Manual de Procedimientos
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Manual de Procedimientos Diagnóstico y caracterización de Shigella spp. 2007 AUTORES Raquel Terragno María Inés Caffer Norma Binsztein Departamento Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur 2 INDICE CAPÍTULO I- INTRODUCCIÓN 5 CAPÍTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SHIGELLA spp. 7 1.-ESPECÍMENES 7 2.-PROCESAMIENTO 7 2.1.-AISLAMIENTO 7 Flujograma de aislamiento e identificación bioquímica de Shigella spp a partir de heces. 9 2.2.-IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE SHIGELLA spp. 10 2.2.1.- Pruebas Bioquímicas Diferenciales 12 2.2.2.-Pruebas bioquímicas 13 Agar Hierro Tres Azúcares y Agar Kligler 13 Agar Lisina Hierro 16 Prueba del Indol 17 Prueba de la Beta Galactosidasa 19 Test de Utilización de Azúcares 21 Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa 23 Prueba del Acetato 25 Prueba del Mucato 26 Citrato de Christensen 27 2.3.-SEROTIPIFICACIÓN DE SHIGELLA spp. Flujograma para Serotipificación de Shigella spp. CAPÍTULO III- PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD 28 31 33 1.- NIVEL DE LABORATORIOS 33 2.-ELEMENTOS DE PROTECCIÓN. 34 3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO. 35 4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO 35 5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA 36 6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS 36 3 CAPÍTULO IV-MEDIOS DE CULTIVO Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS 38 Agar McConkey 38 Agar EMB 38 Agar SS 39 Agar XLD 39 Agar Hektoen 40 CAPÍTULO V - PLANILLAS DE RESULTADOS 4 42 CAPÍTULO I - INTRODUCCIÓN Las bacterias del género Shigella, de la familia Enterobacteriaceae, son bastones Gram negativos, de 0.3 a 1 µm de diámetro y de 1 a 6 µm de longitud, que pueden estar solos, en cadenas o de a pares. Son no móviles, no esporulados, anaerobios facultativos, oxidasa negativo, fermentan la glucosa y otros azúcares sin producción de gas, Voges-Proskauer negativo y rojo de metilo positivo. No utilizan citrato de Simmons, no producen SH2 y son lisina descarboxilasa, arginina dehidrolasa y ureasa negativos (Tabla 1). La temperatura de crecimiento óptima es 37º C. El género está formado por Shigella dysenteriae (serogrupo A); Shigella flexneri (serogrupo B); Shigella boydii (serogrupo C); Shigella sonnei (serogrupo D). La shigellosis, infección causada por Shigella spp., está distribuida en todo el mundo, pero es endémica en países tropicales y de clima templado con mayor incidencia en verano. Es causa de infección intestinal aguda en niños pequeños. Las 2/3 partes de los casos y la mayoría de las defunciones ocurren en niños de 6 meses a 10 años. Representan también un riesgo para viajeros que se trasladan hacia áreas endémicas y son frecuentes los brotes en condiciones de hacinamiento y falta de saneamiento como cárceles, hospitales psiquiátricos, geriátricos, campamentos y a bordo de embarcaciones. Shigella tiene como únicos huéspedes al ser humano y a los primates. La enfermedad se transmite de persona a persona por la vía fecal-oral, por alimentos contaminados donde el vector de transmisión son las moscas, o por el uso de aguas contaminadas para la preparación de los mismos. La bacteria es altamente infecciosa por la ruta oral, la ingestión de tan sólo 10 a 100 organismos produce infección en voluntarios. La gravedad y la letalidad de la infección dependen de la edad de la persona, del estado nutricional, de la magnitud de la dosis infectante y del serotipo del microorganismo. Shigella dysenteriae produce la forma más severa de la enfermedad, con una tasa de letalidad del 20%. En cambio las infecciones por otras especies de Shigella se autolimitan y rara vez son fatales, excepto en huéspedes inmunocomprometidos, ancianos y niños pequeños. Shigella flexneri también puede producir disentería. Shigella sonnei puede producir brotes 5 esporádicos por alimentos semi-cocidos o mal cocidos y aguas contaminadas. Shigella boydii se aísla con menor frecuencia que las otras tres. TABLA 1. Propiedades Bioquímicas de Shigella spp. Ensayo o Sustrato Sulfuro de hidrógeno Resultado - Glucosa (gas) - Glucosa (ácido) + Movilidad - Citrato de Simmons - Adonitol - Mucato - Rojo de metilo + Voges-Proskauer - Arginina dihidrolasa - Lisine decarboxilasa - Ornitina decarboxilasa Sh. sonnei +; otras Shigella – Urea (hidrólisis) - Fenilalanina deaminasa - Salicina - Lactosa - Sacarosa - Xilosa - Bioseguridad Los procedimientos de laboratorio se realizan de acuerdo con las recomendaciones establecidas en “Biosefety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, 4 th. CDC/NIH (Ver Capítulo III - Precauciones de Bioseguridad) 6 CAPÍTULO II – AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SHIGELLA spp. 1.-. ESPECÍMENES Las muestras se deben obtener en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Para muestras humanas se puede utilizar un hisopo de algodón para recoger material mucoso o sanguinolento de la materia fecal. Las muestras que no se van a procesar en dos horas se deben mantener en medio de transporte Cary-Blair con tioglicolato que reduce la tensión de oxígeno. Este medio tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses después de su preparación, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas y las muestras se pueden conservar hasta 5 días, siempre en refrigeración. 2.- PROCESAMIENTO 2.1.- AISLAMIENTO Materiales y equipamiento • Ansas descartables (10µl) • Placas de Petri (9 cm diámetro) estériles • Balanza • Estufa de incubación a 37ºC • Mechero Bunsen • Pipetas para 0.1 ml (pipetas de 1 ml) • Hisopos de algodón Medios • TSA agar (estrías) • TSI agar (estrías) • LIA agar (estrías) • MacConkey agar (placas) • EMB agar (placas) • SS agar (placas) • XLD agar (placas) • Hektoen agar (placas) 7 Procedimiento Comentarios No hay un medio de enriquecimiento específico para el cultivo y aislamiento de Shigella spp. de materia fecal. Si se dispone de caldo GN se lo puede usar para el enriquecimiento. Otra posibilidad es resuspender el hisopo con materia fecal en un caldo tioglicolato y luego sembrar una placa de agar XLD. Día 1 • Realizar la siembra en los medios SS, XLD, McConkey, Hektoen, EMB, con heces frescas suspendidas en solución salina o directamente a partir del hisopo. • Incubar las placas por 18-24 horas a 37º C • Seleccionar uno o dos de los medios de aislamiento. Día 2 • Seleccionar colonias convexas de 2 a 4 mm de diámetro. Leer placas de SS: colonias translúcidas, ligeramente rosadas, a veces con un centro más oscuro. Leer placas de XLD: colonias translúcidas con un tono rojizo. Leer placas de McConkey: colonias translúcidas, ligeramente rosadas. Leer placas de Hektoen: colonias verdes, elevadas y húmedas. Leer placas de EMB: colonias translúcidas de color ambar. • Sembrar las colonias sospechosas en agar TSI, agar LIA y agar TSA. A partir de la estría en TSA se realiza la confirmación bioquímica y la serotipificación (ver día 3). 