51 3.3 TAXONOMÍA DEL AGENTE CAUSAL DEL

ANTECEDENTES HISTÓRICOS, DIAGNÓSTICO Y EPIDEMIOLOGÍA
3.3 TAXONOMÍA DEL AGENTE CAUSAL DEL CARBÓN DE LA PAPA
Gastón Muñoz V.
Rafael Galdames G.
Orlando Andrade V.
Al agente causal del carbón de la papa se le considera integrante de un grupo de hongos
particular denominados genéricamente como carbones ("smuts" en inglés). El término
carbones delimita la organización y estrategia de vida de un grupo de hongos y no
corresponde a un concepto taxonómico. A pesar que el concepto fue acuñado en
referencia a parásitos de plantas, muchos de estos hongos causantes de carbones presentan
fases saprofíticas.
Figura 3.20 Esquema del ciclo de vida de los carbones (Ustilaginomycetes).
En la figura 3.20 se presenta un esquema del ciclo de vida de un carbón. En estos hongos
el cuerpo o soma está compuesto de células haploides y micelio dicariótico. El primero,
en algunas especies, puede producir crecimiento levaduriforme, mientras que el micelio
dicariótico es usualmente parasítico y casi sin excepción sobre especies angiospermas.
El micelio es ramificado, a menudo desarrolla haustorios dentro de las células del
hospedero y normalmente no induce síntomas de su presencia en las plantas. Esto último
ocurre después de la formación de las esporas (clamidosporas, teliosporas o ustilosporas),
las que representan los órganos de diseminación y resistencia. Las esporas se forman
en una cavidad del hospedero denominada soro, constituido por tejido del hospedero,
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una masa de esporas y en algunos casos, células de tejido fúngico modificado. Los
carbones producen una amplia variedad de síntomas en sus hospederos, desarrollando
soros de aspecto variable en diferentes órganos: raíces, tallos, hojas, inflorescencias,
flores, anteras, ovarios. Las esporas pueden ser simples, en pares o agregadas en grupos
variables (aglomerado de esporas o "spore-balls") y más o menos persistentes pudiendo
germinar e infectar a sus hospederos después de 13-15 años, en el caso de algunos
ustilaginomycetes. La germinación de las esporas diploides produce un promicelio
(basidio o ustidio), que luego de divisiones meióticas del núcleo genera esporidias
haploides (basidiosporas) u, ocasionalmente, hifas haploides. Posteriormente, ocurre
una fusión celular (plasmogamia), restaurando el estado dicariótico generándose el
micelio parasítico. La infección de los carbones puede ser localizada, restringida a un
cierto órgano o parte del hospedero o generalizado (sistémico). Las plantas infectadas
usualmente no son distinguibles de las sanas hasta que se forman las esporas.
3.3.1 Sistema de clasificación de los carbones
Se estima que existirían alrededor de 1200 especies de hongos considerados carbones,
distribuidos en alrededor de 50 géneros. El sistema de clasificación de los carbones ha
ido variando con el tiempo tomando en cuenta diversos aspectos o caracteres que
permiten la diferenciación o agrupamiento de los mismos. Inicialmente, se consideraban
características identificables visualmente tales como: color, tamaño, forma y ornamentación
de las esporas, esterilidad de las células, estructura de los aglomerados de esporas,
estructura del soro y tipo de germinación de las esporas. El esquema de clasificación
actualmente aceptado fue propuesto por Bauer, Oberwinkler y Vánky en 1997 (Fig.
3.21) y se ha desarrollado en base a caracteres ultra estructurales tales como interacciones
celulares con el hospedero, características del poro septal, modalidad de desarrollo de
las esporas y forma de las paredes de las mismas. De este modo, se considera que los
carbones han evolucionado en dos clases de la división Basidiomycota: Ustilaginomycetes
y Urediniomycetes, siendo la primera la clase donde se presenta el mayor número de
hongos causantes de carbones.
En la actualidad y con el objeto de comprender mejor la diversidad de especies, no sólo
se toma en cuenta la taxonomía, sino también información filogenética, ecológica e
incluso paleontológica. En este contexto la filogenia molecular o la reconstrucción de
la historia evolutiva de los individuos basados en las diferencias de la secuencia nucleotídica de determinados genes, ha contribuido a corroborar los sistemas de clasificación
propuestos en bases a caracteres fenotípicos y, a su vez, han propuesto nuevas relaciones
en algunas especies.
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Figura 3.21 Esquema del sistema de clasificación taxonómica de hongos que involucra a los carbones hasta llegar a la familia Glomosporiaceae que agrupa al género Thecaphora. Entre paréntesis
se mencionan géneros conocidos de hongos clasificados en esos grupos (adaptado de Bauer,
Oberwinkler y Vánky, 1997; y Bauer, Begerow, Oberwinkler, Piepenbring y Berbee, 2001).
