1.4.- espectrofotometría de absorción atómica

1.- Introducción

La B.C. estudia los procesos metabólicos y moleculares que
tienen lugar en nuestro organismo.

A partir de muestras biológicas, la B.C. determina las
magnitudes biológicas: signos clínicos, valores cuantitativos de
la química de los procesos metabólicos que se utilizan para
conocer el estado clínico de un paciente.

Proporcionan información básica en la prevención, diagnóstico,
evolución y pronóstico de una enfermedad, así como el
seguimiento de la respuesta a un tratamiento.




La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las
investigaciones químicas y biológicas. Estudia la capacidad que
poseen las moléculas para absorber y emitir radiación
electromagnética.
Las REM son formas de energía que cuando se hacen incidir sobre
una muestra que contiene un compuesto que se pretende analizar,
ocurren diferentes fenómenos que se pueden medir y que aportan
información sobre el analito que se estudia.
Las técnicas espectrofotométricas son aquellas que se basan en la
medición de REM por sus propiedades de interacción con la muestra.
En B.C. las principales REM que se utilizan son la luz visible, la luz
ultravioleta y la infrarroja.
1.2.1.- Conceptos básicos de las REM

Las radiaciones o energía electromagnética (E elm) es una forma de energía
radiante que se propaga:
-Mediante ondas: son oscilaciones del campo electromagnético que vibran
perpendicularmente entre sí y de forma asociada se propagan en el espacio.
Sus magnitudes son:
Amplitud(A): Desviación máxima en relación a su valor medio.
Longitud de onda (λ) es la distancia entre dos crestas de un ciclo
completo del movimiento ondulatorio. Se expresa en nm.
Frecuencia (γ) es el número de ondas que se produce en un
segundo (Hz).
-Mediante partícula: como fotón (partícula de energía). Se relaciona con la
frecuencia y con la longitud de onda mediante la expresión siguiente:
E= h.γ (h= cte de Plank)
λ = c /γ
γ= c/ λ
E=h.c/ λ.
Se deduce pues que:
Cuanto mayor frecuencia, mayor energía
Cuanto mayor es la longitud de onda menor es su energía
El espectro electromagnético cubre un amplio intervalo de energía radiante, que
se ordena en regiones.
El ojo humano responde a la REM entre los 380 y 750 nm (espectro visible), por
encima y por debajo se encuentran las infrarrojas y las UV. Son estos tres tipos
de radiaciones las que se utilizan en las técnicas espectrofotométricas. En el
espectro visible la luz se descompone en colores (a cada color le corresponde
una longitud de onda diferente).
Espectro electromagnético. Regiones
Espectro electromagnético. Regiones
La región visible es un conjunto de radiaciones que forma la luz blanca, la
cual está compuesta de ondas de diversas frecuencias (380-750 nm).
Cuando un rayo de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus
componentes de acuerdo a la longitud de onda.
1.2.2.- Interacciones de luz-materia

Cuando un haz de luz incide sobre la materia se producen varios
fenómenos
– Transmisión: la radiación incide sobre una sustancia sin
producirse pérdida de energía ni cambios de dirección.
– Fenómeno de absorción: absorbe E y pasa a un estado
excitado La partícula tiende a regresar a su estado de reposo
Aº +
desprendiendo la energía
1 absorbida en forma de calor.
Aº + h. γ
A*
Aº + calor
A*
–
Aº +
h.γ2
Emisión: cuando la molécula o átomo en estado excitado
libera su energía y vuelve a su estado de reposo
Aº + h.γ 1
A*
Aº + h.γ2
-
Dispersión: el haz de radiación choca con la partícula en suspensión y
cambia de dirección sin cambiar su energía.
Refracción: el haz de radiación al atravesar una solución cambia de
dirección.
Reflexión: el haz de luz, al incidir en una superficie, rebota y cambia de
dirección
Difracción: el haz de luz se desvía al pasar por el extremo de una
superficie o al atravesar una rendija.
Las técnicas espectrofotométricas se pueden clasificar en:
1.2.3.- El espectrofotómetro. Componentes.
–
A)Fuente de radiación. Proporciona la energía radiante. Según el tipo de espectro y
las longitudes de onda que emitan se distingue entre:
 a.
Fuentes de espectro continuo. Se usan en las técnicas de absorción
molecular (UV, VIS e IR) y de emisión molecular por fluorescencia. Las más
comunes son:
–
–
–
–
–

