B-1 - UAM-I

DIVERSIDAD MICROBIANA ASOCIADA A TERREROS
MINEROS: DIFERENTES NICHOS BIOGEOQUÍMICOS
TORRES-CÁZARES K.L.1, CASAS-FLORES S.2, GARCIA-MEZA J.V.1*
Laboratorio de Geomicrobiología, Instituto de Metalurgia, UASLP; Sierra
Leona 550, Lomas 2a, 78210, SLP, México.
2
IPICYT, División de Biología Molecular; Camino a Presa San José 2055,
Lomas 4a, 78216, SLP, México. *E-mail: [email protected]
1
RESUMEN
Debido a su gran tamaño y a la heterogeneidad espaciotemporal en los
terreros mineros (reactividad de minerales, eficiencia de irrigación,
temperatura, pH, pO2, pCO2, potencial rédox, nutrientes disponibles, etc.), se
estima que residen una significativa biodiversidad de Bacterias y Archeas
acidóifilas, no solo quimiolitotróficas biooxidantes de sulfuros metálicos, y que
juegan un papel indirecto en la biolixiviación (Casas-Flores 2009). En el
presente estudio de Geomicrobiología Molecular sobre una muestra de un
terrero minero empacada en tres columnas de biolixiviacións (dos irrigadas
con solución ácida), se identificaron a los microorganismos presentes para
inferir el papel que cada tipo podría estar jugando en este ambiente
particular. Se realizaron extracciones de DNA total, se amplificaron por PCR
los genes rDNA 16S, se clonaron los productos amplificados, se
secuenciaron y se analizaron filogenéticamente las secuencias rDNA 16S
obtenidas. Nuestros resultados indican la presencia de bacterias
quimiolitoauto- y quimiolitoheterotróficas, aerobias y microaerofílicas, y a
acidófilas a circumneutras; es decir, en las columnas se establecen
microambientes particulares. Específicamente, se distinguen tres grupos de
microorganismos:
biolixiviadores
sensu
stricto
(Sulfobacillus,
Acidithiobacillus,
Thiobacillus);
quimioorganotrofos
(Sphingomonas,
Micrococcus, Ochrobactrum y Rhodopseudomonas, este último, fija N2) y
heterótrofos euritípicos (Pseudomonas, Bacillus). Al menos estos tres
grandes grupos deberían estar presentes normalmente en terreros. Es decir,
los terreros mineros son ambientes creados por el ser humano, pero
gobernados por reglas ecológicas tales como las relaciones simbióticas entre
quimiolitótrofos y los demás grupos metabólicos.
Palabras
clave:
Geomicrobiología,
biolixiviación, rDNA 16S
quimioorganotrofos,
quimiolitotrofos,
ABSTRACT
Due to their huge and spatio-temporal heterogeneity of heaps, in terms of
mineral reactivity, irrigation efficiency, temperature, pH, pO2, pCO2, ORP,
dissolved solutes, available nutrients, etc., a considerable diversity of residing
acidophilic Archaea and Bacteria may inhabited it, with diverse metabolic
capacities (not only chemolitotrophics), which may play a direct or indirect
role in biomining (Casas-Flores, 2009). Hence, in this Molecular
Geomicrobiology study, microorganisms directly obtained from a sample of a
mine heap from 3 bioleaching columns, were identified. Total DNA extraction,
PCR amplification of rDNA 16S, cloning, sequencing and analysis of the
genomic rDNA 16S genes were done. The results show the presence of
chemolithoautoand
chemolithoheterotrophics,
aerobics
and
microaerophilics, acidophiles and circumneutral bacterias. Thus, in the
bioleaching columns different microenvironments were established. Three
groups of microorganism were recognized: the bioleachers sensu stricto as
Sulfobacillus, Acidithiobacillus and Thiobacillus; the chemoorganotroph (v. gr.
organic solvents) as Sphingomonas, Micrococcus, Ochrobactrum and
Rhodopseudomonas (fix N2), and the heterotrophics, anaerobics and
euritypes Pseudomonas spp. and Bacillus spp. At least, microorganisms of
these three groups must be common inhabitants of mine heaps. That is to
say, mine heap is a real man-made environment but governed by basic
ecological rules, as the symbiotic interaction through chemolithotrophic and
other metabolic groups.
