Procedimiento recuento mohos y levaduras en alimentos Norma

PROCEDIMIENTO RECUENTO MOHOS Y
LEVADURAS EN ALIMENTOS
NORMA ISO 7954
Sección Microbiología
Alimentos
1.
PRT- 712.02-031
Fecha emisión:
Septiembre 1993
Revisión: 2
Fecha revisión:
24/10/2008
Página 1 de 14
OBJETIVO
Conocer el número de Mohos y Levaduras que contiene un alimento.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Este procedimiento se aplica a todos los alimentos de consumos humano o animal en los
cuales el ambiente es menos favorable para el crecimiento bacteriano por ej pH <5, baja
humedad, aw (0.75), alto contenido en sal o azúcar, baja temperatura de almacenamiento, la
presencia de antibióticos o exposiciones a irradiación.
3.
FUNDAMENTO
Los hongos son generalmente aerobios estrictos, en cambio las levaduras pueden crecer con o
sin oxígeno; en presencia de éste crecen mejor. Las levaduras crecen más rápido que los
hongos.
Existen varios medios de cultivo recomendados para alimentos, para reducir el crecimiento
bacteriano, algunos utilizan valores de pH bajos (≈4), otros la adición de antibióticos como
por ejemplo penicilina + estreptomicina, cloramfenicol, clortetraciclina, oxytetraciclina o
gentamicina.
4.
REFERENCIAS
4.1
Norma ISO 7954. Microbiology- General Guidance for enumeration of yeasts and
moulds- Colony count technique al 25°C. First edition 1987.
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LEVADURAS EN ALIMENTOS
NORMA ISO 7954
Sección Microbiología
Alimentos
PRT- 712.02-031
5.
5.1
TERMINOLOGÍA
No Aplica
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
MATERIALES
6.1.1
Tubos 16x160 mm.
6.1.2
Placas de Petri
6.1.3
Pipetas bacteriológicas de 1 mL
6.2
Fecha emisión:
Septiembre 1993
Revisión: 2
Fecha revisión:
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EQUIPOS
6.2.1
Baño de agua termorregulado a 47°C ± 2 º C para mantener el agar fundido.
6.2.2
Estufa de incubación regulada entre el rango de 22°C a 25º C (24°C ± 1°C).
6.2.3
Cuenta colonias modelo Quebec
6.3
MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVOS
6.3.1
Agar Cloranfenicol- dextrosa- extracto de levadura (cloranfenicol puede ser
reemplazado por oxitetraciclina).
6.3.2
Solución de Cloranfenicol u Oxitetraciclina al 0,1%.
6.3.3
Agua de dilución: Solución de agua peptonada al 0,1 % o Agua buffer fosfato.
6.3.4
Reactivos Tinción de Gram o Reactivos para Tinción Simple.
7.
DESARROLLO
7.1
SIEMBRA
7.1.1
Preparar la muestra por uno de los métodos recomendados en el PRT-712.01-002.
7.1.2
Pipetear por duplicado a placas Petri estériles alícuotas de 1 mL de la muestra si es
producto líquido o 1 mL de la dilución 10-1 en el caso de otros productos.
Sembrar por lo menos dos diluciones consecutivas por duplicado.
7.1.3
PROCEDIMIENTO RECUENTO MOHOS Y
LEVADURAS EN ALIMENTOS
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Sección Microbiología
Alimentos
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Septiembre 1993
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7.1.4
Se recomienda esta serie de diluciones cuando no se conoce el rango aproximado de
microorganismos.
7.1.5
Agregar 15 mL de agar fundido y temperado a 47ºC ± 2ºC.
7.1.6
El tiempo transcurrido entre la preparación de la suspensión inicial y el momento de
agregar el agar no debe exceder de los 15 min.
