Estructura del ADN

Biología Molecular
Lic. Marcelo F. Goyanes
Estructura del ADN
Breve reseña histórica
Hasta casi la mitad del siglo XX una de las preguntas que mantenía ocupados a los
investigadores en el campo de la Biología Molecular y Celular era ¿Qué molécula posee
la información genética? La mirada apuntaba principalmente a dos macromoléculas: las
Proteínas y el ADN.
La molécula de ADN, por ese entonces, parecía demasiado simple para “encargarse” de
tamaña tarea, ya que estaba constituida por solo cuatro componentes. El mismo Levene
en la década del ´20 había aseverado que, como las muestras de ADN estudiadas
poseían proporciones casi iguales de las cuatro Bases nitrogenadas, el ADN debía
comportarse como un tetranucleótido, en el cual los ramilletes de a cuatro nucleótidos se
repetían a lo largo de la molécula de manera más que monótona. Una molécula tan
monótona y repetitiva no se acercaba en lo más mínimo a la idea de una verdadera
portadora de la información genética.
Fue hasta la década del ´50 que gracias a las experiencias y trabajos de Alfred D.
Hershey y su colega Martha Chase se pudo comprobar, a través de estudios realizados
con virus Bacterianos, que la información genética era portada por la molécula de
ADN.
El broche de oro lo constituye el trabajo realizado por James Watson y Francis Crick
quienes realizan el modelo del ADN que concordaba perfectamente con los hechos
conocidos y ayudaría a explicar el papel biológico de esta molécula. No nos olvidemos
que los dos jóvenes investigadores contaban ya con una suma de información más que
relevante e imprescindible para el armado del modelo. Entre los datos más importantes
con los que contaban podemos rescatar:
Se sabía que la molécula de ADN era muy grande, larga y
delgada. Compuesta por nucleótidos que contenían las bases
nitrogenadas Adenina, Timina, Citosina y Guanina.
Linus Pauling (1950) había demostrado que las cadenas de
aminoácidos que componen las proteínas están dispuestas a
menudo en forma de una hélice y se mantienen con esa
conformación gracias a las uniones puente de Hidrógeno que
se forman entre los aminoácidos de los distintos giros de la
hélice. Pauling había sugerido que la estructura del ADN
podía ser semejante a la hélice que presentaban las proteínas.
Los patrones de las fotografías del ADN, obtenidas hasta este
momento, reflejaban los giros de una hélice de grandes
dimensiones.
Erwin Chargaff analizó el ADN y confirmó que las cantidades
de las Bases Púricas eran iguales a las de las Bases
Pirimídicas. En síntesis, las cantidades de Adenina eran
iguales a las de Timina y, las de Citosina se correspondían a
las de Guanina.
Con todos estos datos, Watson y Crick intentaron construir el modelo de ADN.
Para llevar la gran cantidad de información genética el modelo debía considerar dos
aspectos fundamentales: ser heterogéneo y variado. Armaron así el modelo en hojalata
y alambre y, como quien arma un rompecabezas, encajaron cada pieza en su lugar.
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A medida que armaban el modelo, se dieron cuenta que los nucleótidos que
conformaban la molécula de ADN podían encajarse en cualquier orden. Dado que la
molécula de ADN posee miles de nucleótidos de largo, la variabilidad y la
heterogeneidad estaban aseguradas, puesto que la combinación de las bases se volvía
incalculable.
Otra de las conclusiones a las que arribaron fue que la cadena poseía una dirección, ya
que cada grupo fosfato está unido a un azúcar en la posición 5´ (el quinto carbono en el
anillo de azúcar) y al otro azúcar en la posición 3´ (el tercer carbono en el anillo del
azúcar). Así la cadena tiene un extremo 5´ y otro 3´.
Lo interesante del trabajo fue el armado de la cadena complementaria. Las Adeninas
únicamente podían aparearse con las Timinas y las Guaninas con las Citosinas. Pero,
para que esto ocurra, la dirección de las cadenas debía ser inversa. Es así como el
extremo 5´ se aparea con el 3´, vale decir que ambas cadenas son Antiparalelas.
Los estudios de Watson y Crick determinaron que la conformación tridimensional del
ADN consiste en dos cadenas enrolladas de tal manera que se constituye una doble
Hélice. Las Bases Nitrogenadas están agrupadas unas sobre otras constituyendo lo que
se conoce como Ordenamiento de Apilamiento.