i. Lámparas de filamento de tungsteno (wolframio). Emite longitudes de onda del
espectro UV y VIS (360 a 950 nm).
ii. Lámparas de filamento de haluro de tungsteno. Emiten en las mismas longitudes de
onda que la anterior, pero con más intensidad
iii. Lámparas de hidrógeno y deuterio. Producen un espectro continuo en la región UV.
iv. Lámpara de arco de xenón o mercurio. Dan altas intensidades entre 200 y 1000 nm.
v. Fuentes de espectros de líneas. Emiten radiaciones en forma de líneas discretas. Se
emplean en técnicas de absorción atómica y de emisión molecular por fluorescencia.
Las más comunes son las lámparas de vapores de mercurio, de vapor de sodio y de
cátodo hueco.
b.
Fuentes de luz láser. Permiten aplicar luz completamente monocromática,
sin ancho de banda.
Fuentes de Energía o radiación
Lámpara de deuterio
Región UV (190-370 nm)
Fuente de tungsteno.
Región visible (350950 nm)
Lámpara de mercurio
Lámparas láser
B) Monocromador. Permite seleccionar y transmitir una radiación
monocromática a partir de la luz generada por la fuente de emisión.
Cosnta de:
a.Rendija de entrada. evita la entrada de luz dispersa. Suelen ser lentes
colimadoras que colecta el rayo de luz y los organiza en haces
paralelos.
b.Selector de longitud de onda. Modifica la longitud de onda de la radiación. Hay dos
tipos:
Prismas. Son elementos en forma de cuña que descomponen un haz de
luz en sus distintas longitudes de onda
Redes de difracción. Consiste en un gran número de hendiduras paralelas
trazadas sobre un vidrio o una superficie metálica. Cada hendidura se
comporta como un prisma cuando incide un haz de luz sobre ellas.
.
.
c.Rendija de salida. Deja pasar la parte del abanico desplegado por la red o el prisma
que corresponde a las longitudes de onda seleccionadas y lo dirige hacia la cubeta.
C)Cubetas. Son los recipientes en que se coloca la muestra. Pueden ser de
distintos tipos y tamaños, pero todas tienen un ancho de 1 cm. Se fabrican en
materiales que no absorben a la longitud de onda deseada: plástico para la luz
visible y cuarzo para UV.
D)Detector. Está basado en el efecto fotoeléctrico, es decir, que los
fotones que inciden sobre un material liberan electrones que producen una
corriente eléctrica, la cual se puede amplificar. Su cometido es convertir la
respuesta lumínica en una señal eléctrica medible.
Dependiendo del tipo de luz con el que se trabaja existen distintos tipos de
detectores:
a.Célula fotovoltaica o fotocélulas o fotodiodo. El haz de luz incide
sobre un diodo produciendo un flujo de electrones que se puede
medir con un amperímetro.
b.Fototubos o fototubos multiplicadores. La luz incide sobre un
cátodo fotosensible que desprende electrones, los cuales pasan a
un ánodo o a varios dínodos para amplificar la corriente.
c.Detectores de carga acoplada. Son semejantes a los usados en
fotografía digital.
E) Sistema de registro y lectura. La energía eléctrica del detector se refleja
en sistemas de lecturas y presentación de datos. Estos pueden ser:
