Guión de Prácticas - Inicio

FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE
SEVILLA.
PRACTICAS DE VIROLOGÍA. GRADO BIOMEDICINA
PRIMER CICLO
BACTERIOFAGOS COMO HERRAMIENTAS DE LABORATORIO
PRÁCTICA 1: INFECCIÓN DE Escherichia coli CON LOS FAGOS gt11 Y M13
PRÁCTICA 2: TRANSFECCIÓN CON ADN DEL FAGO M13
PRÁCTICA 3: PURIFICACIÓN DE ADN2C DEL FAGO M13
Día 1:
Infección y Titulación con los fagos gt11 Y M13
Inoculación de Dh5F´
Día 2:
Lectura de títulos de fagos
Electroporación y siembra
Día 3:
Re-infección a partir de calva
Inoculación de Dh5F´ infectada con fago M13
Día 4:
Extracción de la forma replicativa y electroforesis
El bacteriófago lambda
El genoma del bacteriófago está formado por un ADN lineal de doble cadena
de 50kpb de longitud, el cual está empaquetado en una cápside icosaédrica de
naturaleza proteica. Este ADN está en forma de una molécula duplex lineal,
cuyos extremos cohesivos (Cos) están formados por 12 nucleótidos de cadena
sencilla.
Las partículas de fagos se adsorben por el extremo de la cola a receptores en
la membrana más externa de la célula. Esta adsorción es más eficiente si está
presente la maltosa en el medio de cultivo, ya que ésta induce la expresión del
operón de la maltosa, el cual contiene el gen Lamb que codifica para el
receptor de lambda.
Después de entrar en la célula, el genoma de lambda se circulariza a través de
sus extremos Cos y la molécula se une covalentemente. De esta manera el
ADN sustrato queda listo para la replicación y la transcripción del ADN de
lambda. Siendo un fago temperado, puede seguir ya sea por vía productiva
(lítica) o por vía temperada (lisogénica). En cualquier caso, la transcripción es
iniciada a partir de dos promotores “tempranos”, PL y PR.
En una infección productiva (lítica) se logra la transición de la transcripción
temprana; se sintetizan las proteínas del virus, los genomas virales se
empaquetan y la lisis de la célula libera aproximadamente 100 partículas
infectivas.
En la respuesta temperada, la mayoría de funciones del fago lambda son
reprimidas, ya sea directa o indirectamente, mediante moléculas represoras del
fago unidas a las regiones operadas asociadas con PL y PR. Si la represión
ocurre antes de que se activen los genes tardíos, la lisis se evita y la lisogenia
queda asegurada. Para que la lisogenia sea estable y no abortiva requiere la
integración del genoma de lambda dentro del cromosoma hospedador
mediante recombinación sitio específico; de esta manera el genoma del fago (el
profago) será replicado como parte del cromosoma de E. coli. Si la bacteria
lisogénica es sensibilizada con calor o luz UV, el profago entra en vía lítica
(Figura).
La cascada lítica del fago lambda está interconectada con el circuito para
lisogenia. Tanto la vía lítica como lisogénica requieren la expresión de genes
inmediatamente tempranos y genes inmediatamente tardíos. Luego estos
divergen; el desarrollo lítico continúa si se promueve la síntesis de un represor.
El bacteriófago  se ha utilizado como vehículo de clonación, para clonación de
ADN genómico de gran tamaño (bacterial artificial chromosome, bacteriófago
P1,…), construcción de librerías de ADN genómico, librerías de expresión,…
Lambda es un bacteriófago muy utilizado en experimentos de DNA
recombinante. Se han identificado y cartografiado todos los genes de lambda, y
se conoce toda la secuencia nucleotídica de su genoma. El tercio central de su
cromosoma es prescindible, y puede reemplazarse por DNA exógeno sin
afectar la capacidad del fago para infectar células y formar calvas. Se han
desarrollado más de 100 vectores basados en el fago lambda, eliminando
diversas porciones del grupo génico central. Para clonar utilizando el fago
lambda, se corta el DNA del fago con una enzima de restricción (por ejemplo,
EcoRI), lo que produce un brazo izquierdo, un brazo derecho y una región
central. Se aíslan los brazos y se ligan (utilizando la DNA ligasa) a un
segmento de DNA obtenido tras cortar DNA genómico con la misma enzima de
restricción (en este ejemplo, con EcoRI). Las moléculas recombinantes
resultantes pueden introducirse en células huésped bacterianas por
transfección. Primero, se permeabilizan las células huésped mediante un
tratamiento químico, y se mezclan con las moléculas ligadas. Los vectores que
contienen el inserto entran en las células huésped, donde dirigen la síntesis de
fagos infectivos, llevando cada uno de ellos el inserto de DNA. Como
alternativa, se mezcla el DNA de lambda que contiene el inserto con los
componentes proteicos del fago; de esta mezcla se forman partículas fágicas
infectivas. Los fagos pueden amplificarse haciéndolos crecer en placas
sembradas con bacterias, donde se formarán calvas, o bien infectando células
en un medio líquido y recogiendo las células lisadas.
