DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEINAS

Prácticas de Bioquímica II
Práctica: Determinación Cuantitativa de Proteínas
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE
PROTEINAS
Objetivos:
Al finalizar este trabajo práctico los alumnos estarán en capacidad de:
-
Conocer el principio que rige la determinación cuantitativa de proteínas por los
métodos de Biuret y Bradford.
-
Comparar la sensibilidad de ambos métodos al aplicarlo a distintas muestras
biológicas.
-
Calcular la concentración de proteínas en muestras biológicas.
Introducción:
El contenido de proteínas de una muestra biológica es un parámetro de gran
utilidad tanto para el investigador como para profesionales del área clínica. Este dato
es importante para el bioquímico, ya que puede precisar la eficiencia de un método de
aislamiento proteico o la cantidad de proteínas de fluidos corporales o de una
determinada fracción subcelular. Para el Veterinario, Médico o el Bioanalista, la
concentración sérica o urinaria de proteínas puede reflejar la presencia de algún estado
patológico o simplemente verificar la condición fisiológica del animal.
Para determinar la cantidad de proteínas en muestras biológicas existe una
diversidad de métodos. Unos se basan en principios físicos como la refractometría,
otros en determinar la composición de nitrógeno total de la muestra y luego calcular la
cantidad de proteínas como el método de Kjeldhal. Sin embargo, estos métodos como
herramientas de trabajo en el laboratorio de Bioquímica son poco precisos. El
surgimiento del espectrofotómetro abrió camino a un gran número de pruebas,
basadas en la ley de Lambert y Beer, entre ellas la determinación cuantitativa de
proteínas. Alguno de los métodos para cuantificarlas son: Biuret, Lowry y Bradford.
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Práctica: Determinación Cuantitativa de Proteínas
Todos los métodos colorimétricos poseen distintas sensibilidades y rangos de
detección por lo que la escogencia del mismo dependerá de la naturaleza de la muestra
a ser analizada.
Método de Biuret
Este método recibe su nombre debido a que el color que se produce en esta reacción,
es similar al de la condensación de dos moléculas de urea, conocido en alemán como:
Biuret. Se fundamenta en la formación de un compuesto azul violeta por la reacción
del ión cúpicro con la proteína en medio alcalino. Este ión forma un enlace covalente
coordinado (Figura 1). Una condición indispensable para la positividad de la reacción
es que el compuesto analizado posea al menos dos enlaces peptídicos en su estructura.
En el caso de los aminoácidos y dipéptidos la reacción es negativa. Si se observa la
reacción se verá claramente porqué hacen falta dos enlaces:
C
O
N H
O
C
C
CH
R
2
C
O
R
OH -
NH
H N
Cu ++
O
CH
CH
R
C
O
Cu ++
O
N H
C
H N
Enlaces Peptídicos
N H
Enlace covalente coordinado
Figura 1. Reacción de Biuret
El color formado responde a la ley de Lambert y Beer, por lo tanto es posible la
cuantificación de las proteínas presentes en una muestra desconocida, mediante la
comparación de la absorbancia de la muestra con la de los estándares de concentración
conocida. Este método detecta proteinas en un rango de 0,5 a 10 mg/mL, lo que es
suficiente para medir la cantidad de proteínas en algunos fluidos biológicos como el
suero y el plasma, ambos con concentraciones mayores de 6 g%.
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Método de Bradford
Éste se basa en la capacidad que presenta el azul brillante de Coomasie G-250 de
unirse a las cargas positivas de la estructura proteica. El colorante presenta dos
estructuras, la roja predominante en solución (Absmax= 465 nm) y la azul, cuando se
encuentra asociado a las proteinas (Absmax= 595 nm).
OC 2 H 5
NH
CH 3
CH 3
C 2H 5
-
N H5C 2
N
CH 2
CH 2
OS 3
S3O -
Figura 2. Estructura del azul de coomasie G250
Debido a que la respuesta del método es la misma para una gran cantidad de proteínas,
la cuantificación se puede llevar a cabo usando cualquier estándar disponible. La
interferencia de otros compuestos distintos a las proteínas es mínima. La sensibilidad
del método esta en el rango de 0,2 a 20 µg/mL. Es decir 1000 veces más sensible que
el método de Biuret.
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MATERIALES Y REACTIVOS
-
Reactivo de Biuret: 1,5 g de CuSO4 : 5 H2O y 6 g de tartrato de sodio y
potasio se disuelven en 500 mL de agua. Añadir 300 mL de NaOH al 10% y
aforar a 1L.
