TP 1: Actividad enzimática de la amilasa
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Ac t i v i d a d e n zi m á t i c a d e l a a m i l a s a A g u st í n G a r r i d o [email protected] Introducción: L a α - a m i l a s a e s u n a e n zi m a p r o t e i c a q u e s e e n cu e n t r a e n l a s a l i va h u m a n a y ca t a l i za l a d e g r a d a c i ó n d e l a lm i d ó n , q u e e s u n p o l i s a cá r i d o d e r e se r va ve g e t a l . E l a lm i d ó n e s t á f o rm a d o p o r d o s t ip o s d e m o lé c u l a s: l a a m i l o sa y l a a m i lo p e ct i n a , a m b o s p o l i sa c á r i d o s d e g l u c o s a . L a a m i lo s a se co n f o rm a p o r ca d e n a s l i n e a l e s d e g l u c o s a s u n id a s p o r e n l a ce s α - C 1 - C4 , m i e n t r a s q u e l a a m i l o p e ct i n a t i e n e , a d e m á s d e e s t o s ú l t i m o s e n la c e s , u n i o n e s C 1 c o n C 6 , f o rm a n d o ca d e n a s r a m if i ca d a s. L a α - a m i l a sa r o m p e uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando d e xt r i n a s l i n e a l e s y r a m i f i c a d a s ( o l i g o s a c á r i d o s ) c o m o p ro d u c t o s. P a r a m e d i r la a c t i vi d a d e n zi m á t i ca d e l a α - a m i l a sa , s e u t i l i za r á u n t e st co l o r i m é t r i c o q u e d e t e c t a e l a lm i d ó n . P a r a e l l o s e c o n t a r á co n u n a s o lu c i ó n d e i o d o / i o d u r o d e p o t a s io ( I 2 / I K ) , ya q u e e l a lm i d ó n e n p r e s e n c i a d e e s t a so l u c i ó n a d q u i e r e u n a c o l o r a c ió n a zu l a d a ca r a c t e r í s t i c a . E s t o t i e n e u n a e xp l i c a c i ó n f í s i c a : e l io d o s e co l o c a e n e l i n t e r i o r d e l a h é l i c e q u e f o r m a l a a m i l o sa ( e n l a s r e g i o n e s h i d r o f ó b i ca s ) , f o rm a n d o u n co m p l e j o d e c o l o r a zu l . C u a n d o l a α - a m i l a sa a c t ú a , d e g r a d a l a a m i l o s a , se d e s i n t e g r a la h é l i c e y p o r t a n t o e n p re s e n c i a d e I 2 / I K ya n o d a r á u n a co l o r a c i ó n a zu l . P o r l o t a n t o , e n e s t e T P m e d i r e m o s l a d e sa p a r i c i ó n d e s u st r a t o ( e vi d e n c i a d a p o r e l t e st c o l o r im é t r i c o ) p a ra d e t e r m i n a r la a ct i vi d a d d e l a e n zi m a . A d e m á s , a n a l i za r e m o s c ó m o a f e c t a n l a s d i st i n t a s c o n d i c i o n e s e n q u e a c t ú a la e n zi m a ( p H , t e m p e r a t u r a , c o n ce n t r a c i ó n d e N a C l ) , a s í co m o l o s e f e c t o s q u e p u e d e n ca u sa r d i f e re n t e s p r e t r a t a m i e n t o s ( p r o t e in a s a , c a l o r ) . L a d i l u c i ó n ó p t im a n o s i n d i c a r á cu á n t o d e b e m o s d i lu i r l a s a l i va p a ra q u e s e lo g r e e l e f e ct o a c r o m á t i c o d e n t ro d e l r a n g o p ro p u e s t o ( 2 - 8 m i n u t o s ) . Metodología: S e p a r t ió