Determinación molecular de las fuentes alimenticias de Lutzomyia

Determinación molecular de las fuentes alimenticias de Lutzomyia spp. (Diptera:
Psychodidae) asociadas a casos de Leishmaniasis Cutánea en el departamento
de Sucre, Caribe Colombiano
Luís Enrique Paternina Tuirán, B.Sc.
Maestría en Ciencias – Entomología, Facultad de Ciencias
Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín
2012
Determinación molecular de las fuentes alimenticias de Lutzomyia spp. (Diptera:
Psychodidae) asociadas a casos de Leishmaniasis Cutánea en el departamento
de Sucre, Caribe Colombiano
Estudiante:
Luís Enrique Paternina Tuirán, B.Sc.
Director:
Sandra Uribe Soto, M.Sc., Ph.D.
Codirector:
Eduar Bejarano Martínez, M.Sc.
Maestría en Ciencias – Entomología, Facultad de Ciencias
Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín
2012
TESIS PARA ASPIRAR AL TITULO DE MAGÍSTER EN CIENCIAS - ENTOMOLOGÍA
DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLÍN.
DEDICATORIA
Esta obra, producto de un trabajo arduo y honesto la dedico a mis padres, Emilce y Luís
Enrique, la fuente de mis fortalezas y mis debilidades, por enseñarme el valor de la
familia, la palabra y las buenas acciones.
A la memoria de mi abuela, Lina Flor Arroyo, por su apoyo incondicional y su amor...
Cada día la llevo en mis pensamientos y mis oraciones.
AGRADECIMIENTOS
A Dios, en quien todo lo podemos.
A mis padres, a mis hermanas y mis sobrinas (mis angelitos) por todo el apoyo y amor que me
han brindado en esta y en mil otras oportunidades.
A los profesores y compañeros del posgrado en Ciencias-Entomología, que con sus consejos y
enseñanzas han permitido formarme académica y personalmente.
A mis amigos y compañeros del Grupo de Investigaciones en Sistemática Molecular de la
Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, por la confianza y los consejos en todo
momento.
A mis amigos y compañeros del Grupo de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de
Sucre, por su confianza y su apoyo, sin ellos este trabajo no hubiese sido posible.
A mi novia, Naty, por su apoyo incondicional y su amor, por mostrarme que el mundo tiene otro
rostro, por ser mí musa.
A la Dra. Sandra Inés Uribe Soto, por el voto de confianza al apoyarme en mi trayectoria
académica y al ser mi guía en este logro.
Al Dr. Eduar Elías Bejarano Martínez, mi mentor y amigo, por creer en mis aptitudes y
enseñarme que en el quehacer científico la voluntad, la dedicación y los buenos principios son
fundamentales.
A COLCIENCIAS y a la Fundación para la Promoción de la Investigación y la Tecnología (FPIT)
del Banco de la República de Colombia, por la financiación de este trabajo.
TABLA DE CONTENIDO
1.
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 11
2.
ESTADO DEL ARTE ........................................................................................................14
3.
2.1
Leishmaniasis en el Mundo y en Colombia ..................................................................14
2.2
El género Leishmania ..................................................................................................16
2.3
Vectores de Leishmaniasis ..........................................................................................17
2.4
Los Reservorios de Leishmania ...................................................................................19
2.5
Fuentes alimenticias de Flebotomíneos .......................................................................21
2.6
Aspectos Desconocidos en los Ciclos de Transmisión de Leishmania .........................24
OBJETIVOS .....................................................................................................................26
3.1
Objetivo general...........................................................................................................26
3.2
Objetivos específicos ...................................................................................................26
4.
HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN ....................................................................................27
5.
METODOLOGÍA...............................................................................................................28
5.1
Área de Estudio ...........................................................................................................28
5.2
Métodos de Captura de Insectos Flebotomíneos .........................................................30
5.3
Procesamiento y Determinación Taxonómica de Flebotomíneos .................................32
5.4
Extracción de ADN total ...............................................................................................32
5.5
Amplificación de ADN de Fuentes Alimenticias mediante PCR ....................................33
5.5.1
Amplificación de ADN de vertebrados a partir de Lutzomyia spp.......................34
5.5.2
Amplificación de ADN de mamíferos a partir de Lutzomyia spp.........................34
5.6
Electroforesis de ADN en gel de Agarosa ....................................................................35
5.7
Secuenciación de ADN y Análisis Genético .................................................................36
5.8
Análisis de Datos .........................................................................................................37
6.
RESULTADOS .................................................................................................................39
6.1
Fauna flebotomínea de focos de leishmaniasis cutánea en Sucre ...............................39
6.2
Evaluación del marcador genético PNOC para analizar fuentes alimenticias...............45
6.3
Determinación de fuentes alimenticias de flebotomíneos .............................................50
7.
DISCUSIÓN......................................................................................................................58
7.1
Fauna flebotomínea de focos de leishmaniasis cutánea en Sucre ...............................58
7.2
Evaluación del marcador genético PNOC para analizar fuentes alimenticias ...............60
7.3
Fuentes alimenticias de los flebotomíneos...................................................................62
8.
CONCLUSIONES .............................................................................................................67
9.
RECOMENDACIONES .....................................................................................................69
10.
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................70
RESUMEN
La leishmaniasis en Colombia es considerada un problema de salud pública debido al gran
número de casos que se registra anualmente y que se aproxima a los 15.000, aunque se
reconoce un fenómeno de subregistro. A esta situación se suma la dificultad que representa
para el control de la enfermedad, el desconocimiento de algunos aspectos relacionados con el
control vectorial, puesto que en muchas zonas endémicas se desconocen tanto las especies
vectoras como los reservorios de los parásitos del género Leishmania que causan la
enfermedad. En el presente trabajo se realizó una aproximación a los potenciales reservorios de
Leishmania en un área de transmisión en el departamento de Sucre, a través del estudio
molecular para identificar las fuentes alimenticias de flebotomíneos presentes en zonas con
casos de leishmaniasis cutánea en Sucre.
Los resultados del trabajo muestran que la fauna de cordados que constituye una fuente
alimenticia frecuente para los flebotomíneos en las àreas donde se registraron casos de
leishmaniasis cutánea es alta, además, varias de las especies identificadas a partir de los
flebotomíneos son consideradas como reservorios importantes de parásitos en Latinoamérica,
como es el caso de Proechimys guyanensis y Tamandua mexicana, mientras que otros taxa
incluyen animales domésticos con posible participación en los ciclos de transmisión de
leishmaniasis mediada por Lutzomyia evansi, debido a la alta frecuencia con que se encontró
que esta especie se alimenta de ellos, estos son: Bos taurus y Equus asinus. Por otra parte, se
identificó a una especie de reptil como fuente alimenticia de Lutzomyia micropyga y se revaluó
el comportamiento alimenticio de Lutzomyia c. cayennensis que se encontró alimentada con
Equus caballus y Proechimys guyanensis.
Los análisis descriptivos y estadísticos realizados indican la necesidad de evaluar
sistemáticamente animales domésticos como potenciales reservorios de parásitos en el
departamento de Sucre, asi como la realización de estudios similares a mayor escala para
establecer la existencia de preferencias tróficas en las diferentes especies flebotomíneas.
ABSTRACT
Leishmaniasis in Colombia is considered a public health problem due to the large number of
cases recorded annually and approaching the 15.000, although the underreported cases
phenomenon is recognized. In addition to the difficulties for diseases control, the lack of
information about important aspects related to vector disease control, because in endemic areas
remains unknown both, the diseases vectors and reservoirs of Leishmania parasites those
cause disease. In this work we intend to approach to the potential Leishmania reservoirs through
molecular studies of bloodmeal sources of phlebotomine sandflies in areas with cases of
cutaneous leishmaniasis in Sucre.
The results of the study show that chordates fauna associated with cases of cutaneous
leishmaniasis in Sucre as blood source for sandflies is high, furthermore, several of these
species are considered reservoirs of Leishmania parasites in different regions of Latin America,
such as Proechimys guyanensis and Tamandua mexicana, while other taxa are domestic
animals with a possible rol in leishmaniasis transmission cycles mediated by Lutzomyia evansi
because of the high frequency which this phlebotomine specie feed on them, these are: Equus
asinus and Bos taurus. On the other hand, a reptile specie was identified as a blood source for
Lutzomyia micropyga and was revalued the feeding behavior of Lutzomyia c. cayennensis that
fed on Equus caballus and Proechimys guyanensis.
The descriptive and statistical analysis carried out indicate the need to systematically assess
domestic animals as potential reservoirs of parasites in Sucre, and realize similar studies on a
larger scale to establish the existence of trophic preferences in different phlebotomine species.
1. INTRODUCCIÓN
La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria causada por protozoos del género
Leishmania, caracterizada por un amplio espectro de manifestaciones que dependen
principalmente de las especies del parásito, tamaño del inóculo y la respuesta inmune
del hospedero (Alvar 2001). Hasta el momento han sido registradas 21 especies de
Leishmania que causan enfermedad en humanos y que clínicamente producen
diferentes manifestaciones como leishmaniasis cutánea, leishmaniasis mucocutánea y
leishmaniasis visceral (WHO 2000).
En Colombia se presentan todas las formas clínicas de la leishmaniasis, distribuidas
geográficamente en todo el territorio nacional con excepción del archipiélago de San
Andrés y Providencia, presentándose una alta incidencia y prevalencia en gran parte
del territorio nacional, siendo la forma cutánea la más frecuente con el 99% de los
casos sintomáticos (Zambrano 2009, Zambrano 2010, Sivigila 2011). En el país, la
leishmaniasis constituye un gran problema en salud pública debido a que se estima que
más de 10 millones de personas se encuentran en riesgo de adquirir la enfermedad y
se registra un promedio de 15.000 casos anuales (Sivigila 2009, Sivigila 2010, WHO
2010), aunque esta cifra podría no refleja la incidencia real de la enfermedad puesto
que se acepta la existencia de un gran subregistro (Vélez et al. 2001).