Keywords: Geomicrobiology, Chemoorganotrophs, Chemolithotrophs, bioleaching,
rDNA 16S
INTRODUCCIÓN
La Tierra se formó hace unos 4,600 millones de años (m.a.) y cerca de 1,000
m.a. más tarde ya albergaba seres vivos; los restos fósiles más antiguos
conocidos se han encontrado en rocas de hace 3,800 m.a., que muestran la
presencia de organismos procariotas y unicelulares, muy probablemente
ancestros de las bacterias. El interés la de geomicrobiología por Bacteria y
Archaea se ha centrado en su papel geoactivo y de gran impacto en el
devenir de los componentes de la geosfera (hidrosfera, litosfera y atmósfera)
desde el origen mismo de la vida: en el flujo de la energía y en los diversos
ciclos de los elementos. También interesa determinar su papel y aplicar sus
capacidades metabólicas para el desarrollo de bioprocesos más eficientes en
términos económicos y ambientales. Es así como la Geomicrobiología busca
responder cuál es el efecto del metabolismo de microorganismos durante su
interacción con, por ejemplo, partículas minerales, interacción de gran
impacto en los procesos mineros. Se sabe incluso, que el origen de
importantes yacimientos de sulfuros metálicos de importancia minera,
tuvieron su origen como efecto de dicha interacción (Ehrlich, 2006). El
proceso contrario, la degradación de sulfuros metálicos que liberan metales
de interés, también está fuertemente influenciado y catalizado por la
actividad de microorganismos de los grupos Archaea y Bacteria
quimiolitotróficas que emplean las formas reducidas del S y/o del Fe como
fuente de electrones. Tales microorganismos han sido ampliamente
estudiados para ser empleados en procesos de biolixiviación en tanques y, a
últimas fechas ha sido de interés su estudio para incementar la biomasa
presente en terreros mineros. En este sentido, Mexicana de Cobre y
Buenavista de Cobre (antes Mexicana de Cananea), has orientado sus
trabajos de investigación en la Geomicrobiología de terreros mineros.
La biología molecular (BM) tiene como objetivo el estudio de los seres vivos a
nivel genético/molecular y busca entender la vida a través de los complejos
mecanismos por los cuales el ADN codifica y expresa las proteínas
apropiadas, en cantidades adecuadas, para los tipos celulares correctos. En
la actualidad, la BM tiene una importancia central para comprender mejor las
interacciones que ocurren en las comunidades de seres vivos, entre ellos y
con el ambiente que les rodea; se ha aplicado en diversos campos de la
biología, específicamente en la identificación de especies y subespecies
biológicas. Este conocimiento se ha incrementado exponencialmente en los
últimos 10 años y se traducirá probablemente en posteriores mejoras de
procesos industriales, como es el caso de la biolixiviación, ya que al hacer
uso de estas herramientas moleculares se pueden obtener interesantes
conocimientos sobre la fisiología de microorganismos biolixiviantes.
Gracias a las técnicas de BM, se ha puesto de manifiesto la existencia de un
gran número de microorganismos: cálculos conservadores estiman que
existen trillones especies de microorganismos y que solo el 1% éstas han
sido cultivadas (Ferrer, 2004; Macalady y Banfield, 2002). El descubrimiento
de esta enorme diversidad microbiana ha motivado el esfuerzo para
determinar capacidades metabólicas de los organismos y vincular sus
enzimas con funciones específicas, y ha permitido mostrar el potencial
genético “ilimitado” de recursos de los microorganismos no-cultivables, sin
que su cultivo en el laboratorio sea necesario. Este último mediante estudios
in situ de metagenómica, de varios fragmentos de DNA que juegan diversas
funciones. A esto último se le denominó hace 10 años como
Geomicrobiología Molecular; es decir el análisis a nivel molecular de los
procesos microbianos en un contexto geoquímico (Macalady y Banfield,
2002).
