Cuaderno de prácticas
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PROCEDIMIENTOS BIOQUÍMICOS Y FISIOLÓGICOS EN LAS ALTERACIONES DE LA SALUD CUADERNO DE PRÁCTICAS CURSO ACADÉMICO 2006-2007 Alumno/a____________________________________________ Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud INTRODUCCIÓN Un laboratorio clínico es el lugar en el que se efectúan trabajos experimentales y se realizan análisis y exámenes bioquímicos, serológicos, histológicos citológicos, bacteriológicos... En la actualidad, la mayoría de los diagnósticos pueden verse completados, confirmados o sujetos a revisión gracias a las técnicas de laboratorio y, por ello, buena parte de la responsabilidad del mantenimiento de la salud recae sobre ellos. En definitiva, las técnicas analíticas cumplen básicamente tres objetivos: • Aportan información para que el médico diagnostique adecuadamente • Permiten seguir la evolución de una enfermedad durante el tratamiento • Pueden ser utilizadas como medida preventiva para conocer el estado de salud de los individuos y detectar precozmente alguna alteración. Cuatro son las condiciones de un buen profesional de laboratorio: • Ciencia: es imprescindible una compresión adecuada • Paciencia: meticulosidad y capacidad crítica • Conciencia: de la responsabilidad del trabajo realizado • Instrumentación: conocimiento básico de los aparatos e instrumentos utilizados. OBJETIVO El objetivo de estas prácticas es familiarizar al alumno con las distintas técnicas experimentales empleadas en el laboratorio de análisis clínicos, trasladando al mismo los conocimientos adquiridos durante la docencia teórica. 1 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud INSTRUCCIONES GENERALES Material necesario Cada alumno deberá venir provisto del siguiente material: § § § § Bata de laboratorio Cuaderno Rotulador de vidrio (si es posible) Bolígrafo, papel milimetrado, regla y calculadora Laboratorio Sigue cuidadosamente las normas de seguridad. Trata el material con cuidado y rotula adecuadamente todos los tubos y cualquier otro recipiente que utilices. Limpieza Al finalizar la práctica, todo el material de cada grupo, así como el material de uso general deberá quedar perfectamente limpio y sin rótulos, el último enjuague debe realizarse con agua destilada. Asistencia Es obligatorio asistir a todas las sesiones prácticas Evaluación Se evaluará de forma continuada en el laboratorio durante el desarrollo de las sesiones prácticas tanto las aptitudes como las actitudes mostradas por el alumno. Tras la finalización del periodo de prácticas se entregará, de forma voluntaria, un cuaderno en el que se incluirán: las respuestas a las cuestiones planteadas, los cálculos realizados así como los resultados obtenidos en cada determinación, un comentario personal con la descripción de las técnicas empleadas, el material utilizado, las normas de manipulación de la muestra, los posibles problemas acaecidos, etc. Si los resultados obtenidos fueran erróneos, el alumno deberá indicar las posibles causas que han originado el error así como la forma de subsanarlas. 2 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud SEGURIDAD EN EL LABORATORIO Es necesario, antes de comenzar cualquier prueba, saber la finalidad y procedimiento experimental exacto con el objeto de tener preparado todo el material y los reactivos necesarios. Aquellos materiales o reactivos que se utilicen con más frecuencia se tendrán guardados en lugares fácilmente accesibles. Es esencial la limpieza, tanto durante el trabajo como al final del mismo. En todo laboratorio existen riesgos potenciales que requieren una atención especial. Como normas generales para prevenir los accidentes se pueden considerar las siguientes: 1. Debe utilizarse bata mientras se permanece en el laboratorio 2. No se debe comer o beber dentro del laboratorio, ni utilizar recipientes para beber o conservar alimentos 3. Antes de utilizar los reactivos, leer los rótulos 4. No dejar destapados los envases 5. Guardar las medidas de asepsia cuando ello sea necesario. En el laboratorio clínico se debe trabajar con guantes en todo momento. 6. Mantener limpio el lugar de trabajo y lavar el material utilizado al finalizar el análisis 7. No fumar 8. No succionar con la boca una pipeta. Utilizar peras de goma. 9. No abandonar una prueba que no está acabada, a no ser que se especifique claramente que se puede hacer 10. El material de vidrio roto se debe proteger antes de tirarlo para evitar cortes 3 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud PRÁCTICA 1 DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SUERO. MÉTODO GOD-POD Con esta práctica se pretende determinar la concentración de glucosa en una muestra de suero, utilizando un kit comercial basado en el método GOD-POD. La glucosa es el glúcido principal del cuerpo y todos los otros glúcidos se convierten en glucosa después de su digestión y absorción. Los niveles de glucosa en sangre se mantienen entre unos límites muy estrechos y constantes gracias, fundamentalmente, a la acción de dos hormonas: insulina y glucagon. En general, dichos valores nunca deben sobrepasar los 200 mg/dl, por grande que sea la ingestión de hidratos de carbono, ni descender por debajo de 50 mg/dl en condiciones fisiológicas. Interpretación de los datos de laboratorio -Hiperglucemia: entre las alteraciones que cursan con hiperglucemia podemos citar: - Diabetes mellitus: síndrome caracterizado por un aumento en los niveles fisiológicos de la glucosa y que cursa de manera característica con polifagia, poliuria y polidipsia. Durante las clases teóricas se explicará detalladamente las pruebas de laboratorio que llevan a su diagnóstico. - Disminución de la tolerancia a la glucosa: glucemia basal inferior a 140 mg/dl y, a las dos horas de sobrecarga oral de glucosa, valores intermedios entre los fisiológicos y los típicos de la diabetes. -Hipoglucemia: hablamos de hipoglucemia cuando los niveles de glucosa en sangre se sitúan entre 40 y 45 mg/dl. La hipoglucemia puede presentarse en ayunas, o bien ser reactiva a la ingestión de alimentos o a la toma de medicamentos CUESTIONES 1. ¿Cuál es la finalidad del blanco? ¿Cómo se ajusta el espectrofotómetro con el blanco? ¿Ha realizado un blanco de reactivos o de suero? por qué? 2. Calcule la concentración de glucosa en el suero indicando los cálculos realizados. 