Sistema genético de gt-11
El sistema gt-11 es útil para la construcción de genotecas de ADNc y /o
genómicas, al igual que para el aislamiento de proteínas de fusión a galactosidasa que posteriormente pueden ser fácilmente identificadas usando
anticuerpos contra -galactosidasa. Este sistema permite diferencia halos de
lisis recombinantes de aquelos que no lo son.
El cromosoma del bacteriófago lambda es una molécula lineal de ADN de
48.6Kb de longitud, con el 40% del genoma no esencial para la propagación del
fago. Los ingenieros genéticos, al retirar estas partes e introducir otras, han
construido una gama de vectores para diferentes propósitos de clonación. Uno
de estos es el vector de inserción y expresión lambda gt-11, un fago
temperado que contiene el promotor Lac y el gen estructural lacZ para la
galactosidasa, tomados a partir del operón Lac de E. coli.
Características generales del sistema gt-11:
Genotipo: lac5, cI857, nin5, sam100.
Capacidad de clonaje: 0 – 7.0 Kb.
Sitio de clonaje: Eco RI.
Promotor: P Lac.
Reconocimiento de recombinantes: fenotipo Lac- sobre huésped LacZ- (halos
blanco).
Reconocimiento de no recombinantes: fenotipo Lac+ sobre huésped LacZ(halos azules).
Huésped:
E. coli Y1090: (rK-, Lon-, Lac-).
El sitio usado para la inserción del ADN clonado es un lugar único de corte Eco
RI localizado dentro del gen Lac Z, 53 pb corriente arriba del codón de
terminación de la transcripción de la galactosidasa.
Huesped
Fagos con de ADN monocatenario. El fago M13 como herramienta en
biología molecular.
El bacteriófago M13 destaca entre los fagos utilizados en biología molecular.
Se trata de un fago de cadena sencilla circular. A diferencia del fago , este
fago infectan cepas de E. coli a través del Pili, por ello la cepa E. coli Dh5 F´
resulta un receptor idóneo.
Dentro de los fagos con ssDNA nos encontramos 2 familias: Inoviridae (fago
filamentoso M13, que infecta Enterobacterias ) y Microviridae (Enterofago
X174).
El fago M13 es un bacteriófago filamentoso de 900nm de longitud y 6.5nm de
ancho que contiene una molécula de ADN circular monocatenario de sentido
positivo encapsulado por ~2300 copias de la proteína de la capside gp8 más
cinco copias de 4 proteinas menores. El ADN se extiende en el interior a lo
largo del eje longitudinal de la partícula. Las proteínas menores están
implicadas en el inicio del ensamblaje y estabilidad de la partícula. Las
proteínas gp3 y gp6 participan en la unión a la célula huésped.
Cuando el fago M13 infecta a una célula bacteriana, la cadena sencilla (cadena
+) se replica y produce una molécula de doble cadena denominada forma
replicativa (RF). Las moléculas RF pueden considerarse similares a los
plásmidos, pudiéndose insertar DNA exógeno en sitios de restricción únicos
presentes en el DNA del fago. Cuando se reinsertan en células bacterianas, las
moléculas RF se replican y producen cadenas sencillas (+), en las que hay una
cadena del DNA insertado. La célula hace salir los clones de DNA de cadena
sencilla que produce M13, que pueden recuperarse y utilizarse directamente
para su secuenciación, o como molde para alteraciones mutacionales de la
secuencia clonada.
Características del Fago M13:
 Simetría helicoidal. Tiene 6 nm de diámetro y 860 nm de longitud.
 Infectan a través del Pili. (E. coli Dh5 F´)
 Poseen DNA monocatenario circular (+).
 Se forman ciertos loops por apareamientos de bases complementarias.
 El ciclo replicativo es complejo: mecanismo de CIRCULO RODANTE.
 En algunos casos puede integrarse en el genoma bacteriano.
