Curso 2005-`06

Curso 2008-2009. Genética Microbiana
Práctica: Detección de interacciones genéticas en Saccharomyces cerevisiae.
Profesores: Lola de Miguel, Gonzalo Millán y Sebastián Chávez
Objetivos
1. Identificar los marcadores genéticos de las cuatro estirpes problema
2. Identificar los genes presentes en los tres plásmidos problema
3. Determinar el número mínimo de mutaciones que confieren auxotrofía para
adenina presentes en las estirpes problema
4. Determinar el tipo de interacción genética existente entre una mutación
termosensible presente en una de las estirpes problema y otra mutación no
identificada
Preguntas a responder al final de la práctica
1. ¿Cuál es el fenotipo de cada estirpe problema en cuanto a sexo, marcadores de
auxotrofía y termosensibilidad?
2. ¿Qué podéis decir de los genes que están presentes en cada plásmido? ¿Qué
plásmidos pueden complementar los fenotipos de auxotrofía y termosensibilidad
de las estirpes problema?
3. ¿Cuál es el número mínimo de mutaciones que confieren auxotrofía para
adenina presentes en el conjunto de las estirpes problema? ¿Qué clases de
interacciones genéticas se dan entre estos genes?
4. Durante el transcurso de la práctica se facilitará a cada grupo una nueva estirpe
problema. Esa estirpe y una de las estirpes problema iniciales, que porta una
mutación que le confiere termosensibilidad, son isogénicas. La nueva estirpe se
facilitará transformada con uno de los plásmidos problema iniciales que
complementa su termosensibilidad. La nueva estirpe posee además una nueva
mutación, no presente en la estirpe isogénica. ¿Qué tipo de interacción genética
existe entre esa mutación adicional y la mutación que confiere
termosensibilidad?
Material
Estirpes:
4 estirpes problema sembradas como líneas paralelas en cajas de YPD.
2 estirpes auxiliares para determinación del sexo:
227-a: MATa lys1-1
70-alfa: MATalfa thr3-10
Plásmidos:
3 plásmidos problema altamente purificados
Medios:
Medio líquido YPD (extracto de levadura + peptona + glucosa)
Cajas de medio YPD sólido
Cajas de medio mínimo SD (sales, vitaminas, amonio y glucosa)
Cajas de medio completo SC (SD+Leu+Trp+Ade+His+Met+Lys+Met)
Cajas de medio SC sin algún requerimiento SC-Ade, SC-Leu, etc
Soluciones para la transformación
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
Día 17 de Noviembre
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Experimento 1: Replicar con terciopelos las estirpes a cajas con los siguientes
medios: SC-Ade, SC-His, SC-Ura, SC-Trp, SC-Leu, SC-Lys, SC-Met, SC e
YPD, este último por duplicado. Incubar a 30ºC todas las cajas excepto una de
las dos cajas de YPD, que debe incubarse a 37ºC.
Experimento 2: Poner a conjugar las estirpes en cajas de medio YPD con cepas
de sexo conocido, 227-a y 70-alfa. Para ello poner en contacto con un terciopelo
por este orden: las estirpes problema, un ceped de las estirpes 227-a y 70-alfa, y
una caja fresca de YPD. Incubar a 30ºC.
Experimento 3: Poner a conjugar todas las estirpes entre sí para formar diploides
en cajas de medio YPD. Para ello replicar con terciopelo las estirpes problema a
una caja de YPD, levantar la caja, girar 90º y volver a ponerla en contacto con el
terciopelo. Incubar a 30ºC.
Experimento 4: Transformar cada una de las estirpes problema con los tres
plásmidos suministrados y sembrar cada transformación en una caja de medio
SC-Ade y otra de SC-Ura. Incubar las cajas a 30ºC.
Día 19 de Noviembre
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Experimento 1: Observar y anotar el estado de crecimiento de las réplicas
sembradas antesdeayer. Mantener la incubación de las cajas a las temperaturas
adecuadas.