3. Si la concentración de glucosa hubiera sido superior a 500 mg/dL. ¿Cómo habría actuado? 4. Para la determinación ha utilizado un método enzimático. ¿Se trata de un método cinético? Justifique su respuesta 4 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud 5 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud PRÁCTICA 2 DETERMINACIÓN DE COLESTEROL TOTAL El objetivo de esta práctica es realizar la determinación del colesterol total presente en una muestra de suero, siguiendo para ello las instrucciones de un kit comercial. El colesterol es un alcohol esteroide insaturado muy soluble en grasas pero poco hidrosoluble. El colesterol presente en el organismo tiene un doble origen: § El que procede de la dieta -exógeno- se encuentra en su mayor parte en forma libre –no esterificado-. El colesterol esterificado es hidrolizado por la colesterol esterasa pancreática dando colesterol libre y ácidos grasos. § El colesterol endógeno –aunque puede ser potencialmente sintetizado por todas las células- se forma fundamentalmente a nivel hepático e intestinal y es eliminado por el hígado –con la bilis- o utilizado para la síntesis de ácidos biliares. El colesterol circula en sangre unido a las lipoproteínas: § § § Las LDL transportan el 70% del colesterol Las HDL del 15 al 20% El resto, circula unido a las VLDL y a los quiliomicrones. El aumento de la concentración plasmática de colesterol, se asocia a un incremento del riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares, por lo que su regulación tiene un alto interés epidemiológico. Interpretación de los datos de laboratorio Niveles elevados de colesterol en sangre se van a encontrar en casos de: 1. Dietas ricas en colesterol y grasas saturadas; estas últimas pueden elevar hasta en un 15-20% la cifra de colesterol sanguíneo. 2. Hipotiroidismo, como consecuencia de la disminución del metabolismo lipídico 3. Diabetes mellitus: debido al incremento notable del metabolismo lipídico 4. En enfermedades de retención renal: en estos casos se eleva tanto el colesterol sanguíneo como los triglicéridos y los fosfolípidos. Se cree que es debido a la inhibición de la lipoprotein lipasa, de manera que se elevan considerablemente las grasas sanguíneas. 5. En casos de ictericia obstructiva Niveles bajos de colesterol en sangre suelen ser indicativos de hepatitis grave y cirrosis. 6 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud 7 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud CUESTIONES 1. Si tuviera que preparar un blanco de suero ¿cómo lo haría? Razone su respuesta. 2. ¿Por qué se incuban los tubos durante 5 min. a 37ºC o 10 min. a Tª ambiente? ¿Por qué varía el tiempo en función de la temperatura? 3. Si la muestra tuviera un valor de 700 mg/dl ¿podría aplicar el método directamente? 4. Determine el valor de colesterol en la muestra problema, especificando los valores experimentales de D.O. obtenido y el cálculo realizado. 5. Si el paciente cuyo suero ha analizado tuviera una concentración de triglicéridos de 200 mg/dl y un nivel de colesterol HDL de 60 mg/dl ¿Cuál sería su concentración de colesterol LDL? 8 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud PRACTICA 3 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS En esta práctica se realizará la cuantificación de las proteínas presentes en una muestra de suero. Las proteínas presentes en el plasma forman parte de un sistema metabólicamente "dinámico" con características y funciones muy diversas. La suma de las concentraciones de todas y cada una de las proteínas presentes en el plasma, se conoce como proteínas totales y en condiciones normales oscila entre 66 y 83 g/L. Fundamento Existen diferentes métodos para determinar la concentración de proteínas de una muestra. El método de Bradford se basa en el cambio de color que se produce cuando el Azul Brillante de Coomasie se une a las proteínas MATERIAL -Reacti vo de Bradford -Albúmina sérica bovina (BSA) (1 mg/ml). -Muestras: Como es un método espectrofotométrico (Ley de Lambert-Beer), las muestras deben estar convenientemente diluidas para que sus absorbancias se encuentren dentro de los valores de la recta de calibración. Así, la muestra problema inicial (S1 ), se diluirá a la mitad 1/2 para obtener otra a la que denominaremos S2. PROCEDIMIENTO 1. Prepare 8 tubos, 6 para la recta patrón (B, 1 2, 3, 4 y 5) y 2 para cada una de las muestras problema que haremos directamente en el tubo de análisis (S1, S2) según el protocolo esquematizado en la tabla siguiente: Tras añadir estos reactivos habrá exactamente 0.1 mI en cada tubo de análisis. 9 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud 2. Añada 5 mI de reactivo Bradford a cada uno de los tubos. Agite sin que se forme espuma 3. Incube la mezcla durante 5 minutos. 