 Hay solapamiento de genes
 Durante la replicación, se forman FORMAS REPLICATIVAS de dsDNA.
El DNA (-) producido puede utilizarse para sintetizar mRNA.
 Puede liberarse
continuamente.
de
la
célula
sin
lisarla,
produciendo
fagos
 Este fago ha sido muy utilizado en BIOLOGIA MOLECULAR. Permite la
secuenciación de genes por el método de Sanger, se puede utilizar
como vector de expresión, en ensayos de mutagénesis, así como en
ensayos de clonación de fragmentos de gran tamaño.
En el presente ciclo de prácticas se iniciará a los estudiantes en algunas
de las técnicas básicas para el manejo de bacteriófagos como
herramientas en un laboratorio de investigación. Para ello se llevaran a
cabo los siguientes protocolos:
INFECCIÓN DE Escherichia coli CON LOS FAGOS gt11 Y M13
TRANSFECCIÓN CON ADN DEL FAGO M13
PURIFICACIÓN DE ADN2C DEL FAGO M13
PRACTICA 1:
INFECCIÓN DE Escherichia coli CON LOS FAGOS gt11 Y M13
PRIMER DÍA (Previo a la Práctica)
Cultivar la estirpe de E. coli Y1090 (para el fago gt11) en 5ml de LB
líquido suplementado con 0.2% de maltosa, 10mM de MgSO4 y ampicilina (50
mg/L) y la estirpe de E. coli Dh5 (para el fago M13) en 5ml de LB líquido
suplementado con ácido nalidíxico (10 mg/L), en agitación a 37 oC durante toda
la noche.
SEGUNDO DÍA (Día de la Práctica)
1. Con el fago gt11 hacer diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 y 10-6 en
tampón SM. Agitar los tubos con el vortex brevemente.
2. Con el fago gt11 hacer diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7
en tampón SM. Agitar los tubos con el vortex brevemente.
3. Mezclar 200L de Y1090 con 100L del fago gt11 de las diluciones 104
, 10-5 y 10-6 del fago.
Mezclar 200L de Dh5 con 100L del fago M13 de la diluciones 10-5,
10-6 y 10-7 del fago.
Hacer por duplicado porque hay que hacer 2 cajas/dilución. Incubar las
mezclas a 37oC durante 5 minutos.
4. Pasar la suspensión de bacterias y fagos a tubos que contienen 3 ml de
agar cobertera fundido, que están a 45-50oC, mezclar suavemente y
verterlo rápidamente sobre una caja de Petri que contiene medio LB.
Hacer una 7ª caja control solo con bacterias (200L).
5. Incubar las cajas a 37oC durante toda la noche.
TERCER DÍA
6. Observar la aparición de calvas. Recuento del número de calvas.
………………………………………………………………………………………………………......
Material Biológico
E. coli Y1090 E. coli Dh5
Fagos gt11 y M13
Agar Cobertera (para 100ml)
LB líquido
Agar
0.7g
Medio LB (pH7)
Triptona
Extracto de Levadura
NaCl
H2O
Tampón SM (para 1 L)
NaCl
5.8g
MgSO4·H2O
2.0g
TrisHCl 1M, pH7
5.5ml
Gelatina 2%
5.0ml
10g
5g
5g
hasta 1000ml
PRACTICA 2:
TRANSFECCIÓN CON ADN DEL FAGO M13
PRIMER DÍA (Previo a la Práctica)
1. Cultivar la estirpe de la estirpe de E. coli Dh5 (para el fago M13) en 5ml
de LB líquido suplementado con ácido nalidíxico (10 mg/L), en agitación
a 37oC durante toda la noche.
SEGUNDO DÍA (Día de la Práctica)
OBTENCIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES DE E. coli
1. A primera hora de la mañana, refrescar las células en medio nuevo de
LB diluyéndolas 100 veces. Cultivar a 37 oC, en agitación hasta alcanzar
una DO600=0.3
2. Repartir el cultivo en alícuotas de 1 ml en microtubos estériles
(necesitáis un tubo para añadir el ADN del fago a las bacterias y un 2º
tubo de control de bacterias). Enfriar los tubos en hielo durante 5
minutos. A partir de aquí hay que mantener las células en hielo.
3. Centrifugar los tubos 1 minuto a 10.000 rpm, tirar todo el sobrenadante y
resuspender las células con mucho cuidado (¡NO UTILIZAR EL
VORTEX) en 75 l de LB frío. Mantener en hielo 5 minutos.