a. Sistemas de lectura directa, generalmente asociada a la
detección con fotocélulas. Utilizan un Galvanómetro.
b. Sistema de amplificación de señal, generalmente asociada a
aparatos.
D) Tipos de espectrofotómetros. Según la disposición de sus componentes
se pueden distinguir tres:
1.- Espectrofotómetro de haz simple. Tiene los componentes ya
estudiados.
2.- Espectrofotómetro de doble haz: en el tiempo. Tiene un dispositivo
reflectante (Chopper) que permite a la radiación procedente del
monocromador a seguir alternativamente dos direcciones, una hacia el
blanco y otra hacia la muestra.
3.- Espectrofotómetro de doble haz en el espacio. Todos los
componentes están duplicados excepto la lámpara, por lo que dos
haces de luz llegan al mismo tiempo a dos muestras.
E. Doble haz en el espacio
E. Doble haz en el tiempo
1.3. ESPECTROFOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR
Se basa en la capacidad de las moléculas de absorber una parte de la
radiación que reciben. Las longitudes de onda que cada sustancia absorbe
son características de cada molécula y por lo tanto se puede usar para
identificarla. El análisis de esta absorción puede ser:
a)Cuantitativo. Se realiza con radiaciones del espectro UV y VIS.
Es el más usado en los laboratorios de bioquímica
b)Cualitativo. Se realiza con radiaciones del IR y en laboratorio
clínico se usa fundamentalmente para análisis de la composición
de cálculos.
Ejemplos de espectros de
absorción
1.3.1.- La absorción molecular.
Cuando una molécula absorbe REM pasa de un estado de reposo a otro de mayor
energía o excitado (cambio de energía en los electrones y en su estructura electrónica),
que se conoce como transiciones. (depende del tipo de enlace entre sus átomos y de
la longitud de onda que le incida).
Las radiaciones de mayor energía UV-VIS son capaces de producir transiciones
electrónicas entre átomos, las IR de menor energía son sólo capaces de producir
transiciones de vibración o rotación en la moléculas y se usan para análisis cualitativos.
Para medir la absorción de energía radiante que caracteriza a una
molécula se utilizan dos términos: transmitancia y absorbancia.
La transmitancia (T) es el cociente entre la intensidad de la luz transmitida
(It) y la intensidad de la luz incidente (Io). No tiene unidades y se da en %
%T= It/Io x 100
En la práctica esta magnitud no se maneja por ser exponencialmente inversa a la concentración de
la muestra y al ancho de la cubeta. Los espectrofotómetros miden la transmitancia, pero hacen
cálculos logarítmicos automáticamente para convertirla en absorbancia (A) que es lineal
y positiva a la concentración de la muestra.
Espectro de absorción. Es la representación gráfica entre la longitud
de onda que incide sobre una sustancia y su absorbancia. Cada
cromógeno (sustancia absorbente) tiene un espectro de absorción
característico.
Utilidad: - Seleccionar longitud de onda para una medida cuantitativa
- Identificación cualitativa
1.3.2.- LEY DE LAMBERT - BEER