-
Reactivo de Bradfrod: 100 mg de azul brillante de Coomasie G 250 se
disuelven en 50 mL de etanol al 95%. Añadir 100 mL de H3PO4 al 85%
(concentrado) y aforar a 1 L con agua destilada. Filtrar a través de papel filtro
Whatman N° 1. Para probar el reactivo medir la absorbancia contra un blanco
de agua destilada a 595 nm, el valor debe estar entre 0,4 y 0,6 UA.
-
Standard de proteína 2 g%
-
Espectrofotómetro
-
Cubetas para espectrofotometría
-
Azul brillante de Coomasie G-250
-
NaCl 0,9%
-
Pipetas volumétricas de 1, 2 y 5 mL.
-
12 tubos de ensayo.
PARTE EXPERIMENTAL:
Experimento Nº 1 Determinación de proteínas por el método de Biuret
Procedimiento:
-
Preparar una dilución 1:10 de plasma bovino en un tubo de ensayo (muestra
problema)
-
Prepare los estandares, blanco y muestra como se indica en el siguiente cuadro:
Reactivos
Blanco
Estándar
0,2 g%
Estándar
0,6 g%
Estándar
1,0 g%
Estándar
albúmina 2 g%
___
0,1 mL
0,3 mL
0,5 mL
0,6 mL
___
NaCL 0,9%
1 mL
0,9 mL
0,7 mL
0,5 mL
0,4 mL
___
___
___
___
___
___
1 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
Plasma diluido
1:10
Reactivo de
Biuret
Estándar Muestra
1,2 g% problema
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Práctica: Determinación Cuantitativa de Proteínas
Una vez agregado el reactivo de Biuret, espere 10 minutos y proceda a leer la
absorbancia a 545 nm con ayuda del espectrofotómetro. Anote los resultados en la
tabla anexa para el posterior análisis.
RESULTADOS
TUBO
ABSORBANCIA
Estándar 0,2 g%
Estándar 0,6 g%
Estándar 1,0 g%
Estándar 1,2 g%
Muestra problema
Experimento N° 2 Determinación de proteínas por el método de Bradford
Procedimiento:
-
A partir del estándar de proteínas (2 g%) prepare por dilución 100 mL de una
solución que contenga 100 mg%, y a partir de ésta prepare 100 mL de
estándares que contengan 10, 25, 50 y 100 mg% de proteína.
-
Prepare 100 mL de una dilución de plasma bovino 1:100 que se utilizará como
muestra problema.
Prepare la siguiente serie de tubos:
Reactivos
blanco
Estándar
10 mg%
Estándar
25 mg%
Estándar
50 mg%
Estándar
___
0,1 mL
0,1 mL
0,1 mL
0,1 mL
___
0,1 mL
___
___
___
___
___
___
___
___
___
___
0,1 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
NaCl 0,9 %
Plasma diluido
1:100
Reactivo de
Bradford
Estándar Muestra
100 mg% problema
- Mezclar bien y leer la absorbancia con un espectrofotómetro a 595 nm dentro del
lapso de 15 a 20 minutos después de agregar el reactivo de Bradfrod.
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Una vez obtenidos los resultados anótelos en la tabla que se suministra a continuación
para su posterior análisis y discusión.
RESULTADOS
TUBO
ABSORBANCIA
10 mg%
25 mg%
50 mg%
100 mg%
Muestra problema
Con los datos de cada tabla construya una curva patrón para cada método (graficando
la concentración de proteinas en el eje “x” contra absorbancia en el eje “y”) y mediante
extrapolación, estime la concentración de proteínas de la muestra. Considere la
dilución realizada en el procedimiento de cada método. Discuta las diferencias
encontradas entre ambos métodos, así como sus ventajas y desventajas en el análisis de
muestras biológicas.
Auto evaluación
1. Establezca diferencias entre el método de Kjelhdal y los estudiados en esta
práctica.
2. Que ventaja representa el hecho de que el reactivo de Bradford posea
absorbancia a dos longitudes de onda distintas, una libre y otra asociado a las
proteínas.
3. En base a la sensibilidad que presentaron los métodos estudiados, que
aplicaciones prácticas tiene cada uno de éstos.
4. Las proteasas son enzimas que rompen los enlaces peptídicos hasta llevar las
proteínas a aminoácidos libres. Si una proteína es incubada con estas enzimas
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que sucederá con la absorbancia en el tiempo al medir la concentración de
éstas por alguno de los métodos estudiados. ¿En cuál la absorbancia se hace
cero primero?
Bibliografía
A.V. Chechetkin, V.I. Voroniaski, G.G. Pokusay. Prácticas de Bioquímica del ganado
y aves de corral.
Boyer, Rrodney. Modern Experimental Biochemistry. 2da Edición. Benjamin Cummins
Editores. 1993.
Bradford, M. “A rapid and sensitive meted for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”. Anal. Biochem. 72:
248-254. 1976.
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