7.1.7
Mezclar el inóculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma
adecuada de llevar a cabo esta operación sería la siguiente:
7.1.7.1
Mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección,
7.1.7.2
hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj,
7.1.7.3
mover con movimientos de vaivén en una dirección que forme ángulo recto con la
primera y
7.1.7.4
hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.
7.1.8
Una vez solidificado el agar, NO INVERTIR las placas.
7.1.9
Incubar a 22 - 25ºC durante 3 a 5 días.
7.1.10 Realizar controles de ambiente, medio de cultivo y diluyente. Anotar resultados en
registros código RG-712.00-010.
7.2
LECTURA
7.2.1
Tomar todas las precauciones necesarias al manipular las placas Petri, para evitar la
contaminación del área de trabajo. Las esporas de los mohos se dispersan con gran
facilidad.
7.2.2
Usar un cuenta colonias y contar las placas que contengan menos de 150 colonias.
7.2.3
Si parte de la placa presenta desarrollo excesivo de hongos, o si es difícil contar
colonias aisladas en menos tiempo, registrar los recuentos obtenidos y registrar el
período de incubación, ya sea tres o cuatro días e incluirlo en el informe final.
No contar las placas antes de 3 días de incubación, la manipulación podría provocar
colonias secundarias por dispersión de esporas.
7.2.4
Contar las colonias de mohos las que se presentan bajo una forma filamentosa
característica (micelio) de color variable. Estas se desarrollan más tardíamente que
las levaduras. Anotar resultados en RG-712.00-023.
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LEVADURAS EN ALIMENTOS
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7.2.5
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Contar las colonias de levadura por separado.
Las colonias de levaduras se presentan en forma de colonias opacas, blancas o
amarillas. Anotar resultados en RG-712.00-023.
7.2.6
7.3
Realizar Tinción de Gram según IT-712.00-066 o microscopía al fresco (IT-712.00081) a las colonias sospechosas de levaduras para confirmar su presencia. Anotar el
resultado en el registro código RG-712.00-023
CALCULO
7.3.1
El número de Mohos y Levaduras por gramo o mL de alimento se determina
según la siguiente fórmula :
N=
ΣC
[ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d
donde :
N
= número de colonias por ml o g de producto
Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = número de placas contadas de la menor dilución.
n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.
d
= dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento
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7.4
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Revisión: 2
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EXPRESION DE RESULTADOS
7.4.1
Se informa Recuento de Mohos por gramo o mL de alimento y Recuento de
Levaduras por gramo o mL de alimento.
7.4.2
Aproximar el resultado a dos cifras significativas. Si el tercer dígito es 6, 7, 8 o 9
adicionar una unidad al segundo dígito. Si el tercer dígito es 1, 2, 3 o 4 considerar
solamente los dos primeros dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una
unidad al segundo dígito si este es impar y mantener el segundo dígito si este es
par. Usar ceros para los demás dígitos hacia la derecha.
7.4.3
i todas las placas de ambas diluciones no presentan crecimiento o desarrollo,
informar como menor de uno por el valor recíproco de la dilución menor por g o
mL.
< 1 x 1/ dm , donde dm = menor dilución
8.
REGISTROS
Identificación
del registro
Registro control de
ambiente, RG712.00-009.
Almacenamiento
Protección
Recuperación Tiempo retención
y disposición
Acceso
Papel
5
años
y
restringido
a
disposición
en
personal
basura
normal
Sección
partidos en trozos.
Microbiología.
Archivador verde
Registros
Laboratorio N°346
Sección
Microbiología
Alimentos y Agua.
Registro control de Archivador verde
Acceso
Papel
esterilidad de medios Registros
restringido
a
de cultivo utilizados Laboratorio N°346 personal
en
el
análisis Sección
Sección
Laboratorio
346, Microbiología
Microbiología.
RG-712.00-010.
Alimentos y Agua.