En el presente trabajo se buscó realizar un análisis metagenómico de
diversidad biológica basada en las secuencias de los genes rDNA 16S
bacterianos en una muestra de terrero empacado en tres columnas
experimentales. La que la metagenómica prescinde del manejo de cultivos
para la extracción del fragmento rDNA 16S de los microorganismos
procariontes (Riesenfeld y col., 2004), asegurando así que no se
preselccionaran los microorganismos presentes en cada columna. El rDNA
16S es un fragmento génico altamente conservado en el transcurso de la
evolución que se ha empleado desde 1978 como primera aproximación para
la identificación de seres. Por reflejar una historia evolutiva, el rDNA permite
la construcción de árboles filogenéticos (relación ancestro-descendiente)
para una certera identificación. Por ello, la identificación de microorganismos
en este trabajo, se sustentó fundamentalmente en la obtención de filogenias
moleculares a partir de las secuencias de los rDNAs amplificados.
METODOLOGÍA
La identificación de los microorganismos procedentes de terreros mineros se
realizó a partir de muestras de terrero fresco empacadas en tres columnas
experimentales. Dos de las columnas fueron irrigadas con una solución
ácida, difiriendo solo en que una de ellas fue inoculada con una muestra
enriquecida de microorganismos aislados de terrrero y la tercera, fue regada
con agua bidestilada e inoculada con los microorganismos; lo anterior, para
probar el efecto de la acidez, entre otros factores, en la composición
específica de las comunidades.
Para la identificación de los microorganismos, las muestras se analizaron en
el Laboratorio de Genómica Funcional y Comparativa del IPICyT. La
identificación implicó la extracción del DNA genómico total de las tres
muestras, para la posterior identificación de microorganismos, de acuerdo al
protocolo modificado de Gabor y col. (2003) modificado de Gómez-Rodríguez
(2007); el DNA genómico rDNA 16S se amplificó para su análisis mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) punto final, para la posterior
clonación de los productos, secuenciación y análisis de secuencias; con el fin
de llevar a cabo la construcción de árboles filogenéticos. La secuenciación
de las clonas se llevó a cabo por el método de Sanger y col. (1977) en el
Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad, del CINVESTAVIrapuato.
Las secuencias obtenidas se compararon con las de base de datos del
Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), recuperando un
grupo de secuencias que tuvieran un valor significativo (> 95% de identidad)
por medio del programa BLAST (Basic Local Alingment Sequence Tool). Una
vez obtenidas las secuencias con un valor significativo según el BLAST y que
se recuperarán las secuencias de los posibles microorganismos que fueron
identificados, se realizó la construcción de los árboles filogenéticos utilizando
el programa MEGA4 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis V4; Tamura y
col., 2007), en el cual se realiza una exploración analítica de las secuencias,
estimación de la divergencia entre las secuencias, reconstrucción y
visualización de los árboles filogenéticos, y crea hipótesis sobre la evolución
de las especies biológicas en términos moleculares.
RESULTADOS y DISCUSIÓN
Se obtuvo DNA plasmídico de 154 clonas en las 3 columnas,
correspondientes a 20 géneros de microorganismos. Los resultados
referentes al análisis bioinformático de la secuencia de 12 clonas de las tres
columnas resultó en un porcentaje de indentidad de 98.5% con el género
Sphingomonas, resultado confirmado por el análisis filogenético (Figura 1).
Las Sphingomonas son bacterias aerobias, quimioorganotrofas que
degradan compuestos orgánico, consideradas por ello importantes
biocatalizadores para la biorremediación de suelos contaminados por tales
compuestos (Takeuchi y col., 2001; Leys y col., 2004). Por ejemplo, la cepa
Sphingomonas sp. GQ249221.1 que corresponde a nuestra cepa C2-3-13,
degrada hidrocarburos aromáticos policíclicos (PHAs) (Li y col., 2009). La
presencia de microorganismos degradadores de compuestos orgánicos se
explica como consecuencia del uso de una mezcla del disolvente keroseno y
un extractante el compuesto orgánico LIX® en el proceso la extracción por
solventes; que, una vez empleada, se mezcla a la solución con la cual son
irrigados los terreros.