Si la cadena gira conformando una hélice, debe de existir un eje de rotación. El mismo
está conformado por las desoxirribosas que están unidas entre sí por una molécula de
Fosfato constituyendo entonces un enlace 3´- 5´ fosfodiester. Este eje azúcar - fosfato se
encuentra en la parte externa de la molécula, mientras que las Bases Nitrogenadas
quedan dispuestas hacia el lado interno de la misma.
La doble hélice exige que cada una de las Bases Nitrogenadas de una cadena se aparee
en forma complementaria con la base de la otra cadena. Este apareamiento tiene lugar
mediante las uniones Puente de Hidrógeno que se forman entre las mismas. Entre las
Bases Adenina y Timina se forman dos uniones Puente de Hidrógeno, mientras que
entre la Guanina y la Citosina se establecen tres uniones de la misma naturaleza. No esta
demás aclarar que la unión entre las Bases Citosina y Guanina será, en consecuencia,
más fuerte que la que se establece entre la Adenina y la Timina.
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Figura N° 1: Estructura de una porción de la molécula de ADN. Cada nucleótido consiste en un
Grupo Fosfato, un azúcar (desoxirribosa) y una Base Nitrogenada Púrica o Pirimídica. El eje de cada
cadena esta constituido por la secuencia repetida de azúcar – fosfato. Cada grupo Fosfato está
unido al carbono 5´ de la desoxirribosa y al carbono 3´ del siguiente nucleótido. Las dos cadenas se
mantienen unidas por medio uniones Puente de Hidrógeno, que se establecen entre las bases
complementarias (A-T y C-G). Se forman tres uniones P. de H. entre las bases C y G, mientras que
entre la A y T se establecen solo dos.
Las cadenas son antiparalelas, la dirección desde el extremo 5´a 3´de una es opuesta al de la otra.
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Topología de ADN
Las cadenas de ADN pueden enrollarse una sobre otra de dos formas: en sentido horario
o en sentido antihorario. Es decir que si las cadenas giran a favor del movimiento de las
agujas del reloj diremos que lo hacen en sentido horario, de lo contrario el sentido que
adquiere el giro será denominado antihorario. Esto determina que existan dos variantes
de AND, el que se enrolla en sentido horario se denomina Right Handed ADN y el que
lo hace en forma contraria se denomina Left Handed ADN o ADN Z.
Right Handed ADN:
Esta variante de ADN a su vez puede subdividiese en dos tipos de organización: el
“ADN A” y el “ADN B”.
1. ADN A:
Las bases Nitrogenadas forman, al unirse con el eje azúcar – fosfato,
un ángulo de 20°.
Por cada vuelta de la hélice, encontraremos 11 pb (pares de bases).
Es menos frecuente que el ADN B.
2. ADN B:
Las bases nitrogenadas forman un ángulo de 90° con el eje azúcar
fosfato.
Por cada vuelta de la Hélice encontraremos 10 pb.
Es el tipo de ADN más frecuentemente encontrado.
Left Handed ADN o ADN Z:
Este tipo de ADN, como indicábamos arriba, gira en sentido antihorario. Esta
disposición en el giro hace que el ADN adquiera forma de ZIG ZAG, de ahí su nombre.
Por cada vuelta de hélice hay 12 pb.
El ADN Z se encuentra acompañado de la unión de grupos metilo (-CH3) y juega un rol
importante en la regulación de la expresión génica. Generalmente las zonas metiladas
del ADN no se transcriben, es así como la distinta disposición del ADN Z en el
genoma de una célula intervendrá en forma activa en la diferenciación de la misma.
Superenrollamiento:
La mayoría de los esquemas que podemos llegar a visualizar del ADN lo muestran
como una molécula lineal y con una estructura de doble hélice. En realidad la
conformación que adquiere en el espacio dista de ello, ya que el mismo posee una
estructura cerrada, constituyendo bucles. Esta estructura la adopta ya que le son
agregadas fuerzas adicionales que lo mantienen empaquetado.
Si además del giro que presenta (horario u antihorario) le agregamos otro giro alrededor
de su eje, obtendremos una idea más acertada de su verdadera conformación. Este giro
adicional, con el que se encuentra dispuesto en el espacio, se lo denomina
Superenrollamiento. Ahora bien, si a algo que ya posee un giro le agregamos otro, este
puede o no coincidir en su dirección con el anterior. Es así como nos veremos ante la
presencia de dos tipos de Superenrollamiento: el Positivo y el Negativo.
