manual de prácticas de laboratorio texicología
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA ACADEMIA DE TECNOLOGIA AMBIENTAL MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO TOXICOLOGIA AMBIENTAL ELABORADO POR: Ana Belem Piña Guzmán Carmen Calixto Mosqueda Sandra Georgina García 1 ÍNDICE ÍNDICE GENERAL PÁG PRACTICA 1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES 3 PRÁCTICA 2. SEGURIDAD EN EL MANEJO DE PRODUCTOS QUIMICOS 8 PRÁCTICA 3. VIAS DE ADMINISTRACIÓN Y MANEJO DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 22 PRÁCTICA 4. EXPOSICION AGUDA DE RATAS WISTAR A XENOBIÓTICOS 25 PRÁCTICA 5. EFECTO HEPATOTÓXICO DEL TETRACLORURO DE CARBONO 29 PRÁCTICA 6. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON SEMILLAS DE LECHUGA (Lactuca sativa L.) 32 PRÁCTICA 7. BIOENSAYO DE TOXICIDAD POR CONTACTO DE LOMBRIZ DE TIERRA (Eisenia foetida) EN PAPEL FILTRO CONTAMINADO CON Cr 37 2 PRÁCTICA No. 1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES I. TEMA Preparación de soluciones para administración de animales de experimentación o posología. II. OBJETIVO GENERAL Practicar los cálculos matemáticos para la correcta preparación de soluciones de laboratorio mediante la resolución de problemas asignados por el profesor de laboratorio para la administración racional de éstos. III. INTRODUCCIÓN 1.1. Soluciones La solución o disolución es la mezcla homogénea de dos o más sustancias. Las más comunes, y a las que nos referiremos en lo sucesivo, son las disoluciones diluidas consistentes en un componente mayoritario líquido, que es el solvente o disolvente, y un componente minoritario, por lo común sólido o líquido (aunque también puede ser gaseoso), que es el soluto. De especial relevancia son las disoluciones acuosas, esto es aquellas en las que el disolvente es agua. La composición de una solución viene dada por la cantidad de soluto disuelto en una cantidad dada de disolución o de disolvente. Tal relación, o concentración, se puede expresar de varias formas: • % w/v (peso/volumen). Se emplea cuando el soluto es sólido y el disolvente líquido. Expresa la cantidad de soluto en unidades de peso (generalmente gramos) por 100 unidades de volumen (generalmente mL) de disolución. Así la unidad más común en que se expresa la concentración en tanto por ciento en volumen es en gramos/ 100 mL de solución • % w/w (peso/peso). Expresa la cantidad de soluto en unidades de peso por 100 unidades de peso de disolución. El peso se expresa en gramos • % v/v (volumen/volumen). El soluto y el disolvente son líquidos. Expresa la cantidad de soluto en unidades de volumen por 100 unidades de volumen de disolución. La unidad típica de medición es mL, expresándose los mL de soluto en 100 mL de solución • Peso de soluto por unidad de volumen de disolución. Aquí se expresa el peso de soluto contenido en un volumen de la mezcla. La forma más corriente es la expresión de gramos/litro (g/L) • Molares (Molaridad). Solución molar (M) es aquella que contiene 1 mol de soluto en un litro de disolución. Un mol de una sustancia es igual a su peso molecular (PM; más adecuadamente y menos conocido como masa molecular relativa, Mr) en gramos y se obtiene sumando los pesos atómicos (PA; menos conocido como masa atómica relativa, A r) de los átomos que lo forman. Las unidades de medición de molaridad son moles/litro (mol/L) • Normales (Normalidad). Solución normal (N) es aquella que contiene un equivalente gramo de soluto en 1 litro de solución. La normalidad es similar a la molaridad, excepto que la concentración se basa en pesos equivalente en vez de pesos moleculares. El equivalente de un 3 compuesto es igual al peso molecular dividido entre la valencia (Peso Equivalente = Peso Molecular/Valencia) • Molales. La molalidad es una expresión de la concentración que difiere de la molaridad porque indica la cantidad de moles de soluto por 1000 g (1 Kg) de disolvente, en vez de la solución final, como en el caso de la molaridad. Las unidades son moles/ 1000 g de disolvente. La molalidad es una medición peso/peso en vez de peso/volumen, por tanto, es independiente de la variación de la temperatura. Ello determina la concentración en forma más precisa que la molaridad, aunque menos usada por la complejidad a la hora de hacer los cálculos. En las soluciones acuosas hay muy poca diferencia entre la molalidad y la molaridad • Fracción Molar de Soluto. Definida como el número total de moles de la sustancia disuelta entre el número total de moles de la disolución (Xsoluto = Nº moles soluto/Nº moles totales). Esta expresión tiene especial interés en relación a la Ley de Henry Nota: La ley de Henry dice que, a temperatura constante, la solubilidad de un gas en un líquido es directamente proporcional a la presión parcial de dicho gas (pgas) sobre la solución (Xgas = k pgas). • Osmolalidad. Número total de partículas de soluto osmóticamente activas o miliósmoles por unidad de peso en kilogramos de agua (miliósmoles/Kg agua). En las soluciones diluidas del cuerpo humano sano, la osmolalidad y la osmolaridad son esencialmente iguales. El aumento de la osmolalidad produce un incremento de la presión osmótica • Osmolariad. También conocida como Tonicidad se define como el número total de partículas de soluto por unidad de volumen de solución, y en los sistemas biológicos se define como unidades de miliósmoles/l de agua. Las soluciones presentan una serie de propiedades que prácticamente dependen sólo de la concentración del soluto y no de su naturaleza química. Son las denominadas propiedades coligativas, entre las que se encuentran las siguientes: presión de vapor, puntos de congelación y ebullición, y presión osmótica. Dosis se define como la cantidad de compuesto de prueba que debe administrarse a un animal de experimentación por kilogramo de peso para producir un efecto deseado. Por lo tanto los efectos tóxicos dependerán de la concentración de xenobiótico en el organismo, debido a que la dosificación mantiene una relación directa entre la cantidad de compuesto administrado y el peso corporal del animal. 1.2. Diluciones Consiste en obtener una solución inferior partiendo de una más concentrada. En laboratorio clínico se suelen expresar las soluciones como una parte de solución original y otra que determina el volumen total de solución final incluido el disolvente. 1.2.1. Diluciones en serie En laboratorio se utilizan técnicas semicuantitativas denominadas titulaciones, de gran utilidad en pruebas serológicas si se quiere determinar el volumen de un anticuerpo en una muestra clínica. 4 Una dilución en serie constituye una sucesión de diluciones en las que van siendo subsecuentemente menos concentradas que su anterior. En un sistema de n diluciones en serie, la concentración de soluto en cada dilución sucesiva es de 1/n de la anterior. Generalmente se efectúan al doble, es decir, que cada dilución tiene la mitad de concentración que su antecesor. IV. METODOLOGÍA MATERIAL, EQUIPOS Y REACTIVOS. Hojas blancas, calculadora y lápiz DESARROLLO EXPERIMENTAL La práctica se realizará de acuerdo con las siguientes actividades: 1. Resolución de una serie de problemas: a. El profesor asignará a cada uno de los equipos un problema para su resolución en clase. b. Se revisarán y discutirán los cálculos matemáticos y se aclararán las dudas que surjan c. Los problemas restantes de la serie se dejarán para resolver como tarea y se entregarán como parte del reporte. PROBLEMAS 1. ¿Cómo prepararías una solución de sulfato de cobre pentahidratado de concentración 0.4 M? 2. ¿Qué volumen de la solución anterior deberás tomar para preparar 100 ml de una disolución de concentración 0.01 M? 3. ¿Cuántos gramos de reactivo deberás pesar para preparar 500 mL de una solución 5% (W/V) de NaCl? 4. Expresa la concentración de la solución anterior en molaridad. 5. ¿Cuántos mg de cloruro de sodio contiene 1 L de solución salina (0.9%)? 6. Una etiqueta en una botella de ácido clorhídrico grado analítico dice 37 % p/p - d= 1,19 g/ml. Se trata de una solución muy concentrada. Cuánto de ella necesitaríamos para preparar una solución 0.1 N (normal)? 7. Cuando se evaporan 50 g de solución de sulfato de sodio (Na2SO4) hasta sequedad, se producen 20 g de sal; ¿Cuál es el % de sal en la solución? 8. ¿Qué % en volumen de alcohol tiene una botella de cerveza de 875 mL con 8 mL de alcohol? 5 9. En el comercio se encuentran ampolletas de clorhidrato de adrenalina cuya concentración es de 1 mg por ml. ¿Cuál es el porcentaje de dicha solución? 10. Requieres preparar un litro de hidróxido de sodio 0.1 N ¿Cuántos gramos de hidróxido de sodio necesitas para prepararla? 11. El difenoxilato es un fármaco antidiarréico. La dosis que se administra en niños es de 0.05 mg/Kg, el preparado vienen en una concentración de 0.05%. ¿Cuántos mililitros de éste se le tienen que administrar a una rata joven que pesa 185 g para guardar la misma dosis que en el humano. 12. Para determinar una curva dosis respuesta a la adrenalina se requiere preparar las siguientes soluciones: 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03 y 0.01 g en 2 ml; si el medicamento tiene una presentación en solución; la cual contiene 100 mg de clorhidrato de adrenalina en 100 ml. ¿Cuáles son los cálculos para obtener dichas concentraciones de adrenalina? 13. Un protocolo de ensayo toxicológico agudo señala la administración del medicamento Penprocilina a una rata. La dosis es de 0.2 ml del medicamento preparado y la formulación es la siguiente: Penicilina G sódica 200 000 U.I. (1667 UI = 1mg) Penicilina G procaínica 600 000 U.I. (1009 UI = 1mg) Agua inyectable 2 ml a) ¿Cuántas unidades y cuántos miligramos se le están administrando de cada una de las penicilinas a la rata? Considera que la penicilina G sodica contiene 1667 UI/mg y la penicilina G procaínica contiene 1000 UI/mg b) ¿A qué porcentaje (w/v) se encuentran los dos tipos de penicilina? 