Experimento 2: Replicar las conjugaciones con terciopelos a cajas de medio
mínimo SD e incubar a 30ºC
Experimento 3: Replicar las conjugaciones utilizando terciopelos a cajas de
medio SC-Met-Lys, SC-Trp-Lys, SC-Leu-Ura, SC-Leu-Trp y SC. Incubar todas
las cajas a 30ºC.
Experimento 4: Observar y anotar el estado de crecimiento de las cajas
sembradas, con especial cuidado en detectar la aparición de colonias aisladas.
Mantener la incubación de las cajas a las temperaturas adecuadas.
Día 21 de Noviembre
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Experimento 1: Observar y anotar el estado de crecimiento de las réplicas
sembradas el día 17 de Noviembre.
Experimento 2: Observar y anotar el estado de crecimiento de las réplicas
sembradas el día 19 de Noviembre.
Experimento 3: Aislar colonias de los diploides seleccionados sembrando por
sectores en el mismo medio. Incubar a la temperatura adecuada.
Experimento 4: Amplificar las colonias aparecidas en las cajas sembradas el día
17 de Noviembre. Sembrar dos colonias de cada tipo, en una caja del mismo
medio de cultivo, en dos cajas de medio YPD y en una caja de medio FOA
(ácido 5-fluoroorótico). Sembrar por sectores para favorecer el crecimiento de
colonias aisladas. Sembrar en los mismos medios una caja con una nueva estirpe
que será facilitada ese día a cada grupo (estirpe X). Incubar a 30ºC salvo una de
las cajas de YPD, que ha de incubarse a 37ºC.
Día 24 de Noviembre
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Experimento 3: Replicar con terciopelos a cajas de SC-Ade y SC, e incubar a
30ºC.
Experimento 4: Observar y anotar la apariencia de las colonias aisladas que han
aparecido en cada una de las cajas sembradas el día 21 de Noviembre. Mantener
la incubación de las cajas a 30ºC.
Día 26 de Noviembre
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Experimento 3: era
Experimento 4: Observar y anotar la apariencia de las colonias aisladas que han
aparecido en cada una de las cajas sembradas el día 21 de Noviembre.
Protocolo de transformación de levaduras
1. Centrifugar 10 ml de un cultivo de levaduras que esté creciendo de forma
vigorosa en medio YPD (107 células /ml aproximadamente) 3 min a 4000
rpm en la centrífuga de mesa.
2. Descartar el sobrenadante y resuspender en 5 ml de agua destilada estéril.
Centrifugar de nuevo 3 min a 4000 rpm.
3. Resuspender en 200 µl de solución tamponada estéril de acetato de litio
recién preparada mezclando:
0,5 ml de Tampón TE 10X (Tris-HCl 0,1M EDTA 10 mM pH 7,5)
0,5 ml de Acetato de litio 1M pH 7,5
4 ml de Agua destilada
4. Mezclar para cada transformación en un tubo de 1,5 ml:
10 µl de DNA de esperma de salmón desnaturalizado (10 mg/ml)
5 µl del plásmido a transformar
50 µl de la suspensión de células
5. Agitar en el vortex
6. Añadir 300 µl ml de solución PEG estéril recién preparada mezclando:
1,5 ml de Tampón TE 10X (Tris-HCl 0,1M EDTA 10 mM pH 7,5)
1,5 ml de Acetato de litio 1M pH 7,5
12 ml de Polietilénglicol 4000 al 50%
7. Mezclar bien en el vortex
8. Incubar 30 min a 30ºC en agitación.
9. Incubar 15 min en un baño a 42ºC
10. Añadir 1 ml de agua destilada estéril y mezclar con la pipeta repetidas veces
11. Centrifugar 1 min a 10000rpm en la centrífuga de mesa
12. Descartar el sobrenadante y resuspender en 200 µl de agua destilada estéril
13. Sembrar 100 µl en una caja de SC-Ura y otros 100 µl en una caja de SC-Ade