid)
 Enterotube II (Becton Dickinson)
 Uni-N/F Tek (Remel)
 GN2 MicroPlate (Biolog)
Biolog tiene una de las bases de datos más grandes.
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Sistemas de identificación automatizados
 MicroScan
 Sensititre
 Vitek
 BD Phoenix 100
 Sherlock
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Resumen:
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