4. Añadir 75 l de medio 2xTSS y mezclar suavemente. Mantener en hielo
5 minutos.
5.
6.
7.
8.
TRANSFECCIÓN:
Añadir 10 l de ADN frío de fago M13 a uno de los tubos y al segundo
tubo de control no se le añade nada. Mantener los tubos en hielo 30
minutos.
Transferir los tubos a un baño a 42ºC durante 90 segundos para dar un
choque térmico a las células. Volver a dejar los tubos 2 minutos en hielo.
A continuación añadir a tubos que contienen agar de cobertera (están en
el baño a 45ºC) 200 l de las células crecidas durante toda la noche, y la
suspensión de células que está en los microtubos, mezclar con cuidado,
y verterlo rápidamente sobre una caja de medio de LB-Xgal (vial con
ADN) y sobre una caja de LB (vial control sin ADN).
Incubar las cajas a 37ºC durante toda la noche.
TERCER DÍA
9. Comprobar la aparición de calvas de lisis.
………………………………………………………………………………………………………......
Composición del medio 2xTSS
Triptona
0.8g
Extracto de Levadura
0.5g
NaCl
0.5g
PEG 8000
20g
Ajustar pH 6.5 con HCl o NaOH y completar el
DMSO
10ml
volumen con H2O hasta 100 ml. Autoclavar y repartir
MgSO4·7H2O
10ml
en tubos eppendorfs y guardar a 4ºC.
H2O
70ml
PRACTICA 3:
PURIFICACIÓN DE ADN2C DEL FAGO M13
PRIMER DÍA
2. Diluir 1/100 el cultivo de E. coli Dh5 (pasar 20 L del cultivo a un tubo
de plástico grande que contiene 2 ml de LB).
3. Tocar con un palillo de dientes estéril una calva de M13 e introducirlo
dentro del tubo que contiene las células.
4. Crecer las células a 37ºC, en agitación durante 24 horas.
SEGUNDO DÍA
1. Transferir 1.4 ml del cultivo a un microtubo y centrifugar durante 2 min.
2. Retirar todo el sobrenadante y resuspender las células precipitadas en
100 L de solución I.
3. (En esta solución las muestras se pueden quedar mucho tiempo)
4. Añadir 200 L de solución II, cerrar el microtubo y mezclar bien
invirtiendo 5 veces (no usar vortex). La solución ha de ponerse densa y
transparente por la lisis celular.
5. (En esta solución las muestras no pueden estar más de 5 minutos)
6. Añadir 150 L de solución III, cerrar el microtubo y mezclar invirtiendo
varias veces. Debe aparecer un precipitado blanco de considerable
tamaño.
7. (En esta solución las muestras no pueden estar más de 5 minutos)
8. Centrifugar 10 minutos a 13.000rpm
9. Tomar 400 L de la fase acuosa (no coger nada del precipitado blanco)
y pasarlos a otro microtubo limpio.
10. Añadir un volumen de isopropanol y mezclar por inversión.
11. Centrifugar el microtubo a máxima velocidad (13000 rpm) durante 20
minutos.
12. En un solo movimiento tirar el sobrenadante y añadir 500 L de etanol al
70º frío, cerrar el tubo e invertirlo varias veces.
13. Centrifugar 1 minuto
14. En un solo movimiento tirar el etanol, dar un pulso en la centrífuga y
retirar el resto del etanol con una punta de pipeta, con cuidado de no
arrastrar el precipitado de ADN. Es importante retirar todo el etanol
porque sino la muestra tardará mucho en secarse.
15. Dejar el tubo abierto en una estufa a 60ºC para que se seque.
16. Rehidratar el ADN con 20 L de tampón TER, que lleva ribonucleasa
para eliminar el ARN.
17. Guardar las muestras a -20ºC hasta el día siguiente.
TERCER DÍA
Añadir a las muestras 3 L de tampón de carga (Azul de bromofenol 0.25% +
glicerol 30%).
Correr las muestras en un gel de agarosa al 0.8% con BrEt a 100V. Observar el
ADN con una lámpara de luz ultravioleta.
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Solución 1: 50 mM glucosa, 25 mM TrisClH pH8, EDTA pH8. Esterilizar en el autoclave, excepto la
glucosa que se esteriliza por filtración y se añade después. Mantener a 4ºC.
Solución 2: SDS 2% : NaOH 1N (1:1), preparar en el acto.
Solución 3: Acetato potásico 3M, ácido fórmico 1.8M.
TE: 10mM TrisClH pH8, 1mM EDTA pH8.