11
La transmisión periurbana y urbana de la leishmaniasis en Colombia es un problema
creciente que reviste gran importancia, si tenemos en cuenta que aproximadamente el
74% de la poblaciones humanas de nuestro país residen en núcleos urbanos (DANE
2005). Entre los principales factores que propician este fenómeno tenemos la
urbanización no planificada en áreas enzooticas, el desplazamiento de poblaciones
humanas, la domiciliación de los vectores y la posible participación de nuevos
reservorios de parásitos en estos ciclos epidemiológicos urbanos (Romero & Sánchez
2007, Paternina et al. 2010). Como producto de todas estas situaciones, Colombia se
ha convertido en el segundo país americano con mayor incidencia de la enfermedad
después de Brasil (OPS 2007). En la Costa Caribe de Colombia se encuentra uno de
los focos de leishmaniasis más importante del país, el foco Montes de María,
constituido por los departamentos de Bolívar y Sucre, este último departamento
representa un corredor epidemiológico de vectores y reservorios de leishmaniasis entre
los departamentos de Bolívar y Córdoba (Díaz-Olmos et al. 2008).
Del triángulo epidemiológico de la leishmaniasis: vectores, parásitos y reservorios, este
último se ha investigado en menor proporción, a causa de las dificultades para el
muestreo de la mastofauna (Travi et al. 1994, Alexander et al. 1998, Travi 1998, De
Lima et al. 2002, De Lima et al. 2006, De Lima et al. 2008). Sin embargo, existen
métodos indirectos que pueden ser igual de productivos que las técnicas tradicionales
para aproximarnos a los reservorios, como la determinación molecular de fuentes
alimenticias con el fin de reducir el espectro de vertebrados a analizar para una
12
posterior búsqueda
de Leishmania en la mastofauna local (Haouas et al. 2007),
aunque este tipo de trabajos moleculares no han sido implementados a la fecha en el
país.
13
2. ESTADO DEL ARTE
2.1
Leishmaniasis en el Mundo y en Colombia
A nivel mundial la leishmaniasis constituye la segunda enfermedad causada por
protozoarios más importante en salud pública después de la Malaria y es una de las
diez enfermedades transmitidas por vectores bajo vigilancia estricta de la Organización
Mundial de la Salud (Singh et al. 2008). Esta enfermedad posee una incidencia anual de
1.5-2 millones de casos, de los cuales 70.000 son fatales y se estima que más de 350
millones de personas se encuentran en riesgo de contraer la enfermedad,
presentándose casos en 98 países del mundo aunque es enfermedad de notificación
obligatoria en solo 32 de estas naciones (Reithinger et al. 2007, WHO 2010).
Colombia ocupa el segundo lugar en incidencia de leishmaniasis en América después
de Brasil, pasando de 5.000 a más de 15.000 casos notificados anualmente y
convirtiéndose en uno de los 10 países del mundo que aportan más del 90% de los
casos cutáneos a nivel mundial (OPS 2007, Murray et al. 2005, Reithinger et al. 2007).
La enfermedad es endémica en todo el territorio Colombiano a excepción de San
Andrés Islas (Figura 1), y se estima que más de 10 millones de personas se encuentran
bajo riesgo de contraer la enfermedad, dándose la transmisión principalmente en áreas
rurales aunque existen registros de casos autóctonos en zonas urbanas de los
municipios de Bucaramanga, Durania, Leticia, Neiva, Remedios, Villeta, Sincelejo y
Cartagena (Desjeux 2002, Bejarano et al. 2002, Zambrano et al. 2011). Considerando
que el 74% de la población Colombiana reside en núcleos urbanos, es de esperarse
14
que se esté subestimando el riesgo epidemiológico que representa esta situación en el
país (DANE 2005, Zambrano et al. 2011).
Figura 1. Distribución de la leishmaniasis cutánea en Colombia (Zambrano 2009)
El foco de leishmaniasis constituido por los departamentos de Córdoba, Bolívar y Sucre,
es uno de los más importantes del país puesto que aporta el 85% de los casos de
leishmaniasis visceral del país y el 85% del total de casos de leishmaniasis cutánea de
toda la región Caribe (Zambrano 2005, Cortes 2006, Zambrano 2009). Dentro del
departamento de Sucre destacan los municipios de Ovejas y Los Palmitos por aportar la
mayor parte de los casos y en los cuales se ha registrado el mayor número de casos de
leishmaniasis cutánea urbana (DASSALUD 2010, comunicación interna), mostrando
15
que la urbanización de la leishmaniasis no está limitada a las ciudades anteriormente
mencionadas y que por el contrario puede constituir un fenómeno frecuente en nuestro
medio (Romero y Sánchez 2007).
2.2
El género Leishmania
Leishmania es un parásito protozoario perteneciente al orden Kinetoplastida y a la
familia Trypanosomatidae, estos parásitos desarrollan su ciclo de vida en dos
hospederos diferentes: en un insecto vector (forma promastigote, flagelado) y en
vertebrados (forma amastigote, no flagelada) (Reithinger et al. 2007).
Dentro del género Leishmania se reconoce la existencia de 21 especies patógenas al
humano que se agrupan taxonómicamente dentro de dos subgéneros, el subgénero
Leishmania comprende básicamente a aquellas especies del parásito que se
desarrollan en la región suprapilórica del intestino del vector como es el caso de L.
infantum, y el subgénero Viannia que comprende las especies de desarrollo peripilórico
como es el caso de L. braziliensis (Lainson & Shaw 1972). La separación taxonómica
con base en esta característica biológica está sustentada en otros hallazgos como
características bioquímicas, diferencias en las densidades de ADN nuclear entre estos
dos subgéneros, y diversos análisis filogenéticos empleando secuencias nucleares y
mitocondriales (Kreutzer et al. 1991, Noyes et al. 1996, Croan 1997, Asato el al. 2009,
Fraga et al. 2010).
16
En Colombia se reconoce la existencia de por lo menos 7 especies del género
Leishmania que causan los diversos cuadros clínicos: L. (L.) infantum, L. (L.) mexicana,
L. (L.) amazonensis, L. (V.) colombiensis, L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis y L. (V.)
guyanensis (Cochero et al. 2007, Ovalle et al. 2006, Romero & Sánchez 2007,
Rodriguez-Barraquer et al. 2008, Martínez et al. 2010). En el departamento de Sucre se
reconoce la presencia de por lo menos 4 de las 7 especies mencionadas: L. infantum
como agente etiológico de leishmaniasis visceral (LV) y como probable causante de
leishmaniasis cutánea (LC), y las tres últimas especies del subgénero Viannia citadas
anteriormente como agentes causales confirmados de leishmaniasis cutánea (LC)
(Martínez et al. 2010, Martínez et al. 2011)
2.3
Vectores de Leishmaniasis
Los insectos vectores de Leishmania son dípteros nematóceros de la subfamilia
Phlebotominae (Diptera: Psychodidae) pertenecientes a los géneros Phlebotomus en el
Viejo Mundo y a Lutzomyia en América (Lane 1993), actualmente se reconoce la
existencia de más de 400 especies del género Lutzomyia, aunque los hallazgos de
nuevas especies son frecuentes (Beati et al. 2004, Terayama et al. 2008, Galati &
Cáceres 2007, Bejarano et al. 2010).
Morfológicamente los flebotomíneos son de aspecto piloso, con un tamaño aproximado
17
entre 3-6mm de longitud, con alas erectas en forma de V (Killick-Kendrick 1999). Por
otra parte, considerando el comportamiento alimenticio de estos insectos, se puede
decir que generalmente son de hábitos crepusculares, las hembras requieren de
ingestas de sangre de vertebrados como un suplemento proteínico para completar la
ovogenesis y realizar la oviposición, mientras que los machos por lo general son
fitófagos (Lane 1993).
Figura 2. Morfología general de flebotomíneos del género Lutzomyia: a) hembra y b) macho
(Dantas-Torres 2009).
En Colombia existe más de 163 especies flebotomíneas, convirtiéndose junto con Brasil
en los países con mayor diversidad flebotomínea a nivel mundial (Bejarano et al. 2010).
el departamento de Sucre 22 especies del género Lutzomyia, de las cuales 10 poseen
antecedentes epidemiológicos como vectores de Leishmania: Lu. longipalpis, Lu.
18
evansi, Lu. spinicrassa, Lu. gomezi, Lu. panamensis, Lu. trinidadensis, Lu. ovallesi, Lu.
rangeliana, Lu. migonei y Lu. shannoni, de éstas las 6 primeras han sido encontradas
naturalmente infectadas en Colombia con Leishmania y las otras cinco han sido
halladas con Leishmania en Venezuela, Guatemala, Brasil y México (Cochero et al.
2007, Bonfante-Garrido et al. 1990, Bonfante-Garrido et al. 1999, Rowton et al. 1992,
Bonfante-Garrido et al. 1991, Pita-Pereira et al. 2005, Sánchez-Garcia et al. 2010 ). Lu.
longipalpis es un reconocido vector de leishmaniasis visceral en América, mientras que
Lutzomyia evansi es el principal vector de leishmaniasis visceral y leishmaniasis
cutánea en la Costa Caribe de Colombia (Pérez-Doria et al. 2011), mientras que el resto
de especies citadas están involucradas en la transmisión de leishmaniasis cutánea, a
excepción de Lu. migonei que parece estar asociada a transmisión de leishmaniasis
visceral en Brasil y Argentina (de Carvalho et al. 2010, Salomón et al. 2010). De tal
forma que el departamento de Sucre puede considerarse de alto riesgo para
leishmaniasis tanto en áreas rurales como urbanas.
2.4
Los Reservorios de Leishmania
A nivel mundial se ha identificado a los organismos de la clase Mammalia como los
reservorios de Leishmania, dentro de esta clase se estima que 62 especies mamíferas
pertenecientes a 46 géneros, 24 familias y 9 órdenes están involucradas como
reservorios de parásitos en los ciclos de transmisión de leishmaniasis (Dereure 1999).