La ley de Lambert-Beer indica que la absorbancia (A) de un analito
es directamente proporcional al coeficiente de absorción (I/mol.cm)
de una solución (a), a la anchura de la cubeta (b) (1 cm) y a la
concentración de la muestra (c) (mol/I).
A = axbxc
LEY DE LAMBERT - BEER
Cuando un haz de luz incide en una disolución, parte de la energía queda
retenida en la muestra (Absorbancia) y parte de ella se transmite
(Transmitancia). Tanto la absorción como la transmisión depende de la
concentración de la solución.
La relación entre la concentración y la absorbancia es directamente
proporcional, mientras que en la transmitancia es inversa y logarítmica.
Linealidad y desviaciones de la LEY DE LAMBERT BEER

Límite de linealidad. Es el intervalo de concentraciones entre las
cuales existe una relación lineal entre la concentración y la
absorbancia, es decir, se cumple la Ley de L-B. Cuando la
concentración del cromógeno sobrepasa los límites de linealidad, la
Ley de L-B deja de cumplirse, convirtiéndose la recta en una curva.
La lectura de una absorbancia fuera de los límites de linealidad
proporciona una concentraciones falsas por lo que hay que diluir la
muestra para que su concentración entre dentro de los límites de
linearidad.
Desviaciones de la Ley de L-B
Desviaciones instrumentales:
- Alteraciones en la luz incidente:, ejemplo que no sea monocromática.
- Errores en la rendija de salida:.
- La cubeta, calidad del material, estado,
- Detector, ejemplo cuando llega luz procedente de otros lugares distintos
al de la fuente de luz
Desviaciones químicas:
- ph de la solución
- Absorbancia del solvente: si es significativa con la del soluto
- Interferencias: otros compuestos que absorben a la misma longitud de
onda, etc
1.3.3- Espectrofotómetro UV-VIS


Es el utilizado en espectrofotometría de absorción molecular. Los más sencillos
tienen los siguientes componentes:
– Dos lámparas (una para espectro visible y otra para espectro UV) con
banda de ancho espectral de 4 nm, haz simple
– Red de difracción
– Detector de fotodiodos
Manejo:
– Esperar 20 minutos tras su encendido
– Seleccionar la longitud de onda
– Seleccionar el modo de medida
– Seleccionar la lámpara: deuterio para UV y tungsteno para visible
– Ajustar a 0 con un blanco
– Seleccionar curva de calibración adecuada o medir el patrón o stándard
– Medir muestra problema
1.3.4.- Mediciones de la muestra problema
Antes de medir la muestra debemos eliminar aquellas absorbancias que no son
debidas a la sustancia que queremos medir (disolvente, cubetas, otras
sustancias en disolución etc.). La determinación de estas absorbancias se
conoce con el nombre de blancos. Estos establecen una línea basal de
absorbancias sobre la que se aplica la ley de Lambert-Beer, la cual realmente
sería:
A= axbxc+n
Siendo n la absorbancia de los blancos.
Para que se cumpla la Ley de Lambert-Beer: absorbancia directamente
proporcional a la concentración del analito se debe anular (restar) la
absorbancia de los blancos. Para ello se pone a 0 el espectrofotómetro con una
«solución blanco»
a) Mediante un factor de calibración (K o F)
Comparando la concentración de la muestra con
una solución de concentración conocida de la
misma muestra
Ap= axbxcp
Am= axbxcm
Ap = Cp
Cm = Cp x Am
Am Cm
Ap
F
Cm = F x Am
b) Mediante curva de calibración
Es la representación gráfica de la absorbancia (eje de ordenadas) frente
a la concentración (eje de abscisas). Se deben representar un mínimo
de tres puntos, correspondientes a tres concentraciones conocidas. La
curva de calibración es la recta que se aproxima lo más posible a las
coordenadas obtenidas.
Para averiguar la concentración de una muestra problema, se interpola
su absorbancia en la curva de calibración.
CURVA PATRÓN
0.6
0.5
A
B
Absorbancia del problema
0.4
S
0
R
0.3
B
A
N
0.2
Interpolación
C
I
A
0.1
0
0
2
4
6
Concentración mg/lt
8
10
12
1.3.5.- Mediciones a punto final, cinéticas y enzimáticas
La mayoría de las magnitudes bioquímicas (analitos), no absorben luz, por lo
que hay que someterlos a una serie de reacciones para obtener, una
sustancias mensurable.
A + R = Sm
- Cuando la reacción da lugar a sustancia que absorben dentro del espectro
visible, de denomina método colorimétrico.
- Cuando una reacción es mediatizada por enzimas, se denomina método
enzimático.
En ambos tipos de reacciones, el cálculo de las magnitudes
bioquímicas se divide en tres grandes grupos:
1.- Cálculo de la concentración a punto final. Significa que la reacción entre
muestra y reactivos se ha producido completamente y la concentración del
analito es directamente proporcional a la concentración de algunos de los
productos formados, que es el que se mide espectrofotométricamente. En ellos
se cumple la ley de L-B.
– Medición a punto final en reacciones colorimétricas.
Es
la
determinación por colorimetría de la concentración de una sustancia o
bien del producto de su reacción con un reactivo específico.
Analito + reactivo = producto coloreado
–
Método a punto final en reacciones enzimáticas. La sustancia problema
es el sustrato de una enzima específica, que lo transforma en un
producto coloreado que absorbe en el espectro UV-VIS
Analito + enzima = producto coloreado
2.- Cálculo de la concentración en técnicas cinéticas.