d e u n a m u e st r a d e sa l i va d e u n in t e g r a n t e d e l g r u p o y s e l a r e co g i ó e n u n va s o d e p re c i p i t a d o q u e s e co l o c ó e n u n r e c i p ie n t e co n h ie l o p a r a r e d u c i r l a e n e r g í a c i n é t i ca ( p a r a d i s m in u i r e l co n t a c t o d e l a s m o lé c u l a s, reduciendo las interacciones químicas que se pudieran producir) de co m p u e s t o s p r e se n t e s e n l a sa l i va q u e p u e d a n a f e ct a r e l f u n c io n a m ie n t o d e la proteína. A p a r t i r d e l a m u e s t ra , s e t o m ó u n a a l í c u o t a p a ra i m p r e g n a r u n p a p e l i n d i c a d o r d e p H s o b r e u n p a p e l b la n co . E l p H o b t e n i d o f u e e n t re 7 - 8 . D e s d e a q u í , e l t r a b a j o se d i vi d i ó e n d o s p a rt e s : u n a p a ra d e t e r m i n a r la d i l u c i ó n ó p t im a y e l t i e m p o d e r e f e re n c i a y l a o t r a , m o d i f i c a n d o u n a d e l a s co n d i c i o n e s e xp e r i m e n t a l e s. Parte 1: S e t o m ó 1 m l d e sa l i va d e l a m u e s t ra d e l va s o d e p r e c i p i t a d o s y se lo d i lu yó co n 9 m l d e a g u a d e st i l a d a e n u n t u b o d e e n s a yo , o b t e n i e n d o u n a d i lu c i ó n 1 / 1 0 . L u e g o s e m e zc l ó p o r i n ve r s i ó n , e vi t a n d o q u e l a so l u c i ó n a d q u i e r a e n e r g í a c i n é t i ca y se p ro d u zc a l a d e s n a t u r a l i za c i ó n d e l a e n zi m a d e n u e st r o i n t e r é s ; y s e lo c o l o có e n h ie l o , p o r l a m i s m a r a zó n a n t e s e xp u e s t a . S e p re p a r ó u n a g r a d i l l a co n 1 5 t u b o s , co n t e n i e n d o c a d a u n o u n a so l u c i ó n ( d e co l o r a c i ó n a m a r i l l a ) d e 5 m l d e a g u a d e l a c a n i l l a y u n a g o t a d e I 2 / I K 0 , 0 1 M , q u e se m e zc l ó p o r a g i t a c i ó n p a r a o b t e n e r u n a s o l u c ió n h o m o g é n e a . L u e g o , se n o s e n t r e g ó u n a s o l u c ió n d e a lm i d ó n 1 % p / v a b a ñ o t é r m i c o a 3 7 ° C ( p a r a q u e c o n f o r m e u n a s o l u c i ó n h o m o g é n e a ) . S e e xt r a j e r o n 6 g o t a s c o n p i p e t a P a st e u r d e la s o l u c ió n d e a l m i d ó n y s e la vo l c ó e n u n t u b o 0 d e l a g r a d i l l a , m e zc l á n d o l o p o r in ve r s i ó n y o b t e n i e n d o u n co l o r a zu l ca r a c t e r í s t i c o d e l c o m p l e jo I o d o - a lm i d ó n . P ro n t a m e n t e , se c o lo c ó e n e l t u b o c o n a l m id ó n 1 m l d e l a d i l u c i ó n 1 / 1 0 d e l a s a l i va ( q u e co n t i e n e a a m i l a s a ) y e n e se in s t a n t e se co m e n zó a c r o n o m e t ra r . A l o s 3 0 s e g u n d o s, s e re t i r a r o n 6 g o t a s d e e st a so l u c i ó n a 3 7 ° C d o n d e d e b í a o c u r r i r l a re a c c i ó n y s e l a s a g r e g ó a l t u b o 1 d e l a g r a d i l l a . E s t e p r o ce d im i e n t o s e d e b