19
Tradicionalmente, la determinación de los reservorios de parásitos se ha realizado
mediante búsqueda directa de Leishmania entre la mastofauna local (Herrer & Telford
1969, Herrer et al. 1971, Herrer et al. 1973, Zeledón et al. 1975, Zeledón et al. 1977,
Zeledon et al. 1979, Lainson et al. 1981, Dedet et al 1985, Dedet et al. 1989, Kreutzer et
al. 1991, Travi et al. 1994, Travi et al. 1998, Alexander et al. 1998, Llanos-Cuentas et al.
1999), y aunque esta metodología ha permitido obtener información muy valiosa acerca
de los reservorios, resulta altamente laboriosa debido a los largos periodos de captura
para obtener un número discreto de animales, a esto le sumamos que es muy
improbable lograr la captura de representantes de toda la mastofauna (Haouas et al.
2007). Adicionalmente, el hallazgo de infección por Leishmania en estos animales
puede resultar ambiguo debido a que puede significar que se está en presencia de un
reservorio o simplemente frente a un hospedero accidental (Dantas-Torres 2007, Maia &
Campino 2011). En este sentido es necesario precisar que los reservorios además de
estar infectados por Leishmania, deben constituir una fuente de sangre y de parásitos
frecuente para los vectores y así poder mantener un ciclo de transmisión zoonótico o
antropozoonótico de la enfermedad.
Desde hace varios años el cultivo de parásitos dejó de ser la herramienta de primera
elección para determinar la infección por Leishmania en mamíferos debido a la difícil
obtención de cultivos positivos principalmente porque su tasa de éxito depende
directamente de la carga parasitaria (Allahverdiyev et al. 2004), en su lugar las técnicas
de biología molecular han permitido detectar parásitos en una gran variedad de
20
especies mamíferas y actualmente es la técnica de primera línea para detectar e
identificar las especies parasitantes (Travi et al. 1994, Alexander et al. 1998, Travi et al.
1998, De Lima et al. 2002, De Lima et al. 2006, De Lima et al. 2008). Sin embargo, el
estudio de los reservorios de parásitos continúa siendo uno de los aspectos menos
estudiados en la dinámica de transmisión de Leishmania, aun cuando son los
responsables de mantener circulando al parásito en la naturaleza y poseer un papel
fundamental en la transmisión de la enfermedad (Ashford 1996).
2.5
Fuentes alimenticias de Flebotomíneos
La identificación de los vertebrados que sirven como reservorios silvestres de
Leishmania tiene gran valor para la comprensión del ciclo epidemiológico de la
leishmaniasis y suministra información pertinente para el control de la enfermedad
(Ashford 1996). Una forma de aproximarse a la identificación de potenciales reservorios
de Leishmania es determinando de qué animales se alimentan las especies
flebotomíneas vectoras (Haouas et al. 2007). El comportamiento alimenticio puede
dividirse en tres categorías básicas, el generalismo
En América, esta determinación de las fuentes alimenticias se ha realizado mediante
observación directa, evaluando la atracción que ejercen diferentes especies animales
confinadas en trampas sobre individuos de una especie flebotomínea, estudiando el
patrón de cristalización de la hemoglobina animal contenida en el tracto digestivo del
21
insecto y también por el análisis serológico de la sangre mediante ensayos de
Precipitina o ELISA (Tesh et al. 1971, Tesh et al. 1972, Morrison et al. 1993, CIDEIM
1994, Cochero 2002, Nery et al 2004, Marassa et al. 2004, Marassa et al. 2006, Oliveira
et al. 2008).
Los ensayos serológicos han permitido reducir el número de potenciales especies
reservorios y han ofreciendo información valiosa acerca de la preferencias alimenticias
de los flebotomíneos en su ambiente natural (Tesh et al. 1971, Tesh et al. 1972, Nery et
al. 2004, Marassa et al. 2004). Si bien es cierto que las técnicas mencionadas han
permitido comprender un poco más la epidemiología de la leishmaniasis, también se
han presentado grandes dificultades debido a la alta diversidad de potenciales
reservorios y a la carencia de sus respectivos antisueros, a los procesos digestivos de
los flebotomíneos que afectan la estructura primaria y tridimensional de los antígenos a
detectar con una consecuente pérdida de especificidad y/o sensibilidad, y finalmente
por el corto periodo de tiempo de detección después que ha ocurrido la ingesta
sanguínea, el cual no supera las 24 horas (Marassa et al. 2004, Haouas et al. 2007).
En la actualidad se han desarrollado técnicas de biología molecular que ofrecen una
alternativa sensible y reproducible que permite superar dichas dificultades técnicas
(Chow-Shaffer et al. 2000, Ngo and Kramer 2003, Kent and Norris 2005, Meece et al.
2005, Oshaghi et al. 2006, Haouas et al. 2007, Abbasi et al. 2009), y a pesar del éxito
que se ha obtenido en el estudio de fuentes alimenticias de flebotomíneos del Viejo
22
mundo (Abassi et al. 2008, Svobodová et al. 2009). El gen citocromo b (Mt-Cyb) es el
estándar en identificación de fuentes alimenticias debido a que es de origen
mitocondrial y puede llegar a tener miles de copias por células (Berry et al. 2000,
Svobodová et al. 2009), sin embargo utilizando este gen es posible co-amplificar
secuencias del insecto vector lo que ha hecho necesaria la búsqueda de marcadores
genéticos exclusivos de vertebrados que puedan ser utilizados para el mismo fin.
Recientemente, se ha propuesto el gen nuclear de copia única PNOC, como candidato
para remplazar a futuro el gen Mt-Cyb (Haouas et al. 2007), este gen es exclusivo de
vertebrados y codifica el precursor proteico de la Nociceptina/Orfanina FQ, un péptido
asociado a la diferenciación celular neuronal y vías de dolor (Mollereau et al. 1996,
Zaveri et al. 2000, Zaveri et al. 2002, Zaveri et al. 2006). En América este tipo de
herramientas moleculares no han sido evaluadas, por lo que su implementación
resultaría en una metodología útil y novedosa para el estudio de la leishmaniasis y de
otras enfermedades complejas transmitidas por artrópodos vectores.
En Colombia solo se cuenta con dos trabajos relacionados con la determinación de
fuentes alimenticias en flebotomíneos vectores de leishmaniasis, uno en Lutzomyia
longipalpis (Morrison et al. 1993) y otro en Lutzomyia evansi (Cochero 2002).
Observaciones realizadas por especialistas en flebotomíneos durante el trabajo de
campo (Young 1977, Bejarano et al. 2022) han permitido acercarnos al comportamiento
alimenticio de diferentes especies del género Lutzomyia, siendo quizá el caso más
citado el del flebotomíneo Lutzomyia cayennensis cayennensis (Young 1977, Young
23
1994, Cochero et al. 2007), especie que ha sido encontrada con tripanosomatídeos en
Los Montes de María y que presumiblemente se alimenta de reptiles (Cochero et al.
2007), aunque no se ha podido establecer la identidad de estos animales.
2.6
Aspectos Desconocidos en los Ciclos de Transmisión de Leishmania
En Colombia se ha avanzado en la identificación de los insectos vectores de
leishmaniasis cutánea, la búsqueda de sitios de cría de los flebotomíneos vectores y la
identificación de parásitos en el vector, esto último, utilizando diferentes metodologías
(Marín et al. 2009, Vivero et al. 2011, Ovalle et al. 2009, Pérez-Doria et al. 2011). No
obstante, el estudio sobre la identificación y caracterización de las fuentes alimenticias
de flebotomíneos y los probables reservorios de leishmaniasis no ha recibido la misma
atención, aun cuando en la actualidad se presenta un proceso de domiciliación de los
insectos vectores y de urbanización de la leishmaniasis cutánea, que hacen suponer la
existencia de cambios en los patrones epidemiológicos clásicos (Desjeux 2002). Por
otra parte, los estudios de identificación de fuentes alimenticias fueron realizados antes
del ascenso epidémico de casos de leishmaniasis en el país (Morrison et al. 1993,
Cochero 2002, Zambrano 2005), por tal razón es factible que las preferencias
alimenticias de estos insectos hayan cambiado como respuesta a la dinámica de
transmisión, que es producto directo de las interacciones entre los reservorios y los
vectores.
24
La determinación de las fuentes alimenticias de los vectores de leishmaniasis proveería
información valiosa sobre los patrones de dispersión debido a que es la hembra la que
busca sangre de un vertebrado, para la maduración de sus huevos y una posterior
oviposición (Lane 1993). Así mismo, se accede a información básica en relación con
los patrones alimenticios de los flebotomíneos y una aproximación sobre las posibles
predilecciones por alguna especie o grupo vertebrado en particular. Por último,
permitiría avanzar en la planeación y establecimiento de estrategias de control con base
en la interrupción del contacto vector-reservorio. Por todas estas razones, es prioritaria
la estandarización de técnicas moleculares para la identificación de fuentes alimenticias
y potenciales reservorios de parásitos, las cuales se perfilan como una herramienta de
gran utilidad y aplicabilidad para el entendimiento de los ciclos de transmisión de
enfermedades transmitidas por vectores.
25
3. OBJETIVOS
3.1

Objetivo general:
Identificar molecularmente las fuentes de sangre en hembras flebotomíneas del género
Lutzomyia de dos focos de leishmaniasis cutánea en el departamento de Sucre.
3.2

Objetivos específicos:
Determinar la composición de la fauna flebotomínea en dos focos de leishmaniasis
cutánea del departamento de Sucre.

Evaluar la utilidad del gen Prepronociceptina (PNOC) como marcador genético para la
determinación molecular de fuentes de sangre de Lutzomyia spp., utilizando como
referente el gen Citocromo B de vertebrados.

Identificar molecularmente las fuentes alimenticias de hembras flebotomíneas de sitios
de transmisión activa de leishmaniasis cutánea en Sucre.
26
4. HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN
Hipótesis Nula (Ho): las hembras flebotomíneas de las diferentes especies del género
Lutzomyia presentes en dos focos de leishmaniasis cutánea del departamento de Sucre
presentan hábitos hematofágicos generalistas.
Hipótesis alternativa (Ha): las hembras flebotomíneas de las diferentes especies del
género Lutzomyia presentes en dos focos de leishmaniasis cutánea del departamento
de Sucre se alimentan de ciertos grupos de vertebrados que actúan como sus fuentes
predilectas de sangre.