En ellas se mide la velocidad de reacción antes de que ésta concluya. Las
condiciones de temperatura y tiempo de medida deben ser muy estrictas para
garantizar los resultados.

La variación de la absorbancia por unidad de tiempo es directamente proporcional a
la concentración y/o actividad del analito, ya que el analito de la muestra va a dar
lugar a la aparición o desaparición de sustancias capaces de absorber radiación. La
ley de L-B adaptada a esta medición sería:
ΔA/min=a x b x c

Al ser a y b constantes, se sustituye por un valor numérico F que proporcionan las
casas comerciales
ΔA/min= Fx c
 Si se compara con un patrón el cálculo será el siguiente:
Cpr= Cpa x ΔApr
ΔApa
3.- Cálculo de la actividad enzimática.
La concentración de enzimas en suero es muy baja pero dado que tiene gran capacidad
catalítica es posible determinar su actividad y presuponer que es directamente
proporcional a su concentración.
El cálculo de su actividad se realiza midiendo su velocidad de reacción de dos formas:
- Midiendo la cantidad de sustrato que desaparece
- Midiendo la cantidad de producto que se forma
Todas las reacciones enzimáticas deben hacerse en condiciones estrictas de ph, temperatura, tiempos y
concentraciones de reactivos.
Métodos a punto final. Puede ser :
- A un punto: (la enzima no tiene periodo de incubación)
- A dos puntos: (cuando sí tiene. Se realiza una medida tras el
periodo de incubación y otra al final de la reacción)
Métodos cinéticos. Se leen las absorbancias cada minuto durante 3 a 5
minutos. Ventajas: detectan desvíos de linealidad entre las medidas.
1.3.6.- Espectrofotometría de absorción molecular
en el espectro IR

En bioquímica clínica se utiliza para averiguar la
composición química de los cálculos urinarios
La espectroscopia infrarroja es usada con mayor frecuencia como un medio para identificar sustancias
químicas y analizar sus composiciones debido a que la absorción de determinadas longitudes de onda
indican qué grupos químicos están presentes en la molécula y, a veces, cómo están enlazados. Aunque los
patrones de los movimientos de vibración de moléculas poliatómicas grandes son complejos, grupos químicos
específicos producen bandas características en un espectro infrarrojo. Estos son conocidos como grupos
vibracionales y reflejan generalmente las vibraciones extensoras de enlaces individuales
Composición química de los cálculos urinarios.
1.4.- ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN
ATÓMICA
Se basa en la capacidad de los electrones de un elemento químico de pasar de
su capa de valencia (estado de reposo) a orbitales de mayor energía (estado
excitado) gracias a la energía absorbida en forma de REM UV-VIS.
1.4.- ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN
ATÓMICA
Las longitudes de onda que absorbe un elemento químico tiene un ancho de
banda muy estrecho y se denominan líneas espectrales. Cada elemento tiene
una línea de espectro única, por lo que se puede determinar su presencia en
una muestra
En laboratorio de BC se emplea para determinar metales: Ca, Fe, Li,
Cu, Hg, etc
Se emplean dos métodos: EAA con llama y EAA con atomización
electrotérmica.
1.4.1.- EAA con llama

El espectrofotómetro de llama es semejante al ya descrito, sólo varía la fuente
de radiación y el tratamiento de la muestra.
Fuente de radiación. Se utiliza una lámpara de cátodo hueco, la
cual contiene en su interior un gas inerte (argón o neón) y el
electrodo de trabajo: un cátodo del mismo material que el elemento
que se pretende medir en la muestra, ya que emite en la longitud de
onda característica del elemento que se analiza.
1.4.1.- EAA con llama

Tratamiento de la muestra. La muestra líquida es aspirada por un capilar hasta
un nebulizador . En él se transforma en un aerosol; luego se mezcla con gases
en la cámara de premezcla y en el quemador se somete a la llama.

