Teórica Técnicas 2015

Tecnologia del ADN recombinante
Clonado y manipulación de genes de bacterias y arqueas
Objetivo: Aislamiento y amplificación de un gen de interés para su posterior
manipulación genética
Pasos:
1. Aislamiento y fragmentación de la fuente de ADN: ADN genómico (ADNg) o
producto de PCR.
2. Inserción del fragmento de ADN en un vector de clonado.
3. Introducción y amplificación del vector recombinante en un organismo huésped.
4. Identificación y selección de l construcción de interes
5. Producción de la proteina codificada por la secuencia de ADN clonada
Estrategia de clonado
Pasos:
1. Construcción de vector recombinante.
2. Transformación de células competentes.
3. Plaqueo en medio selectivo con antibiótico +
IPTG y X-Gal
4. Validación de la presencia de inserto
mediante:
a. digestión de plásmidos de colonias con ER
y análisis en gel de agarosa.
b. amplificación del inserto por “colony PCR”
y gel.
Otros Vectores de clonado
Phagemids (pBs). Combina propiedades de plásmidos y
fagos filamentosos.
Posee ori de plásmido (pUC) y ori de fago filamentoso (F1,
M13), pueden producir ADN circular doble cadena o simple
cadena.
Fagos filamentosos (M13). Clonado en la forma
replicativa (RF, doble cadena circular) de fagos
filamentosos (M13).
Producen ADN simple cadena
Sitio múltiple de clonado (MCS) interrumpe marco de
lectura de gen lac Z (B-galactosidasa), permite selección
de clones recombinantes en presencia de IPTG y X-gal.
Vector-T:
Plásmido con extremos 5’- T simple cadena. Permite clonar directamente productos de PCR
que contienen A simple cadena en extremo -3’ agregada por la Taq ADN polimerasa.
Vector mixto (shuttle vector)
Se puede amplificar en dos organismos diferentes.
pMDS99. Posee un ori para replicación en bacterias (ori P15A) y otro para la
replicación en arqueas halófilas (ori pHV2). Tiene dos marcadores de selección:
Kanamicina R para bacteria y Mevinolina R para haloarqueas.
Subclonado de nep en vector de expresión de
E. coli pET
Promotor T7 y operador lac (región reguladora)
rbs: sitio de unión al ribosoma
Sitios múltiples de clonado dentro del gen lacZ
(NdeI contiene codón inicio traducción ATG)
“His-tag”: cola de polihistidina + codón stop (TGA)
permite sintetizar la proteina de interés fusionada
al epítope His6, facilita purificación e
identificación con anticuerpos anti-His
Terminador transcripcional T7
Construcción de genotecas
Conjunto de clones que
contienen el genoma
En bacteriófago λ
Capacidad de clonado ~ 25 kbp
Bibliotecas de cósmidos
Digestión parcial del ADNg
con ER de corte frecuente
(Sau3A)
Purificación de fragmentos
de ADNg del tamaño
deseado
Secuenciacion de genomas y metagenomas
Estrategia Shotgun cloning para secuenciar ADN en gran escala
Tipo de vector
Inserto (kbp)
Plasmido
20
Fago lambda
25
Cosmido
45
P1
100
BAC
300
YAC
1000
Las genotecas pueden analizarse con diferentes herramientas:
1. Por hibridación con sondas de ADN específicas
2. Con anticuerpos (Inmunodetección)
3. Testeando la función del gen de interés. Ej. Detección de halos de proteólisis
4. Por Transposon tagging. Consiste en generar bacterias mutantes al azar usando Tn,
luego preparar una genoteca de la mutante que presente pérdida de fenotipo de
interés (ej. pérdida de virulencia). Luego se busca el gen mutado de identidad
desconocida por hibridación con secuencias del Tn. Método usado para identificar
genes relacionados con la virulencia en bacterias patógenas.
5. Por complementación de una mutación.
6. Por secuenciación (genomas de organismos y metagenomas)
Manipulación de genes bacterianos
Técnicas de mutagénesis dirigida. Permite cambiar
bases en la secuencia nt de un gen.
Usos: determinar actividad biológica de proteínas con sustituciones de AA conocidas.
Mediante PCR
Mutagénesis sitio dirigida usando un oligo sintético
El inserto se clona en un
vector que produzca copias
simple cadena del inserto
(fago M13) necesarias para
usar como templado.
Cassette mutagénesis y
disrupción génica
Cassette: fragmento de ADN
sintético, lleva gen resistencia a Ab. Se
usan para reemplazar o interrumpir un
gen y generar una mutación.
Disrupción génica por cassette
mutagénesis
Se anula la función de un gen dado por
mutagénesis por inserción. Genera
mutación knockout (KO).
En procariotas (haploides) las células
KO son viables sólo si el gen no es
esencial.
El plásmido con el cassette se linealiza
para impedir su replicación en la
bacteria transformada, por la tanto, las
células resistentes surgen por RH y
poseen sólo una copia del gen (la
mutante por inserción)
Técnica de
mutagénesis in
vivo pop-in popout para
haloarqueas
(Tomado del
Halohandbook, M.
Dyal-Smith 2008)
Cuando ocurren
dos eventos de
recombinacion en
lugares diferentes
se reemplaza un
fragmento por
otro dando lugar a
la mutacion.
Azul indica
regiones
homologas
Aplicación de las técnicas del ADN recombinante para
estudiar la proteolisis en las arqueas:
Secuencia nt y
de aa deducida
del gen nep,
codificante de
una proteasa
extracelular de
arquea halófila
Expresión heteróloga del gen nep en Haloferax volcanii
(arquea halófila extrema)
pET-24b(+)
nep::His6
Nde I
Bpu 1102 I
Hind III
Nde I
Bpu 1102 I
pJAM
nep::His6
Hfx. volcanii DS70
Se analiza la expresión
de la proteína de interés
por SDS-PAGE y
determinación de
actividad proteasa
Expresión heterologa del gen nep en Haloferax volcanii (Hv)
La proteína recombinante se sintetizó y secretó eficientemente en H.v. y
presentó actividad enzimática
Generación de mutantes de la proteasa Nep en la secuencia de
exportación (RR/KK) y en el sitio activo (S/A) aplicando mutagénesis sitio
dirigida (Quick change)
La versión mutante en la
secuencia de exportación
(RR), Nep RR/KK, no es
secretada al medio
La versión mutante en
la serina del sitio activo
(NepS/A) no es activa y
no se autoprocesa