14. De acuerdo a un protocolo experimental para realizar una curva dosis-respuesta de plaguicida “X” en ratones adultos de aproximadamente 40 g de peso, se administrarán 5 grupos experimentales de 5 animales con 3/4, 1/2, 1/3, 1/4 y 1/8 de la DL50. La DL50 del plaguicida “X” empleado es de 65 mg/kg y se tiene un reactivo con 98% de pureza y una densidad de 1.8mg/ml. Considera que cada ratón debe administrarse con 200 l de solución (plaguicida X en aceite de cacahuate). a) ¿Qué volumen de solución en aceite de cacahuate deberá prepararse para administrar cada grupo de animales? b) ¿Qué volumen deberá tomar del plaguicida “X”? c) ¿En qué volumen de aceite de cacahuate deberá disolver el plaguicida “X”? 15. ¿Cuántos litros de solución de CaCl2 0.500 mol/L pueden obtenerse a partir de 15 g deCaCl 2? (Respuesta: 0,270 L) 16. Un frasco ámpula contiene una solución formada por 0.75 g de un medicamento “X” y 10 ml de disolvente. ¿Qué volumen de esta solución es necesario administrar a un ratón de 35 g para que éste reciba una dosis de 250 mg/kg del compuesto a probar? 6 17. Se dispone de una solución de alcohol en agua al 80 %. ¿Qué volumen de esta solución se necesita para preparar 1000 ml de solución de alcohol al 25 %? 18. La inyección subcutánea de atropina (0.2 mg/kg en ratas adultas) puede ser conveniente para controlar la salivación y las secreciones respiratorias. Se administra 30 min antes de la administración de anestesias inhalantes tales como el éter. Se necesita administrar esta dosis a 4 animales de los siguientes pesos: 250, 300, 132 y 200 g. Si la presentación es de 1 mg/ml. ¿Qué dilución harías para poder administrar la dosis adecuada a cada una de las ratas sabiendo que el volumen total con el que se puede administrar una rata esta alrededor de los 0.5 ml? 19. Completa los datos faltantes en la siguiente tabla para soluciones de H2SO4. No. a b Vol. (ml) M N m % (m/m) (g/ml) 1 20 100 1.115 2 20 2 1.122 3 300 311 1 4 300 7.5 1.047 a = gramos de soluto, b = gramos de disolvente, V = mL de solución, M = molaridad, N = normalidad, ρ = densidad 20. Un anticonceptivo X diseñado para ser administrado en mujeres, requiere ser probado previamente en ratas para evaluar los efectos adversos del estradiol. La dosis de fármaco que deberá administrarse es de 32.5 mg/kg de peso. La presentación del medicamento es la siguiente: Acetofénido de dihidroxiprogesterona 75 mg Enantato de estradiol 5 mg Vehículo c.b.p 1 ml a) ¿Qué dosis deberá administrarse a ratas que pesan: 280, 312.5, 276.9 y 300 g? b) ¿Qué dilución harías para administrar a cada rata un volumen menor o igual a 0.4 ml? 7 PRACTICA No. 2 SEGURIDAD EN EL MANEJO DE PRODUCTOS QUIMICOS I. TEMA Manejo adecuado de productos químicos de uso en actividades de laboratorio de investigación toxicológica II. OBJETIVOS GENERALES Conocer los aspectos básicos que sirven de apoyo a la legislación sobre clasificación, envasado y etiquetado de productos químicos. Conocer los elementos básicos de reconocimiento de sustancias químicas de uso en el laboratorio que permitan reconocer el riesgo en su manejo y tomar las medidas de protección necesarias para asegurar su correcta y segura manipulación, el adecuado almacenamiento y su correcta eliminación. III. INTRODUCCIÓN El riesgo que supone el manejo de sustancias químicas viene determinado por la exposición a las mismas y por el peligro que éstas representan. Para poder protegernos adecuadamente nosotros mismos y el medio ambiente, debemos poner en práctica medidas preventivas que tengan en cuenta ambos factores para asegurar su correcta y segura manipulación, el adecuado almacenamiento y su correcta eliminación. 1.1. - LA EXPOSICIÓN Las características de la exposición incluyen fundamentalmente la duración del periodo de contacto, junto con la intensidad (concentración) y las circunstancias de la misma. En el Anexo 1 se incluyen las “normas generales de seguridad en el laboratorio”, cuyo fin primordial consiste en tratar de evitar la exposición a sustancias empleadas en el laboratorio. Con relación a las vías potenciales de entrada de los compuestos al organismo, destacan: - Vía respiratoria: Es la más frecuente e importante en medios laborales, en una exposición ambiental y particularmente durante la permanencia en un laboratorio. Los contaminantes (polvos, humos, aerosoles, gases, vapores) son inhalados y absorbidos rápidamente por los pulmones. - Vía digestiva: suele producirse por aspiración al pipetear, por conservar un producto en un envase de alimentos, o por comer o fumar con las manos contaminadas. - Vía percutánea: Además de provocar efectos corrosivos e irritantes, diversos compuestos modifican las barreras facilitando la entrada de otros, o atraviesan las membranas siendo absorbidos directamente hacia la sangre. 1.2. - EL ETIQUETADO: LEGISLACIÓN Todos los productos químicos son caracterizados previamente a su comercialización siguiendo las recomendaciones de la Unión Europea a través de las Directivas relativas a la clasificación, envasado y etiquetado de sustancias y preparados peligrosos, que están traspuestas a las legislaciones nacionales. Las legislaciones nacionales incluyen de forma concreta las indicaciones 8 de peligrosidad que deben aplicarse a cada sustancia. Ello incluye, por lo tanto, indicaciones para el correcto etiquetado de los mismos, para que cualquier persona pueda conocer de forma rápida cuales son los riesgos asociados a su uso. Según la Norma oficial Mexicana NOM-114-STPS-1994 en concordancia con el sistema Internacional HMIS (Hazardous Materials Identification System) los reactivos o materiales peligrosos se clasifican por colores y grados según su peligrosidad, y esto debe estar especificado en la etiqueta del producto para su correcto manejo y almacenamiento. Existen 4 colores: Azul: Rojo: Amarillo: Blanco: Riesgos a la salud Riesgo de Inflamabilidad Riesgo de reactividad Cuidados especiales Y existen 4 grados de Riesgo: 4: Severo 3: Serio 2: Moderado 1: Ligero 0: Mínimo Las etiquetas de los productos fitosanitarios, químicos y reactivos contienen una valiosa información toxicológica que a menudo no es tenida en cuenta. Podrían evitarse en gran medida los peligros para la salud y el medio ambiente siguiendo las recomendaciones que dichas etiquetas contienen. La sistemática empleada por dichos reglamentos para la caracterización e indicación de la peligrosidad, sea de sustancias o de preparados considerados como tales, se basa en la obligatoria inclusión en la etiqueta del envase de uno o dos símbolos o pictogramas de peligrosidad, según corresponda, acompañado de los números y textos de las indicaciones sobre los riesgos específicos (frases R) y las frases de seguridad o consejos de prudencia (frases S), relativos a la manipulación de productos peligrosos. 1.3. - CRITERIOS DE TOXICIDAD La legislación sobre sustancias químicas peligrosas clasifica a las mismas en tres categorías. CATEGORIA DL50 oral rata mg/Kg. en rata mg/L, 4 hr <25 <50 <0.50 Tóxicas 25-200 50-400 0.50-2 Nocivas 200-2000 400-2000 2-20 Muy tóxicas DL50: dosis letal media; CL50: concentración letal media 9 CL50 inhalatoria DL50 cutánea rata o conejo mg/Kg. 1.4. - LOS PICTOGRAMAS O SÍMBOLOS DE PELIGROSIDAD A continuación se detallan las distintas categorías de peligro en las que se engloban las sustancias o preparados peligrosos según sus propiedades físico químicas y toxicológicas y sus efectos sobre la salud humana o el medio ambiente. Se ha considerado oportuno acompañar a cada una de las categorías de peligro de los símbolos de peligrosidad y de las abreviaturas que las representan. En algunos casos (cuando se trata de sustancias clasificadas como inflamables, sensibilizantes, o peligrosas para el medio ambiente) no existe una abreviatura específica sino que sólo aparece la frase o frases de riesgo que la definen. EXPLOSIVOS: Sustancias y preparados que pueden explotar bajo el efecto de una llama o que son más sensibles a los choques o a la fricción que el dinitrobenceno. - COMBURENTES: Sustancias y preparados que en contacto con otros, particularmente con los inflamables, originan una reacción fuertemente exotérmica. - INFLAMABLES: Sustancias y preparados cuyo punto de destello sea igual o superior a 21°C e inferior o igual a 55°C. - EXTREMADAMENTE INFLAMABLES: Sustancias y preparados líquidos cuyo punto de destello sea inferior a 0°C, y su punto de ebullición inferior o igual a 35°C. - - TÓXICOS: Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan entrañar riesgos graves, agudos o crónicos e incluso la muerte. - MUY TÓXICOS: Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan entrañar riesgos extremadamente graves agudos o crónicos e incluso la muerte. - CORROSIVOS: Sustancias y preparados que en contacto con los tejidos vivos puedan ejercer sobre ellos una acción destructiva. - NOCIVOS: Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan entrañar riesgos de gravedad limitada. - IRRITANTES: Sustancias y preparados no corrosivos que por contacto inmediato, prolongado o repetido con la piel o mucosas puedan provocar una reacción inflamatoria. - PELIGRO BIOLÓGICO: bacterias y virus que entrañen peligro para personas y/o animales. - PELIGROSOS PARA EL AMBIENTE: Sustancias y preparados cuya utilización presenta o puedan presentar riesgos inmediatos o diferidos para el medio ambiente. 