El analito se transforma en átomos elementales capaces de absorber energía a
la longitud de onda que emite la lámpara de cátodo hueco
1.4.1.- EAA con atomización electrotérmica


También llamada EAA con horno de grafito. Es más sensible que con la llama,
sobre todo cuando los metales se encuentran en concentraciones muy baja.
Se sustituye la llama por un horno de grafito.
Espectrofotómetro de absorción
atómica dual: llama y grafito
Espectrofotómetro de absorción atómica
1.5.- Espectrometría de emisión atómica
Algunos elementos químicos tras ser excitados, vuelven a su estado fundamental
emitiendo una radiación luminosa cuya longitud de onda es característica.
La intensidad luminosa producida es directamente proporcional a la concentración de
átomos en la muestra.
Según el sistema de atomización y temperatura producida, existen dos tipos de EEA:
EEA con llama y EEA con plasma.
5
2
1.5.1.- EEA atómica con llama
Mide la emisión de luz de un átomo cuando vuelve a su estado fundamental tras ser
excitado por el calor de una llama.
A diferencia de la EAA con llama el espectrofotómetro de EA con llama no tiene fuente de
radiación.
Se utilizó en L.B. para determinar Na, K y Li. Hoy ha sido sustituida por las técnicas de
electrodo ión selectivo.
Fotómetros de llama
1.5.2.- Espectrometría de emisión atómica por plasma
Emplea como sistema de atomización el plasma: mezcla de gases compuestos por
aniones y cationes, conductor de la electricidad.
El más utilizado es el argón que alcanza temperaturas de 10.000 K, que hace posible la
emisión de varios átomos a la vez y determinar gran cantidad de elemetos químicos.
En B.C. no se utiliza.
1.6.- Espectrometría de luminiscencia
La luminiscencia es el fenómeno de emisión de luz no asociado a altas
temperaturas (Luz fría).
Clasificación:
1.- Fotoluminiscencia. La excitación tiene lugar por absorción de fotones.
2.- Quimioluminiscencia: La energía de excitación procede de una
reacción química
3.- Bioluminiscencia. La quimioluminiscencia tiene lugar en un ser vivo.
4.- Electroquimioluminiscencia. La energía procede de una corriente
eléctrica.
1.6.1.- Fotoluminiscencia
Tiene lugar cuando una sustancia emite su exceso de
energía con una longitud de onda mayor (menor
energía) que la recibida.
Dependiendo del tiempo que dure la emisión se
distingue:
- Fluorescencia: se emite durante poco tiempo (10 -8
seg)
- Fosforescencia: se emite durante un largo periodo
(varias horas)
La espectrometría de fluorescencia o fluorimetría
mide la luz fluorescente emitida por moléculas que
poseen anillos aromáticos o dobles enlaces
conjugados.
Dada su enorme sensibilidad se utiliza para cuantificar
analitos de una muetra en muy bajas concentraciones.
Espectrofotometría de fluorescencia o fluorimetría
El fluorímetro es un equipo semejante al
espectrofotómetro,
con
las
siguientes
particularidades:
- La lámpara es de xenón o de mercurio (250800 nm)
Tiene dos monocromadores, que seleccionan la
longitud de onda de entrada y de salida
- Las cubetas son de cuarzo
- Los componentes están dispuestos en ángulo
recto, para que la luz de la lámpara no interfiera
con el monocromador de emisión ni el detector.
1.6.2.- Quimioluminiscencia