Dentro de las secuencias utilizadas para analizar las relaciones filogenéticas entre los
Ustilaginomycetes se encuentra la región 5' del gen nuclear de la subunidad ribosomal
grande (LSU). Dicha secuencia presenta regiones conservadas entre los hongos. Esto ha
permitido diseñar partidores de PCR, tales como los indicados en la Fig. 3.22A, que
permiten amplificar dicha región desde prácticamente cualquier hongo (Fig. 3.22B). Al
mismo tiempo, la región LSU presenta variaciones que permiten establecer la lejanía o
proximidad evolutiva con otros hongos. Una vez amplificado, el fragmento es secuenciado
para obtener el orden de las bases nucleotídicas del mismo (Fig. 3.22C). La secuencia
es entonces utilizada en el análisis filogenético, el que nos describe la historia evolutiva
que tienen los organismos analizados. Para esto, inicialmente se establece un alineamiento
de las secuencias de los individuos incluidos en el estudio, que evidencian zonas de
la secuencia donde hay similitudes y diferencias respecto al resto de las analizadas. En
base a esta comparación se calculan las distancias genéticas entre ellos, lo cual se
representa finalmente a través de un gráfico o árbol filogenético. En el ejemplo de la
Fig. 3.22D, la posición de cada individuo está relacionada con el resto en base a una
distancia evolutiva. Así, los individuos I2 e I3 forman un grupo independiente, diferente
pero relacionado con I1. Estos tres, a su vez, son diferentes estando menos relacionados
con I4.
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Figura 3.22 Región genómica y etapas involucradas en el análisis filogenético de hongos
Ustilaginomycetes. A. Estructura de los genes nucleares que codifican proteínas de las unidades
ribosomales, SSU unidad ribosomal pequeña; ITS, región espaciadora interna transcrita; LSU;
subunidad ribosomal mayor; IGS, región espaciadora intergénica. NL1 y NL2 son los partidores
que amplifican parte de la región 5' de LSU utilizada en el análisis. B. Separación electroforética
de los productos de la amplificación de PCR utilizando los partidores NL1 y NL2 de cuatro
individuos. La flecha indica la migración del fragmento de la región LSU obtenido. C. Ejemplo
de la obtención de la secuencia nucleotídica de la banda amplificada y análisis de comparación
mediante Blast. D. Ejemplo de un dendograma producto del análisis filogenético el cual se realiza
utilizando los programas ClustalX y MEGA2.1.
Los análisis filogenéticos basados en la región LSU han contribuido a establecer las
relaciones evolutivas entre los Ustilaginomycetes. El ordenamiento obtenido mediante
esta vía ha sustentado, para la gran mayoría de las especies, el actual sistema de
clasificación propuesto para los Ustilaginomycetes (Fig. 3.21).
En el sistema actual, el género Thecaphora forma parte de la familia Glomosporiaceae,
el que se ubica en el orden de los Ustilaginales, subclase Ustilaginomycetidae (Fig. 3.21)
posición que comparte con los géneros Glomosporium y Tothiela. La familia Glomosporiaceae es un buen ejemplo de la dinámica que ocurre en las clasificaciones. Esta
familia agrupa los géneros Thecaphora, Sorosporium y Glomosporium ya que los
antecedentes disponibles señalaban que los tres géneros estaban relacionados entre si,
sin grandes diferencias morfológicas. En 1997, Sorosporium saponariae fue incorporado
al género Thecaphora, renombrándolo como T. saponariae, mientras que en 1994
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Glomosporium amaranthi fue redefinido como T. amaranthi. En todo caso, se considera
que el género Thecaphora no representa un grupo naturalmente homogéneo, puesto
que la forma de germinación es altamente variable entre las especies.