10 Según la Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-1993 los residuos peligrosos se clasifican según el código CRETIB (corrosivo, reactivo, explosivo, tóxico, inflamable y biológico-infeccioso). 1.5. - OTRAS DENOMINACIONES DE PELIGROSIDAD - ASFIXIANTES: Capaces de afectar a las personas por asfixia. Dos grupos: Simples: Porque desplazan el oxígeno del aire. Sólo son peligrosos a concentraciones elevadas. Químicos: Impiden la llegada del oxígeno a los sitios requeridos. - CARCINOGÉNICOS: Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea, pueden producir cáncer o aumento de su frecuencia. 1ª Categoría: Mediante estudios epidemiológicos se ha visto una relación causa-efecto entre exposición y cáncer humano. 2ª Categoría UE o 2A según IARC: Sustancias probablemente carcinogénicas en el hombre, después de realizar estudios a largo plazo en animales y de otras informaciones. 3ª Categoría UE o 2B según IARC: Sustancia sospechosa, o posiblemente carcinógena. Pero no se dispone de datos y los estudios en animales no aportan pruebas suficientes para clasificarlos en la 2ª. - MUTAGÉNICOS: Sustancias que por inhalación, ingestión o penetración cutánea pueden producir alteraciones en el material genético de las células. Categorías igual que en los carcinogénicos. - TERATOGÉNICOS: Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea pueden producir alteraciones en el feto durante su desarrollo intrauterino, causando malformaciones. 1ª Categoría: Asociación causa-efecto 2ª Categoría: Se dispone de suficientes elementos de juicio. - ALERGENOS: Sustancias químicas que al contacto con la piel y las mucosas o su entrada en el organismo, provocan una reacción anormal del sistema de defensa inmunológico. Debe tenerse en cuenta que aunque muchas sustancias o preparados no requieran indicación de peligrosidad, no por ello deben considerarse inocuas, sobre todo si se tiene en cuenta su capacidad de reacción con otros productos. Por todo ello, es recomendable que al manipular cualquier producto químico, se tomen las debidas precauciones, tanto en los considerados como peligrosos, como en los no considerados como tales. 1.6. - PRODUCTOS FITOSANITARIOS Son productos fitosanitarios los insecticidas, bactericidas, fungicidas, desinfectantes, herbicidas, abonos, tratamientos postcosecha, fitorreguladores, productos nutricionales y fertilizantes. En cualquier caso su almacenamiento y eliminación estarán controlados. Teniendo en cuenta que la toxicidad de los productos fitosanitarios puede variar para productos con la misma riqueza y presentación, por motivos tales como las características del producto, los disolventes u otros coadyuvantes que contengan y la fase de recalificación en que se encuentren, aparecen las siguientes notaciones en las etiquetas de los productos: - Peligrosidad para el hombre y animales domésticos: Después del término "hombre" aparecen una o más de las notaciones siguientes, en orden creciente de peligrosidad: Baja, Irritante Xi, Nocivo Xn, tóxico T, Muy Tóxico T+. Si el producto fuera explosivo o inflamable aparecen las letras E o F. 11 - Peligrosidad para la fauna terrestre: Después del término "terrestre" pueden aparecer las letras A, B, C. - Peligrosidad para la fauna acuícola: Después del término "acuícola " pueden aparecer las letras A, B, C. - Peligrosidad apícola: Después del término "apícola" pueden aparecer una o más de las letras A, B, C, D. En todos los casos la peligrosidad de un producto aumenta según la serie: A, B, C, D. 1.7. - FRASES R (Riesgo) o INDICACIONES SOBRE RIESGOS ESPECÍFICOS Las frases de riesgo especifican el peligro que conlleva el manejo de los productos químicos, tanto a corto como a largo plazo. Constituyen una ampliación de la información proporcionada por el símbolo de peligrosidad. Existen 67 frases de riesgo distintas, numeradas correlativamente (R1-R67) y cerca de 50 frases de riesgo combinadas (Ver Anexo 2a). 1.8. - FRASES S (Seguridad) o CONSEJOS DE PRUDENCIA Las frases de seguridad o consejos de prudencia dan indicaciones sobre la manera adecuada de almacenar y manejar los productos químicos. Existen 62 frases distintas de seguridad numeradas correlativamente (S1-S62) y unas 40 frases de seguridad combinada (Ver Anexo 2b) 1.9. - INCOMPATIBILIDAD EN EL ALMACENAMIENTO Tan importante como manejar correctamente los productos químicos es almacenarlos adecuadamente. Desde el punto de vista de la toxicidad, aquellas sustancias que sean muy tóxicas deben ser almacenadas de forma que se limite su extensión tras una rotura accidental del recipiente. Es importante prestar especial atención en el caso de sólidos y líquidos volátiles ya que una de las vías de intoxicación más común en los laboratorios es la inhalatoria. Debe tenerse en cuenta además la posibilidad de que dos productos inocuos, mezclados dejen de serlo, o de que en ocasiones un producto aumente la toxicidad de otro. Hay sustancias cuyo efecto es acumulativo, por lo que exposiciones prolongadas a bajas dosis pueden ser muy peligrosas. Hay que asegurarse de que los recipientes que contienen este tipo de productos estén bien cerrados. En el momento de almacenar o de gestionar los envases de los productos o sustancias peligrosas, será necesario tener en cuenta las incompatibilidades entre los diferentes símbolos de peligrosidad que se indican en la etiqueta. En consonancia con lo anterior, tal y como se especifica en el cuadro adjunto, no deberemos almacenar juntos los productos inflamables con los productos tóxicos (ya que correremos el riesgo de inhalar sustancias tóxicas en caso de incendio), ni tampoco usar el mismo contenedor para guardar, hasta el momento de su gestión final, los envases de productos etiquetados con estos dos símbolos. En definitiva, la separación de los distintos productos y envases responde a la eliminación de riesgos basada en un criterio lógico y teniendo en cuenta la reactividad de las distintas sustancias. 12 1.10. - ELIMINACIÓN DE RESIDUOS Debido al peligro que suponen los residuos químicos para la salud y preservación del medio ambiente, se hace necesaria una adecuada eliminación de los mismos. Como norma general, los residuos se acumularán en recipientes que convenientemente etiquetados para ser dispuestos como ordena la ley, atendiendo a sus características químicas y toxicidad. Es importante recordar que los recipientes que los contienen también están clasificados como residuos. La información específica sobre un compuesto puede encontrarse en catálogos o solicitarse a las firmas que lo producen. Desde el punto de vista práctico, los residuos pueden clasificarse como: Residuos tóxicos y peligrosos: - Ácidos y disoluciones ácidas - Bases y disoluciones básicas - Residuos orgánicos no disolventes - Sales y disoluciones de sales - Aceites minerales 13 Residuos tóxicos y peligrosos:…(continuación) - Metales y disoluciones de metales - Disolventes orgánicos clorados - Disolventes orgánicos no clorados - Mercurio y sus derivados - Otros compuestos no clasificados Otros tipos de residuos: - Residuos radioactivos - Residuos biológicos peligrosos - Residuos biológicos asimilables a urbanos - Otros residuos asimilables a urbanos - Objetos cortantes y punzantes Referencias: - Bello J, López de Cerain A, Ezpeleta O, Jiménez A, Pérez C, Alvarez L (2000) Toxicología. Guía de Practicas, Newbook, Navarra - Cameán AM, Moreno IM, López-Artíguez M, Repetto G y Repetto M (2000) Preparación y realización de un programa de prácticas experimentales para asignaturas del Área de Toxicología: motivación positiva en el aprendizaje teórico-práctico de Toxicología. Instituto de Ciencias de la Educación, Universidad de Sevilla. - Repetto M (2001) Evolución, Estado Actual, Retos y Tendencias de la Toxicología al Iniciar el Milenio. CDROM. Area de Toxicología. Universidad de Sevilla. Sevilla ANEXOS NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO (Anexo 1) Generales • Las instalaciones deben ser adecuadas para prevenir accidentes y exposiciones • El acceso debe ser restringido. Nunca quedarse solo en el laboratorio • Disponer de información clara sobre operaciones de riesgo • Recordar siempre los riesgos físicos, químicos y biológicos, las vías de entrada de los mismos, y tratar de prevenir la exposición y accidentes Hábitos personales • Avisar si se padece alguna alergia. • Llevar recogidos los cabellos. • Es imprescindible el uso de la bata, manteniéndola abrochada. • No fumar, comer, beber ni aplicarse cosméticos, ni guardar alimentos ni bebidas en el laboratorio. • Es conveniente el uso de gafas protectoras. • Emplear guantes, mascarillas y bata desechable cuando se manipulen productos muy peligrosos, o cuando se prevea la posibilidad de exposición (polvos finos, aerosoles). • No colocar objetos personales en mesas de trabajo. 