Registro análisis de Archivador
azul Acceso
Papel
muestras de
Registros
de restringido
a
alimentos y agua
Lecturas e informes personal
Laboratorio de
de
resultados Sección
5
años
y
disposición
en
basura
normal
partidos en trozos.
5
años
y
disposición
en
basura
normal
partidos en trozos.
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Alimentos
Identificación
del registro
Recuentos RG712.00-023.
9.
Almacenamiento
Protección
Fecha revisión:
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Recuperación Tiempo retención
y disposición
Laboratorio
Microbiología.
Recuento
aerobios
mesófilos, S.aureus,
Mohos y levaduras
Sección
Microbiología
Alimentos y Agua.
TABLA DE MODIFICACIONES
Revisión Nº Pág.
Modificada
1
1
1
PRT- 712.02-031
Fecha emisión:
Septiembre 1993
Revisión: 2
1
Motivo del cambio
Se elimina página 1 por cambio en
formato documento institucional.
Se cambió formato del encabezado de
página en todo el documento.
Se corrige PRT-702.02-031 por “PRT712.02-031”.
Se cambió número de revisión por 1 por
revisión N° 2 y el total de páginas.
1
2
1
2
1
2
1
2
En el punto 2.0 se eliminó el último
párrafo.
Se deja pie de página sólo en página 1 y
se actualizan los cargos.
Se eliminó el último párrafo del punto 3.0
Se cambia referencia 4.1 Standard
Methods for examination of Dairy
products por:” Norma ISO 7954
Microbiology- General guidance for
enumeration of yeasts and mouldsColony count technique al 25°C. First
Fecha Aprobación
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Revisión Nº Pág.
Modificada
PRT- 712.02-031
Motivo del cambio
edition 1987”.
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3
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3
1
3
1
3
1
3
1
3
1
3
1
3
Se eliminan las referencias 4.2 al 4.6.
Se cambian los puntos 6.1.1 y 6.1.2 por:
Tubos 16x160 mm y por Placas de Petri
respectivamente.
En el punto 6.2.1 se cambia:...50°C ...por:
... 47°C ± 2 º C...
En el punto 6.2.2 se agrega: ... entre el
rango de 22°C a 25º C ( 24°C ± 1°C).
El punto 6.1.1 se cambió Agar
Oxitetraciclina – Extracto de levadura –
Glucosa-Agar (OGY) (ICMSF) por: Agar
Cloranfenicol- dextrosa- extracto de
levadura (cloranfenicol puede ser
reemplazado por oxitetraciclina).
En el punto 6.3.2 se remplazó la frase por:
“Solución de Cloranfenicol u
Oxitetraciclina al 0,1%”.
En el punto 6.3.3 se reemplazó la frase
por: “Agua de dilución: Solución de agua
peptonada al 0,1 % o Agua buffer
fosfato.
Se agregó el punto 6.3.4 se incluyó: ... o
Reactivos para Tinción Simple.
En el punto 7.1.1 se cambió 702.00-004
por: “PRT-712.01-002”.
En el punto 7.1.2 se agregó: ...”de la
muestra si es producto
líquido o 1 mL de
-1
en
el
caso
de otros
la dilución 10
productos.
Se cambió punto 7.1.3 por:” Sembrar por
lo menos de diluciones consecutivas por
duplicado”.
Fecha emisión:
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Revisión: 2
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Fecha Aprobación
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Revisión Nº Pág.
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3
1
3
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1
4
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1
4
1
4
1
4
1
5
1
5
1
5
PRT- 712.02-031
Motivo del cambio
Se trasladan de posición los números
correlativos.
En el punto 7.1.3 se cambió ....10 mL por
15 mL y 50°C ± 1°C por 47ºC ± 2ºC
En el punto 7.1.4 se cambió las viñetas
de letras a,b,c,d por los números: 7.1.7.1
al 7.1.7.4 .
Se incluyó el punto 7.1.6 al 7.1.10
En el punto 7.2.2 se cambió entre 10 -150
por: ...“menos de 150”.