8 FIGURA 1.- FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE SHIGELLA spp. A PARTIR DE HECES Camino II Camino I MATERIA FECAL (HISOPO) Suspensión en solución fisiológica 1er. día Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2) Caldo de enriquecimiento (1) 18-24 hs, 37ºC Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2) Colonias típicas (3) 2do. día TSI Estría LIA 18-24 hs, 37ºC 3er. día Serotip. O Lectura (4) Colonias típicas (3) P. Bioq. (5) TSI LIA Estría 18-24 hs, 37ºC Lectura (4) 4to. día Serotip. O Lectura P. Bioq. (5) (1) Caldo de enriquecimiento: Ver 2.1.- Aislamiento (2) Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar xilosa lisina desoxicolato, o agar eosina azul de metileno. (3) Se seleccionan de 2 a 3 colonias. (4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Shigella, se siembran pruebas bioquímicas complementarias y se realiza la serotipificación somática O (Serotipo O) (5) Pruebas bioquímicas complementarias: acetato de sodio, mucato de sodio, citrato de Christensen, manita. 9 2.2.- IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE SHIGELLA spp. Materiales y equipamiento • Ansas descartables • Mechero Bunsen • Estufa a 37ºC Medios • Medio base para azúcares • Solución madre de Manitol 10% • Solución madre de Glucosa 10% • Solución madre de Sacarosa 10% • Solución madre de Salicina 10% • Medio base con arginina, lisina y ornitina y medio base sin agregados para control • Vaselina estéril • Discos de ONPG para ensayo de ß- galactosidasa • SIM • Mucato de sodio • Acetato de sodio • Citrato de Christensen Cepas bacterianas • Cepas de referencia para el control de calidad de los medios. Procedimiento Comentarios Día 3 • Leer los tubos de agar TSI y LIA de acuerdo a la Tabla 2 y realizar la prueba de ONPG a partir del TSI. • Del cultivo en agar TSA inocular: medio SIM; medios con arginina, lisina y ornitina y control; medios base con manita, sacarosa, xilosa y dulcita; agar acetato de sodio, agar Christensen, caldo mucato. • Incubar todas las pruebas por 18 a • Colocar una capa de vaselina líquida sobre los medios con aminoácidos y el tubo control. 10 24 horas a 37ºC. • Realizar la partir del agar Serotipificación) • La confirmación bioquímica y la serotipificación se pueden realizar al mismo tiempo. serotipificación a TSA (ver 2.3 Dia 4 • Leer los resultados de las pruebas bioquímicas de acuerdo a la Tabla 2 y anotar los mismos en la Planilla de Resultados. • Realizar la prueba de ONPG utilizando discos de ONPG según lo indicado por el fabricante. • Realizar la prueba de indol agregando 1 ml de reactivo de Erlich al medio. TABLA 2. Pruebas Bioquímicas para identificación de Shigella spp. Interpretación de Resultados Medio TSI Resultados Reacciones Producción de ácido (si la base es amarilla y la estría roja, la producción de ácido se debe a la glucosa) Producción de ácido de lactosa y/o sacarosa Producción de gas TSI TSI TSI LIA LIA Ensayo de Aminoácidos ONPG Medio base con azúcares Indol Negativo Base roja Positivo Base amarilla Estría roja Estría amarilla No hay burbujas de gas en la base Producción de H2S Sin color negro Producción de H2S Sin color negro Reacción alcalina, color violeta Botón púrpura – a través del medio. Organismos Superficie amarilla que no descarboxilan la lisina producen una estría alcalina y un fondo ácido Lisina/ornitina decarboxilasa, Color amarillo arginina dehidrolasa Β-galactosidasa Sin color Fermentación Azul amarillo Rosa Producción de indol Anillo rojo-rosado Anillo amarillo Burbujas de gas en la base Color negro Color negro Botón púrpura – Superficie púrpura Color púrpura Las siguientes características pueden ayudar en la identificación de Shigella spp.: a) Los aislamientos son siempre inmóviles y lisina negativo. 11 b) La producción de gas es rara aunque se puede observar ocasionalmente en cepas de Sh.flexneri, Sh. boydii y Sh. dysenteriae. 2.2.1.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS DIFERENCIALES a) Entre especies de Shigella En la diferenciación de los cuatro miembros del género se deben tener en cuenta algunas propiedades bioquímicas: - Shigella dysenteriae: la mayoría de las cepas no fermentan el manitol, son ornitina descarboxilasa negativa y tienen propiedades bioquímicas diferenciales entre los serotipos. Particularmente, Sh dysenteriae 1 es arabinosa e indol negativo y ONPG positivo muy rápido. - Shigella flexneri: la gran mayoría de las cepas fermentan manitol y son ornitina descarboxilasa negativo. - Shigella boydii: la gran mayoría de las cepas fermentan manitol, son ornitina descarboxilasa negativo y tienen propiedades bioquímicas diferenciales entre los serotipos. - Shigella sonnei: indol negativo, ornitina descarboxilasa positivo, ONPG positivo y manitol positivo. Los caracteres diferenciales se resumen en la TABLA 3.1 TABLA 3.1. Reacciones Bioquímicas de Shigella spp. D-Manitol ONPG Ornitina decarboxilasa Sh. dysenteriae - - - Sh. flexneri + - - Sh. sonnei + + + Sh. boydii + - - Especie Tabla 3.2. Reacciones Bioquímicas de Serotipos de Shigella. Ver página 45 12 b) Entre Shigella spp. y Escherichia coli La diferenciación de Shigella spp respecto a E. coli es uno de los problemas con que se enfrenta el laboratorio de microbiología y refleja el hecho que E. coli y las cuatro especies de Shigella están estrechamente relacionadas sobre la base de estudios de hibridación DNADNA. La mejor aproximación es realizar un conjunto de pruebas bioquímicas. En “Edwards and Ewing’s Identification of Enterobacteriaceae”, 4th Ed., se sugiere realizar los ensayos que se indican en la TABLA 4. TABLA 4. Diferenciación de Shigella spp. y E. coli. Ensayo Mucato Shigella - E. coli + Acetato - + o (+) Cit. Christensen - +, (+), - -o+ + - +, (+), - -o+ +, (+),- +, (+), - +, (+), - - + Sacarosa +, (+), - +, (+), - Salicina - +, (+), - Movilidad - +ó- Indol (producción) Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dehidrolasa Glucosa (gas) + 90% o más positivo en 1-2 días; (+) positivo tardío; - 90% o más negativo. Las pruebas citrato de Christensen, acetato de sodio y mucato de sodio son de valor en la diferenciación de los miembros del género Shigella y Escherichia, particularmente de biotipos anaerogénicos, no móviles, porque los aislamientos que fermentan mucato o son alcalinos en agar acetato o citrato de Christensen es muy probable que sean E.coli. 2.2.2.