4. Mida la absorbancia a 595 nm. Primero se mide el tubo blanco (B) que sirve para ajustar el espectrofotómetro (autocero) y a continuación, el resto de los tubos. Con los 6 primeros valores obtenidos (tubos B, 1 2, 3, 4, 5) podremos construir, en un papel milimetrado, la recta patrón apareando los valores de absorbancia (eje Y) con los de concentración de glucosa (eje X). Esta recta representa la relación que existe entre absorbancia y la concentración de proteínas, y por tanto nos permitirá calcular la concentración de proteínas de las muestras problemas leyendo en dicha recta los valores de absorbancia obtenidos para cada muestra problema (si entran dentro del intervalo de concentraciones comprendido por la recta patrón). Así se calcula la concentración de proteína para cada uno de los tubos de análisis. La concentración de proteínas en cada uno de los tubos de la recta patrón se calcula a partir de la concentración de la solución de albúmina (1 mg/ml) mediante la fórmula C·V = C’·V´ donde C = concentración de albúmina estándar (1 mg/ml); V = volumen de albúmina estándar añadido a cada tubo; C' = concentración de albúmina en ese tubo; V´ = volumen total en el tubo (0,1 ml en todos los tubos). El ajuste de la recta a los puntos se puede hacer gráficamente o por mínimos cuadrados (opcional). En el primer tubo problema (S1) la muestra no está diludida (dilución 1 :1 ) por lo que la concentración de proteínas será la calculada directamente por interpolación en la recta patrón sin necesidad de multiplicar por ningún factor de dilución (el factor sería 1 ). En el segundo tubo problema (S2) la muestra está diluida dos veces (1/2; factor de dilución 2) por lo que la concentración de proteínas en el suero original será 2 veces mayor, así multiplicamos el resultado de concentración obtenido por 2. Para calcular la concentración de proteínas en el suero original (sin diluir), como hemos realizado dos medidas a diferentes diluciones, una vez normalizadas (es decir, multiplicadas por 1 o por 2, según el caso) podremos calcular la media aritmética entre ellas, y esta será el resultado del análisis (sí los resultados obtenidos entre ambas diluciones son coherentes ). Interpretación de los datos de laboratorio El aumento en la cifra de proteínas plasmáticas totales, suele deberse a una disminución relativa del volumen de líquido plasmático debido a hipovolemia o a una deshidratación (en realidad lo que varía no es la cantidad total de proteínas sino la proporción entre éstas y el nivel hídrico del organismo). 10 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud La disminución en la cantidad de proteínas totales, puede tener causas tan variadas como: El aumento del volumen plasmático, como consecuencia de una retención de líquidos. La disminución en la síntesis de albúmina debido a alteración hepática o desnutrición graves . El descenso en la producción (hipogammaglobulinemia) o aumento de las pérdidas (quemaduras intensas, síndrome nefrótico) de la fracción de las globulinas. CUESTIONES 1. ¿Qué es y para que sirve una recta patrón? Calcule la concentración de albúmina de los distintos puntos de la recta patrón. 2. ¿Qué interferencias está eliminando el blanco utilizado? Razone la respuesta. 3. Dibuje la recta de calibración enfrentando los valores de absorbancia (eje Y) obtenidos para cada concentración de albúmina (eje X). Calcule la ecuación de la recta por el método de los mínimos cuadrados (opcional). 4. Calcule la concentración de proteínas de S2. 5. Calcule la concentración de la muestra S1 utilizando el resultado de la concentración de proteínas obtenida para S2 y el valor obtenido en el tubo S1. 6. Si suponemos que el suero del enfermo se diluyó 200 veces (1/200) para obtener S1 ¿Cuál será la concentración de proteínas del suero del enfermo? 11 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud PRACTICA 4 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS El objetivo de esta práctica es separar mediante electroforesis las proteínas del plasma sanguíneo identificando tras tinción las distintas fracciones obtenidas. Fundamento Las proteínas poseen carga eléctrica en función de sus grupos ionizables y del pH y, por tanto, son capaces de migrar al ser sometidas a un campo eléctrico (Electroforesis). Normalmente se utiliza un tampón a pH > 8.0. A estos valores de pH, la mayoría de las proteínas están cargadas negativamente, por lo que se desplazan hacia el polo positivo (ánodo). La velocidad de desplazamiento de cada proteína estará determinada por su carga y su tamaño (relación carga/masa). La electroforesis de las proteínas plasmáticas nos permite separar 5 fracciones con cargas negativas decrecientes, que son: Albúmina (la más negativa); α 1-globulinas; α 2-globulinas; ß-globulinas; (fibrinógeno en el caso de utilizar plasma), y γ-globulinas (las menos negativas). Material - Cubeta de electroforesis Alimentador para electroforesis Aplicador semi-micro Tiras de acetato de celulosa Tampón veronal sódico 0,04 M: Dietilbarbiturato sódico 8,24 g/l (preparado comercial, pH >9) Colorante: Negro amido, 0,5 g; Metanol, 45 ml; Ac. acético 10 ml; Agua destilada 45 ml Decolorante: Metanol 47,5 ml; Ac. Acético 5 ml; Agua destilada 47,5 ml Plasma o suero sanguíneo humano Procedimiento experimental - - Sumerja previamente las tiras de acetato de celulosa en el tampón durante 15 min. como mínimo, y absorber el exceso de tampón de las tiras entre dos hojas de papel de filtro. Monte las tiras sobre el puente de la cubeta de electrofo resis, previamente llena de tampón, con la cara absorbente hacia arriba. Con el aplicador, tome el plasma sanguíneo problema y póngalo sobre la tira a un centímetro del borde del cátodo (polo negativo) de color negro. A los valores de pH determinados por el tampón, las proteínas plasmáticas muestran carga negativa, por lo que migrarán hacia el ánodo (polo positivo) 12 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud - de color rojo. Por tanto es muy importante la colocación correcta de las tiras en la cubeta de electroforesis. Conecte la fuente de alimentación y deje correr la electroforesis durante 35 min. a 200 v. Terminada la migración desconecte el alimenta dor y la cubeta. Coloree las tiras durante 5 minutos con el colorante negro amido. Decolore las tiras realizando 3 ó 4 baños en la solución decolorante hasta que se visualicen bien las bandas y los líquidos de lavado estén limpios. La solución decolorante una vez utilizada se filtra con carbón activo para su reutilización. Valores normales en el adulto: Rango % - Albúmina 54-62 % - α 1-globulinas 2-5 % - α 2-globulinas 7-10 % - ß-globulinas 8-13 % - γ-globulinas 14-19 % Rango de g/100 ml 3,4 - 5,4 0,2 - 0,4 0,5 - 0,9 0,6 - 1,1 0,7 - 1,7 Cuestiones 1. ¿Por qué se utiliza un tampón de electroforesis de pH tan alto (pH=9)? ¿Qué ocurriría si utilizara un tampón de pH inferior ej. pH=6? 2. ¿Qué finalidad se persigue sumergiendo las tiras de acetato de celulosa en el tampón 15min antes de la electroforesis? 3. ¿Cerca de qué polo se aplican las proteínas? ¿Por qué? 4. ¿Para que se utiliza el colorante negro amido? 5. ¿Qué diferencia se observa al hacer el proteinograma en una muestra de plasma en lugar de suero? ¿Cómo cuantificarías las fracciones proteicas? 6. ¿Cómo realizaría un lipidograma? 13 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud PRACTICA 5 ANÁLISIS DE ORINA MEDIANTE EL EMPLEO DE TIRAS REACTIVAS La finalidad de esta práctica es realizar el análisis de anormales en una muestra de orina. La tira reactiva diagnóstica de inmersión es una tira de plástico a la que se fija una o más almohadillas de celulosa que está químicamente impregnada de tampón y varios indicadores químicos. Cuando se humedece en orina, cada almohadilla se convierte en un medio químico en miniatura que responde a la presencia de compuestos químicos específicos presentes en la muestra. Para obtener resultados semicuantitativos, es importante observar los tiempos que se especifican para la realización de cada lectura. Las zonas reactivas, una vez impregnadas de orina se comparan con las escalas colorimétricas del envase. Se debe considerar la tira reactiva como un dispositivo de selección primaria que junto con el examen visual, permite separar las muestras anormales de las normales. Las anomalías deben dilucidarse usando pruebas de seguimiento y confirmación. Las tiras reactivas disponibles en el mercado tienen tests para: glucosa, bilirrubina, cuerpos cetónicos, densidad, sangre, pH, proteínas, urobilinógeno, nitritos y leucocitos. Composición de las almohadillas Glucosa: 16,3% p/p glucosa oxidasa (1,3UI); 0,6% p/p peroxidasa (3300UI); 7% p/p Yoduro potásico; 60,7% p/p tampón; 15,4% p/p ingredientes no reactivos. Bilirrubina: 0,4% p/p sal de diazonio de 2,4-dicloroanilina; 37,3% p/p tampón; 62,3% p/p ingredientes no reactivos. Cetonas: 7,1% p/p nitroprusiato sódico; 92,9% p/p tampón. Densidad: 2,8% p/p azul bromotimol; 97,2% p/p. Poli(metil vinil éter ácido maleico sal sódica). Sangre: 6,8% p/p diisopropilbenceno dihidroperóxido; 4% p/p 3,3´,5,5´tetrametilbencidina; 48% p/p tampón; 41,2% p/p ingredientes no reactivos. pH: 0,2% p/p rojo metilo; 2,8% p/p azul de bromotimol; 97% p/p ingredientes no reactivos. Proteínas: 0,3% p/p azul de tetrabromofenol; 97,3% p/p tampón; 2,4% p/p. Ingredientes no reactivos. Urobilinógeno: 0,2% p/p p-dietilaminobenzaldehido; 99,8% p/p ingredientes no reactivos. Nitritos: 1,4% p/p p-ácido arsanílico; 1,3% p/p 1,2,3,4-tetrahidrobenzoquinolin3-ol; 10,8% p/p tampón; 86,5% p/p ingredientes no reactivos. Leucocitos: 0,4% p/p éster de pirrol aminoacídico derivatizado; 0,2% p/p sal de diazonio; 40,9% p/p tampón; 58,5% p/p ingredientes no reactivos. 14 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud Recogida y preparación de muestras No deben utilizarse conservantes de orina porque pueden interferir en los resultados de las cetonas, bilirrubina o urobilinógeno. El crecimiento bacteriano también puede afectar a los resultados de glucosa, pH y sangre. Manejar siempre las muestras bajo condiciones sanitarias estrictas. Técnica Las instrucciones deben ser seguidas cuidadosamente para obtener resultados fiables. 1. Utilizar orina fresca recogida en un recipiente limpio y seco 2. Sacar una sola tira del frasco y utilizarla inmediatamente. Sumergir brevemente la tira en la muestra y sacarla con rapidez 3. Escurrir el exceso de orina con el borde del frasco. Mantenerla en posición horizontal 4. Si estamos leyendo visualmente comparar los colores con la carta de colores del frasco –mantener la tira cerca de la tabla de colores y escoger cuidadosamente-. La mayor precisión se obtendrá ajustándola a los tiempos de lectura correctos. Algunos colores toman mayor intensidad con el tiempo y después decrecen, por lo cual colores que aparezcan transcurridos 2 minutos carecen de significado. Si el color de una zona reactiva no es uniforme debemos fijarnos en la zona más oscura. Todas las zonas, excepto los leucocitos, se pueden leer entre 1 y 2 minutos como “screening” de positivo o negativo. Leer los test de leucocitos a los 2 minutos. 5. Si se lee instrumentalmente, seguir las instrucciones de manejo del aparato. 