14 Realización de los experimentos • Trabaja siempre sobre la mesa de trabajo o en campana según se requiera. • Nunca adiciones agua sobre ácido, lo correcto es adicionar ácido sobre agua. • No toques con las manos ni degustes los productos químicos. •Al experimentar el olor de productos químicos, nunca coloques el producto o el frasco directamente en la nariz y evitar inhalar los productos químicos, sus polvos, vapores o aerosoles. Utilizar la vitrina de gases cuando sea necesario. • No pipetees con la boca. • Cuando estés manipulando frascos o tubos de ensayo, nunca dirijas la abertura en tu dirección o en la dirección de otras personas. • Presta atención cuando tengas que realizar procesos de calentamiento. • Ten cuidado para no quemarte al utilizar nitrógeno o CO2 líquidos, las válvulas del gas deben ser abiertas lentamente con las manos y nunca ser forzadas con martillos u otras herramientas, ni las dejes con presión cuando el cilindro de gas o la línea en tu mesa de trabajo no estén siendo usados. • Pon mucha atención en cuanto a la presencia de llamas abiertas u otras posibles fuentes de ignición. • Utiliza encendedores piezoeléctricos largos; no emplees cerillos ni encendedores de bolsillo. No dejes los mecheros encendidos si no se están utilizando. •La destilación de solventes, manipulación de ácidos y compuestos tóxicos y las reacciones que generen gases tóxicos son operaciones que deben ser realizadas en campanas con buen arrastre. •Siempre que sea posible, antes de realizar reacciones donde no conozcas totalmente los resultados, has una reacción en pequeña escala en la campana. •Al trabajar con reacciones peligrosas (peligro de explosión, generación de material tóxico, etc.) o cuya peligrosidad desconozcas procede de la siguiente forma: 1. Avisa a tus compañeros del laboratorio 2. Trabaja en una campana con buen arrastre, retirando todo tipo de material inflamable. Trabaja en un área limpia. 3. Usa protector acrílico. 4. Ten un extintor cerca y listo para ser usado. • No mezcles reactivos a menos que tengas la seguridad de que puede hacerse. • No llenes los tubos de ensayo más de dos centímetros por debajo del borde. En las valoraciones no llenes los recipientes por encima de la mitad de su capacidad. • Cierra las botellas inmediatamente con su tapón correspondiente. • Calienta los tubos de ensayo inclinados y utilizando pinzas. No dirijas hacia tí mismo ni hacia los demás, tubos de ensayo, matraces, etc. que estén calentándose o emitiendo vapores. • Utilizar gradillas y soportes. No llevar tubos de ensayo ni productos en los bolsillos de la bata. • Toma los tubos de ensayo con los dedos nunca con la mano. • No reintegres nunca reactivos a su recipiente de origen para no contaminarlo. No tomes reactivos en exceso. • Cuando se quiera hervir líquidos (p. ej. destilación), se deben calentar con plato poroso en su interior. • Si se debe calentar algún disolvente orgánico, se empleará manta o placa calefactora, nunca mechero. • Trata con delicadeza el material de vidrio, y con cuidado los equipos eléctricos y los gases a presión o vacío. • El empleo de material radioactivo exige autorización del manipulador y las instalaciones. • Si vas a utilizar animales, deberás hacerlo previa capacitación. 15 Preparación de soluciones • Limpia antes la balanza si estuviera sucia, y después de usarla. Usar una brocha o un papel, nunca soplar. • Pesar el reactivo sólido sobre papel no absorbente, de aluminio o directamente en un vaso de precipitados. Disolverlo en vaso de precipitados. Verter la disolución en un matraz aforado y enrasar con el disolvente. • Lavar inmediatamente la espátula • Los ácidos se añaden diluidos y muy lentamente, sobre las bases o el agua. Los agentes oxidantes se añaden diluidos y muy lentamente, sobre los agentes reductores, y viceversa. Para terminar • Al finalizar una reacción u operación, recoge los materiales, reactivos, equipos etc., evitando acumulaciones innecesarias. • Asegúrate de la desconexión de aparatos, agua, gases, etc. • Limpia el lugar de trabajo. Lava con mucha precaución todo el material de vidrio usado, que tendrá que ser enjuagado con agua destilada. • Elimina correctamente los residuos producidos. Se recomienda lo siguiente: - Los residuos de solventes de reacciones y de rotavapores deben ser colocados en frascos apropiados para ser tratados para descarte. Evita mezclar los solventes, para esto te sugerimos la siguiente separación: Solventes clorados, Hidrocarburos, Alcoholes y Cetonas, Éteres y Ésteres, Acetatos y Aldehidos. Siempre que sea posible indica también los porcentajes aproximados de los componentes, ya que este tipo de residuo acostumbra ser incinerado por empresas especializadas que exigen una descripción minuciosa del material que reciben. Verifica primero si es posible recuperar estos residuos en el laboratorio. - Los residuos acuosos ácidos o básicos deben ser neutralizados en el caño antes de descartados, y solo después de esto podrán ser descartados. Para el descarte de metales pesados, metales alcalinos y de otros residuos, consulta anticipadamente la bibliografía adecuada. - El uso de solución sulfocrómica o mezcla crómica para limpieza está siendo prohibido en la mayoría de laboratorios. En el caso de necesitar usarla nunca la deseches directamente en la tarja. • Por último, lavar las manos antes de abandonar el laboratorio y quitar la bata 16 RIESGOS ESPECIFICOS ATRIBUIDOS A SUSTANCIAS Y PREPARADOS PELIGROSOS (FRASES R) (Anexo 2a) - R1 Explosivo en estado seco. - R2 Riesgo de explosión por choque, fricción, fuego u otras fuentes de ignición. - R3 Alto riesgo de explosión por choque, fricción, fuego u otras fuentes de ignición. - R4 Forma compuestos metálicos explosivos muy sensibles. - R5 Peligro de explosión en caso de calentamiento. - R6 Peligro de explosión, en contacto o sin contacto con el aire. - R7 Puede provocar incendios. - R8 Peligro de fuego en contacto con materias combustibles. - R9 Peligro de explosión al mezclar con materias combustibles. - R10 Inflamable. - R11 Fácilmente inflamable. - R12 Extremadamente inflamable. - R14 Reacciona violentamente con el agua. - R15 Reacciona con el agua liberando gases extremadamente inflamables. - R16 Puede explosionar en mezcla con sustancias comburentes. - R17 Se inflama espontáneamente en contacto con el aire. - R18 Al usarlo pueden formarse mezclas airevapor explosivas/inflamables. - R19 Puede formar peróxidos explosivos. - R20 Nocivo por inhalación. - R21 Nocivo en contacto con la piel. - R22 Nocivo por ingestión. - R23 Tóxico por inhalación. - R24 Tóxico en contacto con la piel. - R25 Tóxico por ingestión. - R26 Muy tóxico por inhalación. - R27 Muy tóxico en contacto con la piel. - R28 Muy tóxico por ingestión. - R29 En contacto con agua libera gases tóxicos. - R30 Puede inflamarse fácilmente al usarlo. - R31 En contacto con ácidos libera gases tóxicos. - R32 En contacto con ácidos libera gases muy tóxicos. - R33 Peligro de efectos acumulativos. - R34 Provoca quemaduras. 17 - R35 Provoca quemaduras graves. - R36 Irrita los ojos. - R37 Irrita las vías respiratorias. - R38 Irrita la piel. - R39 Peligro de efectos irreversibles muy graves. - R40 Posibilidad de efectos irreversibles. - R41 Riesgo de lesiones oculares graves. - R42 Posibilidad de sensibilización por inhalación. - R43 Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. - R44 Riesgo de explosión al calentarlo en ambiente confinado. - R45 Puede causar cáncer. - R46 Puede causar alteraciones genéticas hereditarias. - R48 Riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada. - R49 Puede causar cáncer por inhalación. - R50 Muy tóxico para los organismos acuáticos. - R51 Tóxico para los organismos acuáticos. - R52 Nocivo para los organismos acuáticos. - R53 Puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. - R54 Tóxico para la flora. - R55 Tóxico para la fauna. - R56 Tóxico para los organismos del suelo. - R57 Tóxico para las abejas. - R58 Puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente. - R59 Peligroso para la capa de ozono. - R60 Puede perjudicar la fertilidad. - R61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto. - R62 Posible riesgo de perjudicar la fertilidad. - R63 Posible riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto. - R64 Puede perjudicar a los niños alimentados con leche materna. - R65 Nocivo: si se ingiere puede causar daño pulmonar. - R66 La exposición repetida puede provocar sequedad o formación de grietas en la piel. - R67 La inhalación de vapores puede provocar somnolencia y vértigo CONSEJOS DE PRUDENCIA RELATIVOS A SUSTANCIAS Y PREPARADOS PELIGROSOS (FRASES S). (Anexo 2b) - S1 Consérvese bajo llave. - S2 Manténgase fuera del alcance de los niños. - S3 Consérvese en lugar fresco. - S4 Manténgase lejos de locales habitados. - S5 Consérvese en (líquido apropiado a especificar por el fabricante). - S6 Consérvese en…(Gas inerte a especificar por el fabricante) - S7 Manténgase el recipiente bien cerrado. - S8 Manténgase el recipiente en lugar seco. - S9 Consérvese el recipiente en lugar bien ventilado. - S12 No cerrar el recipiente herméticamente. - S13 Manténgase lejos de alimentos, bebidas y piensos. - S14 Consérvese lejos de… (Materiales incompatibles a especificar por el fabricante). - S15 Conservar alejado del calor. - S16 Conservar alejado de toda llama o fuente de chispas. No fumar. - S17 Manténgase lejos de materiales combustibles. - S18 Manipúlese y ábrase el recipiente con prudencia. - S20 No comer ni beber durante su utilización. - S21 No fumar durante su utilización. - S22 No respirar el polvo. - S23 No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles [denominación(es) adecuada(s) a especificar por el fabricante]. - S24 Evítese el contacto con la piel. - S25 Evítese el contacto con los ojos. - S26 En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. - S27 Quítese inmediatamente la ropa manchada o salpicada. - S28 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con. (Productos a especificar por el fabricante). - S29 No tirar los residuos por el desagüe. 