Se agregó un punto, cambiando el punto
7.2.3 por:” Si parte de la placa presenta
desarrollo excesivo de hongos, o si es
difícil contar colonias aisladas en menos
tiempo, registrar los recuentos obtenidos
y registrar el período de incubación , ya
sea tres o cuatro días e incluirlo en el
informe final.
Se cambian de posición los números
correlativos.
En el punto 7.2.3 se cambió RG-702-00023, por: “RG-712.00-023”
En el punto 7.2.4 en el párrafo después
del punto a parte, se cambió RG-702-00023 por :” RG-712.00-023”
En el punto 7.2.5 se cambió IT-702.00066 por: “IT-712.00-066” , RG-702-00023 por :” RG-712.00-023”
Se asigna el punto 7.4.1 y se agregaron
los puntos 7.4.2 y 7.4.3.
En el punto 8.0 RESPONSABLES se
cambió por REGISTROS y sus ítemes.
Se incluyó tabla de registros.
Se eliminaron los ítemes de responsables.
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Fecha Aprobación
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Revisión Nº Pág.
Modificada
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5
1
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1
9
1
9
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Motivo del cambio
Fecha emisión:
Septiembre 1993
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Fecha revisión:
24/10/2008
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Fecha Aprobación
El punto 9.0 Distribución se cambió por:
TABLA DE MODIFICCAIONES.
Se agregó el punto 10. ANEXOS y sus
ítemes.
Al título se le agregó la palabra
CLORANFENICOL
A la fórmula se le agregó la explicación
del asterisco( *)
Se agregaron 2 puntos en la preparación
del medio.
10. ANEXOS
10.1 Anexo N° 1 Recuento Mohos y levaduras, Técnica recuento en placa por siembra en
profundidad.
10.2 Anexo N° 2 Generalidades.
10.3 Anexo N° 3 Agar cloranfenicol (oxitetraciclina)-Extracto de Levadura- Dextrosa.
10.4 Anexo N° 4 Hoja registro de resultados de análisis RAM, S.aureus, Mohos y
Levaduras en muestras de alimentos y agua.
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ANEXO Nº 1
RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS
TECNICA RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
1 mL
HOMOGENEIZADO:
9 mL AP
10 g muestra
90 mL Agua peptonada 0.1%
Dil 10 -1
10 -2
10 -3
SIEMBRA :
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
Agar OGY
INCUBACION:
22-25 ºC placas no invertidas por 5 días
LECTURA PLACAS :
Lectura de placas que contengan entre 10 a 150 ufc
Colonias levaduras
CONFIRMACION :
Colonia mohos , (micelio)
Tinción de Gram
Formas alargadas o cocáceas Gram positivas
CÁLCULO RTO
LEVADURAS:
Hacer el cálculo según Nº de colonias confirmadas
por Gram, por la dilución
CALCULO RTO MOHOS:
Hacer el cálculo según Nº de colonias contadas por la dilución
INFORME
Informar como Nº de UFC mohos/g o mL de producto
Informar como Nº de UFC levaduras/g o mL de producto
1 mL
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ANEXO Nº 2
GENERALIDADES
Los hongos y levaduras son fácilmente encontrados en alimentos en los cuales el ambiente
es menos favorable para el crecimiento bacteriano por ej bajo pH 5 o <5, baja humedad,
aw (0.75), alto contenido en sal o azúcar, baja temperatura de almacenamiento, la
presencia de de antibióticos o exposiciones a irradiación. Causan deterioro de estos
alimentos si son almacenados en condiciones deficientes, como por ejemplo (frutas
frescas, jugos de fruta, vegetales, quesos, cereales, picles y alimentos deshidratados o
congelados, decoloración de las superficies de los alimentos, olores y sabores extraños.
Habría que sumar al deterioro, el peligro potencial de producción de micotoxinas,
producidas por algunas especies de hongos. Si estas sustancias son ingeridas causan
intoxicación alimentaria.