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS Agar Hierro Tres Azúcares (TSI) y Agar Kligler I. Principio El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de carbono y producir sulfuro de hidrógeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y 13 10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formación de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o sacarosa, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirán productos alcalinos y el medio TSI permanecerá rojo. La producción de SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Este medio puede reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos bioquímicos y la interpretación de los resultados son los mismos para ambos medios. II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volúmenes de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121º C por 15 minutos y enfriar inclinado dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar. III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material. B. Punzar el fondo en el centro. C. Retirar el ansa y estriar sobre la superficie del agar. D. Dejar la tapa floja para permitir intercambio de aire. E. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas. IV. Resultados A. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o lactosa (E. coli). B. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente (Shigella spp.). C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa). D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp). E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.). 14 V. Control de Calidad Bacteria Estría Punción SH2 Salmonella Typhi K A + (*) Salmonella Paratyphi A K Ac/g - Salmonella spp. K A + Shigella spp. K A - Enterobacter aerogenes A Ac/g - Enterobacter cloacae A Ac/g - Escherichia coli A Ac/g - Citrobacter A Ac/g + Klebsiella A Ac/g - Proteus vulgaris A A oAc/g +(sucio) Proteus mirabilis K Ac/g o A + (sucio) Klebsiella pneumoniae A Ac/g o A - (*) sólo en la parte superior de la punción o formación de un anillo. A:ácido; K:alcalino; c/g: cn gas VI. Consideraciones A. Cuando se agrupan los miembros de la familia Enterobacteriaceae, las reacciones del TSI y KIA pueden variar ligeramente. Algunos no fermentadores de lactosa pueden fermentar sacarosa. B. El test se debe leer entre las 18 y 24 horas. Lecturas tempranas pueden dar falsos resultados ácido/ácido, mientras que lecturas tardías pueden dar falsos resultados alcalino/alcalino. C. Una gran producción de SH2 enmascara la reacción de la glucosa. Sin embargo la glucosa fue fermentada aunque no se vea el cambio de color. Observar si hay producción de gas. D. En el TSI, la utilización de sacarosa puede suprimir el mecanismo enzimático que resulta en la producción de SH2. Por esta razón, algunos organismos pueden demostrar producción de SH2 en KIA pero no en TSI. 15 Agar Lisina Hierro (LIA) I. Principio La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene lugar en medio ácido, es necesaria la fermentación previa de la glucosa. Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un viraje al amarillo en todo el medio. La formación de SH2 produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido. Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepción de Morganella morganii, desaminan la lisina a ácido α-cetocarbónico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis. II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121º C por 15 minutos. Enfriar de manera de tener estría y fondo. Guardar en heladera. III. Procedimiento A. Inocular punzando el fondo y luego estriar la superficie del agar. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas (a veces pueden ser necesarias 48 horas). IV. Resultados Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al amarillo. La formación de SH2 se indica por la aparición de una coloración negra. 16 V. Control de Calidad Bacteria Estría Punción SH2 Salmonella sp. K K + Proteus mirabilis R A + Proteus vulgaris R A + Morganella morganii K A - Prov. rettgeri R A - Providencia spp. R A - Citrobacter spp. K A + Escherichia coli K A - Shigella spp. K A - Klebsiella spp. K A - A.ácido; K.alcalino; R: desaminación de la lisina Este medio no es un sustituto del método estándar de Moeller. VI. Consideraciones Dado que decarboxilación de la lisina ocurre únicamente a pH ácido, este medio sólo puede utilizarse para diferenciar cultivos que fermenten glucosa. Prueba Del Indol I. Principio El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehídos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-). 17 II. Materiales A. Caldo triptofano • Peptona 20.0 g • Cloruro de sodio 5.0 g • Agua destilada 1000 ml A este caldo se le incorpora triptofano en una concentración del 1%. El medio se esteriliza a 121º C durante 15 minutos. Dejar enfriar antes de su empleo y guardar a 4-10ºC para su conservación. B. Reactivo de Erlich • p-dimetilaminobenzaldehido 1.0 g • alcohol etílico, 95% 95.0 ml • ácido clorhidríco, concentrado 20.0 ml Se disuelve el aldehído en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega lentamente el ácido. El reactivo de color amarillo es estable por un año. Identificar el reactivo con una etiqueta y guardar refrigerado en botellas color caramelo. III. Procedimiento A. Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene triptofano. B. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas. C. Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo. D. Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo. E. Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo. F. Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de agregar el reactivo. Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase. 18 V. Control de Calidad Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos, antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fácil obtención y que su conservación en cultivos madre no ofrezca problemas. Escherichia coli +; Enterobacter aerogenes -; Klebsiella pneumoniae – VI. Consideraciones A. El pH óptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (7.4-7.8). La disminución del pH provoca una reducción en la producción de indol y una reacción falsamente negativa o débilmente positiva. B. Los cultivos a los cuales se les efectúa la prueba del indol deben ser incubados aeróbicamente. El descenso en la tensión de oxígeno disminuye la producción de indol. C. No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada acidez producida por la fermentación del azúcar puede inhibir la actividad de la triptofanasa. El agregado de triptofano estimula la producción de indol, mientras que la glucosa la inhibe. Prueba de la β-Galactosidasa I. Principio La fermentación de la lactosa requiere dos enzimas; mientras que la permeasa facilita la penetración de la molécula de lactosa dentro de la célula bacteriana, la β-galactosidasa hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de ambas enzimas; sin embargo hay bacterias que tienen β-galactosidasa pero no permeasa. El o-nitrofenil-β-D-galactósido (ONPG) es un compuesto incoloro estructuralmente similar a la lactosa. En presencia de β-galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y o-nitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se agrupa de acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es útil en la identificación de fermentadores de lactosa. 