e r í a h a b e r r e p e t i d o ca d a 3 0 s e g u n d o s p a r a l o s s i g u i e n t e s t u b o s h a s t a q u e l a m u e s t ra a d q u i r i e r a u n co l o r p a rd u zc o , s i n e m b a r g o , ya e n e l t u b o 1 , a l m e zc l a r l o p o r in ve r s i ó n c o n u n t a p ó n d e g o m a , se o b t u vo u n a c o l o r a c i ó n p a r d a . C o m o e l e f e ct o a c r o m á t i c o e xp l i c a d o e n l a i n t r o d u c c i ó n s e h a b í a d a d o a n t e s d e l o s 2 m in u t o s , e r a e vi d e n t e q u e l a d i lu c i ó n 1 / 1 0 n o e ra l a ó p t im a . P o r e s o , s e d e c i d ió u n a n u e va d i lu c i ó n 1 / 5 0 . P a r a o b t e n e r e s t a d i l u c i ó n , se t o m ó 1 m l d e la 1 / 1 0 d e s a l i va y se l a c o l o có e n u n t u b o d e e n s a yo s c o n 4 m l d e a g u a d e st i l a d a , m e zc l á n d o l o p o r i n ve r s i ó n . S e r e p i t i ó e l p r o ce d im i e n t o a n t e r i o r d e l a m e d i c i ó n d e l a r e a c c ió n e n zi m á t i c a y d e e st a m a n e r a se d e t e r m i n ó e l t ie m p o d e re f e r e n c i a p a r a l a d i lu c i ó n 1 / 5 0 , q u e s e r á l a d i l u c ió n ó p t im a . Parte 2: A ca d a g r u p o se l e a s i g n ó u n t ra t a m i e n t o d i s t i n t o p a ra a n a l i za r l a a c t i vi d a d d e l a e n zi m a a lt e r a n d o l a s co n d i c i o n e s a n t e r i o r e s ( m o d if i c a n d o u n a so l a va r i a b l e ) . N u e s t r o g r u p o r e c i b i ó u n a so l u c i ó n N a C l 0 , 1 M p a ra a n a l i za r l o s e f e ct o s d e l a p r e se n c i a d e Na C l so b r e l a a m i l a s a . P a r a r e a l i za r e s t a r p a r t e , se t ra b a j ó c o n u n a d i l u c ió n d e sa l i va a l d o b le d e l a d i l u c i ó n ó p t i m a ( e s d e c i r , 1 / 1 0 0 d e s a l i va ) . S e p i p e t e a r o n 0 , 5 m l d e l a d i l u c i ó n 1 / 5 0 d e s a l i va p a r a m e zc l a r l o s p o r i n ve r s i ó n co n 0 , 5 m l d e Na C l . S e r e p i t i ó e l p ro c e d im i e n t o r e a l i za d o e n la p a r t e 1 y se e n co n t r ó e l t ie m p o e n e l q u e se l o g r ó e l e f e ct o a c r o m á t i c o p a r a l a s a l i va d i l u i d a co n N a C l . No o b s t a n t e , e st e t ie m p o n o se p u e d e co m p a r a r co n la d i l u c i ó n 1 / 5 0 d e l a s a l i va p u e s t o q u e se t r a t a d e d i l u c i o n e s d e s a l i va d i s t i n t a s . P o r l o t a n t o , se e la b o r ó u n a m e d i c i ó n co n t r o l ( c o n e l m i sm o p r o c e d i m i e n t o a n t e r i o r p e r o p a r t i e n d o d e u n a d i l u c i ó n 1 / 1 0 0 d e s a l i va e n a g u a d e s t i l a d a s i n N a C l ) . P a r a l a m e d i c i ó n c o n t r o l s e r e a l i za r o n 1 7 t u b o s. R e su l t a d o s : Parte 1 - p H sa l i va l : e n t r e 7 y 8 - T ie m p o d e r e f e re n c i a : d e s a p a r e c i ó e l c o l o r a zu l a l o s 5 ’ 3 0 ’ ’ d e a g r e g a r l a e n zi