6. Como todos los tests de laboratorio, el diagnóstico definitivo o la decisión terapéutica no debe basarse en un solo resultado o test. Instrucciones de almacenaje y cuidado Almacenar las tiras en su propio frasco. No extraer el desecante. No sacar la tira hasta el momento de su uso. No tocar las áreas reactivas de la tira. Almacenar a temperaturas inferiores a 30ºC, pero no en refrigerador. No almacenar bajo luz directa. Información sobre las áreas reactivas Glucosa. Tiempo de lectura visual: 30 seg. Este test es específico de glucosa; no hay otra sustancia que se conozca presente en orina que dé resultados positivos. En orinas diluidas o con glucosa en pequeña cantidad, concentraciones de ácido ascórbico superiores a 2,2 mmol/l pueden dar falsos positivos. Sensibilidad del test: 4-7 mmol/l. Bilirrubina. Tiempo de lectura visual: 30 seg. Normalmente la bilirrubina no es detectable en orina incluso por los métodos más sensibles. Incluso resultados traza de bilirrubina son suficientes para iniciar una investigación. Colores atípicos (no comparables al bloque positivo o negativo) indican que se deben continuar la investigaciones en esta muestra. Metabolitos de 15 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud drogas que dan color a pH bajo pueden causar falsos positivos. Sensibilidad del test: 7-14 µmol/l. Cetonas. Tiempo de lectura visual: 40 seg. El test reacciona con el ácido acetoacético en orina. No reacciona con acetona ni con ácido betahidroxibutírico. Ciertas orinas de pH bajo y/o densidad alta pueden dar falsos positivos. Las muestras de orina no patológicas suelen dar negativo con este reactivo. Niveles detectables de acetona puden aparecer en caso de dieta, embarazo o ejercicio extremo frecuente. En cetoacidosis o ayuno prolongado junto con otras alteraciones del metabolismo lipídico o de carbohidratos, las cetonas pueden aparecer en grandes cantidades en la orina antes de que se manifiesten en el suero. Sensibilidad del test: 0,5-1 mmol/l. Densidad. Tiempo de lectura visual: 45 seg. Este test permite la determinación de densidades entre 1-1,03. No se afecta por constituyentes no iónicos como la glucosa o colorantes. Orinas alcalinas altamente tamponadas pueden causar lecturas relativamente bajas en comparación con otros métodos. Pueden salir resultados falsamente altos en presencia de concentraciones moderadas de proteínas (1-7,5 g). Sangre. Tiempo de lectura visual: 60 seg. La interpretación del resultado “trazas” puede variar ampliamente entre distintos pacientes y se requiere valorar cada paciente individualmente. El desarrollo de unos puntos verdes (eritrocitos intactos) o de color verde difuminado (hemoglobina/mioglobina libre) en el área reactiva de la tira indican la necesidad de una investigación más profunda. La sangre se suele encontrar en los periodos menstruales de la mujer. Este test es muy sensible a la hemoglobina libre y algo menos a los eritrocitos intactos y así se complementa con la investigación microscópica. La sensibilidad de este test puede disminuir algo en las orinas de alta densidad. Este test es igualmente sensible a hemoglobina como a mioglobina. Alta densidad o proteinuria pueden disminuir la sensibilidad del test. Falsos positivos pueden aparecer por ciertos contaminantes oxidantes o por la peroxidasa microbiana asociada a una infección. Sensibilidad del test: 150-620 µg/l (equivale aproximadamente a 5-20 células intactas por microlitro). pH. Tiempo de lectura visual: 60 seg. El área de pH mide de una en una unidad en el rango de 5 a 8,5 en lectura visual y de 5 a 9 en lectura instrumental. Si no sigue el procedimiento correcto y permanece un exceso de orina en la tira, se puede producir un fenómeno conocido como “runover”, en el cual el tampón del reactivo de proteína contamina la prueba de pH dando un resultado anormalmente bajo. Proteínas. Tiempo de lectura visual: 60 seg. (o inmediatamente, o hasta 2 minutos después de la inmersión de la tira). El área reactiva de la tira es más sensible a las albúminas que a las globulinas, hemoglobinas, proteínas de Vence-Jones y mucoproteínas. Un resultado negativo no puede descartar por lo tanto la presencia de estas últimas. Generalmente no se suele detectar proteínas por este método en orina a pesar de que normalmente se excreta una pequeña cantidad. Cualquier color por encima de trazas es indicador de proteinuria. Para orinas de alta densidad suele aparecer el resultado de trazas en orinas normales. Se precisa una evaluación clínica para valorar el resultado de trazas. Se pueden encontrar falsos positivos en orinas alcalinas o altamente tamponadas y por contaminación con compuestos cuaternarios amoniacales y detergentes. Sensibilidad del test: 0,15-0,30 g/l. Urobilinógeno. Tiempo de lectura visual: 60 seg. El área reactiva puede detectar concentraciones tan bajas como 3 µmol/l (aproximadamente 0,2 unidades Ehrlich). El rango normal es de 3-16µmol/l. Un resultado de 33µmol/l significa el tránsito entre normal y anormal, y el paciente o la orina deben ser examinados con más cuidado. El área reactiva puede tener interferencias con sustancias que interfieran con la reacción de Ehrlich. Reacciones de color atípicas se pueden presentar en caso de presencia de ácido p-aminobenzoico o formalinas. Sustancias altamente coloreadas como riboflavinas pueden enmascarar el desarrollo del color. Con este test no se puede determinar la ausencia de urobilinógeno. 