27
5. METODOLOGÍA
5.1
Área de Estudio
El estudio fue desarrollado en áreas del departamento de Sucre donde se presentan
con mayor incidencia casos de leishmaniasis cutánea en humanos y se han reportado
también casos urbanos de la enfermedad, específicamente en zona urbana y
periurbana de los municipios de Ovejas y Los Palmitos (Figura 3). Geográficamente,
ambos municipios hacen parte del reconocido foco mixto de leishmaniasis “Montes de
María”, en términos ecológicos ambos se encuentran dentro de la zona de vida “Bosque
Seco Tropical” (Bs-T), con registros de temperatura media de 27.5°C, humedad relativa
de 77-80% y precipitación media anual de 1000-1300 mm.
En el municipio de Ovejas y Los Palmitos se seleccionaron dos puntos por municipio
para llevar a cabo los muestreos de flebotomíneos, los cuatro puntos seleccionados
para la realización de este trabajo presentaban casos con múltiples lesiones y
reincidencia de pacientes con leishmaniasis cutánea. En el municipio de Los Palmitos
los dos puntos seleccionados estaban separados por una distancia líneal de
aproximadamente 4.000 metros, mientras que en el caso de Ovejas los dos puntos de
captura estaban separados aproximadamente 500 metros.
28
Figura 3. Municipios muestreados y puntos donde se realizaron las capturas de flebotomíneos
A) Los Palmitos y B) Ovejas.
29
5.2
Métodos de Captura de Insectos Flebotomíneos
Durante un año de muestreo, desde Mayo del 2010 hasta Abril del 2011, se realizaron
capturas de flebotomíneos en las zonas bajo estudio empleando diferentes
metodologías con el fin de obtener datos robustos acerca de la fauna flebotomínea en
las zonas bajo estudio (Figura 4).
Se utilizaron trampas CDC operadas entre las 18:00-6:00 horas en el intra, peri y
extradomicilio (n=2 trampas por ambiente domiciliar/municipio) durante dos noches y en
la última semana de cada mes con el fin de obtener datos de abundancia y distribución
de la fauna flebotomínea respecto a la vivienda (Cortés & Fernández 2008). Este
muestreo fue realizado de forma simultánea en ambas municipalidades para mantener
la relación temporal entre los dos sitios de muestreo. La implementación de las trampas
CDC de la forma descrita representa al menos un total de 3.456 horas de muestreo,
1.728 horas por municipio. También se utilizaron trampas de luz tipo Shannon (n=1 por
municipio) que fueron instaladas en el extradomicilio de las viviendas donde se
presentaron casos de leishmaniasis cutánea y fueron operadas entre las 18:00-21:00
horas durante una noche en la segunda semana de cada mes, para un total de 72
horas de trabajo de campo.
Adicionalmente se implementó la búsqueda activa en sitios de reposo (BA) con
aspirador bucal y aspirador eléctrico para capturar poblaciones flebotomíneas que no
30
son usualmente atraídas por las fuentes luminosas de las trampas tradicionalmente
usadas (CDC y Shannon), este muestreo fue realizado una vez al mes desde las 07:0013:00 horas en el extradomicilio hasta un radio de 1Km de las viviendas durante los
últimos 8 meses de muestreo, que representa un total de 96 horas de captura, 48 horas
en cada municipalidad bajo estudio.
Figura 4. Trampas para la recolección de flebotomíneos, A) Trampa CDC en peridomicilio de
Ovejas B) Trampa CDC en peridomicilio de Los Palmitos C) Trampeo con Shannon en
extradomicilio de Ovejas.
31
5.3
Procesamiento y Determinación Taxonómica de Flebotomíneos
Todos los insectos fueron examinados bajo un estereomicroscopio con el fin de separar
los flebotomíneos de otros grupos de insectos. Las hembras del género Lutzomyia
capturadas que contenían sangre en su tracto digestivo fueron disecadas empleando
cuchillas estériles a nivel de los tres últimos segmentos abdominales y a nivel de la
cabeza. Estos tres segmentos y la cabeza fueron sometidos a clarificación química en
Lactofenol (Ácido Láctico y Fenol, 1:1) para remover las setas y permitir la visualización
de las estructuras internas esclerotizadas que son determinantes en la identificación
taxonómica, mientras que el resto del cuerpo del insecto (tórax y segmentos proximales
del abdomen) fueron refrigerados en microtubos a -86ºC, hasta ser utilizados en la
extracción de ADN total. La identificación taxonómica fue realizada usando las claves
taxonómicas de Young & Duncan 1994 y Galati 2003.
5.4
Extracción de ADN total
A partir del tórax y los segmentos proximales del abdomen de cada hembra
flebotomínea alimentada se realizó la extracción de ácidos nucleicos usando el
protocolo de alta concentración de sales descrito por Collins et al. (1987), con las
siguientes modificaciones: maceración mecánica del insecto con un micropistilo plástico
estéril en 60 µl del búfer de lisis (0.08 NaCl, 0.16 M Sacarosa, 0.06 M EDTA, 0.5% SDS,
0.1 M Tris-HCL a pH de 7.5), luego una digestión enzimática del macerado con
Proteinasa K (1ug/uL) a 65ºC durante 2 horas, seguida de la adición de 14uL de Acetato
32
de Potasio 8M e incubación en hielo durante 30 minutos, posteriormente se realizó una
centrifugación a 13.400g/10min/4ºC. Al sobrenadante obtenido del paso anterior se
adicionaron 200 µl de Etanol Absoluto y fue mantenido a 4ºC durante toda una noche,
luego se realizó una centrifugación a 13.400g/20min/4ºC y se descartó el sobrenadante,
el precipitado obtenido fue lavado con Etanol 70 % y posteriormente secado en un
concentrador centrífugo de ácidos nucleicos, finalmente el ADN fue resuspendido en
60uL de agua ultrapura. La concentración de las muestras se mantuvo en un rango de
15-25ng/uL.
Este ADN se conservó a -20ºC hasta su utilización en la amplificación de ADN de
vertebrados y mamíferos.
5.5
Amplificación de ADN de Fuentes Alimenticias mediante PCR
Antes de la amplificación de ADN de vertebrados a partir de hembras alimentadas con
sangre provenientes de campo, fue realizada una estandarización utilizando material
genético de dos tipos de muestras: I) ADN de canino obtenido a partir de sangre
periférica sometida a un protocolo de extracción de alta concentración de sales (DíazOlmos et al. 2008) y II) ADN humano obtenida a partir de hembras de Lu. evansi
alimentadas artificialmente con sangre humana (12 horas de post-ingestión sanguínea)
y sometidas al protocolo de extracción de ADN de Collins et al. (1987) modificado.
33
Utilizando ambos controles se logró la amplificación de una banda única, intensa y
definida con ambos marcadores genéticos utilizando 1.5mM de MgCl2, 1.5U de Taq
Polimerasa y 40 a 60ng de ADN total.
5.5.1 Amplificación de ADN de vertebrados a partir de Lutzomyia spp.
La amplificación de ADN de vertebrados fue realizada con oligonucleótidos derivados
de los cebadores L14841 y H15149 (Figura 5), que amplifican un fragmento de 358pb
del gen mitocondrial Citocromo B en vertebrados (Steuber et al. 2005, Oshaghi et al.
2006, Svobodová et al. 2009) con el siguiente perfil térmico de amplificación optimizado:
desnaturalización inicial a 95C/5min, seguida por 35 ciclos de desnaturalización a
95ºC/30seg, alineación de cebadores a 58ºC/30seg y extensión a 72ºC/45seg, y por
último una extensión final a 72ºC/5min.
5.5.2 Amplificación de ADN de mamíferos a partir de Lutzomyia spp.
Por otra parte se amplificó también un fragmento de 330pb del gen nuclear que codifica
la Prepronociceptina (PNOC) utilizando los cebadores PNOC-F y PNOC-R (Figura 5),
que amplifican este fragmento de ADN únicamente en mamíferos (Murphy et al. 2001,
Haouas et al. 2007), con el siguiente perfil térmico de amplificación optmizado:
desnaturalización inicial a 95ºC/5min, seguida por 35 ciclos de desnaturalización a
95ºC/30seg, alineamiento de cebadores a 55ºC/30seg y extensión a 72ºC/45seg, y
finalmente una extensión final a 72ºC/5min.
34
Durante la realización de estos ensayos moleculares se utilizó como control negativo
agua ultrapura para determinar sí existía contaminación durante la preparación de los
ensayos moleculares.
Figura 5. Posición de los cebadores sobre su gen blanco, mostrando el tamaño esperado de
cada amplicon.
5.6
Electroforesis de ADN en gel de Agarosa
Los productos de amplificación obtenidos mediante PCR de los genes PNOC y Mt-Cyb
Vertebrados fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 2% con previa
adición de la tinción fluorescente para ácidos nucleicos GelStarR, para ello 5uL del
producto de PCR se mezclaron con 2uL de Azul de Bromofenol y se sometió a
35
electroforesis horizontal en búfer TBE 0.5X a 80 voltios durante 40 minutos. La
fotodocumentación de los geles fue realizada con un transiluminador Visi-Blue UVP
Systems y una cámara fotográfica Cannon A640, los productos de PCR fueron
considerados positivos cuando se presentaron amplicones del tamaño esperado para
cada gen evaluado, utilizando como referentes los controles positivos de PCR y un
marcador de peso molecular Promega 100pb DNA Ladder.
5.7
Secuenciación de ADN y Análisis Genético
Los amplicones de Mt-Cyb vertebrados y PNOC obtenidos a partir de la sangre
contenida de los tractos digestivos de Lutzomyia fueron sometidos a secuenciación de
ADN en ambos sentidos de la cadena del ácido nucleico con un equipo de
electroforesis capilar 3730XL, las secuencias fueron editadas y alineadas con el
programa MEGA 5 para obtener secuencias consenso por muestra. Las secuencias de
cada hebra y la secuencia consenso de cada muestra fueron analizadas de la siguiente
forma e independientemente.