m a a l a d i l u c i ó n d e 1 / 5 0 y s e o b t u vo u n co l o r p a r d o . C o m o e s t e t i e m p o d e r e f e r e n c i a s e o b t u vo e n e l r a n g o p r o p u e s t o p o r e l T P d e e n t r e 2 y 8 minutos, podemos afirmar que la dilución 1/50 es la óptima. Parte 2 D i l u c i ó n 1 / 1 0 0 N a C l c o n s a l i va : s e o b se r vó u n a d e sa p a r i c i ó n d e l c o l o r a zu l e n e l t u b o 1 3 a l o s 6 ’ 3 0 ’ ’ d e a g r e g a r l a s o l u c i ó n a l t u b o d e a lm i d ó n a 3 7 ° C . E n e l t u b o c o n t r o l , l u e g o d e 1 7 t u b o s ( p a sa d o s 8 ’ 3 0 ’ ’ ) , n o s e a p r e c i a r o n c a m b io s ( e l c o lo r a zu l n o d e sa p a r e c i ó ) , e s d e c i r , n o h u b o e f e c t o acromático. E s t o q u i e r e d e c i r q u e e n p re s e n c i a d e N a C l l a a c t i vi d a d e n zi m á t i c a d e l a a m i l a sa a u m e n t a ya q u e n e ce s i t a u n t ie m p o m e n o r a l d e l c o n t r o l p a r a lograr el efecto acromático. Se podría suponer que Na+ o Cl— o ambos p u e d e n a f e ct a r l a a c c ió n e n zi m á t i c a d e a m i l a s a . Discusión: P a r a e m p e za r , s e h a d e a c l a r a r q u e l a s d i l u c io n e s ó p t im a s p a r a sa l i va s d e d if e re n t e s p e r s o n a s so n d i st i n t a s p o r q u e l a s ca r a c t e r í s t i c a s y co n c e n t r a c i o n e s d e l o s co m p u e s t o s va r í a n d e u n a p e r so n a a o t r a . E st o m i s m o o cu r r e c o n e l p H s a l i va l y e l t i e m p o d e r e f e re n c i a . E l r a n g o d e 2 a 8 m i n u t o s p a r a e l e f e ct o a c r o m á t i c o e le g i d o s e d e b e a q u e l o s t ie m p o s s e a n m a n e ja b l e s e n e l t r a b a j o p r á ct i c o . S i s e b u s c a s e u n t ie m p o d e re f e r e n c i a m u y p e q u e ñ o , l o s ca m b i o s n o h u b ie s e n s i d o apreciados. P o r lo s e xp e r i m e n t o s q u e r e a l i za m o s e n e l T P , n o se p u e d e co n o c e r l a f o rm a e n q u e e l N a C l a u m e n t a l a a c t i vi d a d d e l a e n zi m a , s i n e m b a r g o , u n a ve z f i n a l i za d o e l T P , n o s in f o r m a r o n q u e r e c ie n t e s d e s cu b r i m i e n t o s d ie r o n a co n o ce r q u e l a α - a m i l a s a c o n t i e n e e n l o s r e st o s a m in o a c í d i c o s d e s u s i t i o a c t i vo C l - - , y p o r e l lo , a l a g r e g a r N a C l , l o s a n io n e s c l o r u r o se u n e n a l s i t io a c t i vo a u m e n t a n d o l a a c t i vi d a d e n zi m á t i c a . E s d e c i r , e l c l o r o a c t ú a co m o co f a ct o r d e l a e n zi m a . L a p r o t e i n a sa K e s u n a p r o t e a sa , e s d e c i r , t i e n e u n a a ct i vi d a d e s p e c íf i c a la c u a l c o n s i s t e e n d e g r a d a r p ro t e í n a s . L a m i s m a a ct ú a r o m p i e n d o l o s e n la c e s d é b i l e s d e l p o l i p é p t id o , h a st a q u e a d q u ie r a s u e s t r