Es importante mencionar que se encontraron tres especies diferentes del
género Sphingomonas, a las que aún no se les ha nombrado con el epíteto
de la especie.
Figura 1. Árbol filogenético basado en secuencias de los rDNA 16S
bacterianos. Las secuencias obtenidas en el presente trabajo están
nombradas como C2-3-126, C3-2-181, C1-3-56, C1-2-37, C3-2-180, C2-1-88,
C1-2-26, C1-1-1, C2-3-127, C3-1-156, C3-1-162 Y C2-3-131, mientras que
las secuencias de referencia tomadas del NCBI corresponden a
Sphingomonas sp. AY349411.1, Sphingomonas sp. GQ181132.1,
Novosphingobium pentaromativorans NR, Sphingomonas sp. GQ249221.1.
Como control externo se utilizó la secuencia del rDNA 16S de Escherichia
coli AB599716.1. Los números en los nodos representan los porcentajes de
bootstrap de 100 réplicas.
Un segundo grupo de microorganismos identificados incluye dos clonas
catalogadas como Sulfobacillus thermosulfidooxidans (Figura 2). Los
Sulfobacillus son microorganismos biolixiviantes, quimiolitotróficos,
reductores de Fe3+ bajo condiciones anaerobias, pero
oxidantes de
compuestos de azufre y de Fe2+ bajo condiciones anaerobias (Rawlings,
1997), típico de ambientes mineros que anteriormente fue identificado en
terreros (Casas-Flores, 2009; García-Meza y col., 2010). Ambas clonas
corresponden exclusivamente a la columna irrigada con solución ácida, la
cual mostró mejor eficiencia en términos de biolixiviación de Cu y Fe (TorresCázares, 2012), lo que nos permite concluir que los Sulfobacillus y un
ambiente ácido favorecen la bioxidación de Cu en terreros.
Figura 2. Árbol filogenético basado en secuencias de los rDNA 16S
bacterianos. La secuencia obtenidas en el presente se nombran como C1-19 y C1-1-6, mientras que las secuencias de referencia tomadas del NCBI
corresponden a Sulfobacillus thermotolerans JF510470.1, S. benefaciens
EU099988.1, S. thermotosulfidooxidans EU499918.1 y GU180244.1, S.
bacterium EF199990.1, Sulfobacillus sp. X75270.1 y DQ673613.1. Como
control externo se utilizó la secuencia del rDNA 16S de Escherichia coli
AB599716.1. Los números en los nodos representan los porcentajes de
bootstrap de 100 réplicas.
En un tercer grupo se encontraron tres clonas que corresponden al género
Bacillus; una de ellas C3-1-160 a la especie B. cereus, según el análisis
bioinformático; al hacer el análisis filogenético (Figura 3) se observó que las
dos clonas restantes corresponden a microorganismos del género Bacillus
pero no se define la especie. Los Bacillus son microorganismos ampliamente
distribuidos geográficamente (Blanco y col., 2009) por lo que no es raro
encontrarlos en terreros, no obstante son neutrófilos; dos clonas (C3-1-160 y
C3-3-201) se aislaron de la columna irrigada con agua en lugar de solución
ácida, lo que propició un ambiente neutro y por lo tanto el ambiente ideal
para que estos microorganismos se desarrollaran. La presencia de la clona
C1-1-16 en la columna irrigada con solución ácida, se explica considerando
que Bacillus forman endoesporas cuando se encuentran bajo condiciones no
aptas para su desarrollo; tal habilidad, les da a las especies de este género
una ventaja competitiva muy importante en un ambiente como el suelo
(Calvo y Zúñiga, 2010).