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Superenrollamiento Positivo:
Se presenta cuando el ADN se enrolla en el espacio en sentido horario, al igual que la
doble hélice, quedando apretado. Este tipo de Superenrollamiento se produce en vivo
sólo en condiciones especiales. Un caso típico que genera Superenrollamiento Positivo
esta dado por enzimas que rompen el ADN, lo giran y luego vuelven a unirlo. Si el giro
que realizan va a favor del sentido horario el número de pb por vuelta aumentará,
quedando la doble hélice apretada. Estas enzimas se denominan Topoisomerasas (serán
descriptas en el capítulo referido a la autoduplicación del ADN). Un caso extremo de
Superenrollamiento estaría dado en el pasaje de ADN del tipo B al ADN del tipo Z. En
este último caso, el ADN gira en sentido horario sobrepasando el sentido horario de la
hélice original.
Otro de los casos en los cuales el Superenrollamiento Positivo se hace evidente, y que
veremos más adelante, lo confiere el aumento de tensión originada por delante de la
horquilla de replicación durante el proceso de autoduplicación del ADN.
Superenrollamiento Negativo:
En este caso, el ADN gira en sentido antihorario. De esta forma, la tensión del ADN
baja y la cantidad de pb por vuelta de la hélice se hace menor. Es sumamente importante
ya que, disminuyendo la tensión de la doble hélice, se hace factible la separación de las
dos cadenas.
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Replicación del ADN
Una de las características más notables del ADN es
su capacidad de replicarse. Vale decir que el ADN
es capaz de formar copias de sí mismo. El proceso
de autoduplicación del ADN se lleva a cabo en el
período S del ciclo celular. Esta etapa es un paso
previo obligado para realizar la división celular en la
etapa M de mencionado ciclo. Los genes deben
poseer tres funciones principales, como portadores
del material hereditario:
Deben ser capaces, por medio de una replicación
fiel, de transmitir la información genética de
generación en generación.
Figura N° 2: Ciclo Celular
Deben contener la información necesaria para sintetizar todas las proteínas
fundamentales para permitir el normal desarrollo de la célula.
Deben aceptar cambios ocasionales como forma de evolución, es decir, deber
aceptar la capacidad de mutar.
La replicación permite
que el ADN sea capaz de cumplir con las funciones
anteriormente mencionadas. La réplica del material hereditario es un producto directo
de este proceso; la información para la síntesis de las proteínas está asegurada por
medio de la replicación y los errores en la replicación posibilitan y generan cambios que
pueden llevar a la evolución.
La replicación del ADN es Semiconservativa, puesto que las dos cadenas del ADN
sirven de patrón para la síntesis de las nuevas cadenas. Cada doble hélice hija, producto
del proceso de autoduplicación, tendrá una cadena recién sintetizada (nueva) y otra
cadena que, con anterioridad, formaba parte de la molécula parental.
Figura N° 3: Replicación Semiconservativa del ADN. Obsérvese en la figura que las
cadenas del ADN parental se conservan y pasan a formar parte de las cadenas hijas.
En el esquema, las cadenas nuevas se visualizan en negrita.
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La replicación se llevará a cabo en el núcleo de la célula eucariota, e intervendrán una
dotación de enzimas que se encargarán de abrir la doble hélice, incorporar los
nucleótidos y disminuir la tensión que se genere por delante de ella.
Enzimología de la Replicación:
Con el fin de esclarecer el proceso de replicación, describiremos primero todas las
enzimas que intervienen y luego desarrollaremos el proceso en su conjunto.
ADN polimerasa: Es la principal enzima de este proceso. Ella es capaz de sintetizar
nuevas cadenas de ADN , a partir de una hebra patrón y las unidades estructurales
correspondientes (desoxirribonucleótidos).
Los desoxirribonucleótidos, para ser incorporados por esta, deben estar
trifosfatados. Es decir que se necesitarán dATPs, dGTPs, dTTPs y dCTPs, para
poder sintetizar las nuevas cadenas de ADN.
Otra de las características principales de esta enzima, es que polimerizará los
nucleótidos en la dirección 5´a 3´. Como consecuencia de esto, la dirección en la
cual leera la cadena patrón de ADN será de 3´a 5´ .
Un rasgo a tener en cuenta es que la ADN polimerasa NO puede iniciar su síntesis
sin la existrencia de un cebador de ARN.
No solamente polimeriza los nucleótidos, sino que se ha comprobado que es capaz
de corregir los posibles errores que se cometan durante la autoduplicación.
Helicasas: Son las enzimas encargadas de separar las dos hebras del ADN. Estas
enzimas son responsables de la ruptura de las uniones puente de Hidrógeno que se
establecen entre las bases de las dos cadenas del ADN. Para poder separar las dos
hebras del ADN se necesitará energía, que es obtenida de la hidrólisis del ATP. Por
cada dos pares de bases que separan, se gastan dos moléculas de ATP.