u ct u r a p r im a r i a y, p o r lo t a n t o , p ie r d a su f u n c i o n a l i d a d . L a p ro t e in a s a K ( 1 0 0 l , d i s u e l t a e n u n a s o lu c i ó n a c u o s a co n b u f f e r ) se in c u b a c o n l a d i l u c ió n d e sa l i va ( 1 m l ) d u r a n t e 1 h . a 5 0 g r a d o s Ce l s i u s ( t o d o e s t e p r o ce s o e s e l p re - t ra t a m i e n t o d e l a d i l u c i ó n ) . L u e g o d e e s t e l a p s o d e t ie m p o se a g r e g a l a s a l i va t r a t a d a co n p ro t e in a s a a lo s 1 0 m l d e a l m id ó n y s e r e p i t e e l p r o ce d i m ie n t o p a r a l a d e t e r m i n a c ió n d e la a c t i vi d a d e n zi m á t i ca r e a l i za d o e n l a P a r t e 1 . A l s e r l a a m i l a s a u n a p r o t e í n a , u n o e sp e r a r í a q u e la p r o t e i n a s a l e h a g a p e r d e r su f u n c i o n a l i d a d . S in e m b a r g o , e st o n o o c u r r i ó , p u e s t o q u e l u e g o d e u n d e t e r m in a d o p e r í o d o d e t i e m p o s e o b s e r vó e l e f e ct o a c r o m á t i c o , e s d e c i r , l a a m i l a s a e s t a b a a c t u a n d o . E s t o s e p u e d e e xp l i c a r d e d i ve r s a s m a n e r a s . P o r e j e m p l o , n u n ca a ve r i g u a m o s l a c o n c e n t r a c i ó n d e l a e n zi m a e n l a s a l i va , p o r l o t a n t o , t a l ve z e ra m u y su p e r i o r a l a d e la p r o t e i n a s a y p o r e s o n o l l e g ó a c u m p l i r s e f u n c ió n . D e l a m i sm a m a n e r a , h a y q u e t e n e r e n cu e n t a e l p e r í o d o d e i n cu b a c i ó n . T a l ve z n o f u e s u f i c i e n t e p a ra q u e l a p ro t e in a s a k d e g r a d e a l a a m i l a sa . P o r ú l t i m o , c a b e a c l a r a r q u e s e e f e ct u ó u n co n t ro l o d e r e a c c i ó n p a ra n o co n c l u i r e r r ó n e a m e n t e . S e c o lo c ó e n u n t u b o u n a d i l u c i ó n d e s a l i va p e r o so n s ó l o e l b u f f e r , p a r a a s e g u r a r n o s q u e n o h a ya a g e n t e s e xt e r n o s q u e a f e c t e n l o s r e su l t a d o s . E n e l p r e - t r a t a mi e n t o d e l a e n zi ma a u n a t e mp e r a t u r a d e 1 0 0 º C d u ra n t e 1 0 m i n u t o s s e t r a t ó p r e vi a m e n t e a l a d i l u c i ó n o p t im a d e sa l i va 1 / 5 0 d u r a n t e 7 m i n u t o s e n u n b a ñ o d e a g u a a 1 0 0 º C , p e ro a l m e d i r l a a ct i vi d a d e n zi m á t i c a , c o n e l m i s m o p ro c e d im i e n t o d e s c r i t o e n l a p a r t e 1 , n o s e o b s e r vó n i n g ú n c a m b io d e l c o l o r a zu l , ( p o r l o q u e s e p u e d e d e c i r q u e n o s e p ro d u j o e l e f e c t o a c r o m á t i c o ) , d u r a n t e 7 m i n u t o s ( q u e e s e l t ie m p o d e r e f e r e n c ia o b t e n i d o p o r e l g r u p o 2 c o n p H s a l i va l e n t r e 7 y 8 ). A p a r t i r d e l o s r e su l t a d o s o b t e n i d o s s e p o d r í a d e d u c i r q u e l a a l f a α - a m i