19 II.Materiales A. Solución de ONPG Disolver 80.0 mg de ONPG en 15.0 ml de agua destilada a 37º C, agregar 5.0 ml del buffer fosfato, ajustar a pH 7.0 y esterilizar por filtración. La solución es estable por 6 meses. Rotular la solución y guardar refrigerada (4 a 8º C), en recipientes de color caramelo o envueltos en papel de aluminio. B. Buffer fosfato de sodio 1M (pH 7.0) Disolver 6,9 g de NaHPO4.H2O en 45.0 ml de agua destilada. Agregar 3.0 ml de una solución de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el pH a 7.0. Llevar el volumen a 50.0 ml con agua destilada y guardar a 4º C. III. Procedimiento A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensión espesa del organismo a ensayar en 0.5 ml de solución salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una prueba basada en la observación de un cambio de color. B. Agregar un disco o dos gotas de solución de ONPG. C. Incubar la mezcla a 37º C y examinar cambio de color hasta 24 horas. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color. V. Control de calidad Escherichia coli + Salmonella (-) VI. Consideraciones A. Se puede partir de estrías de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de TSI. B. La solución de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo. C. A veces se puede favorecer la liberación de la enzima agregando una gota de tolueno, se deja reposar unos minutos a 37º C y se agrega luego el ONPG. 20 Test de Utilización de Azúcares I. Principio Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de carbono con producción de ácido o ácido y gas. El patrón de utilización de azúcares ayuda en la diferenciación e identificación de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azúcares se agregan a un medio basal estéril. La producción de ácido se manifiesta por un cambio de color del indicador. La elección del medio y del indicador depende del camino metabólico del organismo y de la claridad visual del cambio de pH. II. Materiales A. Medio base • Peptona 10.0 g • Extracto de carne 1.0 g • Cloruro de sodio 5.0 g • Azul de bromotimol • Indicador de Andrade 5.0 ml • Agua destilada 1000 ml 10.0 ml Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar el pH a 7.1-7.2 (7.4). Autoclavar a 121º C por 15 minutos y enfriar en baño de agua a 50º C. Fraccionar el medio base en alícuotas y agregar los azúcares esterilizados por filtración en concentraciones de: 0.5% para dulcita y salicina y 1.0% para los otros azúcares. Dispensar en volúmenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estériles. El medio se guarda en heladera y es estable por 3 meses. Para la glucosa y glicerol, el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antes de autoclavar. La campanita se llenará con el medio y luego se agrega el azúcar estérilmente después de enfriar a 50º C. B. Indicador de Andrade Disolver 0.5 g de fucsina ácida en 100 ml de agua destilada, agregar 15.0 ml de NaOH 1N (4%); mezclar bien y dejar reposar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando 21 frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castaño. Si no se produce una decoloración suficiente agregar 1.0 ml de NaOH 1N (4%). C. Solución de azul de bromotimol Mezclar 47.5 ml de agua destilada con 2.5 ml de NaOH 0,1N y luego agregar 0.1 g de indicador. III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material de un cultivo en medio sólido. B. Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono. Para una batería de 8 a 10 azúcares, es suficiente un único inóculo, no hay necesidad de flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de carbono de tubo a tubo es infinitesimal y no afectará los resultados. Para una batería grande (15 a 20) de azúcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inóculos, flameando el ansa antes de tomar nueva muestra. C. Incubar a 37º C y examinar día por día por 4 a 5 días. Para algunos microorganismos puede ser necesario una incubación más prolongada (7 días), registrando los resultados día por día. D. En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 días. IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificación del medio. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de calidad Con distintos microorganismos que fermenten los azúcares, como por ejemplo: Escherichia coli: glucosa + Klebsiella: lactosa + Yersinia enterocolitica: sacarosa + 22 VI. Consideraciones A. Inocular un medio basal sin azúcar para cada microorganismo. B. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa. C. Como cualquier indicio de gas, aún una burbuja pequeña, es evidencia de producción de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular. D. La campanita de Durham se agrega únicamente al medio con glucosa porque si el microorganismo produce gas con glucosa producirá gas con los otros azúcares. No obstante, si se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es aconsejable agregar campanita a otros azúcares, pero hay que tener en cuenta que todas las enterobacterias son fermentadoras de glucosa por definición, entonces sólo se pone campanita al medio con glucosa. Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa I. Principio La decarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en la identificación de enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por acción de una dehidrolasa. El test se debe acompañar con un tubo control que contiene el medio base sin aminoácido. Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter agglomerans (-) La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+) de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-). 23 II. Materiales El medio base más comúnmente utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio está disponible comercialmente. Las concentraciones de aminoácidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma D, porque los microorganismos son activos sólo frente a la forma L. Fraccionar el medio base en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminoácidos a 3 porciones del medio. El pH se debe ajustar después de agregar el aminoácido y antes de esterilizar a 6 – 6,2. Fraccionar en volúmenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121º C por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos y guardar en heladera. III. Procedimiento A. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos. B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril. C. Incubar a 37ºC D. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día. IV. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento. Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo). V. Control de calidad Bacteria Proteus vulgaris Morganella morganii Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Salmonella Typhimurium Klebsiella spp. Arginina - Lisina - Ornitina - - - + + - + - + + + + + - + - 24 VI. Consideraciones A. Inocular siempre un tubo control. B. Debe haber desarrollo para que el resultado sea válido. C. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de interpretar la reacción. D. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisáceo puede indicar reducción del indicador más que formación de productos alcalinos. Se debe agregar más indicador antes de interpretar el resultado E. Si la reacción es difícil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular. Luego de 24 horas cualquier traza de color púrpura indica un resultado positivo. F. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de interpretar los resultados. G. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer sólo a las 24 horas. H. Un pequeño precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso. Prueba del Acetato I. Principio El medio permite determinar la capacidad de las bacterias de utilizar acetato como única fuente de carbono y de energía. Sirve para diferenciar E. coli de Shigella. II. Materiales El medio es igual al agar citrato de Simmons, con la diferencia que lleva 0.25 gr de acetato de sodio en lugar de citrato. Disolver en agua destilada, dispensar en volúmenes de 3 ml y autoclavar a 121º C por 15 minutos. Enfriar en forma de estría y guardar en heladera. III. Procedimiento A. Tomar material con un ansa estéril e inocular el agar por punción. B. Incubar a 37º C durante 7 días, registrando los resultados día por día. IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del medio al azul. Ensayo negativo: no hay cambio de color. 25 V. Control de Calidad E. coli + Shigella – VI. Consideraciones No hay. Prueba del Mucato I.Principio Se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos de metabolizar el ácido múcico. Es útil para diferenciar Escherichia coli de Shigella. II. Materiales Bactopeptona 1.0 g Acido múcico 1.0 g Azul de bromotimol 1/500 1.8 ml NaOH 4N 1.2 ml Pesar el ácido múcico y disolver en 80 ml de agua destilada Colocar el recipiente sobre un agitador magnético y agregar 1.2 ml de NaOH 4N aproximadamente (para 100 ml de solución se debe agregar 2.0-2.5 ml de NaOH 4N gota a gota), hasta virar el color amarillo de la solución al azul-verdoso; este color debe persistir durante 5 minutos de agitación. El agregado del álcali es para transformar el ácido múcico poco soluble en la sal soluble, mucato de sodio. A continuación agregar 1.0 g de bactopeptona, 1.8 ml de azul de bromotimol. y 15.0 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 por medio de NaOH 0.1N o HCl 0.1N, si se ha pasado el pH. Esterilizar por filtración y fraccionar en forma estéril en volúmenes de 3 ml por tubo. Guardar en heladera. III. Procedimiento Tomar material con un ansa estéril e inocular un tubo con mucato. Incubar a 37º C durante 48 horas, realizando lecturas a las 24 horas. 26 IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del color al amarillo o amarillo verdoso. Ensayo negativo: no hay cambio de color el medio permanece azul verdoso. V. Control de Calidad Cepas mucato (+): E. coli, Salmonella Paratyphi B Cepas mucato (-): Proteus vulgaris, Shigella sp., Salmonella Paratyphi A VI. Consideraciones No hay. Citrato de Christensen I. Principio Este medio pone en evidencia la utilización del citrato en presencia de nitrógeno orgánico (monoclorhidrato de cisteína). Es igual al de citrato de Simmons con la única diferencia que la fuente de nitrógeno es orgánica. Es útil en la diferenciación entre Escherichia coli y Shigella. II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Se disuelve el polvo con agua destilada, se caliente suavemente y se fracciona en volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Se esteriliza a 121º C durante 15 minutos y se enfría en pico de flauta. El medio se guarda en heladera. III. Procedimiento Se repite todo exactamente igual que lo indicado para el citrato de Simmons, pero las lecturas se realizan durante 7 días, registrando los resultados día por día. IV. Resultados Ensayo positivo: color rojo rosado en el pico de flauta. Ensayo negativo: no se observa cambio de color. V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes + Escherichia coli + 27 Shigella – VI. Consideraciones No hay. 2.3.- SEROTIPIFICACIÓN DE SHIGELLA spp. El uso de métodos de serotipificación con propósitos de vigilancia epidemiológica se basa en el hecho que los microorganismos muestran variaciones en su composición antigénica. Los microorganismos producen una variedad de antígenos: componentes estructurales de la célula (constituyentes de la pared celular, cápsulas, flagelos, fimbrias); productos de secreción de las células (toxinas, enzimas extracelulares) o antígenos contenidos en el interior de las células. Químicamente, los antígenos usados con este propósito pueden ser proteínas, carbohidratos, o mezclas de ambos componentes. Debido a la característica del género Shigella de ser inmóviles, solamente se ponen en evidencia los antígenos (denominados somáticos) compuestos por cadenas polisacarídicas del lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa, integrante de la pared celular. Cuando un antisuero específico se mezcla con una suspensión de un cultivo puro de Shigella se observa una reacción de aglutinación. Luego del aislamiento e identificación, se realiza la aglutinación en lámina: los anticuerpos en el suero aglutinarán con la bacteria cuando los antígenos correspondientes estén presentes. Materiales y equipamiento • Ansas descartables • Láminas de vidrio Reactivos • Solución salina 2% • Antisueros polivalentes y monovalentes de Shigella para la serotipificación de miembros del género Shigella. Se necesita el siguiente conjunto de antisueros: a) Tres antisueros de Shigella dysenteriae. 