Las secuencias fueron cotejadas con las secuencias disponibles en la base de datos
GenBank y con una base de datos propia de nuestro grupo de investigación usando la
herramienta BlastN para determinar mediante los criterios de máxima identidad,
cobertura y puntuación total en el alineamiento múltiple a qué especie animal pertenecía
la sangre contenida en el tracto digestivo de los flebotomíneos analizados. Se consideró
36
que una muestra fue apropiada para el análisis genético cuando presentó una tasa de
identidad superior al 80% con secuencias de las bases de datos NCBI, EMBL y DDBJ.
También se computó una BlastN Linneaus con el software Geneious 4.8, en el cual se
obtienen los puntajes de máxima identidad, cobertura y puntuación total en el
alineamiento múltiple resumidas en jerarquías taxonómicas en una dendograma
Neighbor Joining (NJ).
5.8
Análisis de Datos
Se realizó un análisis descriptivo de la fauna flebotomínea de las zonas bajo estudio
con un análisis de abundancia relativa de especies, especies capturadas por tipo de
trampa y especies capturadas por ambiente analizado, en el programa Excel 2010. Así
también se calcularon los índices de diversidad de Shannon-Weaver (H) y Simpson (1D), y el índice de Dominancia (D) para comparar ecológicamente los dos municipios y
se valoró la existencia de diferencias estadísticas significativas mediante una prueba T
Diversidad H (Shannon) con el programa de análisis ecológico PAST 2.05. Por otra
parte se valoró de forma gráfica la dominancia y equitatividad de las comunidades
flebotomíneas de Ovejas y Los Palmitos utilizando un modelo de abundancias
logaritmizadas por rangos de especies (Gráfico de Whittaker) en el programa
Biodiversity Pro 2.0.
Para la evaluación del marcador genético PNOC en comparación con el gen Mt-Cyb
37
Vertebrados en estudios de fuentes alimenticias de flebotomíneos se consideraron los
siguientes parámetros: I) Eficiencia de amplificación II) Reproducibilidad de los ensayos
moleculares y III) Legibilidad de sus cromatogramas de secuencias.
En cuanto a las fuentes alimenticias de los flebotomíneos se realizó un análisis
descriptivo de los hallazgos en Excel 2010, un análisis de correspondencia entre las
especies flebotomíneas y las fuentes alimenticias determinadas para establecer
asociaciones, tendencias o posibles patrones de comportamiento hematofágico con los
programas SPSS 17 y PAST 2.05. Las asociaciones o tendencias halladas mediante el
análisis de correspondencia fueron valoradas estadísticamente mediante un análisis de
Ji-cuadrado en el programa GraphPad Instat v3.
38
6. RESULTADOS
6.1
Fauna flebotomínea de focos de leishmaniasis cutánea en Sucre
Durante el seguimiento realizado a la fauna flebotomínea empleando los métodos de
captura con trampa CDC, trampa Shannon y búsqueda activa en sitios de reposo se
recolectaron 8.118 individuos de los municipios de Ovejas y Los Palmitos en el
departamento de Sucre. La fauna flebotomínea presente en focos de leishmaniasis
cutánea en el departamento de Sucre estuvo conformada por 9 especies (Figura 6),
entre ellas, Lu. evansi (90.92%), Lu. panamensis (3.01%), Lu. cayennensis cayennensis
(1.88%), Lu. dubitans (1.82%), Lu. gomezi (0.92%), Lu. micropyga (0.86%), Lu.
trinidadensis (0.42%), Lu. rangeliana (0,12%), y Lu. atroclavata (0.024%).
La especie dominante fue Lutzomyia evansi, con un total de 7.381 individuos
recolectados (Tabla 1), presentando altas densidades peridomiciliares durante el
seguimiento realizado con trampas CDC en ambos municipios (Figura 6), seguida por
Lutzomyia panamensis con 245 especímenes, Lutzomyia cayennensis con 153,
Lutzomyia dubitans con 148, Lutzomyia gomezi con 75, Lutzomyia micropyga con 70,
Lutzomyia trinidadensis con 34, Lutzomyia rangeliana con 10 y 2 especímenes de
Lutzomyia atroclavata.
39
Figura 6. Espermatecas de las especies flebotomíneas presentes en las áreas de estudio en el
departamento de Sucre.
40
OVEJAS (OV)
LOS PALMITOS (LP)
Especie
CDC
Shannon
BA
SUBTOTAL
CDC
Shannon
BA
SUBTOTAL
TOTAL
Lu. evansi
3454
1668
37
5159
1801
319
102
2222
7381
Lu. cayennensis
19
14
36
69
75
0
9
84
153
Lu. micropyga
0
0
69
69
1
0
0
1
70
Lu. panamensis
120
80
1
201
33
11
0
44
245
Lu. gomezi
22
45
0
67
6
2
0
8
75
Lu. atroclavata
0
0
0
0
2
0
0
2
2
Lu. trinidadensis
12
0
19
31
2
0
1
3
34
Lu. dubitans
36
1
0
37
111
0
0
111
148
Lu. rangeliana
8
2
0
10
0
0
0
0
10
3671
1810
162
5643
2031
332
112
2475
8118
7
6
5
8
8
3
3
8
9
Dominancia D
0.886
0.851
0.296
0.837
0.791
0.924
0.836
0.809
0.828
Shannon H
0.304
0.354
1.318
0.433
0.488
0.182
0.33
0.458
0.457
Simpson 1-D
0.113
0.148
0.703
0.162
0.209
0.075
0.164
0.190
0.171
TOTAL
Riqueza S
T Diversidad H CDC (OV Vs. LP)= -6.362; 3955,2 GL; Pvalue= 2,21x10
-10
(P<0.05)
-4
T Diversidad H Shannon (OV Vs. LP)= 3.836; 573,7 GL; Pvalue= 1,38x10 (P<0.05)
T Diversidad H BA (OV Vs. LP)= 11.542; 182,11 GL; Pvalue= 1,76x10- 23 (P<0.05)
T Diversidad H TOTAL (OV Vs. LP)= -0.890; 5039,9 GL; Pvalue= 0.373 (P>0.05)
Tabla 1. Abundancia por municipalidad, tipo de trampeo e índices ecológicos de la fauna
flebotomínea. La prueba T Diversidad H en negrilla es estadisticamente significativos.
41
A partir de la Tabla 1 podemos notar que de acuerdo al método de trampeo utilizado es
posible colectar ciertas especies flebotomíneas, por ejemplo, es notable que Lutzomyia
micropyga pudo ser colectada de forma casi exclusiva (98.57% del total capturado)
utilizando búsqueda en sitios de reposo y que fue colectada en su mayoría en el
municipio de Ovejas; en el caso de Lutzomyia dubitans notamos que esta especie
flebotomínea fue capturada casi en su totalidad (99.32% del total capturado) empleando
trampas CDC hallandose en mayor frecuencia en el municipio de Los Palmitos, por otra
parte tenemos a Lutzomyia rangeliana que fue capturada empleando trampas de luz
(CDC y Shannon) únicamente en el municipio de Ovejas. Esta relación entre los
métodos de colecta y la presencia de ciertas especies flebotomíneas ha sido notado
con anterioridad y puede deberse a diversos factores, entre ellos el ambiente donde se
instalan las trampas y a las características de los ambientes donde se realizan las
búsquedas activas en sitios de reposo (Killick-kendrick 1987, Alexander et al. 2000).
Por otra parte, diferencias estadísticas en cuanto a la abundancia y composición de la
fauna flebotomínea de Ovejas y Los Palmitos fue detectada en los tres métodos de
captura mediante una prueba T de Diversidad H (índice de diversidad de Shannon),
trampas CDC (2,21x10-10 <0.05), trampa Shannon (Pvalue= 1,38x10-4 <0.05) y
búsqueda activa en sitios de reposo (Pvalue= 1,76x10-23 <0.05), siendo este último
método de colecta presenta las diferencias estadísticas más significativas e indica que
el municipio de Ovejas es mucho más diverso en este sentido.
42
Figura 7. Distribución porcentual de las abundancia de Lutzomyia evansi respecto al domicilio,
mediante trampeo con CDC.
Al respecto es importante mencionar que el municipio de Ovejas pertenece a la
subregión Montes de María que aun conserva relictos de bosque en cercanías de su
centro poblado, manteniendo en su paisaje parte de la cobertura vegetal nativa (Figura
3B), mientras que Los Palmitos es un municipio de la subregión Sabanas, cuyos
paisajes han sido intensamente modificados en relación con la expansión de la frontera
agrícola y pecuaria (Figura 3A), constituyendo así, dos áreas altamente contrastantes.
Estas diferencias se ven también reflejadas en las magnitudes del índice de dominancia
(D), hallándose alta dominancia en Los Palmitos (D=0.836) con relación a lo encontrado
en Ovejas (D=0.296).
Por otra parte, fue ilustrada la dominancia y equitatividad de la comunidad flebotomínea
a través de un gráfico de abundancias logaritmizadas por rangos de especies (Figura
8), con base en este análisis se puede observar claramente que ambas comunidades
flebotomíneas tienen como especie dominante a Lutzomyia evansi. En el caso de la
43
comunidad de Ovejas se puede notar que la especie dominante es seguida por un
grupo de especies de moderada abundancia poblacional y finalmente por una especie
exótica. En los Palmitos existe una variación muy marcada entre los niveles de
abundancia, aspecto que puede notarse a simple vista por la forma casi lineal de la
gráfica de Whittaker.
Figura 8. Gráfico de abundancias logaritmizadas por rangos de especies de las comunidades
flebotomíneas de Ovejas y Los Palmitos.
44
6.2
Evaluación del marcador genético PNOC para analizar fuentes
alimenticias
La evaluación del marcador genético nuclear PNOC (Prepronociceptina) se realizó en
80 hembras pertenecientes a 8 especies provenientes de 4 localidades del
departamento de Sucre. Además de los individuos provenientes de los sitios iniciales de
muestreo, se incluyeron individuos colectados en Sincelejo (3 Lu. c. cayennensis, 2 Lu.
shannoni, 1 Lu. atroclavata, 1 Lu. trinidadensis, 1 Lu. micropyga) y de Colosó (4 Lu.
panamensis), en razón a la presencia y disponibilidad de hembras alimentadas de
especies de gran interés desde el punto de vista epidemiológico en la transmisión de la
leishmaniasis.