l a s a s e d e sn a t u r a l i za a l se r e xp u e s t a a u n a t e m p e r a t u r a t a n e l e va d a , ya q u e s e p r o d u ce u n e xc e s o d e ch o q u e s e n t r e l a s m o lé c u l a s p r e s e n t e s e n l a sa l i va c o m o c o n se c u e n c i a d e l a u m e n t o d e l a e n e r g í a c i n é t i ca , p ro d u c i e n d o l a r u p t u r a d e l a s u n i o n e s d é b i l e s ( c o m o p u e n t e s d e h i d r o g e n o , f u e r za s d e va n d e r wa a l s , i n t e r a c c i o n e s i ó n i c a s ) , q u e a f e ct a l a e st r u c t u ra t e r c i a r i a d e l a e n zi m a y a su ve z l a co n f o rm a c ió n d e su s i t i o a c t i vo , p e r d i e n d o la ca p a c i d a d d e r o m p e r l a s u n i o n e s C 1 - C 4 d e l a s g l u c o s a s. Y e s p o r e st o q u e e l co l o r a zu l n o d e s a p a r e ce e n l o s t u b o s d e e n sa yo . C o n r e s p e ct o a l a i n f l u e n c i a d e l p H d e l me d i o e n l a a ct i v i d a d e n zi má t i c a d e l a α - a mi l a s a , p o d e m o s d e c i r q u e a p H e xt r e m o s ( e s d e c i r , m u y á c i d o s o m u y b á s i c o s ) la e n zi m a n o f u n c io n a , o a l m e n o s d i sm i n u ye n o t a b l e m e n t e su a c t i vi d a d . E s t o p o d e m o s c o n c l u i r a p a r t i r d e l o s e xp e r im e n t o s r e a l i za d o s p o r o t r o s g r u p o s , q u e , m a n t e n i e n d o e l r e s t o d e l a s co n d i c i o n e s i n i c i a l e s , m i d i e r o n la a c t i vi d a d d e l a α - a m i l a s a e n d o s m e d io s co n p H e xt r e m o s . E l g r u p o 4 h a b í a e n c o n t r a d o u n t ie m p o d e r e f e r e n c i a d e 6 m i n u t o s ( a p a r i c i ó n d e l e f e c t o a c ro m á t i c o ) p a ra su d i l u c i ó n ó p t i m a y u n p H s a l i va l d e e n t r e 6 y 7 . S in e m b a r g o , a u n p H 2 ( m á s á c i d o ) , n o e n c o n t r ó ca m b i o s ( e s d e c i r , n o h u b o efecto acromático) en 10 minutos de reacción. Algo parecido ocurrió con el g r u p o 1 2 , q u e h a b í a e n c o n t r a d o u n t i e m p o d e r e f e r e n c ia d e 1 ’ 3 0 ’ ’ p a ra u n p H s a l i va l d e e n t r e 7 y 8 , y c u a n d o r e p i t ió e l e xp e r im e n t o e n u n m e d i o co n p H 1 2 ( m á s b á s i c o ) n o h u b o e f e ct o a c r o m á t i co e n 4 m i n u t o s d e r e a c c ió n . T o d a s l a s e n zi m a s t ie n e n u n p H ó p t im o , e n d o n d e t i e n e n m a yo r a c t i vi d a d , y a m e d id a q u e s e a l e j a n d e e se p H ( p a r a a m b o s l a d o s ) d i sm i n u ye n su a c t i vi d a d . E s t o s e d e b e a q u e a l g u n o s r e s t o s a m in o a c í d i c o s d e l a s e n zi m a s ( e n e l ca s o d e q u e se a n p r o t e í n a s ) t ie n e n c a r g a s y p u e d e n se r l o s r e s p o n sa b l e s t a n t o d e m a n t e n e r l a e s t r u c t u r a t r i d i m e n s i o n a l d e l a p ro t e í n a c o m o d e i n t e r a c c io