28 - A(I -) que aglutina los serotipos indol negativos (1,3,4,5,6,9 y 10) - A(I +) que aglutina los serotipos indol positivos (2,7 y 8) - Un antisuero monovalente anti Sh. dysenteriae 1. b) Antisueros polivalentes de Shigella flexneri para aglutinar los 6 serogrupos y antisueros monovalentes para diferenciar los serotipos dentro de cada serogrupo.. c) Un antisuero de Shigella sonnei. d) Dos antisueros de Shigella boydii - C(I-) para aglutinar serotipos indol negativo (1,2,3,4,6,8,10,12 y 14). - C(I+) para aglutinar serotipos indol positivo (5,7,9,11,13 y 15). La nomenclatura de los antisueros mencionados corresponde a los nombres dados por el Instituto Nacional de Producción de Biológicos - ANLIS “Carlos G. Malbrán”, Argentina. Procedimiento Comentarios • Mezclar cuidadosamente, con un palillo sobre una lámina de vidrio, un ansa del cultivo en TSA y una gota de solución salina 2% (control de autoaglutinación). • Si no hay aglutinación el cultivo no está rugoso y se procede al segundo paso. • Mezclar cuidadosamente, con un palillo sobre una lámina de vidrio, un ansa del cultivo en TSA y una gota de antisuero polivalente. Mover la lámina suavemente por 2 minutos. • La selección de los antisueros polivalentes se debe hacer en base a la historia de la región o país y a las pruebas bioquímicas diferenciales indicadoras de especie • Una suspensión homogénea indica una reacción negativa. Una aglutinación indica una reacción positiva. • La aglutinación positiva con los antisueros polivalentes continúa con la aglutinación con algunos de los antisueros monovalentes correspondientes, para determinar el serotipo del cultivo. • Cuando un cultivo que presenta características bioquímicas de Shigella aglutina pobremente o no aglutina, se puede estar en presencia de un aislamiento capsulado. Estos cultivos se deben calentar en un baño de agua a 100ºC por 15 a 30 minutos y luego se repite el ensayo de aglutinación. 29 Comentarios Situaciones atípicas que se pueden presentar: a) TSI alcalino/ácido sin gas, SIM (-v-), acetato de sodio negativo, ureasa negativa y aglutinación con el antisuero específico pobre o negativa: estos cultivos se deben calentar a 100º C. b) TSI alcalino/ácido con gas, SIM (---), acetato de sodio negativo, ureasa negativa: a estos cultivos se les debe probar aglutinación porque algunos serotipos de Sh. dysenteriae, Sh. flexneri y Sh. boydii fermentan glucosa con producción de gas. 30 FLUJOGRAMA PARA SEROTIPIFICACIÓN DE SHIGELLA spp. Cultivo con propiedades bioquímicas de Shigella Aglutinación con solución salina 2% Negativo Positivo Cepa rugosa Aglutinación con OShB Positivo Sh. flexneri (probar serotipos 1a 6) Positivo Sh. sonnei Positivo Sh. boydii (probar serotipos indol + y -) Negativo Aglutinación con OShD Negativo Aglutinación con OShC Negativo Aglutinación con OShA Positivo Sh. dysenteriae (probar serotipos indol + y -, y serotipo 1) Negativo Calentar y repetir el procedimiento 31 Referencias Bopp, Ch., Brenner, F., Wells, J., Strockbine N. 1999. Escherichia, Salmonella, Shigella,. In Manual of Clinical Microbiology. Murray, P. (Ed.). Cap. 28, pp. 459-474. Ewing, W. 1986. Edwards and Ewing´s Identification of Enterobacteriaceae. 4th edition. Elsevier Science Publishers. Le Minor, L., Richard, C. 1993. Méthodes de Laboratoire pour l´Identification des Entérobactéries. Institut Pasteur. 32 CAPÍTULO III – PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD Los laboratorios de microbiología son ambientes de trabajo que pueden presentar riesgos de adquirir enfermedades infecciosas para las personas que trabajan en ellos. Los accidentes en el laboratorio ocurren por ausencia de entrenamiento, desconocimiento, experiencia escasa, cansancio, trabajar muy rápido, no seguir prácticas seguras y subestimar la peligrosidad del trabajo. Frente a estas situaciones se introdujo el concepto de bioseguridad que es el “conjunto de métodos tendientes a minimizar el riesgo asociado al manejo de microorganismos, mediante la protección de los operadores, personas del entorno, productos y medio ambiente”. Define las condiciones de contención provistas por el uso de equipos de seguridad. Los microorganismos se han clasificado en grupos de riesgo en función de su patogenicidad, forma y facilidad de transmisión, la dosis infecciosa, y la existencia de tratamiento. Los microorganismos con los cuales se trabajará Salmonella, Shigella y otros miembros de la Familia Enterobacteriaceae, pertenecen al Grupo de Riesgo II, donde el riesgo individual es moderado y el riesgo comunitario limitado. Estos microorganismos pueden provocar enfermedades en humanos y animales, pero con pocas probabilidades de riesgo grave para el personal de laboratorio, animales o medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección pero se dispone de medidas de tratamiento y de prevención y el riesgo de propagación es limitado. 1.- NIVEL DE LABORATORIO El laboratorio donde se trabaja con estos microorganismos es de Nivel de Bioseguridad 2. En este nivel el personal debe contar con una capacitación específica para el manejo de los agentes patógenos y el director es un profesional competente. El acceso al laboratorio está restringido cuando se están desarrollando actividades y la puerta de entrada debe tener el símbolo indicador. Se toman precauciones especiales cuando se manejan elementos cortopunzantes y se utilizan elementos de protección (ambos, delantales, guantes, máscaras faciales) con los procedimientos que pueden representar un riesgo para el operador. Las mesadas de trabajo tienen que ser impermeables al agua, resistentes al calor moderado y a los productos químicos empleados en la desinfección. 33 El laboratorio debe disponer de un lavatorio para el lavado de manos y de adecuados sistemas de decontaminación del material. En los laboratorios está prohibido comer, beber, fumar, manipular de lentes de contacto, maquillarse. 2.- ELEMENTOS DE PROTECCION a) Ambos, delantales o uniformes de laboratorio durante la permanencia en el mismo; esta vestimenta no debe salir del laboratorio y el personal no puede llevarla a su casa para el lavado. b) Guantes cuando es posible que las manos entren en contacto con materiales infecciosos o superficies contaminadas. Los guantes se descartan luego de su uso, no se lavan ni se reusan y no se deben usar fuera del laboratorio. c) Protección Facial se requiere su uso cuando existe la posibilidad que algún procedimiento genere gotas o aerosoles La protección facial esta dada por anteojos, máscaras faciales, barbijos. d) Gabinete de seguridad biológica, cuando existe la posibilidad de generación de gotas o aerosoles. El gabinete que se utiliza es Clase II que protege al operador, los productos y el medio ambiente. El aire externo no entra directamente a la mesa de trabajo sino que previamente pasa por un filtro HEPA para luego ingresar al área de trabajo, y también sale al ambiente a través de otro filtro, (Fig. 1). Es obligatorio que los gabinetes se evalúen y certifiquen en el momento de la instalación en el laboratorio, cuando se trasladan y por lo menos una vez por año a partir de ese momento. FIGURA 1 34 Dentro del gabinete debe ingresar solamente el material indispensable para trabajar para perturbar lo menos posible la circulación del aire dentro del gabinete. 