La ingenieria genética_JUANMA

TRABAJO SOBRE INGENIERÍA GENÉTICA 4º P.D.C.‐ A.C.T. CURSO:2012/2013 La ingeniería genética es la tecnología del control y transferencia de ADN de un organismo a otro, lo que
posibilita la creación de nuevas especies, la corrección de defectos genéticos y la fabricación de numerosos
compuestos.
Aparición de la ingeniería genética
En 1953 se descubrió el fenómeno llamado de restricción: ciertos fagos (virus bacteriano) que parasitan a E.
coli podían desarrollarse en ciertas cepas de esta bacteria, pero no podían hacerlo en otras (se dice que
están "restringidos" en determinadas cepas).
A finales de los 60, Werner Arber, en Basilea, descubre las enzimas de restricción responsables de ese
fenómeno: la cepa de bacteria restrictiva, que produce unas endonucleasas ("enzimas de restricción, o
restrictasas") que escinden el ADN del fago crecido en otra cepa diferente.
Esas primeras enzimas de restricción eran inespecíficas en cuanto al sitio del ADN donde cortaban, pero
en 1970 Hamilton O. Smith, en Baltimore, descubre un nuevo tipo de enzima de restricción totalmente
específica: capaz de reconocer una determinada secuencia de ADN, de unos pocos pares de bases, y de
cortar en ambas cadenas en lugares concretos.
En 1972, Mertz y Davis añadieron a una mezcla de ADN de diferentes orígenes una enzima ADN-ligasa,
procurando que se reparasen los enlaces fosfodiéster. Y esto les hizo darse cuenta de que podían constituir
la base para la producción de moléculas recombinantes in vitro, con material genético de diferentes
especies.
Pero este ADN recombinante, generado en el tubo de ensayo, es inerte, no es más que una macromolécula
híbrida que por sí sola no hace nada. Si queremos que el ADN recombinante haga algo, hay que introducirlo
en células vivas que sean capaces de expresar su información genética.
Esto nos lleva ya a la idea de lo que es la Ingeniería Genética: la formación in vitro de nuevas
combinaciones de material genético, por medio de la inserción de un ADN de interés en un vehículo
genético (vector), de modo que tras su introducción en un organismo hospedero el ADN híbrido
(recombinante) se pueda multiplicar, propagar, y eventualmente expresarse.
Experimento en la ingeniería genética
Un experimento de ingeniería genética podría ser:
1. Se corta por separado el ADN del organismo a estudiar y el ADN del vector con la misma
restrictasa, de modo que se generan extremos compatibles entre sí (mutuamente cohesivos).
2. Se juntan ambos ADN y se les añade ADN-ligasa: de esta forma, las uniones entre ADN pasajero y
ADN del vector se sellan mediante un enlace covalente, generándose moléculas híbridas
(quiméricas o recombinantes).
3. Ahora hay que introducir las moléculas generadas en los organismos huésped. En el caso de
bacterias se recurre a una técnica sencilla denominada transformación, que permite la entrada del
ADN a través de las envueltas del microorganismo.
JUAN MANUEL AMAT ‐ 1 ‐ TRABAJO SOBRE INGENIERÍA GENÉTICA 4º P.D.C.‐ A.C.T. CURSO:2012/2013 4. Finalmente, hay que localizar las bacterias que han captado el ADN que ha entrado. A menudo este
es el paso más laborioso, pero el hecho de que el vector posea uno o varios genes de resistencia
favorece al menos la eliminación de las bacterias que no han recibido ADN del vector: basta añadir
al medio de cultivo el antibiótico para el que el vector confiere resistencia. Para localizar los
transformantes recombinantes, muchos vectores incorporan un gen marcador que produce alguna
sustancia coloreada. Si insertamos el gen a aislar dentro de ese marcador, lo rompemos, por lo que
las colonias bacterianas no producirán la sustancia coloreada, sino que permanecen incoloras o
blancas.
5. El resultado del experimento es la obtención de al menos una colonia (clon) de bacterias que portan
la combinación buscada de vector con el inserto de ADN pasajero. Se dice entonces que hemos
clonado dicho ADN.
La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que destacan:
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La tecnología del ADN recombinante;
La secuenciación del ADN;
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La tecnología del ADN recombinante
Si se quieren unir dos ADNs, cada uno de los cuales procede de una especie diferente podemos utilizar
dichas enzimas como herramientas. Cada ADN se trata con una endonucleasa de restricción que origina en
este caso un corte escalonado en las dos hebras dobles de ADN. Los extremos escalonados del ADN1 y el
ADN2 son complementarios, con lo cual, una condición que tiene que tener los dos ADNs que se quiere unir
es que tengan un pequeño fragmento igual en sus secuencias. Los dos DNAs así cortados se mezclan, se
calientan y sé enfrían suavemente. Sus extremos cohesivos se aparearán dando lugar a un nuevo ADN
recombinado, con uniones no covalentes. Las uniones covalentes se consiguen añadiendo ADN ligasa y
una fuente energética para formar los enlaces.