3.3.2 Estudios para establecer la posición taxonómica del agente causal del Carbón
de la Papa
Hasta el año 2001, la posición taxonómica del fitopatógeno no era clara. La primera
descripción del agente causal de la enfermedad fue realizada por Barrus y Muller en
1943 y al año siguiente, Barrus describió el hongo denominándolo como Thecaphora
solani Barrus. Las características más relevantes descritas estaban relacionadas con las
esporas, las que formaban agregados firmes de 2 a 8 esporas, de aspecto rugoso en su
superficie, color café oscuro y aspecto polvoriento. Estas características son propias del
género Thecaphora, cuyo representante tipo es la especie T. seminis-convolvuli
(Figs. 3.23C y D). Sin embargo, se omitió una descripción de las características del hongo
en latín, formalidad fundamental para revindicar la aceptación de una nueva especie,
lo que significó a los autores que se invalidara la denominación propuesta. En 1972,
O'Brien y Thirumalachar reexaminaron el hongo describiendo diferencias con respecto
a otras especies descritas hasta ese entonces para el género Thecaphora, particularmente
el desarrollo del soro locular y la facilidad de separar los agregados de esporas. Basado
en dichas diferencias propusieron un nuevo género Angiosorus solani Thirum & O'Brien,
cumpliendo con la descripción formal en latín. No obstante, un carácter importante
para establecer taxonómicamente el género, como es el modo de germinación de las
esporas, no fue descrito en ninguno de los trabajos.
Posteriormente en 1988, Mordue y Vanky analizaron las descripciones sobre el fitopatógeno resaltando el hecho que Angiosorus solani no presentaba características
diferenciales con otras Thecaphora. Sin embargo, no existían a esa fecha nuevos estudios
que ayudaran a esclarecer esta situación. El año 2001 se inició en el Centro de Investigación
INIA-Carillanca, Temuco, Chile, un trabajo de investigación que permitiera aportar
nuevas evidencias con respecto a la posición taxonómica del fitopatógeno.
3.3.3 Análisis morfológicos y estructurales
Los aspectos morfológicos de las teliosporas aisladas de tumores y agallas de la zona
norte y sur tales como color, disposición y tamaño de las teliosporas concordaban con
lo descrito previamente siendo similar a lo reportado para otras especies de Thecaphora
(Figs. 3.23A, B). Sin embargo, se constató que las teliosporas no podían ser desagregadas.
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De hecho, la adhesión parece ser bastante fuerte ya que una suspensión de teliosporas
agitada a alta velocidad en presencia de perlas de vidrio no logra la liberación de las
ustilosporas. Tampoco se logra tal separación cuando se ejerce presión sobre teliosporas
dispuestas sobre dos portaobjetos. Ambos hechos están de acuerdo con lo descrito por
Barrus.
El análisis ultraestructural de la superficie de las teliosporas realizado mediante microscopia
de barrido mostró una superficie rugosa y la presencia de una pared divisoria entre las
ustilosporas (Fig. 3.23B). Tales características están presentes en T. seminis-convolvuli
(Fig. 3.23D) evidenciándose una relación con el género Thecaphora.
Una característica importante para la clasificación de los carbones es el desarrollo del
proceso germinativo. Para estudiar esto, las teliosporas fueron sembradas en placas de
agar sólo con agua o con medio nutritivo malta-levadura y observadas bajo microscopio
para detectar la aparición de las estructuras germinativas. En la mayoría de las veces,
el hongo en estudio desarrolló micelio septado (Fig. 3.24 A y B) similar a lo descrito
para T. seminis-convolvuli (Fig. 3.24C).
Figura 3.23 Comparación morfológica y estructural de teliosporas de T. solani (A y B) y T. seminisconvolvuli. (C y D). A y C muestran el aspecto al microscopio óptico de aglomerados de teliosporas,
mientras que B y D muestra el aspecto de las superficie de las mismas visto mediante microscopia
electrónica de barrido. (Figuras C y D reproducidas de: K. Vánky. 1998. Mycol. Res. 102(5):513-526)
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Figura 3.24 Comparación del proceso germinativo observado en teliosporas de T. solani (A y B)
y T. seminis-convolvuli (C). (Figura C reproducida de: M. Woronin. 1881. Naturf. Ges. 12:559-587).
3.3.4 Análisis filogenético basados en la región LSU
La posibilidad de obtener cultivos puros del hongo en laboratorio permitió obtener
biomasa desde donde se extrajo ADN genómico. A partir de este ADN se pudo amplificar
la secuencia LSU y realizar un análisis filogenético tal como se describe en la Fig. 3.22.
De este modo, utilizando los aislamientos indicados en el Cuadro 3.2 y los partidores
NL1 y NL4 (Fig. 3.22A) fue amplificado un fragmento de la región 5` LSU mediante
PCR. Para todos los aislados se amplificó un sólo fragmento de ADN de alrededor de
660 pb (pares de bases). Cada fragmento fue clonado y secuenciado, verificándose que
todos ellos tenían la misma secuencia nucleotídica. Esto indica que todos los aislamientos
analizados, colectados de diversos lugares, hospederos e incluso tipo de tejido fúngico
(Cuadro 3.2), corresponden al mismo hongo. La secuencia obtenida fue comparada en
la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) usando el
algoritmo Blast, encontrándose que presentaba homología con la misma región ribosomal
de otros hongos Ustilaginomycetes. La similitud más alta se obtuvo con las secuencias
de las únicas tres especies de Thecaphora cuya región LSU es conocida (T. amaranthi,
T. saponariae y T. seminis-convolvuli). Esto indica una estrecha relación genética con
dicho género.