18 - S30 No echar jamás agua a este producto. - S33 Evítese la acumulación de cargas electrostáticas. - S35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles. - S36 Úsese indumentaria protectora adecuada. - S37 Úsense guantes adecuados. - S38 En caso de ventilación insuficiente, úsese equipo respiratorio adecuado. - S39 Úsese protección para los ojos/la cara. - S40 Para limpiar el suelo y los objetos contaminados por este producto, úsese… (a especificar por el fabricante). - S41 En caso de incendio y/o de explosión no respire los humos. - S42 Durante las fumigaciones/pulverizaciones, úsese equipo respiratorio adecuado. [Denominación(es) adecuada(s) a especificar por el fabricante]. - S43 En caso de incendio, utilizar. (los medios de extinción los debe especificar el fabricante).(Si el agua aumenta el riesgo, se deberá añadir: "No usar nunca agua"). REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA DE SEGURIDAD EN EL MANEJO DE PRODUCTOS QUÍMICOS. Contesta las siguientes preguntas: ¿Es inocuo un producto etiquetado sin pictogramas? ¿Cuáles son los dos factores fundamentales que condicionan la exposición? ¿Qué significa la notación Xn? Definir el significado de los siguientes pictogramas:? ¿Qué significa la frase de seguridad S51? ¿Cuál es la clave de riesgo que identifica a los compuestos capaces de causar quemaduras? ¿Cómo se clasifica un compuesto con una DL50 de 300 mg/Kg? ¿Cuáles son los riesgos de un producto etiquetado con R18? ¿Por qué no debe fumarse en presencia de compuestos químicos? ¿Qué indica el símbolo ? ¿Qué precauciones deben tomarse para su manejo? ¿Qué claves identifican a la frase de riesgo siguiente? “Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por inhalación, contacto con la piel e ingestión” ¿En qué contenedor de residuos debe depositarse un frasco con restos de cloroformo? ¿Cuál es el significado de Xi? ¿Qué indican los consejos de prudencia S3/9/49? 19 ¿Cuál es la principal vía de entrada al organismo de contaminantes en el laboratorio? Dibuja el pictograma correspondiente a comburente. ¿Qué precauciones de manejo deben tomarse para un compuesto etiquetado con el consejo de seguridad S18? ¿Qué significa ? ¿Puede tirarse por el desagüe un producto cuya etiqueta no tiene pictogramas, frases R ni S? Justifica tu respuesta. 20 PRÁCTICA No. 3 VÍAS DE ADMINISTRACIÓN Y MANEJO DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN I. TEMA Manejo de animales en modelos de toxicidad in vivo. II. OBJETIVO GENERAL Mostrar al alumno de un modo general las formas de marcaje y manejo de animales de laboratorio de uso más frecuente e identificar y practicar las distintas vías de administración de xenobióticos en animales de laboratorio. III. INTRODUCCIÓN Los modelos experimentales son herramientas biológicas que han permitido el estudio de procariotes (bacterias y otros microorganismos) y eucariotes (animales y vegetales), facilitando el conocimiento de los procesos de la vida tanto naturales como patológicos, por lo cual, es adecuado conocer su manejo, respetando los derechos de los animales de acuerdo a los tratados de Helsinki. La investigación en el área biomédica demanda gran cantidad de animales de laboratorio con características biológicas específicas y en la oportunidad solicitada por el investigador. Para lograr el cumplimiento de esta tarea, el investigador diseña y opera métodos reproductivos acordes con las necesidades propias de la comunidad investigadora. Los resultados de un experimento dependen en gran parte del manejo de los animales, siendo vital la participación del médico veterinario, al grado que un mal manejo puede invalidar un experimento. También es importante señalar que existen otros factores que pueden alterar el resultado de un experimento entre ellos destacan la constitución física y el estado inmunológico del animal, de tal forma que el manejo adecuado de los sujetos de experimentación es la parte medular de un protocolo experimental pues el resultado depende de factores subjetivos y objetivos que actúan en forma diferente en cada sujeto de experimentación. Entre los animales más utilizados en una investigación y por ende los mayormente reproducidos en los bioterios, son el ratón, rata, conejo, hamster, cuyo y chimpancés. Otros animales que se usan en menor medida como modelos experimentales son: gato, perro, peces, tortugas, cerdos, aves en general, ranas hurones, cabras, ovejas, bovinos, equinos, chinchilla y armadillo. Además es importante el marcaje que facilite hacer su diferenciación en cualquier momento, en especial cuando se hacen experimentos crónicos en los que se prolonga su observación por tiempo más o menos largo. Todos los métodos utilizados deben gozar de selectividad, aplicación rápida y ser preferentemente indoloros. En ocasiones cuando lo requiere se debe aplicar anestesia local. En las últimas décadas se ha podido apreciar un incremento considerable en el interés y valoración de la vida animal en los países más desarrollados, fenómeno que se está generalizando en Latinoamérica y Asia. Las revistas científicas internacionales exigen que los investigadores firmen un documento donde se garantice que las experiencias han sido efectuadas respetando las normas internacionales existentes, por ejemplo la declaración universal de los derechos de los animales (UNESCO, 1996) y la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NRC, 1996). La firma 21 de este documento significa aseverar que los trabajos han sido previamente autorizados por comités de ética institucionales y que todo el personal que interviene en el trabajo en relación con los animales de laboratorio ha aprobado previamente un curso de capacitación en el tema. En México, la Norma Oficial Mexicana sobre el manejo animal (NOM-062-ZOO-1999) es vigilada por la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural, así como por los Gobiernos Estatales y del Distrito Federal. Las responsabilidades del investigador para el cuidado de los animales incluyen: El diseño y realización de los procedimientos con base en su relevancia para la salud humana y animal, el avance del conocimiento y el bienestar de la sociedad El uso de las especies, calidad y número apropiados de animales El evitar o reducir al mínimo la incomodidad, estrés y dolor. El uso apropiado de sedación, analgesia y anestesia El establecimiento de metas y objetivos en el experimento Brindar un manejo apropiado a los animales, dirigido y realizado por personas calificadas La conducción de experimentos en animales vivos sólo por, o bajo la, estricta supervisión de personas calificadas y con experiencia. La administración de un xenobiótico (trátese de un fármaco o agente tóxico) obliga a tener en cuenta los factores que modifican su actividad que entre otros pueden ser: su dosificación, la frecuencia de administración, la distribución del fármaco en el organismo, sus antagonismos tanto químicos como farmacológico, su efecto de potenciación, su tolerancia específica, la edad del animal y la vía de administración. Este último factor es quizá el más importante de todos, ya que, de no ser elegida una vía de administración correcta, la actividad del agente administrado puede atenuarse, o a veces nulificarse y en algunas ocasiones puede producir efectos tóxicos o farmacológicos exagerados que resulten lesivos. Las vías de administración de agentes xenobióticos son las rutas de entrada al organismo, las cuales influyen en la latencia, intensidad y duración del efecto, por esta razón es de suma importancia conocer las ventajas y desventajas de cada una para poder elegir una vía de administración adecuada en una situación particular. Las diferentes vías de administración de un xenobiótico dependen de su composición química y en algunas ocasiones de objetivo terapéutico o tóxico que se persigue, estas se pueden clasificar en: Enterales: Los xenobióticos son introducidos al organismo por los orificios naturales del cuerpo. Referente o relacionada al intestino o al tracto gastrointestinal (Ej.: oral, sublingual, rectal) Parenterales: Los xenobióticos para ser introducidos al organismo, requiere la utilización de una aguja hueca hipodérmica, se crea un orificio no natural en el cuerpo. Diferente o paralelo al intestino o al tracto gastrointestinal. (ej.: intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, intraarticular, intravascular, intrapleural, intravenosa, intraosea, intraarterial, intratecal, intracardiaca, intralinfática, etc.) 22 IV. METODOLOGÍA MATERIAL BIOLÓGICO, EQUIPO Y REACTIVOS Ratas (1 por equipo) 1 Trapo limpio o franela Guantes de látex Jeringa para insulina Solución fisiológica inyectable Sonda intragástrica Observar com atención y posteriormente practicar las vias de administración parenterales mostradas por lós profesores de la asignatura, siguiendo atentamente lãs instrucciones para el buen manejo de animales de laboratório. V. CUESTIONARIO 1. ¿Por qué es importante saber manejar los animales de laboratorio? 2. ¿Cuáles son los cuidados ambientales a considerar en animales de experimentación? 3. ¿Cómo se define un animal no tradicional de experimentación (ANTE)? 4. Investiga cómo se debe realizar la disposición final de los animales de experimentación 5. ¿Cuál es la vía más común para administrar xenobióticos? ¿Por qué? 6. Menciona tres vías de administración de aplicación parenteral. 7. ¿Cómo afecta el efecto del primer paso la biodisponibilidad de un xenobiótico? 8. Menciona en que vía de administración se evita el proceso de absorción del xenobiótico? ¿Por qué? VI. BIBLIOGRAFÍA Leader, R. W., and D. Stark. 