Del total de hembras analizadas
36 provenían del municipio de Ovejas, 32 del
municipio Los Palmitos, 8 de la ciudad de Sincelejo y 4 del municipio de Colosó. Las
identidades taxonómicas y el número de individuos hembra por especie fueron: 59
Lutzomyia evansi, 7 Lutzomyia cayennensis cayennensis, 6 Lutzomyia panamensis, 3
Lutzomyia micropyga, 2 Lutzomyia shannoni, 1 Lutzomyia trinidadensis, 1 Lutzomyia
rangeliana y una Lutzomyia atroclavata. El estado alimenticio de las hembras utilizadas
varió desde ingestas sanguíneas completas hasta ingestas sanguíneas parciales
(Figura 9).
45
Figura 9. Estados alimenticios de hembras flebotomíneas utilizadas. A) Ingesta completa B)
Ingesta parcial C) Tamaño relativo de una hembra alimentada junto a un microtubo de 1.5mL.
Utilizando los parámetros estandarizados para la amplificación del gen PNOC que
mostraron mejores resultados (Figura 10), se analizaron 80 hembras flebotomíneas de
los que fue posible amplificar un fragmento de aproximadamente 330pb perteneciente
al gen nuclear PNOC en aproximadamente 30 de ellas (30/80, 37.5%), de estos 30
amplicones solo 10 se consideraron como amplicones secuenciables, esto se debió a
que 20 amplicones presentaron inespecificidades que no pudieron ser removidas aun
después de implementar modificaciones de cloruro de magnesio, cebadores, ADN
46
plantilla y perfil térmico de amplificación al protocolo de PCR (Figura 11). En el caso del
gen Mt-Cyb se obtuvo amplicones para las 80 muestras procesadas (Figura 12). Los
amplicones secuenciables del gen PNOC (10) y la totalidad de los amplicones del gen
Mt-Cyb Vertebrados (80) fueron purificados y posteriormente secuenciados en ambos
sentidos de la cadena de ADN. La legibilidad de los cromatogramas de secuencia del
gen PNOC fue satisfactoria y comparable a la del gen Mt-Cyb (Figura 13).
Figura 10. Electroforesis de la PCR del gen nuclear PNOC con condiciones estandarizadas, es
notable la presencia de una banda bien definida y única. M: marcador peso molecular (100pb),
C+: ADN de canino, C-: Agua, 1-12: ADN de Lu. evansi alimentadas con sangre humana.
47
Figura 11. Amplicones del gen PNOC. M: marcador peso molecular (100pb), 1-12: Muestras de
flebotomíneos alimentados.
Figura 12. Amplicones del gen Mt-Cyb. M: marcador peso molecular (100pb), C+: ADN de
canino, C-: Agua, 1-11: Muestras de flebotomíneos alimentados.
48
Figura 13. Cromatogramas de secuenciación obtenidos a partir de los amplicones de fuentes
alimenticias A) Cromatograma gen PNOC B) Cromatograma Mt-Cyb Vertebrados.
49
6.3
Determinación de fuentes alimenticias de flebotomíneos
A partir de los 80 individuos analizados se pudo determinar la identidad 86 taxones
animales, de los cuales 66 representaban vertebrados y 20 restantes fueron secuencias
pertenecientes a los insectos flebotomíneos analizados, representando un 76,75% de
éxito en la identificación de vertebrados que representan fuentes alimenticias para las
especies flebotomíneas en Sucre.
Las 66 muestras identificadas como vertebrados pertenecieron a 9 taxones de
vertebrados distribuidos en cinco familias de mamíferos, una familia de reptiles y una
familia de aves: Equus asinus (Mammalia: Equidae), Bos taurus (Mammalia:
Bovidae), Homo sapiens (Mammalia: Hominidae), Equus caballus (Mammalia:
Equidae), Sus scrofa (Mammalia: Suidae), Tamandua mexicana (Mammalia:
Myrmecophagidae), Proechimys guyanensis (Mammalia: Echimyidae), Mabuya sp.
(Sauropsida: Scincidae) y Gallus gallus (Aves: Phasianidae).
La utilización del gen PNOC permitió identificar a Tamandua mexicana como fuente
alimenticia de Lu. trinidadensis (n=1) y Lu. shannoni (n=1), información que resulta
complementaria a la obtenida utilizando el gen Mt-Cyb. Inicialmente el análisis genético
mostró alta similitud a Tamandua tetradactyla, esto se debe a que no existen
secuencias de Tamandua mexicana en las bases de datos moleculares para este gen,
sin embargo, considerando la distribución geográfica de las especies de este género, la
50
muestra corresponde a
también
permitió
Tamandua mexicana (Morales-Jiménez et al. 2004). Así
identificar
ingestas
mixtas
en
Lutzomyia
micropyga
(n=1)
alimentándose de Homo sapiens (PNOC)-Mabuya sp. (Mt-Cyb), de la misma forma se
detectaron 3 ingestas mixtas en Lutzomyia panamensis alimentándose de Homo
sapiens (PNOC)-Bos taurus (Mt-Cyb) en una muestra, y de Homo sapiens (PNOC)Equus asinus (Mt-Cyb) en dos muestras de esta especie flebotomínea. La Figura 14
ilustra la forma en que la BlastN taxonómica organiza los datos de acuerdo a jerarquías
taxonómicas y rangos de similaridad genética asociadas a las diferentes jerarquías
señalando de una forma mas precisa la identidad de la fuente alimenticia detectada,
mientras que las relaciones fuente alimenticia-flebotomíneo y la frecuencia con la que
estos vertebrados fueron detectados es mostrada en la Tabla 2, por otra parte la tabla 3
muestra la distribución de las fuentes sanguíneas identificadas respecto al ambiente
domiciliar y por método de trampeo.
En un esfuerzo por recuperar información descartada a partir de los individuos en los
cuales se co-amplificó el gen Mt-Cyb de insectos (Insecta, ver Tabla 2), fue realizado un
ensayo de PCR adicional para amplificar una región de aproximadamente 772pb del
gen Mt-Cyb de mamíferos según las condiciones descritas por Ngo & Kramer (2003)
con optimizaciones hechas en nuestro laboratorio para el trabajo con flebotomíneos. En
este ensayo se utilizaron 12 Lutzomyia evansi, 3 Lutzomyia cayennensis, 1 Lutzomyia
panamensis y 1 Lutzomyia rangeliana, sin embargo no se obtuvo el amplicón esperado
en ninguno de los individuos analizados (Figura 15).
51
Figura 14. BlastN Linneaus del software Geneious, señalando a Bos taurus como fuente
alimenticia de una hembra de Lutzomyia evansi alimentada.
Figura 15. PCR negativa del gen Mt-Cyb mamíferos en muestras con ingestas alimenticias no
identificadas por PNOC/Mt-Cyb.
52
Fuente Alimenticia (N)
Especie Flebotomínea (frecuencia y método de colecta)
Equus asinus (20)
Lu. evansi (14 BA, 2 CDC), Lu. panamensis (4 CDC)
Bos taurus (18)
Lu. evansi (9 Sh, 5 BA, 3 CDC), Lu. panamensis (1 Sh)
Lu. evansi (4 Sh, 2 CDC), Lu. panamensis (2 CDC, 1 Sh), Lu. micropyga (2 BA),
Homo sapiens (13)
Lu. shannoni (1 BA), Lu. atroclavata (1 BA)
Equus caballus (4)
Lu. evansi (1 BA, 1 CDC), Lu. panamensis (1 CDC), Lu. c. cayennensis (1 BA)
Sus scrofa (4)
Lu. evansi (3 CDC, 1 Sh)
Tamandua mexicana (2)
Lu. trinidadensis (1 BA), Lu. shannoni (1 BA)
Mabuya sp. (2)
Lu. micropyga (2 BA)
Proechimys guyanensis (2)
Lu. evansi (1 Sh), Lu. cayennensis (1 Sh)
Gallus gallus (1)
Lu. evansi (1 Sh)
Tabla 2. Fuentes alimenticias de las especies flebotomíneas analizadas. N: Frecuencia de
fuente alimenticia, BA: búsqueda activa, Sh: Shannon.
Ambiente Captura
Fuente sanguínea (N)
Municipio
Intra
Peri
Extra
OV
LP
SIN
COL
Equus asinus (20)
0
4
16
4
12
0
4
Bos taurus (18)
1
11
6
7
11
0
0
Homo sapiens (13)
0
9
4
5
4
2
2
Equus caballus (4)
0
3
1
2
0
1
1
Sus scrofa (4)
1
3
0
3
1
0
0
Tamandua mexicana (2)
0
2
0
0
0
2
0
Mabuya sp. (2)
0
1
1
1
0
1
0
Proechimys guyanensis (2)
0
2
0
1
1
0
0
Gallus gallus (1)
1
0
0
1
0
0
0
3
35
28
24
29
6
7
TOTAL
Tabla 3. Fuentes alimenticias identificadas por ambiente de captura y municipalidad. N:
Frecuencia de fuente alimenticia, OV: Ovejas, LP: Los Palmitos, SIN: Sincelejo, COL: Colosó.
53
A partir de la Tabla 2 también podemos observar antropofília en 5 de 8 especies
flebotomíneas analizadas, que corresponden a Lutzomyia atroclavata, Lutzomyia
micropyga, Lutzomyia panamensis, Lutzomyia shannoni y Lutzomyia evansi. El índice
de antropofília solo fue computado para esta última especie debido a su número de
individuos evaluados (IA= 6/47, 12.76%). Ingestas sanguíneas mixtas fueron detectadas
usando en conjunción ambos genes (PNOC y Mt-Cyb) en 4 individuos: 1 Lutzomyia
micropyga alimentada con Mabuya sp. (Mt-Cyb)–Homo sapiens (PNOC), 2 individuos
de Lutzomyia panamensis en el que se detectó Equus asinus (Mt-Cyb)–Homo sapiens
(PNOC) y 1 individuo de la misma especie flebotomínea, alimentada de Bos taurus (MtCyb)-Homo sapiens (PNOC). Los datos de la Tabla 3 nos permiten deducir que los
flebotomíneos son capaces de movilizarse luego de una ingesta sanguínea parcial con
el fin de completar la ingestión, es así como encontramos flebotomíneos en el
intradomicilio que se alimentaron de animales asociados a ambientes peridomiciliares
y/o extradomiciliares como Bos taurus, Sus scrofa y Gallus gallus.