16 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud Nitritos. Tiempo de lectura visual: 60 seg. Este test depende de la conversión de los nitratos en nitritos a través de las bacterias presentes en la orina, generalmente Gram negativas. Este test es específico para nitritos y no reacciona con otras sustancias presentes en la orina. Puntos o bordes rosados no deben confundirse con un resultado positivo. Cualquier desarrollo de color rosa suave uniforme debe interpretarse como un resultado positivo e indicador de al menos 10 microrganismos/ml, pero el desarrollo del color no es proporcional al número de microorganismos presentes. Un resultado negativo no puede probar la ausencia de microorganismos. Pueden aparecer falsos negativos debido a la presencia de microorganismos que no contengan la reductasa para el paso de nitratos a nitritos o cuando la orina no ha pasado tiempo suficiente en la vejiga (4 horas o más) para el proceso de reducción o cuando no haya habido ingesta de nitratos en la dieta. La sensibilidad está reducida en las orinas de alta densidad. Sensibilidad del test: 13-22 µmol/l. Leucocitos. Tiempo de lectura visual: 2 min. Las muestras de orina normales deberían dar en general resultados negativos. Resultados positivos tienen significado clínico. Los resultados de traza deben ser interpretados cuidadosamente aunque, si son repetitivos, se deben considerar positivos. Falsos positivos pueden deberse a descargas vaginales o a drogas. Concentraciones de glucosa elevadas (160mmol/l), alta densidad o la tetraciclina pueden disminuir la sensibilidad. Cualquier sustancia que de color a la orina puede enmascarar la interpretación del test. Sensibilidad del test: 5-15 células/c.a.p. Cuestiones 1. ¿Qué es el análisis de anormales? 2. Describa el procedimiento utilizado para su realización. ¿Ha tenido alguna precaución con la posición de la tira? 3. ¿Por qué deben mantenerse las tiras dentro del frasco evitando al máximo mantenerlo abierto? 4. Describa el resultado obtenido en su muestra de orina. ¿Se trata de un análisis cuantitativo? Justifique su respuesta 17 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud PRÁCTICA 6 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DEL ENZIMA FOSFATASA ALCALINA EN SUERO La actividad enzimática puede determinarse mediante métodos cinéticos o métodos a punto final. Con esta práctica se pretende determinar de la actividad de la enzima fosfatasa alcalina, utilizando para ello un kit comercial basado en un método cinético. Las fosfatasas son enzimas que catalizan la descomposición de los ésteres de fosfato con poca especicidad para un substrato determinado. Existen dos tipos de fosfatasas: la fosfatasa alcalina, que tienen un pH de actividad óptima de 9 y la fosfatasa ácida, que tienen un pH de actividad óptima de 5. Pueden separarse, alterando el pH al cual se realiza la prueba, siendo los métodos de determinación en esencia similares para ambas. Interpretación de los datos de laboratorio La determinación de fosfatasa alcalina se utiliza principalmente para el diagnóstico de las ictericias obstructivas post-hepáticas. Cuando la obstrucción es completa los valores aumentan de 3 a 8 veces sobre los valores normales en suero. Se ha observado que, cuando la enfermedad está producida por un carcinoma pancreático, los niveles de fosfatasa son más elevados que en procesos benignos. Igualmente, se encuentran aumentados en casos de hepatitis vírica, ictericia hepatocelular tóxica, ictericia hepatocanalicular, etc. Se producen elevaciones de esta enzima en procesos hepáticos no ictéricos, como en la enfermedad hepatobiliar, carcinoma hepático y abcesos hepáticos. Otras enfermedades con aumento de los niveles de fosfatasa alcalina son las enfermedades óseas, caracterizadas por un aumento de la actividad osteoblástica, como la enfermedad de Paget, raquitismo, fracturas, tumores óseos, hiperparatiroidismo... Cifras fisiológicamente elevadas pueden producirse en mujeres embarazadas y en niños en crecimiento. La determinación de fosfatasa ácida se utiliza para el diagnóstico de los pacientes con carcinoma prostático, observándose niveles elevados. CUESTIONES 1. En la derminación de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina se ha utilizado un método cinético. Comente sus ventajas 2. ¿Ha preparado algún tubo blanco? ¿Por qué? 3. Dibuje una gráfica en la que enfrente la D.O. obtenida en cada minuto? Calcule el ∆E/min medio. 4. Determine la actividad enzimática explicando el significado del factor 3300 empleado en el cálculo. 5. Si la actividad obtenida fuera demasiado alta ¿Cómo afectaría a la forma de la gráfica? ¿Cómo actuaría para obtener un resultado fiable? 18 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud 19 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud PRÁCTICA 7 TINCIÓN DIFERENCIAL DE EXTENSIONES HEMATOLÓGICAS El objetivo de esta práctica es la realización de una extensión y tinción sanguínea, así como la posterior identificación al microscopio cada una de las células observadas. Los métodos que se pueden seguir utilizar para hacer un análisis de la morfología de las células de la sangre son varios. Se puede hacer un examen en fresco sin coloración, una coloración vital u observar las células fijadas y teñidas. El examen de la sangre teñida es lo más habitual. Para ello se hace una extensión de sangre en un porta, se fija y se tiñe observando por último al microscopio. La extensión de sangre también se denomina frotis. Principalmente se utiliza para hacer recuento de los distintos tipos de leucocitos. Puede obtenerse mucha información del estudio de una extensión de sangre. Nos puede servir tanto para realizar un diagnóstico como para seguir el curso de una enfermedad o indicarnos los efectos nocivos de algún tratamiento. Para que los resultados sean fiables es fundamental que la extensión esté bien hecha. Preparación de la extensión Son varios los métodos a seguir: a) Método del cubreobjetos § § § § § Tomar un cubre y depositar en su centro una gota pequeña de sangre Colocarlo con la gota de sangre mirando hacia abajo Aproximar desde abajo otro cubre de manera que las esquinas de los mismos queden alternadas. La sangre entonces se extiende entre los dos cubres de forma rápida y uniforme. Una vez extendida la sangre se separan los dos cubreobjetos mediante deslizamiento de uno sobre otro. El movimiento ha de ser firme y rápido, no levantándolos ni apretando uno sobre otro. Colocarlos sobre papel de filtro y dejar secar al aire. La parte donde no está la sangre será la que esté en contacto con el papel. b) Método del portaobjetos Es el método más utilizado en la práctica, ya que es mucho más cómodo de realizar. 