1987. The importance of animals in biomedical research. Perspect. Biol. Med. 30(4):470-485 NRC (National Research Council). In press. Occupational Health and Safety in the Care and Use of Research Animals. A report of the Institute of Laboratory Animal Resources Committee on Occupational Safety and Health in Research Animal Facilities. Washington, D.C.: National Academy Press. Quezada-Domínguez Abraham, 1997. Introducción al manejo de animales de laboratorio: roedores y pequen̋as especies. Editoriales de la Universidad Autónoma de Yucatán, Centro de Investigaciones Regionales “Dr. Hideyo Noguchi”, Universidad de Ciencias Biomédicas . pp: 121 y 123. http://books.google.com.mx/books?id=S5SdmSLsZL4C&pg=PA121&lpg=PA121&dq=aguja+de+intubaci%C3 %B3n+intragastrica+rata&source=bl&ots=9Zwv9nD27R&sig=AJxY3YBEGS4yQzvLX4WDacbsySs&hl=es&ei= O6KATqS_MuissQKBo9Ai&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=1&ved=0CCoQ6AEwAA#v=onepage&q &f=false 23 PRÁCTICA No. 4 EXPOSICION AGUDA DE RATAS WISTAR A XENOBIÓTICOS I. TEMA Manejo de animales en modelos de toxicidad in vivo. II. OBJETIVO GENERAL Observar los efectos del etanol sobre el SNC y la interacción de éste xenobiótico con el fármaco disulfiram en una especie roedora tras una exposición aguda. III. INTRODUCCIÓN Las expresiones categorías de toxicidad y clasificación de la toxicidad se utilizan a veces en el ámbito de las actividades de regulación. Las categorías de toxicidad se refieren a una calificación arbitraria de las dosis o niveles de exposición que causan efectos tóxicos. Se habla así de “sumamente tóxico”, “muy tóxico”, “moderadamente tóxico”, etc. Lo más frecuente es que estas expresiones se apliquen a la toxicidad aguda. La clasificación de la toxicidad se refiere a la agrupación de las sustancias químicas en categorías generales conforme a su efecto tóxico principal. Se habla así de sustancias alergénicas, neurotóxicas, carcinógenas, etc. Esta clasificación puede ser útil en el ámbito administrativo como advertencia y como información. La relación dosisefecto es la relación entre la dosis y el efecto a nivel individual. Un incremento de la dosis puede incrementar la intensidad de un efecto o su gravedad. Hay algunos efectos tóxicos, como la muerte o el cáncer, que no tienen grados, sino que son efectos “de todo o nada”. Sin embargo, los efectos pueden ser sistémicos que son efectos tóxicos que se producen en diversos órganos y tejidos al mismo tiempo, aunque siempre hay un órgano que resulta más dañado o alterado que otros y aquí es donde se habla de un órgano diana o blanco. Existen otro tipo de efectos denominados agudos y crónicos, los primeros se producen tras una exposición limitada y poco tiempo después de ésta (de segundos hasta días), y pueden ser reversibles o irreversibles; mientras que los segundos se generan tras una exposición prolongada (meses, años, decenios) y/o persisten después de que haya cesado la exposición. La exposición aguda es una exposición de corta duración, mientras que la exposición crónica es una exposición de larga duración (a veces toda la vida). Toxicología del etanol: A excepción del agua, la mayor exposición a cualquier tipo de solventes es la del etanol. No solo es usado como un solvente, pues también es altamente consumido por un gran número de personas como uno de los componentes de las bebidas alcohólicas. Es bien absorbido en el tracto gastrointestinal. Los pulmones y riñones excretan un 5-10 %; el resto es metabolizado en el hígado. El alcohol (etanol) se metaboliza esencialmente por oxidación, transformándose en acetaldehído. En las situaciones de consumo oral (las más habituales), este proceso metabólico tiene lugar en el hígado y se halla principalmente mediado por el enzima alcohol deshidrogenada (ADH) (Petersen y cols., 1983). En un segundo paso, el acetaldehído formado del metabolismo del etanol es transformado en acetato por medio del enzima aldehído deshidrogenada (ALDH) que se encuentra en el hígado. El etanol puede afectar al sistema nervioso central, provocando estados de euforia, desinhibición, mareos, somnolencia, confusión, ilusiones (como ver doble o que todo se mueve de forma 24 espontánea). Al mismo tiempo, baja los reflejos. Con concentraciones más altas ralentiza los movimientos, impide la coordinación correcta de los miembros, pérdida temporal de la visión, etc. En ciertos casos se produce un incremento en la irritabilidad del sujeto intoxicado como también en la agresividad; en otra cierta cantidad de individuos se ve afectada la zona que controla los impulsos, volviéndose impulsivamente descontrolados y frenéticos. Estas alteraciones funcionales usualmente son reversibles, pero puede producir lesiones en todos los tejidos según sea la dosis ingerida y la duración de la acción del alcohol. Finalmente, a dosis muy altas conduce al coma y puede provocar muerte. La resistencia al alcohol no parece aumentar en las personas adultas, de mayor peso y de menor altura, mientras que los niños son especialmente vulnerables. Se han comunicado casos de bebés que murieron por intoxicación debida a la inhalación de vapores de etanol tras haberles aplicado trapos impregnados de alcohol. La ingesta en niños puede conducir a un retardo mental agravado o a un subdesarrollo físico y mental. También se han realizado estudios que demuestran que si las madres ingerían alcohol durante el embarazo, sus hijos podían ser más propensos a tener el síndrome de alcohólico fetal. El disulfiram es un fármaco usado para ayudar en el tratamiento del alcoholismo crónico, produciendo una reacción aguda al consumo de etanol. Este fármaco impide la acción de la enzima acetaldehído deshidrogenasa, por lo que bloquea el metabolismo del alcohol etílico, acumulándose acetaldehído el cual ocasiona síntomas molestos como calor, vasodilatación, taquicardia, palpitaciones, náuseas, vómitos, sudoración, hipotensión arterial, etc. IV. METODOLOGÍA MATERIALES Y REACTIVOS Material 2 ratas hembra y 2 ratas macho. 1 ratones hembra y 1 ratones macho Sonda gástrica. Jeringas para insulina Reactivos Etanol absoluto Disulfiram tabletas 500mg Acetaldehido DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. No alimentar a 2 de las ratas 8-10 hrs previas al estudio. Dejar agua ad libitum. 2. Distribuir aleatoriamente a los animales, marcarlos y pesarlos. Anotar el peso de cada uno en la siguiente tabla. XB dosis/vía 25 Testigo Etanol Etanol Disulfiram Etanol Etanol Acetaldehido 5ml/kg/i.m. 10ml/kg/i.g. 90 mg/kg/i.g. 5ml/kg/i.m. 10ml/kg/i.g 0.5ml/kg/i.m. Sin alimento Sin + Con Con alimento Etanol i.m. alimento alimento Rata X X X X X X X Hembra Rata X X X X X X X Macho 3. Los animales de experimentación serán administrados por la vía indicada con las soluciones proporcionadas por el profesor y se observarán los signos tóxicos que se presenten, registrar el tiempo en que se presentan, el número de animales muertos si se presentara el caso. 4. Después de la administración, anote el inicio de cada uno de los siguientes signos propuestos e indica la frecuencia con la que se presenta el efecto. SIGNOS Testigo Etanol i.m. Sin alimento Etanol Etanol Etanol Disulfiram Acetaldeh i.m. i.g. i.g i.g. ido i.m Con Sin Con + alimento alimento alimento Etanol i.m. Irritabilidad Excitabilidad Pasividad Depresión Anestesia Ataxia Anestesia Diarrea Urinación Defecación Piloerección Convulsiones Alteraciones pupilares Frecuencia cardiaca y respiratoria + leve; ++ moderado; +++ severo; ++++ muy severo; - no se observó IV. CUESTIONARIO 1. Describe el mecanismo de acción de cada uno de los xenobióticos empleados en la práctica. 2. Describe el metabolismo del etanol, indicando los factores y enzimas que participan en la oxidación y los metabolitos producidos. 26 3. ¿Cómo influyen las características fisicoquímicas de cada uno de los xenobióticos utilizados en la práctica en la respuesta tóxica presentada por los animales? 4. ¿Qué factores influyen en la respuesta del animal hacia un xenobiótico? 5. Realiza una lista de bebidas alcohólicas con su respectivo porcentaje de etanol. ¿cuál de las bebidas de su lista cree podrían alterar el SNC si un individuo adulto consumiera 250 mL con y sin alimento? 6. El alcohol etílico es el producto mayoritario de las bebidas alcohólicas; sin embargo, en éstas existen componentes minoritarios. Menciona algunos ejemplos y di si consideras que podrían potencializar o atenuar el efecto del etanol. 7. Cita un instrumento de regulación directa (Norma) que regula y garantiza que las bebidas alcohólicas que se comercialicen en territorio nacional cumplan con los requisitos necesarios que garanticen la seguridad e información comercial dirigida al consumidor. 8. Menciona la manera de tratar médicamente a un paciente con intoxicación alcohólica y a uno que padece alcoholismo crónico IV. BIBLIOGRAFÍA 1. Córdoba D, Cadavid S, Ramos JI. Inhibidores de colinesterasas. Toxicología. Córdoba, D. 4a Ed., Manual Moderno, Bogotá, 2001. 2. Eaton DL, Klaassen CD. Principles of Toxicology. Casarett & Doull’s Toxicology. The basic science of poisons. Klaassen, C.D. 5th eEd., McGraw Hill, New York, 1996. 3. Mayero-Franco L y Mencías-Rodríguez E. Manual de Toxicología Básica. Díaz de Santos SA, España, 2000. 