interacciones macromolecula - ligando

INTERACCIONES
MACROMOLECULA - LIGANDO
Ana Denicola
Curso Fisicoquímica Biológica
Muchas funciones biológicas involucran la interacción de
pequeñas moléculas (metabolitos, reguladores, señales)
que llamamos ligandos, con superficies específicas de
macromoléculas como las proteínas que participan en
distintos procesos celulares.
Esta interacción implica la formación de enlaces nocovalentes entre la pequeña molécula o ión (ligando) con
una región específica de la macromolécula (proteína) que
llamamos sitio de unión.
La unión de un ligando a una proteína puede ser tan
fuerte que parezca irreversible, pero si no se forman
enlaces covalentes, lo podemos considerar un proceso en
equilibrio.
Proteína = P
Ligando = A
P + A
PA
K = [PA]/ [P][A]
K = constante de equilibrio de asociación
K`= constante de equilibrio de disociación = 1/K
[PA]= concentración del complejo proteína-ligando
[P]= concentración de proteína (no acomplejada)
[A]= concentración de ligando libre
P + A
PA
De esta interacción nos interesa estudiar:
- estequiometría, número de sitios de unión que tiene la
proteína para este ligando A
- afinidad, con qué fuerza se une A a P, comparar con la
fuerza de unión de otro ligando B a la misma proteína
-cinética de la interacción
- cambios estructurales que ocurren en la proteína luego
de la unión de A, que pueden o no llevar a cambios en la
funcionalidad de la proteína
- información estructural sobre el sitio de unión de A a P,
fuerzas que intervienen en la unión
Proteína = P
Ligando = A
P + A
PA
K = [PA]/ [P][A]
K = constante de equilibrio de asociación
K`= constante de equilibrio de disociación = 1/K
[PA]= concentración del complejo proteína-ligando
[P]= concentración de proteína (no acomplejada)
[A]= concentración de ligando libre
Sólo un sitio de unión
Parámetro experimental r:
r = moles de ligando unido por mol de proteína
(número promedio de sitios ocupados)
r = [A]unido/ [P]total
[A]unido = [PA]
[P]total = [P] + [PA]
r = [PA]/ [P] + [PA]
K = [PA]/ [P][A]
r = K [A]/ 1+K [A]
• un sitio de unión, n=1
• con afinidad K (M-1)
15.6
Múltiples sitios de unión
r = moles de ligando unido por mol de proteína
r = [A]unido/ [P]total
[A]unido = [PA] + 2[PA2] + 3[PA3] + ...
[A]unido =
[P]total =
i[PA]i
[PAi]
Ki = [PAi]/ [P][A]i
Múltiples sitios de unión
Si los sitios de unión son idénticos e independientes:
K1 = K2 = K3 = .... = K
r = n K [A]/ 1 + K [A]
• n sitios de unión
• todos con = afinidad K (M-1)
15.9 b
15.10 a
Para evaluar los parámetros n y K, se linealiza la
hipérbola:
Doble recíproco:
Scatchard:
1 / r = 1 / n + 1 / n K [A]
r / [A] = n K - r K
• n sitios de unión
• todos con = afinidad K (M-1)
Doble recíproco
Scatchard
J. BIOL. CHEM. 265, 12623-12628, 1990
The Human a2-Macroglobulin Receptor Contains High Affinity Calcium Binding Sites
Important for Receptor Conformation and Ligand Recognition
Múltiples sitios de unión no equivalentes
• gráfico de Scatchard no da lineal
• gráfico de Hill:
log (r / n - r) = log K + nH log [A]
Log (Y/1-Y) = log K + n log [A]
si la curva tiene pendiente >1 para alguna [A]
cooperatividad positiva
si la curva tiene pendiente <1 para alguna [A]
cooperatividad negativa
• las proteínas que presentan cooperatividad de unión en general son
multiméricas (varias subunidades) o monoméricas con dominios definidos
15.13
Métodos experimentales para obtener datos de unión de
ligandos a proteínas
1) Medir la fracción de ligando unido, r
El complejo proteína-ligando se separa del ligando libre:
• diálisis en equilibrio (es la técnica más exacta pero muchas
veces demora en alcanzarse el equilibrio y se requiere
cantidades apreciables de muestra)
• filtración por membrana, centrifugación o ultrafiltración
• cromatografía de gel filtración
• sedimentación
Métodos experimentales para obtener datos de unión de
ligandos a proteínas
2) Medir la fracción de sitios de unión ocupados, O
O = r / n = fracción de saturación
se debe seguir un cambio (
ligando luego de la unión
X/
X
total
X) ya sea en al proteína o en el
= O
• se grafica X en función de [A]
• si se conoce n (número total de sitios) se puede calcular r y de ahí el
tratamiento es igual que para diálisis en equilibrio
15.5
Métodos experimentales para obtener datos de unión de
ligandos a proteínas
2) Medir la fracción de sitios de unión ocupados, O
se debe seguir un cambio (
ligando luego de la unión
X / X total = O
•
•
•
•
•
fluorescencia
absorción UV-vis
dicroismo circular
NMR
electroforesis capilar
X) ya sea en al proteína o en el
•
•
•
•
•
resonancia Raman
infrarrojo
sedimentación
EPR
difracción RX
• susceptibilidad a hidrólisis (por proteasas)
• susceptibilidad a oxidación (por peroxidasas)
• surface plasmon resonance (Biacore)
Biochemistry 1988, 27, 1075-1080 1075
Spectroscopic and Thermodynamic Studies on the Binding of Gadolinium( 111) to
Human Serum Transferrin
FIGURE 2: (A) EPR titration of 3.6 X lo4 M apotransferrin in 0.05 M Hepes, pH 7.4, with
Gd(II1). The ratio of Gd to transferrin is given by the number at the beginning of each
spectrum. Arrows mark g’= 4.1. Microwave frequency, 9.298 GHz; microwave power, 10
mW; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude, 10 G; sweep time, 200 s;
time constant, 0.5 s; sample temperature, 77 K. (B) Plot of the amplitude of the g’ =
4.1 signal (1650 G) vs the Gd:transferrin ratio.
Biochemistry 1988, 27, 1075-1080 1075
Las proteínas más utilizadas para ensayar esta interacción
son las proteínas séricas:
• albúmina (humana o bovina)
• transferrina (o apotransferrina)
• IgG
Las proteínas séricas (y en particular la seroalbúmina, la
más concentrada) son el principal blanco si el metalofármaco es administrado i/v, e influye en su
biodisponibilidad
HSA 585 aa: 35C (17 disulfuros + C34), W214
Dominios I, II, III
7,8-dihidroxicumarina (Dafnetina)
Antioxidante, quelante, inhibidor de proteina kinasa
Studies on the interactions between human serum albumin and
imidazolium [trans-tetrachlorobis(imidazol)ruthenate(III)]
J. Inorg. Biochem. 73 (1999) 123-128
J Inorg Biochem 73 (1999) 123-
J Inorg Biochem 73 (1999) 123-
Solution studies of the antitumor complex dichloro 1,2propylendi-aminetetraacetate ruthenium (III) and of its
interactions with proteins.
J. Inorg. Biochem. 71 (1998) 45-51.
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" Complejo + albúmina
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