20 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud Se utilizan dos portas, en uno de ellos se pone la gota de sangre y con el otro se realiza la extensión. Los pasos a seguir son: § § § Colocar una gota de sangre pequeña aproximadamente a 1 cm del borde del portaobjetos. Este puede estar sujeto con la mano izquierda por el extremo opuesto a donde está la gota, o bien puede estar colocado sobre una mesa. Es preferible lo segundo, ya que así tiene un lugar de apoyo. Coger con la mano derecha (con los dedos índice y pulgar) el otro portaobjetos y apoyarlo sobre el que tiene la gota de sangre por delante de ella. El ángulo que forman ambos portaobjetos ha de ser de 30º a 40º. Hacer retroceder el portaobjetos hacia el extremo donde no estaba la gota de manera rápida y uniforme hasta que la sangre quede totalmente extendida. Observaciones En una extensión de sangre realizada correctamente se observará una parte más gruesa en donde estaba la gota de sangre, después una uniforme y al final una zona de menor espesor deshilachada. Cada una de esas partes corresponde a lo que se denomina cabeza, cuerpo y cola de la extensión. La extensión de sangre no ha de llegar a los bordes del portaobjetos ni tener estrías o vacuolas. El espesor de la extensión depende del ángulo entre los dos portaobjetos, tamaño de la gota, rapidez y presión con que se realiza la extensión. A mayor rapidez se consigue un mayor espesor. A mayor ángulo también el espesor es mayor. Si el espesor es muy grueso las células aparecen sobrepuestas, con lo que los leucocitos no se identifican con facilidad. Si es demasiado fino las células están muy separadas y hay que recorrer muchos campos para hacer el recuento. 21 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud Una buena preparación para contar leucocitos es aquella en la que los glóbulos rojos aparecen algo amontonados, ya que así los leucocitos se encuentran también más juntos (pero no superpuestos) y su recuento se hace más rápido. A la hora de hacer el recuento diferencial de leucocitos hay que tener en cuenta que la distribución de las células no es uniforme. Las células grandes (monocitos y neutrófilos) se sitúan en los bordes, mientras que las células pequeñas (linfocitos) se sitúan en el centro de la extensión. Por esta razón no se cuenta sólo en el centro o en los bordes, sino que se siguen unas trayectorias a modo de grecas. CUESTIONES 1. ¿Cuál es la finalidad del fijador? 2. Comente los colorantes utilizados 3. Haga un dibujo de las células observadas. 22 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud 23 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud 24 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud Célu las sang uíneas Plaquetas, Linfocito Linfocito Neutrófil o Monocit o Eosinófil o Basófil o Neutrófilos: 3.500-7.000/mm 3, 60-70% Eosinófilos: 150-400/ mm 3, 2-4% Basófilos: 50-100/ mm 3, < 1% Linfocitos: 1.500-2.500/ mm 3, 20-25% Monocitos: 200-800/ mm 3, 3-8% Eritrocitos: 4,5-5 millones/ mm 3 Plaquetas: 200.000-300.000/ mm 3 25 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud APENDICE 1. PREPARACIÓN DE DILUCIONES En el laboratorio, en muchas ocasiones es necesario diluir las muestras o los reactivos para obtener concentraciones adecuadas a las técnicas. La perfecta preparación de estas diluciones es imprescindible para la obtención de unos resultados correctos. La dilución realizada se expresa generalmente como una unidad de la solución inicial por unidades de la solución final. Por ejemplo, una dilución al 1/10 requiere que una unidad de la solución inicial sea o haya sido diluida hasta un volumen final de 10 unidades (un volumen de 1 solución inicial más 9 volúmenes de disolvente). Aquellas concentraciones en las cuales se expresa la concentración como cantidad de soluto en un volumen fijo de disolución, como es el caso de la Normalidad, Molaridad o % p/v, se denominan escalas volumétricas de concentración. Cuando la concentración se expresa sobre una de estas escalas volumétricas, la cantidad de soluto contenido en un volumen dado de solución es igual al producto del volumen por la concentración: Cantidad de soluto = volumen·concentración Si diluimos una solución, el volumen de la misma aumentará a la par que disminuye su concentración, mientras que la cantidad de soluto presente permanecerá constante. Por ello, dos soluciones con distintas concentraciones, pero que contienen las mismas cantidades de soluto, están relacionadas de la siguiente forma: V1 · C 1 =V 2 · C 2 Aplicaciones de esta fórmula: a) Si se conocen tres de los términos de esta ecuación, se puede calcular el cuarto. Las cantidades a los dos lados de la ecuación deben expresarse en las mismas unidades. Ejemplo 1 Preparar 50 mI de HNO3 0,1 M a partir de una solución concentrada de HNO3 1 M. Aplicando la fórmula V 1 · C 1 =V 2 · C 2 donde: C1 = 1 mol/l C2 = 0, 1 mol/l V2 = 50 m I V1 = desconocido 26 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud Sustituyendo: V 1 · 1 mol/l = 50 ml · 0, 1 mol/l Despejando V1= 5 ml Para preparar 50 m I de HNO3 0, 1 M, mediremos 5 m I de HNO3 1 M y completaremos hasta 50 m I con agua destilada. b) Despejando C 2 de la ecuación [1] obtenemos: C2 = (V 1 · C 1) / V 2 = C 1 · V 1 / V 2 El cociente de volúmenes se denomina cociente de dilución y se representa 1/d. Por tanto: C2 = C 1 · 1/d Es decir, para calcular la concentración de la nueva solución diluida, hay que multiplicar la concentración inicial por el cociente de dilución. Ejemplo Calcular la concentración de una disolución obtenida a partir de una inicial al 10 por 100 que se ha diluido al 1/10. C 2 = C 1 · 1/d C2 = 10 .1/10 = 1 por 100 c) Si se realizan sucesivas diluciones, para conocer la concentración de la dilución final, basta multiplicar la concentración inicial por todos los cocientes de dilución. C2 = C 1 .1/d [1] .1/d [2]... Ejemplo: Se ha partido de una solución al 10 por 100 p/v; ésta se ha diluido inicialmente al 1/10, y la solución obtenida al 1/2. Calcular la concentración de la solución final. C2 = C 1 .1/d (1) .1/d (2) ... C2 = 10 .1/10 .1/2 = 0,5 por 100 d) Forma práctica de realizar una dilución. 