3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO 1. Leer cuidadosamente todas las instrucciones antes de comenzar con los protocolos de trabajo. 2. Considerar POTENCIALMENTE CONTAMINADO a todo material de vidrio, plástico, pipetas, espátulas, que esté en contacto con las supensiones bacterianas. 3. Todo material contaminado potencialmente infeccioso se tratará en autoclave. No efectuar ninguna limpieza del mismo en el laboratorio. 4. Descartar los residuos plásticos potencialmente infecciosos en recipientes resistentes a la perforación, que contienen hipoclorito de sodio al 1%. Estos recipientes NO SE DEBEN LLENAR COMPLETAMENTE. 5. Descartar los materiales con cultivos microbianos en recipientes con bolsas plásticas de color rojo, para su posterior eliminación. 6. Descartar material de vidrio en recipientes de acero inoxidable con tapa de seguridad para su posterior descontaminación en autoclave. 7. Cada mesada debe tener propipetas, guantes, alcohol 70% y una solución de hipoclorito de sodio al 10%. 8. Notificar a las personas responsables del área o instructores de trabajos prácticos cuando se produzcan derrames, quienes tomarán las medidas adecuadas según el caso. 9. Descartar el material de vidrio roto envolviendo los trozos en papel, colocarlo en bolsa plástica y finalmente en un recipiente resistente y rotulado con claridad “vidrios rotos”. 4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO 1. Mantener la calma y avisar al resto de las personas. 2. Dar aviso al Departamento de Seguridad e Higiene. 3. Si el fuego es pequeño y sabe utilizar un extintor, úselo. Si el fuego es de consideración no se arriesgue y evacue el laboratorio. 4. No corra, camine rápido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. 5. No lleve objetos ya que pueden entorpecer su salida. 35 6. Si pudo salir del laboratorio, por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se encarguen. 5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA Se deben tener disponibles los números telefónicos correspondientes. 6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS El acondicionamiento seguro de muestras para diagnóstico bacteriológico es responsabilidad de todos los involucrados en el proceso: el profesional, el responsable del laboratorio y el personal de la empresa de transporte. El embalaje de los materiales infecciosos debe evitar la fuga de los mismos por rotura o mal empaque del envío. Los materiales para diagnóstico se deben enviar en el “sistema de triple envase” de acuerdo a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud WHO/EMC/97.3. (Fig. 2) El sistema consiste de: a) Recipiente primario, a prueba de pérdidas, con cierre hermético (tubo pequeño o vial), en el cual se coloca la muestra. b) Recipiente secundario, resistente, a prueba de fugas, impermeable, donde se incluye el recipiente primario. c) Envoltorio externo, para proteger el envase secundario de influencias externas, como daño físico o agua. El espacio entre los recipientes primario y secundario se debe llenar con material absorbente, para retener el contenido del recipiente primario en caso que ocurra una pérdida durante el transporte. Los formularios con datos de la muestra, notas y todo otro tipo de información que identifiquen o describan a la muestra, al remitente y al destinatario, se deben colocar alrededor del recipiente secundario. 36 FIGURA 2 REFERENCIAS Laboratory Biosafety Manual, 3rd ed., World Health Organization Geneva, 2004 www.who.int Biological Safety. Principles and Practices, 3rd ed. Fleming, D.O., Hunt, D.L. Ed. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4th ed., Richmond J., McKinney Ed. CDC/NIH, 2001. www.cdc.gov. Safety in Health-Care Laboratories. World Health Organization Geneva, 1997. www.who.int/. 37 CAPÍTULO IV - MEDIOS DE CULTIVO Agar MacConkey Es un medio selectivo y diferencial para aislar microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Sirve para aislar Salmonella, Shigella, y coliformes de materia fecal, orina, alimentos y aguas residuales. Es un medio de baja selectividad para usar con inóculos pequeños. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben microorganismos Gram (+). La presencia de lactosa permite el desarrollo de las cepas lac (+) que se manifiesta por el viraje del indicador debido a la producción de ácido; luego se absorbe el rojo neutro dando color rojo a la colonia y un halo turbio por la precipitación de las sales biliares por la acidez del medio. Las bacterias no fermentadoras de lactosa (S. Typhi, S. Paratyphi, Shigella dysentariae) no alteran el medio, dando colonias incoloras y transparentes. Para detectar S. Typhi hay que usar medio MacConkey con agar SS y agar bismuto sulfito. El medio contiene: peptona, sales biliares, rojo neutro, cristal violeta, sales y lactosa. Interpretación Salmonella, Shigella: incoloras, medio amarillo Escherichia: rojas, halo turbio Enterobacter, Klebsiella: grandes, rosadas a rojo, mucosas Proteus: incoloras Agar EMB Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias patógenas intestinales Gram (-). El contenido de lactosa y sacarosa hace posible la diferenciación de Salmonella y Shigella lac/sac (-), de la flora acompañante lac (-)/lac(+) (Proteus vulgaris, Citrobacter, Aeromonas hydrophila). La combinación de colorantes es la que permite diferenciar entre los fermentadores y no fermentadores de lactosa. La sacarosa se incluye porque algunos coliformes la fermentan más rápido que a la lactosa. El desarrollo de las bacterias Gram (+) está inhibido por los colorantes del medio (eosina amarilla y azul de metileno). 38 Agar EMB Levine contiene solamente lactosa. El medio contiene: peptona, sales biliares, tiosulfato, carbonato de calcio, lactosa y sacarosa. Interpretación Salmonella, Shigella: transparentes, ámbar rosado Escherichia: violáceas con brillo metálico y centro negro azulado Enterobacter, Klebsiella: colonias grandes, mucosas sin brillo metálico y centro oscuro. Bacterias lac (+): negras o centro oscuro, halo transparente. Bacterias lac (+) o sac (-): incoloras. Agar SS Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y animales; pero no es el ideal para Sh. dysenteriae y Sh. boydii. Sirve también para Yersinia enterocolitica y para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores. La presencia de verde brillante, bilis de buey, alta concentración de tiosulfato y el citrato inhiben la flora acompañante. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formación de sulfuro de hierro. La degradación de la lactosa a ácido provoca el viraje del indicador rojo neutro a rojo. El medio contiene: extracto de carne, peptona, lactosa, citrato de hierro amoniacal, tiosulfato, verde brillante, rojo neutro. Interpretación Salmonella: incoloras, transparentes, centro negro Shigella: incoloras, transparentes, medio amarillo Proteus: transparentes, centro rojo, medio amarillo Escherichia coli: rosadas a rojo, medio rojo Enterobacter aerogenes: rosadas a crema, opacas, mucosas Bacterias lac +: rojizas, mucoides, centro negro Agar XLD Es un medio de selectividad moderada a alta que permite ser usado con Salmonella y Shigella. La degradación de xilosa, lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al 39 amarillo. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la producción de sulfhídrico. La decarboxilación de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo púrpura por aumento del pH. El desoxicolato inhibe Gram (+). La diferenciación de Salmonella/Shigella de otras enterobacterias se basa en tres reacciones: fermentación de xilosa, decarboxilación de lisina y producción de sulfhídrico. La xilosa diferencia Shigella de Providencia que no fermenta xilosa o lo hace muy lentamente; la lisina diferencia Salmonella de los fermentadores de xilosa no patógenos. La lactosa y la sacarosa en exceso evitan que los coliformes lis + reviertan la condición alcalina de los microorganismos consumidores rápidos de xilosa/lisina. La producción de sulfhídrico ocurre en condiciones alcalinas dando colonias con centro negro; en condiciones ácidas la precipitación negra se inhibe. El medio contiene: extracto de levadura, xilosa, lactosa, sacarosa, lisina, desoxicolato, tiosulfato, citrato de hierro amoniacal, rojo fenol, sales. El precipitado que ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede eliminarse por filtración. Interpretación E. coli, Enterobacter: amarilla, opacas, c/precipitado Aeromonas: amarilla, opacas, c/precipitado Klebsiella: amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado Citrobacter: amarilla, opacas, centro negro Serrati, Hafnia: amarilla, opacas P. vulgaris, P. mirabilis: amarilla, translúcidas, centro negro Salmonella: igual color del medio, centro negro Shigella, Providencia: igual color del medio, translúcidas Salmonella Typhi: amarilla, ligeramente opacas Agar Hektoen Es un medio selectivo para bacterias intestinales, incluidas algunas shigellas. No tiene efecto inhibidor sobre Salmonella y Shigella pero si sobre flora acompañante. Debido a los dos indicadores (azul de bromotimol y fucsina), las colonias lac + tienen una diferencia 40 cromática con las colonias lac -; lo mismo ocurre con bacterias fermentadoras de sacarosa y salicina. El tiosulfato con el hierro dan coloración negra a las colonias sulfhídrico+. Las sales biliares inhiben a la flora acompañante. Puede agregarse novobiocina para inhibir Citrobacter y Proteus. El medio contiene: peptona, extracto de levadura, sacarosa, lactosa, salicina, tiosulfato, citrato de hierro amoniacal, sales biliares, azul de bromotimol, fucsina. Interpretación Shigella, Providencia: verdes, planas, transparentes Salmonella, Proteus: verde-azuladas, c/s centro negro Pseudomonas: verde-azuladas, planas, borde irregular Coliformes: salmón, halo de precipitación 41 CAPITULO V - PLANILLA DE RESULTADOS Aislamiento de Shigella de heces – Morfología en agar selectivo Fecha:____________________ Nombre:__________________ Muestra:__________________ Color Resultados Morfología en MacConkey Morfología en EMB Morfología en SS Morfología en XLD Morfología en Hektoen 42 Comentarios PLANILLA DE RESULTADOS Aislamiento de Shigella de heces – Pruebas Bioquímicas Fecha:____________________ Nombre:__________________ Muestra:__________________ Color Resultados TSI profundidad TSI estría TSI gas TSI H2S LIA profundidad LIA estría Arginine dihidrolasa Lisine decarboxilasa Ornithine decarboxilasa Mucate (fermentación) Acetate (utilización) Cit. Christensen Indole (reacción) Sucrose (fermentación) Manitol (fermentación) Xylose (fermentación) Dulcita (fermentación) Β-galactosidasa 43 Comentarios PLANILLA DE RESULTADOS Aislamiento de Shigella de heces – Serotipificación Fecha:____________________ Nombre:__________________ Muestra:__________________ A) Antisueros polivalentes OSh A OSh B OSh C B) Antisueros de serotipos Antisueros polivalentes OSh A OSh B OSh C OSh D Antisueros de serotipos 44 OSh D Subgrupo/Serotipo Sh. dysenteriae Sh. flexneri Sh. boydii Man. % Dul. % Xil. % Ram. % Raf. % Glic. Indol % Orn. Decarb. % 1 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 "+/(+)" 100 - 0 - 0 2 - 0 - 0 - 0 + 98 - 0 "(+)/+" 98 + 100 - 0 3 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 "(+)/+" 100 - 0 - 0 4 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 "(+)/+" 100 - 0 - 0 5 - 0 "+/(+)" 100 - 0 - 0 - 0 "+/(+)" 100 - 0 - 0 6 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 "-/(+)" 38 - 0 - 0 7 - 0 - 0 - 0 "(+)/+" 90 - 0 - 0 + 100 - 0 8 - 0 - 0 "+/(+)" 96 - 0 - 0 "+/(+)" 100 + 100 - 0 9 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 "+/(+)" 100 - 0 - 0 10 - 0 - 0 + 100 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 1 + 95 - 0 - 0 - d 89 - 0 "-/+" 35 - 0 2 + 99 - 0 - 0 - d 77 - 0 "-/+" 44 - 0 3 + 98 - 0 - 0 d 12 d 88 - 0 "+/-" 88 - 0 4 + 99 - 0 - 0 d 23 d 82 - 0 "+/-" 55 - 0 4 - 0 - 0 d 71 "-/+" 48 - 3 - 0 + 98 - 0 5 + 99 - 0 - 0 - 5 d 72 - 0 + 95 - 0 6 + 99 d 80 - 4 - 6 - d 98 - 0 - 0 1 + 100 - 1 "+/(+)" 97 - 0 - - "(+)/+ 96 - 0 - 0 2 + 100 - 1 - 0 - 0 - - "+/(+)" 100 - 0 - 0 3 + 100 d 75 d 86 - 0 - - "+/(+)" 91 - 0 - 0 4 + 99 "-/(+)" 28 - 0 - 0 - - "+/(+)" 100 - 0 - 0 5 + 100 6 "+/(+)" 100 Sh. sonnei % - - 0 (+) 94 - 0 - - d 61 + 100 - 0 "(+)/+" 100 + 100 - 0 - - "(+)/+" 100 - 0 - 0 7 + 100 - 0 + 98 - 0 - - "(+)/+" 98 + 100 - 0 8 + 100 - 0 + 94 - 0 - - "(+)/+" 100 - 0 - 0 0 9 + 95 - 0 - 0 d 80 - - "(+)/-" 82 + 100 - 10 + 94 + 100 d 84 - 0 - - "(+)/+" 100 - 0 - 0 11 + 100 "-/(+)" 34 "+/(+)" 100 - 0 - - "(+)/+" 100 + 100 - 0 12 + 100 "-/(+)" 14 - 0 - 0 - - "-/+" 14 - 0 - 0 13 + 100 - 0 - 0 - 0 - - "(+)/-" 63 + 100 + 100 14 "-/+" 29 - 0 "(+)/+" 100 - 0 - - "+/(+)" 100 - 0 - 0 15 + 90 - 0 - 0 - 0 - - "(+)/+" 64 + 100 - 0 + 99 - 1 - 1 "+/(+)" 98 d 84 d 46 - 0 + 99 Tabla 3.2. Reacciones Bioquímicas de Serotipos de Shigella spp. + 90% o >; - 90% o >; +/- >> +; -/+ >>-; d diferentes reacciones 45