Figura 3. Árbol filogenético basado en secuencias de los rDNA 16S
bacterianos. Las secuencias obtenidas en el presente trabajo están
nombrada como C1-1-16, C3-1-160 y C3-3-201, mientras que las
secuencias de referencia tomadas del NCBI corresponden a Bacillus
methylotrophicus
HQ844510.2
B.
vallismortis
GU205781.1,
B.
amyloliquefaciens HQ407277.1, B. thuringiensis JF460746.1, B. cereus
EF633995.1, Bacillus sp. HQ603746.1 y EF558732. Como control externo
se utilizó la secuencia del rDNA 16S de Escherichia coli AB599716.1. Los
números en los nodos representan los porcentajes de bootstrap de 100
réplicas.
El cuarto grupo de microorganismos incluye 4 clonas que, según los análisis
con la base de datos del NCBI, mostraron un 100% de identidad con
Ochrobactrum sp., y 2 clonas (C2-3-135 y C3-3-198) tipificadas como
“especie no cultivable” pero del mismo género; Así, el árbol filogenético de la
Figura 4, muestra que la clona C3-3-204 es Ochrobactrum sp. Las especies
de este género son microorganismos quimiolitótrofos oxidantes de sulfuros a
azufre elemental o a sulfatos (Mahmood y col., 2009). Además, especies de
este género degradan hidrocarburos policíclicos aromáticos (Arulazhagan y
col., 2010). Cabe mencionar que este trabajo, es la primera referencia donde
se propone a Ochrobactrum como microorganismo quimiolitótrofo que
participa en procesos típicos de ambientes mineros.
Seis clonas del terrero fueron asociadas al género Pseudomonas, de las
cuales solo 3 dieron un porcentaje de identidad de 100% con Pseudomonas
sp.; las otras 3 clonas son similares a microorganismos no cultivables que se
agruparon con este género (Figura 5). En trabajos previos se identificaron
Pseudomonas alcaligenes, P. brenneri, P. mendocina, P. pseudoalcaligenes,
aisladas también de terreros de La caridad (Casas-Flores, 2009). Las
Pseudomonas son bacterias euritípicas (de distribución cosmopolita) y
anaerobias que solubilizan minerales de Fe y pueden degradar compuestos
policíclicos aromáticos, incluso hay especies que utilizan el cianuro como
fuente de nitrógeno (viswiki, 2012); además, las Pseudomonas poseen en su
estructura celular, bombas de arsénico para expulsar este metaloide desde
su citoplasma (Casas-Flores, 2010).
Figura 4. Árbol filogenético basado en secuencias de los rDNA 16S
bacterianos. Las secuencias obtenidas en el presente están nombradas
como C3-3-198, C3-3-200, C3-3-206, C3-3-194, C3-3-204 y, C2-3-135,
mientras que las secuencias de referencia tomadas del NCBI
corresponden a Ochrobactrum antrhrophi FJ873801.1, O. lupini
AM490629.1, O. tritici y GU171382.2, Ochrobactrum sp. HQ67073.1 y
EF031010.1, Ochrobactrum sp. no cultivable GQ4166…, y una bacteria no
cultivable DQ860027.1. Como control externo se utilizó la secuencia del
rDNA 16S de Escherichia coli AB599716.1. Los números en los nodos
representan los porcentajes de bootstrap de 100 réplicas.
Figura 5. Árbol filogenético basado en secuencias de los rDNA 16S
bacterianos. Las secuencias obtenidas en el presente trabajo están
nombradas como C2-1-77, C1-2-62, C1-2-42, C3-3-203, C1-1-18 y C2-1-73,
mientras que las secuencias de referencia tomadas del NCBI corresponden
a Pseudomonas sp. EU308476.1, bacterias no cultivables GQ157104.1 y
DQ803142.1, P. alcalophila AJ550466.1, P. mendocina DQ178224.1, P.
fluorescens JN679850.1, Pseudomonas sp. no cultivable GQ41718.1 y
GQ157104.1, Pseudomonas sp. AB196245.1 y FJ907533.1, Pseudomonas
pseudoalcaligenes HQ407234.1, Pseudomonas sp. GU129929.1. Como
control externo se utilizó la secuencia del rDNA 16S de Escherichia coli
AB599716.1. Los números en los nodos representan los porcentajes de
bootstrap de 100 réplicas.