1 /d significa 1 unidad de la solución inicial + (d -1) unidades de disolvente. Ejemplo: Diluir una solución al 1/5. Para hacer esta dilución, por cada unidad que tomemos de la solución inicial tomaremos 5 -1 = 4 unidades de disolvente. Ej. 1 ml de solución inicial y 4 ml de disolvente. Ejemplo: 27 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud Diluir con agua destilada 10 mI de una solución al 1/10. Para hacer esta dilución, por cada unidad que tomemos de la solución inicial tomaremos 10 -1 = 9 unidades de disolvente. Como tenemos 10 unidades de solución inicial, tendremos que tomar 9 x 10 = 90 unidades de agua destilada. En resumen, para hacer esta dilución cogeremos los 10 mI de solución inicial y los completaremos con 90 mI de agua. e) En el laboratorio de Análisis Clínicos, principalmente en Inmunología, es frecuente la utilización de diluciones seriadas, que se llaman así porque después de la primera son todas iguales. Ejemplo : Diluir un suero al 1/2 (1:2) por adición de 1 mililitro de suero a 1 mililitro de solución salina. Tubo (1). A partir del tubo (1) preparamos cuatro tubos (tubos 2, 3, 4, 5) que contienen cada uno 1 mililitro de solución salina como diluyente. Realizamos la dilución seriada por transferencia de 1 mililitro del tubo (1) al tubo (2), mezclamos y transferimos 1 mililitro del tubo (2) al tubo (3), y así sucesivamente hasta el tubo (5). La concentración del suero decrece según un factor 2 en cada dilución: tubo (1) 1/2; tubo (2) 1/4; tubo (3) 1/8; tubo (4) 1/16; tubo (5) 1/32. 28 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud 2. CROMATOGRAFíA La cromatografía agrupa un importante grupo de técnicas que permiten separar componentes de mezclas complejas. En todas las separaciones cromatográficas la muestra que se desea separar se disuelve en la "fase móvil" que normalmente está formada por un gas o un líquido. La fase móvil se hace pasar a través de una "una fase estacionaria", la cual se mantiene fija en una columna o en una superficie sólida que actúa como soporte. NOTA: Fase móvil: en la cual están los solutos que se van a separar Fase estacionaria: lecho a través del que fluye la fase móvil Los componentes fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil. Los componentes con baja afinidad por la fase estacionaria se desplazan con más rapidez al ser arrastrados por la fase móvil. Una vez que todos los componentes han atravesado la fase estacionaria, salen separados unos de otros lo que permite utilizar las fracciones en procesos de identificación o cuantificación . FASES DEL PROCESO CROMATOGRÁFICO 1. Preparación de la fase estacionaria 2. Introducción de la muestra vehiculada por una fase móvil 3. Paso a través de una fase estacionaria donde se producen las interacciones que más tarde llevarán a su separación 4. Elución (según en que técnica) 5. Lectura de los resultados para obtener el cromatograma MECANISMOS IMPLICADOS 1. Adsorción 2. Reparto 3. Intercambio iónico 4. Exclusión molecular 5. Afinidad Cromatografía de adsorción: poco usada en clínica Cromatografia de reparto: basada en las diferencias de solubilidad de las distintos analitos en dos fases inmiscibles Ejemplo: cromatografía en capa fina (ver figura 1): • sobre un cristal u otra superficie se deposita una suspensión uniforme de partículas (ej gel de sílice) que más tarde se seca y activa. En dicha placa se aplica la muestra y se deja secar. 29 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud • • • Se introduce la placa en una cámara en cuyo fondo hay un disolvente que va subiendo por capilaridad y arrastrará a los componentes de la mezcla en función de la solubilidad de los mismos en la fase móvil. Se deja hasta que el frente llegue al final Los resultados se visualizan por ejemplo por tinción con colorantes. Aparecerán unas manchas que se pueden identificar mediante el uso de patrones o cuantificar mediante densitometría o raspado de las manchas, disolución y determinación espectrofotométrica. Cromatografia de intercambio iónico: basada en un mecanismo electrostático por atracción entre iones de distinta carga. En el laboratorio clínico se utiliza en analizadores de aminoácidos, separación de Hb, isoenzimas y esteroides (Ver figura 2) Cromatografia de exclusión molecular: basadas en la diferencia de tamaño de las distintas sustancias a separar. En clínica se utiliza para purificaciones ej de hormonas (Ver figura 2) Cromatografia de afinidad: basada en mecanismos que implican interacciones específicas entre dos moléculas como uniones enzima-sustrato, hormonareceptor, antígeno-anticuerpo... (Ver figura 2) NOTA: HPLC ó cromatografía líquida de alta presión (resolución): es un sistema de cromatografía en columna (la fase estacionaria se deposita en una columna) con un sistema inyector de la muestra y un impulsor de la fase móvil que acelera el proceso Figura 1 30 Practicas de Procedimientos Bioquímicos y Fisiológicos en las alteraciones de la salud Figura 2 31