Para eliminar o reducir tales problemas en los alimentos susceptibles se debería:
a) Reducir la carga de esporas con buenas prácticas de higiene.
b) Consumo rápido de los alimentos preparados
c) Guardar los alimentos congelados a-12 ºC
d) Eliminar o reducir el contacto con el aire
e) Calentar los alimentos antes de envasarlos para destruir células vegetativas y esporas.
f)
Agregar ácidos que eviten el crecimiento.
g) Agregar preservantes químicos, tales como sorbatos o benzoatos.
Ningún ser humano ni animal puede consumir alimentos que estén visiblemente
contaminados por hongos, excepto los alimentos fabricados con algunas especies de
hongos que le dan su sabor característico, como por ejemplo queso roquefort,
cammembert o ciertos salames.
Las levaduras crecen más rápido que los hongos, pero generalmente crecen en conjunto.
Los hongos son generalmente aerobios estrictos, en cambio las levaduras pueden crecer
con o sin oxígeno; en presencia de éste crecen mejor.
En alimentos frescos y congelados, el encontrar un número bajo de esporas de hongos y
levaduras es poco significativo; pero si el alimento está altamente contaminado su
consumo puede resultar peligroso.
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Existen varios medios de cultivo recomendados para alimentos, para reducir el
crecimiento bacteriano, algunos utilizan valores de pH bajos (≈4), otros la adición de
antibióticos como por ejemplo penicilina + estreptomicina, cloramfenicol, clortetraciclina,
oxytetraciclina o gentamicina.
La Gentamicina se recomienda para controlar el crecimiento de bacterias Gram negativas
y es bastante efectiva en productos cárneos enfriados.
El agar Rosa de Bengala retarda el crecimiento de hongos que normalmente forman
abundante micelio aéreo, tales como Neurospora y Rhizopus y es inhibitorio para algunas
levaduras. Se recomienda usar preferentemente el agar con antibiótico ya que su
selectividad y especificidad son superiores a las del agar acidificado.
En cuanto a la temperatura de incubación la recomendada por dar mejor resultado es de
22ºC por 5 días.
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ANEXO Nº 3
AGAR CLORANFENICOL (OXITETRACICLINA)-EXTRACTO DE
LEVADURA-GLUCOSA
Fórmula
Extracto de levadura
5
g
Glucosa
20
g
Cloranfenicol
0,1
g*
Agar
20
g
Agua destilada
1000 ml
* obtener una concentración final de 100µg / mL de medio.
•
Pesar según lo indica el fabricante y adicionar 1 L de agua destilada.
•
Calentar ligeramente para su completa disolución
•
Enfriar y medir el pH del, medio de cultivo 6,6 ±0,2 con electrodo de contacto.
•
Dispensar 100 ml en frasco con tapa rosca.
•
Esterilizar en autoclave a 121 ºC por 15 minutos.
•
Si reemplaza el cloranfenicol por oxitetraciclina, debe preparar el medio como se indica
arriba, pero omita el cloranfenicol. Dispensar en cantidades de 100 mL y esterilice.
Preparar a parte la oxitetraciclina al 0,1 % (m/m) en agua destilada y esterilice por
filtración.
•
Justo antes de usar el medio añada 10 mL de la solución a 100 mL del medio base el que
ha sido mantenido fundido a 47°C± 2°C.
•
Después de la adición del antibiótico, no debe someterse el medio a altas temperaturas.
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SOLUCION DE OXITETRACICLINA
•
Disolver 0,1 g de oxitetraciclina en 100 ml de agua destilada.
•
Esterilizar por filtración. Esta solución se puede refrigerar hasta 5 días.
•
En el momento de usar, añadir 10 ml de solución de oxitetraciclina al 0,1% por 100 ml de
agar previamente licuado y enfriado a 50ºC.