Se encontró una clona que presentó un 99% de identidad con un
microorganismo no cultivable del género Acidithiobacillus sp.; el análisis
filogenético (Figura 6) indica que, en efecto, es un microorganismo del
género Acidithiobacillus, pero al que no se le ha asignado el epíteto de
especie. Como sea, se trata de un género típico de ambientes mineros,
biolixiviante, ferro- y/o sulfurooxidante.
Figura 6. Árbol filogenético basado en secuencias de los rDNA 16S
bacterianos. La secuencia obtenida en el presente está nombrada como C11-2, mientras que las secuencias de referencia tomadas del NCBI
corresponden a Acidithiobacillus sp., Acidithiobacillus sp. no cultivable, y A.
ferrooxidans Como control externo se utilizó la secuencia del rDNA 16S de
Escherichia coli AB599716.1. Los números en los nodos representan los
porcentajes de bootstrap de 100 réplicas.
Finalmente, 3 clonas dieron 99%, 98% y 99% de identidad con Micrococcus
sp., Rhodopseudomonas palustris y Thiobacillus thioparus, respetivamente.
Micrococcus y R. palustris degradan hidrocarburos policíclicos aromáticos
(Altamirano y Pozzo, 2000) y R. palustris fija N2 atmosférico (Dutton y Evans,
1969; Harwood y Gibson, 1987). Por su parte, T. thioparus, es un
sulfurooxidante ampliamente estudiado.
CONCLUSIONES
Se distinguieron tres grupos de microorganismos en las columnas
empacadas con muestra de terrero: (a) quimiolitotróficos de sulfuros
metálicos y biolixiviadores sensu stricto que biooxida sulfuros (Sulfobacillus,
Thiobacillus) y/o Fe(II) (Acidithiobacillus sp., Leptospirillum spp.); (b)
quimioorganotrofos degradadores de compuestos orgánicos complejos que
pueden contener N su estructura molecular (Micrococcus, Ochrobactrum
Pseudomonas spp., Rhodopseudomonas fijadora de N2 y Sphingomonas), y
(c) los heterótrofos euritípicos (Bacillus spp.). De acuerdo a lo anterior, se
trata de comunidades dominadas por microorganismos quimioorganotrofos
(en mayor proporción en cuanto a número de especies y número de clonas) y
quimiolitotrofos; se sugiere que entre ambos grupos se establecen relaciones
sintróficas al poner los primeros a disposición de los segundos, compuestos
orgánicos sencillos o CO2 durante la degradación de compuestos orgánicos
complejos, además de representar una fuente del N indispensables para la
biosíntesis de proteínas, ya sea a partir de N2 atmosférico (fijado por
Ochrobactrum sp., Rhodopseudomonas palustris) o el presente en
compuestos orgánicos (Micrococcus, Pseudomonas spp. y Sphingomonas).
Aunado a lo anterior, la presencia de ambos grupos de microorganismos,
sugiere que al interior de los terreros se esté llevando a cabo no solo la
biolixiviación de metales sino también puede darse la descomposición de
compuestos orgánicos.
Es decir, los terreros mineros son ambientes creados por el ser humano,
pero gobernados por reglas ecológicas tales como las relaciones simbióticas
entre quimiolitótrofos y los demás grupos metabólicos. Los análisis
metagenómicos pueden ser realizados in situ, para extraer DNA directamente
de las muestras de terreros o, incluso, de los tanques de biolixiviación o
bioflotación. Sin embargo, una descripción más completa del papel de los
microorganismos en los terreros mineros y en términos geomicrobiológicos,
requiere de estudios sobre la estructura y función de las comunidades
microbianas combinando técnicas geoquímicas, bioquímicas y moleculares,
especialmente de metagenómica, metatranscriptómica, y metaproteómica de
tal modo que pueda obtenerse información sobre las comunidades para
explotarla en campo.
AGRADECIMIENTOS
Trabajo realizado mediante los proyectos # 53-07-23 y 53-08-356 otorgados
a Viridiana García-Meza y Sergio Casas-Flores, respectivamente, por
Mexicana de Cobre, S.A. de C.V. KLTC agradece también al CONACyT por
su apoyo (becaria 230755).
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