Otra enzima clave para unir ADNs es la transferencia terminal, que puede adicionar muchos residuos
de desoxirribonucleótidos sucesivos al extremo 3´de las hebras del ADN. De este modo pueden construirse
colas de poli G (nucleótico de guanina) en los extremos 3´ de las dos hebras de ADN dúplex y colas de poli
C (nucleótico de citosina) en los extremos del otro ADN. Como estas colas son complementarias, permitirán
que los dos ADNs se unan por complementariedad. Posteriormente, se forman los enlaces covalentes por el
ADN ligasa.
La secuenciación del ADN
Técnica que permite saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.
Abreviadamente, éste sería el método a seguir:
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Como la técnica se basa en la síntesis de ADN, para hacer la reacción de secuenciación se necesita:
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Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar.
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Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido complementario del
extremo de la cadena.
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Desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP.
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Didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación.
JUAN MANUEL AMAT ‐ 2 ‐ TRABAJO SOBRE INGENIERÍA GENÉTICA 4º P.D.C.‐ A.C.T. CURSO:2012/2013 Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa al incorporarse un
didesoxinucleótido. Se produce un conjunto de cadenas dobles cuyas longitudes dependen de la situación
del didesoxinucleótido incorporado. Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciación, cada una con un
didesoxi distinto. Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis, se
autorradiografía, y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí,
dan la secuencia del ADN.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto,
con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un
determinado estudio.
La técnica de la PCR consiste en:
1. En un tubito se mezcla el ADN molde, los dos cebadores (oligonucleótidos), los cuatro dNTPs y el
ADN-polimerasa termorresistente.
2. Se calienta a 94 °C durante 5 min, con lo que se separan las cadenas del ADN molde a amplificar,
generándose las correspondientes cadenas sencillas.
3. Se baja la temperatura en torno a los 60 °C, de modo que cada cebador se empareja con el
extremo correspondiente de una de las cadenas del molde. Se dice que ahora tenemos los moldes
cebados.
4. Se sube la temperatura hasta 72 °C (la óptima de funcionamiento de la polimerasa Taq), y se deja
durante 5 min, tiempo durante el que se está produciendo la síntesis in vitro de las cadenas
complementarias de cada hebra molde.
5. Se sube la temperatura a 94 °C durante 20 segundos, suficientes para separar la cadena recién
sintetizada respecto del molde original.
6. Las cadenas sencillas generadas entran ahora en un nuevo ciclo (pasos 1 al 5), y así
sucesivamente, de modo que tras 30-60 ciclos obtenemos una amplificación del ADN original de
millones o miles de millones de veces.
Biotecnología genética
En la década de 1970 se abrieron nuevas perspectivas en el campo de las biotecnologías gracias a la
elaboración de nuevas técnicas que permiten llegar directamente al material que está en el origen de todas
las características y procesos vitales, es decir, el ADN. Este conjunto de técnicas moleculares de
manipulación genética recibe el nombre de ingeniería genética.
Su objetivo es la manipulación in Vitro del ADN, la introducción de este ADN así modificado en células vivas
y la incorporación del mismo como parte del material hereditario de dichas células. De este modo, ADN de
diversas procedencias, por ejemplo, la fracción de ADN humano regula la síntesis de insulina, puede
introducirse en bacterias de manera que pasa a formar parte de su genoma y lograr así que la bacteria
adquiera la capacidad de elaborar insulina.
JUAN MANUEL AMAT ‐ 3 ‐ TRABAJO SOBRE INGENIERÍA GENÉTICA 4º P.D.C.‐ A.C.T. CURSO:2012/2013 La ingeniería en los seres vivos
Obtención de proteínas de mamíferos
Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del crecimiento, factores de coagulación, etc., tienen
un interés médico y comercial muy grande. Antes, la obtención de estas proteínas se realizaba mediante su
extracción directa a partir de tejidos o fluidos corporales. En la actualidad, gracias a la tecnología del ADN
recombinante, se clonan los genes de ciertas proteínas humanas en microorganismos adecuados para su
fabricación comercial. Un ejemplo típico es la producción de insulina que se obtiene a partir de la levadura
Sacharomyces cerevisae, en la cual se clona el gen de la insulina en humanos.
Obtención de vacunas recombinantes
El sistema tradicional de obtención de vacunas a partir de microorganismos patógenos inactivos, puede
comportar un riesgo potencial. Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por
ingeniería genética. Como la mayoría de los factores antigénicos son proteínas lo que se hace es clonar el
gen de la proteína correspondiente.
JUAN MANUEL AMAT ‐ 4 ‐ TRABAJO SOBRE INGENIERÍA GENÉTICA 4º P.D.C.‐ A.C.T. CURSO:2012/2013 Diagnóstico de enfermedades de origen genético
Diagnóstico genético preimplantacional.
Conociendo la secuencia de nucleótidos de un gen responsable de una cierta anomalía, se puede
diagnosticar si este gen anómalo está presente en un determinado individuo.
Obtención de anticuerpos monoclonales
Este proceso abre las puertas para luchar contra enfermedades como el cáncer y diagnosticarlo incluso
antes de que aparezcan los primeros síntomas.
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