Se produce cuando una reacción química genera una molécula excitada
electrónicamente, la cual emite luz al volver a un estado de menor energía
La reacción química es la oxidación de un
compuesto (luminol, isoluminol, éster de acridino) por
un oxidante (H2O2, Hipoclorito u oxígeno).
Es muy usada en inmunología:
inmunoquimioluminiscencia
peroxidasa del rábano (horseradish peroxidase o HRP)
Equipo de Quimioluminiscencia
1.7.- Espectrofotometría de
dispersión

Cuando un haz de luz choca con partículas en
suspensión, una parte se dispersa, otra se
absorbe, otra se refleja, etc

La dispersión de la luz y su intensidad depende
de varios factores, entre ellos la concentración
de partículas, longitud de onda, tamaño y peso
molecular, distancia de cubeta y detector.
Se trabaja con suspensiones. Las más frecuentes están formadas por
agregados procedentes de reacciones antígeno-anticuerpo.
Las técnicas espectrofotométricas de dispersión son la turbidimetría y la
nefelometría
1.7.1.- Turbidimetría
Mide la disminución de la intensidad del haz de luz (transmitancia) que atraviesa la
cubeta que contiene la suspensión.
Para su medición se emplea un espectrofotómetro UV-VIS.
Se cumple la Ley de L-B, sustituyendo el coeficiente de absorción por una constante K
que depende del tamaño y forma de la partícula y de la longitud de onda:
A= K x b x C
TURBIDÍMETROS
1.7.2.- Nefelometría
NEFELÓMETROS
1.8.- Refractometría

Técnica de análisis cuantitativo basada en el fenómeno de refracción de la luz.

El índice de refracción es directamente proporcional a la cantidad de
sustancias disueltas en una solución, por lo que se puede calcular la
concentración de solutos a partir de la variación de dirección.
Se emplea en el estudio de solutos como la albúmina: Concentración en
muestras séricas y/o plasmáticas. Peso específico en orina.

Refractómetro
Elementos del refractómetro:

Prismas:
– Tapa
– Soporte de la muestra
La luz incidente les atraviesa y la luz refractada la recoge un:

Sistema óptico

Ocular. A través de él se observa un círculo en el que aparecen diferenciadas
dos zonas, una clara y otra oscura y una escala gráfica. La línea que delimita
ambas zonas y que corta a la escala proporciona directamente la medida.
Refractómetros
1.9.- Fotometría de reflectancia. Química
seca


.
Mide la intensidad de luz reflejada en una superficie después de producirse
una reacción química que se desencadena al aplicar la muestra.
La reacción química tiene lugar en la fase sólida de la superficie de un soporte
(tira o slide). En ella se encuentran los reactivos. Al añadir la muestra ésta
difunde sobre la fase sólida del soporte disolviendo los reactivos y se produce
la reacción, la cual es cuantificada por medio de un espectrofotómetro de
reflexión. Se conoce como técnica de química seca.
Instrumentación






Partes del espectrofotómetro de reflexión:
Fuente de luz: lámparas de haluro de tungsteno y xenón. Selector de longitud
de onda.
Sistema óptico: lentes, espejos y filtros.
Reactivos de fase sólida: parte reactiva del soporte.
Detector, procesador de datos: cuantifican la reacción.
Sistema de lectura. Puede ser:
–
–
Sobre la superficie: tiras reactivas.
Sobre el reverso de la superficie: reactivos multicapa
Los reactivos de química seca
.
Tiras reactivas:
Experimentan un cambio de color al entrar en contacto con la muestra.
Partes de una tira:
- Soporte de plástico.
- Matriz de celulosa con reactivos.
Se utilizan en diagnóstico rápido o pruebas de autodiagnóstico
7
4
Películas multicapa o slide



Slide: chasis cuadrado de plástico con la zona reactiva en su centro constituida
por múltiples capas.
La muestra se deposita en la zona reactiva produciendo la reacción.
Se emplean en los Autoanalizadores.
Fin