Proteínas estabilizadoras de la cadena: Una vez que las cadenas del ADN son
separadas, la estabilidad de las mismas disminuye considerablemente. El ADN
tiende a reasociarse y, son estas proteínas quienes impiden que el ADN vuelva a su
conformación inicial. Su presencia es fundamental para mantener las cadenas
estiradas.
Topoisomerasas: Al producirse la duplicación, el ADN adquiere cierto grado de
superenrollamiento. Imaginemos que la molécula de ADN es como una bandita
elástica, a la cual le conferimos vueltas alrededor de su eje longitudinal. Si ahora
tomamos uno de sus extremos y separamos cada una de sus partes veremos que, por
delante de donde se produce la separación, la bandita adquirirá una mayor tensión,
plegándose sobre sí misma. Lo mismo ocurre con la molécula de ADN, si la
Helicasa separa las cadenas delante de donde se está produciendo la replicación
aumentará, en forma más que considerable, la tensión de la molécula. Para evitar
esto, las topoisomerasas cortan la doble hélice, rotan el ADN y vuelven a unirlo,
evitando así que aumente la tensión por delante de la horquilla de replicación.
En consecuencia, encontraremos a las Topoisomerasas por delante del lugar donde
se está produciendo la duplicación.
ARN polimerasa o Primasa: Esta enzima es la que sintetiza el cebador, un primordio
de ARN necesario para que la ADN polimerasa pueda iniciar la síntesis de las
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nuevas cadenas. El cebador es una pequeña porción de ARN de 10 a 12
ribonucleótidos de largo que se mantendrá unido a la cadena de ADN molde hasta
que sea removido.
Mecanismo de la Replicación:
Ya dijimos que la duplicación se llevará a cabo durante el período S del ciclo celular y
que es un proceso fundamental para que la célula pueda dividirse.
El ADN actuará como patrón, ya que la ADN polimerasa agregará los nucleótidos de las
nuevas cadenas por complementariedad de bases. El lugar donde transcurre la
replicación se denomina Horquilla de Replicación, esta estructura tiene forma de “Y”, y
es la zona donde se sintetiza el ADN para formar las dos moléculas hijas (Ver figuras
Nº 4 y 5). Las horquillas de replicación se originan en una estructura denominada
Burbuja de Replicación, una región en la que las cadenas de la hélice de ADN se
separan una de otra, actuando como patrón para la síntesis de las nuevas cadenas de
ADN. Las zonas donde se producen las Burbujas de replicación no son aleatorias, se ha
demostrado que existen secuencias de bases que indican los lugares precisos donde la
replicación ha de comenzar. Cada Burbuja de Replicación posee dos Horquillas de
Replicación, una de las cuales se desplaza hacia la derecha y otra hacia la izquierda.
Este proceso necesita, en primera instancia, que las dos cadenas del ADN se separen.
Para esto, las Helicasas se unirán a la cadena de ADN e hidrolizarán las uniones Puente
de Hidrógeno que las mantienen unidas. La consecuente apertura de la doble hélice hace
que las cadenas simples adquieran inestabilidad, esta es compensada por la unión de las
proteínas estabilizadoras de la cadena simple.
La ADN polimerasa no es capaz de iniciar la síntesis a partir de los
desoxirribonucleótidos libres, por lo tanto necesitará que la Primasa sintetice en forma
previa el Primer o Cebador. Una vez incorporado el Cebador, la ADN polimerasa
incorporará los nucleótidos en forma complementaria a las bases de la cadena patrón.
Una vez que la Horquilla
avance, la tensión por
delante
de
la
misma
aumentará, para evitar esto
las Topoisomerasas cortarán
la doble hélice, la rotarán y
volverán a unirla.
Debido a la orientación
antiparalela del ADN, una de
las cadenas de la horquilla de
replicación
quedará
en
sentido 3´a 5´, por lo cual la
ADN polimerasa podrá
trabajar en forma continua
(recordemos que esta enzima
Figura N° 4: Horquilla de replicación. Síntesis de la
leía en dirección 3´a 5´y
cadena continua y de la discontinua.
polimerizaba en dirección
5´a 3´).
En cambio, la otra cadena de la Horquilla, quedará orientada en la dirección inversa
(5´a 3´), por lo cual en cada Horquilla de Replicación deberán actuar al menos dos
ADN polimerasas. Una de ellas podrá actuar en forma contínua, puesto que, a medida
que se abra la doble hélice se encontrará con el extremo 3´ de la cadena patrón,
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pudiendo así incorporar el nucleótido correspondiente. En cambio, la otra ADN
polimerasa se encontrará, cuando la apertura de la doble hélice avance, con el extremo
5’ de la cadena patrón, por lo cual será necesario incorporar otro cebador de ARN para
poder continuar la síntesis.