El análisis de correspondencia realizado entre las especies flebotomíneas y sus fuentes
alimenticias muestra 4 importantes asociaciones: I) Lu. micropyga – Mabuya sp., II) Lu.
shannoni / Lu. trinidadensis – Tamandua mexicana, III) Lu. cayennensis – Proechimys
guyanensis / Equus caballus y IV) Lu. evansi – Bos taurus / Equus asinus / Gallus
gallus. Estas complejas asociaciones son apoyadas por el análisis multivariado, puesto
que los dos ejes principales explican el 71.85% del total de las observaciones (Eje 1=
41.042%, Eje 2= 30.808%). Este análisis muestra las tendencias de poblaciones
54
flebotomíneas por sus fuentes alimenticias (Figura 16).
Figura 16. Análisis de correspondencia entre las especies flebotomíneas (circulos y color de
fuente negra) y sus fuentes alimenticias (círculos y color de fuente rojo).
55
Para cuantificar las asociaciones flebotomíneos-fuentes alimenticias estadísticamente y
evaluar si existen diferencias significativas entre las frecuencias con las cuales se
alimentaron de ciertos grupos animales, se computó el estadístico Ji-cuadrado entre
frecuencias observadas y frecuencias esperadas bajo un esquema de igual
probabilidad. Este procedimiento estadístico fue realizado a la especie flebotomínea
Lutzomyia evansi, debido a que fue la única especie que registró suficientes datos para
realizar este análisis, arrojando un valor de probabilidad de
P= 0.0001 (P<0.05)
demostrando que existen diferencias significativas y que es altamente probable que
exhiban preferencia alimenticia por Bos taurus y Equus asinus (Tabla 4)
Fuente Alimenticia
Frecuencia Observada
Bos taurus
17
Equus asinus
16
Homo sapiens
6
Prueba χ²
χ ²: 39.200
6 grados de libertad
Sus scrofa
4
P dos colas: 0.0001
Equus caballus
2
Gallus gallus
1
Proechimys guyanensis
1
Tabla 4. Prueba de Ji-cuadrado de fuentes alimenticias en Lutzomyia evansi.
56
Los resultados de este análisis coinciden con la distribución relativa de esta especie
flebotomínea respecto al domiciliio, donde Lutzomyia evansi se presenta con mayor
frecuencia en el peridomicilio (Figura 7). Gracias a la utilización de gran cantidad de
especímenes (n=58) capturados mediante búsqueda activa en sitios de reposo y
trampas Shannon, es posible afirmar que los resultados y las asociaciones aquí
mostradas se aproximan a un comportamiento hematofágico silvestre de las especies
evaluadas (Alexander et al. 2000), aunque es necesario un mayor número de muestras
para demostrar que estos comportamientos flebotomíneo-fuente alimenticia son
persistentes.
57
7. DISCUSIÓN
7.1
Fauna flebotomínea de focos de leishmaniasis cutánea en Sucre
En general la fauna flebotomínea de ambas municipalidades estuvo compuesta por 8
especies con una abundancia relativa muy similar entre los dos municipios, a excepción
de la especie Lu. atroclavata de la cual no se colectaron especímenes en Ovejas y solo
se obtuvieron dos ejemplares en Los Palmitos, así también ocurrió con la especie Lu.
rangeliana, de la cual no se hallaron especímenes en Los Palmitos en contraste con los
10 individuos encontrados en Ovejas. En cuanto a los índices ecológicos de ambos
municipios, estos fueron muy similares a excepción de las notables diferencias entre los
índices calculados para el método de búsqueda activa entre Ovejas y Los Palmitos
(Tabla 1), que señala al municipio de Ovejas como el más diverso.
Los diferentes análisis realizados muestran dominancia de Lutzomyia evansi sobre el
resto de las especies en la comunidades flebotomíneas, tal como ha sucedido en
trabajos anteriores en el Caribe Colombiano (Travi et al. 2002, Bejarano et al. 2002,
Cortes & Fernandez 2008), sin embargo se notaron diferencias en la fauna de las
especies de moderada abundancia poblacional de los dos municipios, tal es el caso de
Lutzomyia panamensis en Ovejas que registró 201 individuos en Ovejas y solo 44 en
Los Palmitos, en contraste con Lutzomyia dubitans que registró 111 individuos en Los
Palmitos y solo 37 en Ovejas (Tabla 1). Otro caso notable es el de Lutzomyia micropyga
que fue hallada en moderada abundancia poblacional en el municipio de Ovejas
58
mientras que en Los Palmitos se encuentra como una especie exótica (Tabla 1).
Considerando las diferencias observadas entre los municipios de Ovejas y Los
Palmitos, podemos decir que éstas se pueden deber a diversos factores, entre ellos las
actividades económicas propias de cada municipio y a la existencia o ausencia de
parches de vegetación nativa en proximidades a los sitios de muestreo que puedan
albergar diferentes especies flebotomíneas (Figura 3 y 4). El municipio de Ovejas es de
aspecto arborizado, con abundante cobertura vegetal en las zonas donde se presentan
casos de leishmaniasis cutánea, propiciando la existencia de sitios de reposo y de cría
para las diversas especies flebotomíneas; por otro lado, el municipio de Los Palmitos
presenta un paisaje altamente intervenido debido a las intensivas actividades agricolas
y pecuarias que son la base de la economía local y poseen mucha menor proporción
zonas arborizadas en comparación con el municipio de Ovejas. Estas diferencias en la
composición de la fauna flebotomínea de ambos sitios supone la existencia de
diferentes ciclos zoonóticos de Leishmania y otros parásitos tripanosomatídeos
mediada por las especies de mediana abundancia poblacional, en Ovejas se puede
considerar como importantes para un ciclo de transmisión secundario o como probables
vectores secundarios de parásitos a Lutzomyia panamensis, Luzomyia cayennensis,
Lutzomyia micropyga y Lutzomyia gomezi tomando como referentes los antecedentes
de infección por Leishmania u otros parásitos tripanosomatídeos en estas especies
(Santamaria et al. 2006, Cochero et al. 2007, Dominguez-Madera et al. 2010, PaterninaGómez et al. 2011), mientras que en el municipio de Los Palmitos es probable la
59
existencia de ciclos zoonóticos de Leishmania u otros tripanosomatídeos mediada por
Lutzomyia dubitans, Lutzomyia cayennensis y Lutzomyia panamensis, aunque se
desconoce el papel potencial que pueda desempeñar Lutzomyia dubitans como vector
de parásitos tripanosomatídeos.
7.2
Evaluación del marcador genético PNOC para analizar fuentes alimenticias
El marcador genético PNOC ha sido implementado en la detección e identificación de
fuentes alimenticia a partir de flebotomíneos del Viejo Mundo donde fue utilizado con
éxito en 97 individuos pertenecientes 4 especies de Phlebotomus (Diptera:
Psychodidae), amplificando e identificando hasta especie todas las muestras analizadas
(97/97, 100%) y mostrando que estas se alimentaban de hasta tres especies de
mamíferos diferentes (Haouas et al. 2007). En Francia se logró identificar a 6 especies
de mamíferos como fuentes alimenticias para 13 especies de Culicoides (Diptera:
Ceratopogonidae) analizadas utilizando este mismo marcador genético, con una tasa de
amplificación de 91% (143/157) y una tasa de identificación de las muestras de 100%
(143/143) (Ninio et al. 2011).
En nuestro trabajo se pudo obtener una tasa de amplificación de 37.5% (30/80) de
muestras pertenecientes a 8 especies analizadas, de los 30 amplicones del gen PNOC
obtenidos solo 10 de ellos fueron adecuados para la secuenciación directa de ADN
(12.5%, 10/80). Las inespecificidades co-amplificadas durante la PNOC-PCR tuvieron
60
un comportamiento sostenido, es decir, los individuos que mostraban estas
inespecificidades siempre fueron los mismos, en contraste con algunas muestras que
amplificaron únicamente la banda esperada (Figura 11), este hecho puede deberse a
múltiples factores, sin embargo una de las explicaciones más razonables puede ser el
origen mismo de la sangre, tiempo de postingestión o un estado fisiológico particular de
esas muestras que afecte la amplificación satisfactoria (Mukabana et al. 2002, Oshaghi
et al. 2005, Noguera et al. 2006, Chagas et al. 2007, Haouas et al. 2007). Esta hipótesis
en la falla de amplificación del gen nuclear PNOC debido a una condición o
característica fisiológica de la muestra, es apoyada por los resultados que mostraron
cada una de las repeticiones, desde muestras que produjeron una banda única hasta
muestras con múltiples bandas, aún después de evaluar concentraciones de cloruro de
magnesio entre 1-4mM, temperatura de alineamiento de cebadores desde 50ºC hasta
67ºC y variación en la cantidad de ADN plantilla utilizada en cada ensayo que varió
entre 30-80 ng por reacción. Respecto a la valoración cualitativa de los cromatogramas
de secuenciación directa de ADN pudimos notar una calidad comparable a la del
marcador de referencia Mt-Cyb Vertebrados (Figura 13).
La valoración de tres criterios primarios (eficiencia de amplificación, reproducibilidad y
legibilidad de los cromatogramas de secuencia) sugiere que el uso de este marcador
para identificar fuentes alimenticias tiene un limitado poder, por tanto se recomienda el
uso de este marcador solo en compañía de un marcador altamente productivo como el
gen Mt-Cyb, debido a que en conjunción se obtiene información complementaria que
61
resultó ser de gran relevancia, como es evidente por la identificación de ingestas
sanguíneas mixtas que involucran al humano.