4. http://sinat.semarnat.gob.mx/dgiraDocs/legamb/Metil%20Paration%20450%20CS.pdf 5. http://www.cnpml.org.sv/SAICM/public/documetos/HojasDeSeguridad/Hoja_de_Seguridad_d el_Paration_Metil.pdf 6. http://es.wikipedia.org/wiki/Etanol 27 PRACTICA N° 5 EFECTO HEPATOTÓXICO DEL TETRACLORURO DE CARBONO I. TEMA Toxicodinamia II. OBJETIVO GENERAL Observar los efectos directos de un compuesto administrado bajo un régimen de exposición subcrónica. III. INTRODUCCIÓN El tetracloruro de carbono es una de las sustancias que causan efectos tóxicos considerables en el hígado; si bien es claro que la mayoría de las sustancias son metabolizadas a nivel de éste órgano, que por su constitución está encargado de transformar las sustancias que llegan a él, ya sea de origen externo o de los tejidos extrahepáticos como producto de su metabolismo; también es cierto que muchas de estas sustancias tienen afinidad por el hígado, causando serios problemas patológicos: como es el caso del tetracloruro de carbono. Los órganos más afectados por la toxicidad del tetracloruro de carbono son el hígado y los riñones. En experimentos con ratones y ratas se ha demostrado que el tetracloruro de carbono puede inducir la formación de hepatomas y carcinomas hepatocelulares. Dado que las dosis que inducían tumores hepáticos eran más altas que las que inducían toxicidad celular, es probable que la capacidad cancerígena del tetracloruro de carbono sea consecuencia de sus efectos hepatotóxicos. Según los datos disponibles, se puede considerar que el tetracloruro de carbono no es un compuesto genotóxico. El CIIC ha clasificado el tetracloruro de carbono como posiblemente cancerígeno para el ser humano (Grupo 2B): hay pruebas suficientes de que es cancerígeno para animales de laboratorio, pero no hay pruebas suficientes sobre su efecto en el ser humano. RIESGO DE INHALACIÓN Por evaporación de esta sustancia a 20ºC, se puede alcanzar muy rápidamente una concentración nociva en el aire. EFECTOS DE EXPOSICIÓN DE CORTA DURACIÓN La sustancia es irritante ocular. Puede causar efectos en el sistema nervioso central, dando lugar a pérdida del conocimiento. El tetracloruro de carbono causa efectos nocivos al hígado y riñón. Se recomienda vigilancia médica. EFECTOS DE EXPOSICIÓN PROLONGADA O REPETIDA El contacto prolongado o repetido con la piel puede causar dermatitis. Esta sustancia es posiblemente carcinógena para los seres humanos. Los métodos que pueden utilizarse para evidenciar los efectos tóxicos son: – Bioquímicos cualitativos y cuantitativos. - Bioquímicos - Histopatológicos 28 OBJETIVO: MATERIALES Ratas macho sanas con 1 tubo de ensaye 1 gradilla para tubos 2 jeringas de 5ml 2 cajas petri 3 pipetas de 1.5 y 10 ml Gradilla portapipetas 2 sondas gástricas delgadas 2 vasos de precipitados 1 par de guantes 1 balanza 1 cubrebocas un peso aproximado de 200-250 g. (1 por equipo) REACTIVOS 2 ml de tatracloruro de carbono 5 ml de aceite vegetal 100% puro 30 ml de solución salina fisiológica 30 ml de agua destilada EQUIPOS 1 equipo de disección PROCEDIMIENTO Administración del tóxico Cada grupo de trabajo deberá contar con una animal de experimentación, a uno de ellos se le administrará, por vía oral (sonda intragástrica), una mezcla de tetracloruro de carbono en aceite vegetal a una dilución de 1/5 (v/v) en aceite vegetal (cacahuate u olivo), y a una dosis de 0.4 ml de tetracloruro puro por kg de peso del animal. La administración se realizará por vía intragástrica 24, 48, 72 y 96 horas antes del sacrificio. Al otro animal (control) se le administrará, por vía oral, el mismo volumen total administrado al animal problema, pero solo de aceite vegetal y en los mismos intervalos de tiempo. En ambos casos se empleará una sonda delgada: - Extraer sangre del animal antes del sacrificio - Observación microscópica del hígado - Aislar el hígado y vesícula biliar - Lavar con solución salina fisiológica Durante la práctica 1.- Se extraen muestras de sangre de ambos ejemplares, aproximadamente 3 ml, que servirán para calcular el tiempo de coagulación. Se emplean tubos de ensaye. 29 2.- Luego los ejemplares se sacrifican por decapitación y se obtienen los hígados para observaciones macroscópicas directas y la comparación respectiva. Tiempo de Coagulación 1.-Tomar aproximadamente 3 ml de sangre. La sangre deberá extraerse con sumo cuidado, evitando la estasis. Se empieza a contar el tiempo desde el momento en que la sangre penetra en la jeringa. 2.- Se preparan dos tubos de 11 mm de diámetro interior, previamente enjuagados con solución salina normal y en cada uno se coloca 1 ml de sangre. 3.- Colóquese los tubos en una gradilla y después de tres minutos inclínese el primer tubo para observar el estado de fluidez. Esta observación se repite cada 30 seg. El punto final es el momento en que se forma un coagulo firme. CUESTIONARIO 1.- Explicar el mecanismo de formación de hígado graso por intoxicación con tetracloruro de carbono y describir las alteraciones bioquímicas que se presentan. 2.- Describir las características fisicoquímicas del tetracloruro de carbono y de otras dos sustancias que sean consideradas hepatotóxicas 3.- refiere algunas medidas de tratamiento en casos humanos de hígado graso. BIBLIOGRAFIA: IPCS, 1999: Carbon tetrachloride. Ginebra (Suiza), Organización Mundial de la Salud, Programa Internacional de Seguridad de las Sustancias Químicas (n.º 208 de la serie de la OMS Criterios de Salud Ambiental). 30 PRACTICA No. 6 ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON SEMILLAS DE LECHUGA (Lactuca sativa L.) 1. INTRODUCCIÓN El efecto tóxico o la respuesta tóxica es cualquier cambio en el funcionamiento normal del organismo que ha sido producido por la exposición a una sustancia tóxica, para este efecto se consideran solamente los cambios irreversibles o que permanecen un periodo prolongado después de la exposición. Para el efecto de toxicología ambiental las exposiciones se clasifican en exposiciones crónicas, subcrónicas y agudas. Las exposiciones crónicas duran entre el 10 % y el 100% de la vida del organismo, las exposiciones crónicas son menores al 10% del periodo vital y las exposiciones agudas suceden en un solo evento y abarcan periodos cortos como de 24 a 120 horas (1). El objetivo de realizar pruebas de toxicidad aguda es identificar el potencial toxicológico de compuestos químicos ya sean comerciales o presentes en el ambiente. Este tipo de pruebas son más factibles de hacer debido a que el tiempo de exposición es corto. El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba estática de toxicidad aguda (120 horas de exposición) en el que se pueden evaluar los efectos fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento. Como puntos finales para la evaluación de los efectos fitotóxicos, se determina la inhibición en la germinación y la inhibición en la elongación de la radícula y del hipocotilo (Figura 1). Es importante destacar que durante el período de germinación y los primeros días de desarrollo de la plántula ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de una sustancia tóxica puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por lo tanto una etapa de gran sensibilidad frente a factores externos adversos. Por otra parte, muchas de las reacciones y procesos involucrados son generales para la gran mayoría de las semillas, por lo que la respuesta de esta especie y los datos obtenidos a partir de la aplicación de esta prueba son en gran medida representativos de los efectos en semillas o plántulas en general. El éxito o aptitud de una plántula para establecerse en un ambiente determinado es de gran importancia para garantizar la supervivencia de la especie. La evaluación del desarrollo de la radícula y del hipocotilo, constituyen indicadores representativos para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la planta. A diferencia de la prueba tradicional de germinación de semillas, la evaluación del efecto en la elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas permite ponderar el efecto tóxico de compuestos solubles presentes en niveles de concentración tan bajos que no son suficientes para inhibir la germinación, pero que sin embargo pueden retardar o inhibir completamente los procesos de elongación de la radícula o del hipocotilo, dependiendo ello del modo y sitio de acción del compuesto. De esta manera, la inhibición en la elongación de la radícula e hipocotilo constituyen 31 indicadores subletales muy sensibles para la evaluación de efectos biológicos en vegetales, aportando información complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la germinación. Este ensayo puede ser aplicado para la evaluación de la toxicidad de compuestos puros solubles, de aguas superficiales (lagos, ríos), aguas subterráneas, aguas para consumo humano, aguas residuales domésticas e industriales, además de lixiviados de suelos, sedimentos, lodos u otras matrices sólidas (Bowers et al, 1997; Cheung et al, 1989; Dutka, 1989). A diferencia de otras pruebas en las que se consideran algas o plantas acuáticas sumergidas como organismo de diagnóstico, el bioensayo con semillas permite evaluar la fitotoxicidad de muestras coloreadas o con elevada turbiedad de manera directa y sin necesidad de filtración previa, reduciéndose así las interferencias debidas al pretratamiento y simplificando el procedimiento de prueba. Figura 1. Proceso de germinación y morfología de la semilla y la plántula de lechuga Lactuca sativa L. 2. OBJETIVO Los alumnos evaluarán los efectos fitotóxicos de una solución que contiene un elemento contaminante, en el proceso de germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas de lechuga (Lactuca sativa L.) durante los primeros días de crecimiento. 3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS *Semillas de lechuga de la especies L. sativa L variedad mantecosa Cajas Petri de 100 mm de diámetro Matraces aforados de 50 mL Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL Regla u otro elemento de medición Pinzas Toallas de papel Bolsas plásticas **Papel de filtro Whatman No. 3 (o equivalente), 90 mm de diámetro. 32 *Las semillas de lechuga se adquieren en establecimientos locales, procurando que sean semillas sin ningún tratamiento (sin fungicidas o plaguicidas), con buen poder germinativo y baja variabilidad en la elongación de la radícula e hipocotilo. **El papel de filtro que se seleccione como sustrato de germinación debe tener las siguientes características: trama amplia y porosa que asegure una buena capacidad de retención de líquido; resistencia de la fibra del papel para que las radículas crezcan por su superficie sin atravesarlo, situación que dificultaría la remoción de las plántulas sin dañarlas; ausencia de residuos tóxicos (por ejemplo, blanqueadores; y que no promueva el desarrollo de hongos (no asociados a las semillas). 