Para realizar el análisis filogenético, la secuencia obtenida fue alineada con secuencias
LSU de hongos Ustilaginomycetes y Exobasidiomycetes (indicadas en la Fig. 3.25)
utilizando el programa ClustalX. Basado en este alineamiento, el análisis filogenético
se realizó mediante el método de "neighbor-joining" usando el programa MEGA2.1
resultando en un dendograma cuya topología se muestra en la Fig. 3.25. Este resultado
muestra claramente que T. solani se agrupa junto a las otras especies de Thecaphora
para las cuales se conoce la secuencia LSU, evidenciando definitivamente una estrecha
relación genética con dicho género.
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Por otro lado, es importante mencionar que el análisis filogenético muestra al género
Thecaphora más cercano al orden de los Urocistales y alejado de los Ustilaginales. Esto
se contrapone a lo establecido en el actual sistema de clasificación basado en caracteres
ultra estructurales donde Thecaphora, como miembro de la familia Glomosporiaceae,
es parte del orden Ustilaginales (Fig. 3.21). Es necesario incorporar más secuencias de
otros miembros de la familia para clarificar esta discrepancia entre el análisis taxonómico
y el filogenético. Por lo tanto y por el momento, se valida lo descrito en la Fig. 3.21.
Cuadro 3.2 Aislamientos de Thecaphora solani utilizados para amplificar la región LSU
para análisis filogenéticos.
Aislamiento
Tipo celular
Hospedero
Región
Ts-5
Ts-15
Ts-16
Ts-21
Ts-21
Ts-22
Ts-23
teliosporas
micelio
micelio
teliosporas
micelio
teliosporas
teliosporas
S. tuberosum
S. tuberosum
S. tuberosum
S. tuberosum
IV
IV
VIII
IX
Datura stramonium1
Solanum furcatum2
IV
IV
1: chamico; 2: tomatillo.
Figura 3.25 Dendograma del análisis filogenético basado en al región LSU de 26 secuencias de
LSU rDNA correspondientes a hongos ustilaginomicetes. En cada nodo se presentan los valores
de bootstrap mayores a 50%, lo cual indica que tal nodo es significativo. La barra indica los
cambios esperados por sitio.
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CONCLUSIONES
Los estudios realizados han contribuido a establecer la real posición taxonómica del
agente causal del carbón de la papa. Los datos aportados muestran que el fitopatógeno
presenta similitudes morfológicas y ultra estructurales con el género Thecaphora. Esta
relación está sólidamente respaldada por los análisis filogenéticos basados en la región
LSU. Por lo tanto, la descripción inicial de Barrus estaría correcta y el patógeno debiera
ser llamado T. solani Barrus.
Finalmente, hay que hacer notar que T. solani es la única especie del género Thecaphora
capaz de desarrollarse en la zona radical de su hospedero. Así, esta especie presenta
características fitopatológicas propias, cuyo mecanismo de acción es aún desconocido.
El poder elucidar este mecanismo aportará a una mejor comprensión de la enfermedad
y por ende a elaborar mejores estrategias de control.
LITERATURA CONSULTADA
Barrus, M. F. 1944. A Thecaphora smut on potatoes. Phytopathology 34:712-714.
Barrus, M. F., and A. Muller. 1943. An Andean disease of potato tubers. Phytopathology
33:1086-1089.
Bauer, R., D. Begerow, F. Oberwinkler, M. Piepenbring, and M.L. Berbee. 2001. In
McLaughlin, McLaughlin, Lemke (eds.) The Mycota p. 57-83. VII Part B.
Systematics and Evolution.. Springer-Verlag, Belin Heidelberg. Alemania.
Bauer, R., F. ,Oberwinkler, and K. Vánky. 1997. Ultrastructural markers and systematics
in smut fungi and allied taxa. Can. J. Bot. 75:1273-1314.
Begerow, D., R. Bauer, and F. Oberwinkler. 1997. Phylogenetic studies on nuclear
large subunit ribosomal DNA sequences of smut fungi and related taxa. Can.
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Mordue, J. E. 1988. Thecaphora solani. CMI descriptions of pathogenic fungi and bacteria
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Piepenbring, M. and Bauer, R. 1995. Noteworthy germinations of some Costa Rican
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Vánky, K. 1988. Taxonomical studies on ustilaginales III. Mycotaxon 69: 93-115.
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