En resumen: cuando la cadena patrón presente la dirección 3´a 5´, la síntesis se
realizará en forma Continua. Por el contrario, cuando la cadena patrón
. presente la dirección 5´a 3´, la síntesis se realizará en forma Discontinua.
Una de las consecuencias de la síntesis Discontinua es que quedarán pequeños
fragmentos de ADN, de unos 100 a 200 pb, intercalados con los cebadores. A estas
porciones de ADN se los denomina Fragmentos de Okazaki, en honor al científico que
los describió por primera vez.
En el caso de la cadena conductora (la que se polimeriza en forma continua) es
necesario la presencia de un solo Cebador, en cambio, en la cadena retardada (la que se
polimeriza en forma discontinua) se necesita más de un Primer.
Luego de terminada la síntesis de ambas cadenas, los Cebadores son removidos por una
enzima y la ADN polimerasa agrega los nucleótidos faltantes. La enzima denominada
Ligasa, se encarga de unir ambos extremos del ADN.
Figura N° 5: Proceso de Replicación del ADN. Obsérvese la Horquilla de Replicación en la
cual se encuentran actuando las dos ADN polimerasas. La cadena con dirección 3´a 5´ se
replica en forma continua y la de dirección opuesta lo hace en forma discontinua. La
Primasa sintetiza el Cebador. La Topoisomerasa actúa en forma adelantada a la Horquilla
de Replicación, disminuyendo el superenrollamiento positivo.
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Energética de la Replicación:
Ya hemos mencionado que las unidades estructurales utilizadas en este proceso son los
desoxirribonucleótidos. También se dijo que los mismos debían encontrarse
trifosfatados para poder ser utilizados por la ADN polimerasa. Es así como se utilizarán
Desoxiadenina trifosfato (dATP), Desoxiguanina trifosfato (dGTP), Desoxicitosina
trifosfato (dCTP) y Desoxitimina trifosfato (dTTP). Antes de incorporar el nucleótido a
la cadena patrón, la ADN polimerasa escinde dos de los tres grupos fosfato de los
mismos, quedando así monofosfatados y liberándose por cada uno un PPi. Esta ruptura
de los enlaces de alta energía que mantenía unidos a los P libera energía, que es
utilizada para impulsar las reacciones catalizadas por la ADN polimerasa.
Replicación en Células Procariotas y Eucariotas:
La gran mayoría de la información con la que contamos, en materia de la replicación del
ADN, se obtuvo a partir de investigaciones realizadas en organismos Procariotas. Sin
embargo, no hay diferencias sustanciales entre ambos procesos. La principal diferencia
radica en que las células Procariotas replican el ADN en forma desnuda, puesto que en
las células Eucariotas el ADN se encuentra es estado de Cromatina. Esta Cromatina
esta básicamente formada por ADN y proteínas básicas denominadas Histonas. Como
veremos más adelante, las Histonas se unen al ADN y ayudan al empaquetamiento del
mismo. Las proteínas nucleares frenan el accionar de la ADN polimerasa, por lo tanto,
la velocidad de replicación en las células Eucariotas es diez veces menor que en las
células Procariotas. Basándose en esto, también es posible explicar la diferencia entre
la longitud de los Fragmentos de Okazaki. En las células Procariotas, los segmentos de
Okazaki poseen una longitud de 1000 a 2000 pb en cambio, en las células Eucariotas,
los Fragmentos adquieren longitudes de apenas 100 a 200 pb. Una de las explicaciones
posibles es la disposición de las histonas a lo largo de la molécula de ADN, esta
longitud de 200 pb coincide con los tramos de ADN que quedan desprovistos de
mencionadas proteínas.
Figura N° 6: Replicación del ADN.
La figura muestra el proceso por el
cual se inicia la burbuja de
replicación. A) La replicación se
inicia en una secuencia de 300 pb,
que indican el origen de la misma. B)
La
doble
hélice
se
abre,
conformando
la
burbuja
de
Replicación, la Primasa sintetiza el
Cebador. C) Una vez sintetizado el
cebador,
la
ADN
polimerasa
comienza a sintetizar la nueva
cadena de ADN. D) Se originan dos
Horquillas de replicación completas,
una de las cuales se desplaza hacia
la izquierda con la cadena continua
en la parte superior y la retrasada en
la parte inferior, y la otra hacia la
derecha, con la cadena continua en
la parte inferior y la cadena
retrasada en la parte superior.