4. METODOLOGÍA De acuerdo al esquema de la figura 2, el procedimiento del ensayo de toxicidad que realizarás, deberá seguir los pasos enlistados: Colocar en cada una de 6 cajas Petri numeradas (C1 …..C6) un disco de papel filtro. Colocar en las cajas 5ml de las siguientes diluciones: (evitando que se formen bolsas de aire). C1. Control negativo1: agua dura reconstituida C2. Control negativo 2: agua de crecimiento. C3. Control positivo: 15 mg/l de CuSO4 o ZnCl2 C4. Solución problema 1: 2,5mg/l de CuSO4 o ZnCl2 C5. Solución problema 2: 5mg/l de CuSO4 o ZnCl2 C6. Solución problema 3: 10 mg/l de CuSO4 o ZnCl2 33 Etiquetar cada caja con los siguientes datos: solución, fecha y hora de inicio y término, materia, grupo y equipo. Con la ayuda de una pinza colocar 20 semillas en cada caja, uniformemente distribuidas en toda la caja. Tapar las cajas. Colocar las cajas en bolsas de plástico negras, para evitar la pérdida de agua por evaporación y para no inhibir la germinación, debido a que las semillas son fotoblásticas negativas. Incubar a 22 °C durante 120 horas. Realizar 3 repeticiones para cada ensayo. Figura 2. Esquema general del procedimiento de prueba de toxicidad con semillas de lechuga Lactuca sativa L. 5. RESULTADOS El efecto medido en este bioensayo es la inhibición de la elongación de la radícula, hipocotilo y de la germinación (Figura 2). Como resultado final se espera obtener la CE50 o CI50 o % de inhibición. Los valores serán aceptados si el porcentaje de germinación es superior al 90% en el control negativo. 34 I. Observar cuidadosamente cada caja y anotar cualquier indicador de fitotoxicidad como necrosis, pelos poco desarrollados, radículas con crecimiento ensortijado. La necrosis se manifiesta como manchas de color pardas, blancas o marrones. II. Utilizando una regla medir la longitud de la radícula y del hipocotilo de casa plántula. III. La medida de la elongación de la radícula se considera desde el nudo hasta el ápice radicular. Antes de cada medición se recomienda congelar las cajas y descongelarlas conforme se van midiendo, el objetivo de la congelación y la descongelación es obtener las plántulas menos rígidas. La medida de elongación del hipocotilo se considera desde el nudo hasta el sitio de inserción de los dos cotiledones. 6. EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para la expresión de resultados se realizarán los siguientes cálculos: I. Promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas de cada repetición. II. Porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula y del hipocotilo con el promedio de elongación para cada dilución respecto del promedio de elongación del control negativo III. Porcentaje de inhibición de la germinación IV. Con los datos anteriores realizar una gráfica dosis-respuesta, colocando en el eje de las ordenadas el porcentaje de inhibición y en el eje de las abscisas la concentración. Bibliografía: Peña E. Carlos, Dean E. Carter y Ayala-Fierro Felix. 2001. Toxicología Ambiental: Evaluación de Riesgos y Restauración Ambiental. Distribuido en internet vía Southwest Hazardous Waste Program website http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/. 35 PRACTICA No. 7 BIOENSAYO DE TOXICIDAD POR CONTACTO DE LOMBRIZ DE TIERRA (Eisenia foetida) EN PAPEL FILTRO CONTAMINADO CON Cr INTRODUCCIÓN Los bioensayos con lombrices son ampliamente reconocidos como prueba para evaluar la toxicidad de suelos contaminados (Dorn et al., 1998; Wilson et al., 2002). La lombriz más utilizada en México ha sido Eisenia en sus especies foetida y andrei, las cuales pertenecen a la familia Lumbricidae. Estas especies de lombriz son exógenas en México, pero de amplia distribución, fácil manejo y cultivo (Fragoso, 2002). Su principal característica morfológica es la presencia de segmentos externos e internos en su cuerpo, son hermafroditas y cuando son adultas se observa una protuberancia epidérmica denominada clitelo, en el que se forman los capullos en los cuales son depositados los huevos (Santamaría, 1996). Esta especie se desarrolla bien a pH de 5 a 7 y a temperaturas de 20 a 28 ºC (Ramírez- Romero, 2008). El ensayo completo incluye dos clases de pruebas toxicológicas: 1) prueba por contacto con papel filtro y 2) prueba con suelo artificial y muestras de suelo contaminado. En éste caso por limitaciones de tiempo sólo se efectuará la primera parte. La prueba por contacto en papel filtro puede ser utilizada como preliminar para determinar las concentraciones correspondientes a las que se tiene que llevar a cabo la prueba con suelo, es fácil de realizar y da resultados reproducibles. El presente ensayo se basa en la guía 207 de la OECD para la evaluación de sustancias (OCDE, 1984). La prueba por contacto en papel filtro involucra la exposición de las lombrices a sustancias de prueba sobre un papel filtro húmedo con la finalidad de identificar el potencial tóxico del compuesto presente en el suelo. Esta prueba tiene una duración de 48 horas pero puede ampliarse hasta 72 horas. Figura 1. Prueba con papel filtro con lombriz de tierra OBJETIVO Los alumnos evaluarán los efectos tóxicos de una solución de cromo hexavalente en papel filtro por contacto con lombriz de tierra (Eisenia andrei) durante 48 horas. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS 36 * lombriz de tierra (Eisenia andrei) Frascos de boca ancha tipo Gerber Balanza Pinzas, tijeras Papel aluminio, tela, ligas Tiras de papel de filtro de paso intermedio de 4.5 cm x 7 cm. K2Cr2O7 grado reactivo Merck *Las lombrices de tierra (Eisenia foetida) utilizadas en ésta práctica fueron una donación del proyecto de la Dra. M Olivia Franco Hernández de la UPIBI-IPN METODOLOGÍA Para esta prueba se deben lavar los contenedores de vidrio con agua caliente y detergente, se deben enjuagar y dejar secar. Cortar papel filtro con 4.5 cm de ancho por 7 cm de longitud depositarlo en el frasco. No debe exceder del borde del frasco. Se prepara la solución de K2Cr2O7 de trabajo. Se deposita 1 mL de diferentes concentraciones de esta solución en el papel filtro (con micropipeta), cuidando que se distribuya homogéneamente, y se seca por rotación del frasco con papel filtro. Después de secado el papel filtro, se adiciona en cada vial de 1 a 5.5 mL de agua desionizada o destilada (de acuerdo a los resultados de humedad del papel filtro explicado previamente), cada vial es tapado con tela (tipo organza) y con papel aluminio que se ha perforado para obtener orificios que permitan preservar la humedad y facilitar el intercambio de aire. Los controles son: papel filtro con agua desionizada. Las concentraciones a emplear serán tres. Para cada tratamiento o nivel de concentración se preparan 10 replicas. Una lombriz se coloca en cada frasco, depositándola sobre el papel filtro húmedo. Antes de ser colocadas en los viales, las lombrices son depositadas por tres horas en papel filtro humedecido, con la finalidad de vaciar sus intestinos; después son lavadas y secadas. Los viales son colocados en forma horizontal en la oscuridad, a una temperatura de 20 o 22± 2 C, durante un periodo de 48 horas. Las lombrices se consideran muertas cuando no responden a ningún estimulo mecánico. Cualquier síntoma patológico se reporta. RESULTADOS El efecto medido en este bioensayo es la mortalidad y como resultado final se espera obtener la CL50. Sin embargo, de no obtener dicha respuesta, cualquier cambio en el estado general de las lombrices deberá ser reportado y concluir sobre los hallazgos de este efecto tóxico. REPORTE DE LA PRUEBA En el reporte del ensayo debe incluirse la siguiente información: Los datos del compuesto que se probó Las características del organismo de prueba, incluyendo la especie, condiciones de cultivo, número de lombrices utilizadas por réplica 37 Las condiciones de la prueba, así como cualquier variación de las condiciones de la misma. Los resultados del peso promedio de los organismos al inicio y final de la prueba. Así como una descripción de cambios físicos o patológicos observados en los organismos Los resultados del bioensayo deberán plasmarse en una gráfica en donde se comparen los datos de todos los equipos que trabajaron con diferentes concentraciones del tóxico y se discutirá acerca de los resultados y de la utilidad, ventajas y desventajas del bioensayo como prueba toxicológica. Bibliografía: 38 Dorn, P. B., T. E. Vipond J. P. Salanitro y H. L. Wisniewksi. 1998. Assessment of the acute toxicity of crude oils in soil using earthworms, microtox and plants. Chemosphere 37(5):845-860. Fragoso, G. C. 2002. Las lombrices de tierra en México: diversidad, distribución y manejo. II Simposium Internacional y Reunión Nacional Lombricultura y abonos orgánicos. Ramírez-Romero Patricia, Mendoza-Cantú Ania, 2008. Ensayos toxicológicos para la evaluación de sustancias químicas en agua y suelo. La experiencia en México. SEMARNAT. Tercera parte: ensayos en suelo. Ensayo de toxicidad aguda con la lombriz de tierra Eisenia andrei. Cuevas-Diaz Maria del Carmen, Ferrera- Cerrato Ronald, Roldan-Martin Adriana, Rodriguez-Vazquez Refugio. pp: 209- 224. Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). 1984. Earthworm, acute toxicity tests. Guideline for testing of chemicals N° 207 (consultado en abril de 1984). OCDE, París, 9 pp.