n a r co n e l s u st r a t o . E l p H d e l m e d i o ( e s d e c i r , la p re s e n c i a d e i o n e s H + u O H - ) p u e d e m o d i f i c a r l a s ca r g a s d e e s t o s a m i n o á c i d o s y d e e s t e m o d o i n c l u so d e s n a t u r a l i za r a l a e n zi m a . D e b e m o s a c l a r a r q u e a u n q u e la e n zi m a t e n g a a ct i vi d a d a l p H sa l i va l d e ca d a p e r so n a ( s i e m p r e e n t r e 6 y 8 , se g ú n l a t a b l a ) , e st o n o q u i e re d e c i r q u e é s t e s e a su p H ó p t im o . P a r a d e t e rm i n a r l o e xp e r im e n t a l m e n t e , d e b e r í a m o s h a b e r m e d id o la a ct i vi d a d e n zi m á t i ca a d i f e r e n t e s p H p a r a r e a l i za r u n a c u r va , p e r o n o p o d e m o s d e t e r m i n a r e l p H ó p t im o d e l a α - a m i l a sa a p a rt i r d e lo s r e s u l t a d o s d e e st e T P . E n e l t r a t a m i e n t o d e l e f e ct o d e l a t e mp e r a t u r a , se m id e la a c t i vi d a d e n zi m á t i c a c o m o se e f e c t u ó e n l a p a rt e 1 , p e r o i n c u b a n d o l a r e a c c i ó n a t e m p e r a t u r a s d i f e r e n t e s d e 3 7 ° C : a 0 ° C , a t e m p e ra t u r a a m b i e n t e y a 7 0 ° C . A 0 ° C y a 7 0 ° C , n o s e p r e s e n t a ro n ca m b i o s d e co l o r e n l o s t u b o s d e l a g r a d i l l a , e s d e c i r q u e e l c o l o r a zu l n u n ca d e s a p a r e c i ó . P o r l o t a n t o , se p o d r í a d e c i r q u e l a a m i l a s a n o a c t u ó . E n ca m b i o , a t e m p e ra t u r a a m b ie n t e s í s e p re s e n t a r o n ca m b i o s , p e r o e n u n t i e m p o m a yo r a l d e r e f e re n c i a d e l g r u p o q u e l o r e a l i zó . E s t o e ra d e e s p e ra r s e , ya q u e c a d a e n zi m a t ie n e u n r a n g o d e t e m p e r a t u r a ó p t i m a y, e n e l c a so d e l a a m i l a sa , a l e n co n t ra r s e é s t a e n e l c u e r p o h u m a n o ( q u e s i e m p r e t i e n e u n a t e m p e r a t u r a d e 3 7 ° C ) , se su p o n e q u e a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e n o va a p e r d e r s u a c t i vi d a d , p e r o s í d i sm i n u i r l a , ya q u e l o s ch o q u e s i n t e rm o l e cu l a r e s va n a s e r m e n o r e s. S in e m b a r g o , a l d i s m in u i r d e m a s i a d o l a t e m p e r a t u r a , l o s c h o q u e s e n t r e l a s m o l é cu l a s d i s m in u ye n t a m b ié n , p o r l o q u e l a a ct i vi d a d e n zi m á t i c a b a j a h a s t a e l p u n t o e n e l q u e n o s e p u e d e ve r e n e l e xp e r im e n t o . P o r e l co n t r a r i o , a l a u m e n t a r l a t e m p e ra t u r a d e i n c u b a c i ó n a 7 0 ° C , l o s c h o q u e s e n t r e l a s m o l é cu l a s se va n a a c r e c e n t a r d e t a l f o rm a q u e la e n zi m a s e va a d e s n a t u r a l i za r . E s p o r e l l o q u e se p r e su m e q u e n o s e o b se r va r o n ca m b i o s e n los tubos.