7.3
Fuentes alimenticias de los flebotomíneos
El análisis genético de las secuencias de ADN obtenidas a partir de los 90 amplicones
seleccionados, sumadas a un análisis de correspondencia utilizando una matriz
especie-especie, apoyó la existencia de relaciones notables entre las diferentes
especies flebotomíneas y sus fuentes alimenticias (Figura 16).
De este análisis es importante resaltar la fuerte asociación de Lu. micropyga con el
reptil Mabuya sp., considerando que en Panamá esta especie flebotomínea fue hallada
con sangre de reptil/anfibios mediante técnicas serológicas por Tesh et al. (1971),
además del reciente reporte de infección por parásitos tripanosomatídeos hasta ahora
no identificados en esta especie flebotomínea (Paternina-Gómez et al. 2011). Mabuya
es un género de pequeños lagartos denominados comúnmente como “Lisas” por su
apariencia brillante (Galván-Guevara & de la Ossa 2009), son diurnas, habitan zonas de
bajas altitudes y aunque habitan predominantemente zonas boscosas se les puede
observar en áreas abiertas (Withing et al. 2006). Esta descripción del hábitat de Mabuya
concuerda con los sitios del presente trabajo donde Lu. micropyga fue encontrada.
Otra asociación importante es la que mostraron las especies Lu. trinidadensis y Lu.
62
shannoni con el mamífero Tamandua mexicana, si tenemos en cuenta que la primera
especie flebotomínea es un vector de Leishmania y la segunda ha sido asociada a
focos de transmisión de Leishmania en algunas zonas de América como probable
vector (Lawyer et al. 1987, Bonfante-Garrido et al. 1990).
Los análisis serológicos realizados por Tesh et al. (1971) indicaban que la especie Lu.
trinidadensis se alimentaba exclusivamente de reptiles/anfibios, sin embargo, en
nuestro trabajo se halló sangre del mamífero Tamandua mexicana en la única muestra
analizada, re-evaluando el concepto que previamente se tenía acerca de su
exclusividad alimenticia por animales ectotérmicos. Así también se observó en la misma
zona a Lu. shannoni picando a humanos y a Tamandua mexicana, la cual pertenece a
un grupo de mamíferos denominados como edentados, en el trabajo de Tesh et al.
(1971) se encontró que Lu. shannoni se alimentaba de hasta 76% de mamíferos y que
de ese total un 36.6% eran edentados, sin llegar a precisarse la identidad del mismo. Es
importante mencionar que la mayoría de estudios realizados en reservorios de
leishmaniasis han sido desarrollados en áreas de Suramérica donde se encuentra
Tamandua tetradactyla (la otra especie de este género de mamíferos), aunque se
considera a Tamandua mexicana un potencial reservorio de diferentes especies de
Leishmania (Stephens et al. 2009, Navarrete & Ortega 2011), teniendo en cuenta que
sus hábitos y biología es similar a la de su especie hermana que es un reservorio
reconocido de estos parásitos (Lainson & Shaw 2005,)
63
Otra asociación importante es la de Lu. cayennensis – Equus caballus / P. guyanensis,
lo que demuestra que esta especie no se alimenta exclusivamente de reptiles tal como
fue sugerido por Lewis (1975), en este estudio solo fueron analizables dos muestras
que revelaron un cierto grado de generalismo en esta especie flebotomínea al
alimentarse
de
especies
de
(Perissodactyla y Rodentia)
mamíferos
pertenecientes
a
órdenes
diferentes
con hábitats muy disímiles, además Proechimys
guyanensis ha sido asociado como reservorio de Leishmania en focos de especies del
complejo Leishmania mexicana y como reservorio de especies del complejo Leishmania
braziliensis, al igual que varias especies más del grupo de las ratas espinosas al que
pertenece (Lainson et al. 1981, Dedet et al. 1989, Travi et al. 1998, Reyes & Arrivillaga
2009).
Por otra parte, se evidenció en el análisis de correspondencia que las fuentes
alimenticias más importantes para Lu. evansi y Lu. panamensis son Bos taurus y Equus
asinus, que constituyeron el 63,33% (38/66) del total de vertebrados identificados,
particularmente para Lu. evansi debido al número de ejemplares analizados (Tabla 2).
Las asociaciones de Lu. evansi por sus fuentes alimenticias fueron comparadas usando
una prueba Ji-cuadrado para evaluar la existencia de diferencias significativas en las
frecuencias de sus fuentes alimenticias (47 identificadas), la prueba estadística señala
una preferencia alimenticia de Lutzomyia evansi por Bos taurus y Equus asinus (Tabla
4), hecho que coincide con la alta abundancia peridomiciliar que exhibe esta especie
flebotomínea (Figura 7). El papel de los bovinos y equinos en la epidemiología de la
64
leishmaniasis no es claro, aunque existen reportes de leishmaniasis cutánea en ambos
organismos y pocos trabajos se han enfocado en la búsqueda sistemática de
Leishmania en estos animales (Bhattarai et al. 2010, Rolão et al. 2005, Cerqueira et al.
2003), además existe evidencia de altas cargas parasitarias en Bos taurus y una
considerable prevalencia en zonas endémicas (Da Silva et al. 2011), lo cual podría
significar que constituye un reservorio no considerado anteriormente o poco explorado
en la epidemiología de la leishmaniasis en Colombia si tenemos en cuenta que
Lutzomyia evansi además de ser vector de leishmaniasis visceral, es también vector de
leishmaniasis cutánea en el Caribe colombiano (Pérez-Doria et al. 2011).
Es importante resaltar que la ganadería extensiva es la principal actividad económica en
Los Palmitos, hecho que concuerda con la alta frecuencia con la que Lutzomyia evansi
se alimenta de Bos taurus, aunque la frecuencia con la que se alimenta de Equus
asinus fue mayor a pesar de que estos equinos poseen una menor población debido a
su papel como animal de ayuda en las labores domésticas; en el municipio de Ovejas
por el contrario, la principal fuente alimenticia fue Bos taurus seguida por Equus asinus
(Tabla 3), a pesar que la principal actividad económica es la agricultura mientras que la
ganadería constituye una actividad secundaria con una baja densidad poblacional de
bovinos (Gobernación de Sucre, 2012). Adicioinalmente, resulta muy interesante desde
el punto de vista epidemiológico que flebotomíneos que se alimentan de animales
habitualmente asociados al peri y extradomicilio puedan desplazarse hasta el área
intradomiciliar como Bos Taurus, Sus scrofa y Gallus gallus (Tabla 3). En nuestro caso,
65
los tres tipos de fuentes alimenticias halladas en el intradomicilio fueron ingeridas por
hembras de la especie Lutzomyia evansi, fenómeno que indica el potencial de
desplazamiento de este flebotomíneo para obtener una segunda ingesta alimenticia.
El análisis molecular de fuentes alimenticias provee información acerca del
comportamiento alimenticio de los flebotomíneos y es de gran utilidad para una
posterior búsqueda de reservorios silvestres de Leishmania, puesto que redujo el
potencial listado de docenas de especies animales en las zonas a solo 9 taxones,
suministrando información de interés epidemiológico como el potencial antropofílico de
especies flebotomíneas consideradas exentas de este comportamiento, como en el
caso de Lu. micropyga que mostró alimentarse de reptiles del género Mabuya y picar al
humano.
Metodológicamente, es posible extrapolar este trabajo al estudio de otras enfermedades
transmitidas por vectores como Chagas, Rickettsiosis, Malaria, Fiebre Amarilla entre
otras, teniendo en cuenta que los flebotomíneos son capaces de ingerir hasta 0.5uL de
sangre en comparación con los grandes volúmenes de sangre que son capaces de
ingerir los mosquitos y garrapatas (Haouas et al. 2007), por otra parte, los análisis
estadísticos en conjunto con el conocimiento de aspectos básicos de ecología de las
comunidades flebotomíneas respecto al domicilio, nos permite aproximarnos de una
manera más integral a la dinámica de transmisión de la leishmaniasis en el
departamento de Sucre.
66
8. CONCLUSIONES
1. Lutzomyia evansi es la especie flebotomínea dominante en la comunidad
flebotomínea en áreas de transmisión de leishmaniasis cutánea en el
departamento de Sucre.
2. Existen diferencias considerables en la frecuencia de especies con moderada
densidad poblacional entre los dos municipios estudiados, Ovejas (subregión
Montes de María) y Los Palmitos (subregión Sabanas), atribuibles principalmente
a las diferencias en la composición del paisaje de ambos municipios.
3. A pesar de que el gen PNOC provee información valiosa que no fue detectada
por el gen Mt-Cyb vertebrados, el uso del gen PNOC como único marcador para
identificar fuentes alimenticias no es apropiado en flebotomíneos americanos.
4. La comunidad flebotomínea presente en zonas de transmisión de leishmaniasis
cutánea en el departamento de Sucre se alimenta de una gran variedad de
organismos vertebrados, sin embargo, fueron detectadas tendencias de algunas
especies flebotomíneas que pueden ser importantes desde el punto de vista
epidemiológico.
67
5. Lutzomyia evansi posee una fuerte asociación o predilección alimenticia por Bos
taurus y Equus asinus, hipótesis apoyada por los diversos análisis estadísticos
realizados a las muestras analizadas y por las las altas densidades
peridomiciliares.
68
9. RECOMENDACIONES

Se recomienda el uso sistemático de diferentes métodos de colecta para abordar
íntegramente el estudio de la fauna flebotomínea, debido que ciertas especies
pueden ser recolectadas por métodos específicos.

Se recomienda la evaluación de un número mayor de muestras de cada especie
flebotomínea para tener una panorámica más amplia que permita analizar la
existencia de patrones o preferencias alimenticias.

Se recomienda la evaluación de otros marcadores genéticos exclusivos de
vertebrados como posibles alternativas al gen mitocondrial Mt-Cyb, para sobrellevar
las dificultades que presenta este gen al coamplificar secuencias del insecto.

Se recomienda el análisis de infección por Leishmania en poblaciones animales
identificadas como fuentes alimenticias de las diferentes especies flebotomíneas.
69
10.
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